CN113817854A

CN113817854A - 一种单标记ssDNA探针可视化检测沙门氏菌基因的方法

Info

Publication number: CN113817854A
Application number: CN202111148736.XA
Authority: CN
Inventors: 王柳; 白琳琳; 张芳; 何开雨; 徐霞红
Original assignee: Zhejiang Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Zhejiang Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2021-09-28
Filing date: 2021-09-28
Publication date: 2021-12-21
Anticipated expiration: 2041-09-28
Also published as: CN113817854B

Abstract

本发明公开了一种单标记单链DNA(ssDNA)探针可视化检测沙门氏菌基因的方法。通过RPA对沙门氏菌的特征基因进行扩增，利用Cas12a和crRNA组装的复合物识别并结合RPA扩增的特异产物上的特征序列以激活Cas12a的附属切割活性，从而对单荧光标记的ssDNA进行切割，使其被GO吸附的能力减弱，而无沙门氏菌DNA的样本因为不激活Cas12a的附属切割活性，单荧光基团标记的ssDNA无法被切割，被GO吸附而出现荧光淬灭；最终将沙门氏菌的基因信息转换为可视的荧光变化。本发明实现了对沙门氏菌基因的特异、单标记、可视化检测。

Description

一种单标记ssDNA探针可视化检测沙门氏菌基因的方法

技术领域

本发明属于微生物检测领域中的沙门氏菌检测，具体涉及了一种单标记ssDNA探针可视化检测沙门氏菌基因的方法。

背景技术

根据世界卫生组织报道，全球范围内年均有6亿例食源性疾病由食用受肠道病原体污染的食品引起，其中42万例死亡。在欧盟，2018年约有5146起食源性疫情，肉类和相关产品是主要的传染源，占2018年食源性疫情的17.9％，而其中最常见的病原体是沙门氏菌。沙门氏菌为肠杆菌科(Enter-obacteriaceae)沙门氏菌属(Salmonella)的革兰氏阴性需氧或兼性厌氧杆菌，目前全球已知有2523种血清型。沙门氏菌属食物中毒是一种常见的细菌性食物中毒，其中以鼠伤寒、肠炎和猪霍乱杆菌最常见。沙门氏菌主要存在于鸡蛋、肉类和肉制品中，会导致胃肠炎症状，包括持续腹泻、发烧、呕吐和腹部绞痛等。此外，在淋巴系统入侵或炎症性肠病的情况下，感染沙门氏菌还可能导致败血症和伤寒。因此，为了保证食品安全，准确、高效地检测沙门氏菌也变得越来越重要。

食品中沙门氏菌的常规检测方法是平板培养法，包括菌落计数和标准生化鉴定，一般需要2到3天对致病菌进行初步鉴定，额外需要长达一周的时间进一步确认致病菌的种类，检测周期长，工作量大。免疫学检测方法主要是基于抗原和抗体间的相互作用而实现的，相比于传统的平板培养分离鉴定法检测时间已经大幅度缩短，但抗原和抗体之间的结合强度及细菌抗原交叉反应常影响检测结果的灵敏度和准确性。基于生物遗传信息发展起来的核酸检测技术具有特异性强、灵敏度高等优点，如聚合酶链式反应(PCR)。但PCR需要精密的温控设备，不适用于现场检测。

恒温核酸扩增不需要模板的热变性，在等温条件下即可实现目标序列的指数复制，仅简单的金属浴或水浴锅即可满足温控需求，避免对昂贵的仪器设备的依赖，具有省时、易操作、低成本的特点，且灵敏度极高。常规用于恒温扩增产物检测的方法主要包括实时荧光采集和凝胶电泳，前者需要精密的荧光采集装置，后者操作时间长，两者在现场检测领域都受到一定的限制。可视化检测法具有操作方便、结果直观等优点，在现场检测领域具有巨大的优势。扩增体系中各成分(如焦磷酸根离子、镁离子、氢离子等)在反应前后发生较大幅度变化，常被用于构建可视化判断扩增反应进程的方法，例如HNB法、钙黄绿素法、浊度法、pH染料法等。但引物、反应温度、缓冲溶液、酶等任一因素的非最佳条件都可能导致扩增反应过程中非特异性核酸链延伸与积累，而上述方法无法排除非特异信号所产生的干扰，进而影响检测结果的准确性。

CRISPR(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)是一种存在于几乎所有古生菌和多数细菌中的抵御病毒入侵的一种获得性免疫方式，可用来对抗入侵的病毒及外源DNA。Cas12a是一种与CRISPR相关的DNA内切酶，在crRNA的引导下依赖PAM序列特异性识别双链DNA序列，形成三体复合物。与此同时，Cas12a的附属切割活性被激活，不加选择地切割体系中的所有ssDNA。CRISPR/Cas12a的这种特性已被成功应用于开发快速、低成本且高灵敏的核酸检测工具上，在核酸分子诊断领域具有重要的应用潜力。但是，CRISPR/Cas12a仅能检测pM甚至更高浓度的核酸序列，其灵敏度无法满足实际生产中沙门氏菌的检测需求。利用RPA的高灵敏度的特点，将其与CRISPR/Cas技术联用，能够很好的解决CRISPR自身灵敏度受限的问题，并排除RPA的非特异信号的干扰，实现沙门氏菌的特异检测。但是，当前利用CRISPR/Cas进行目标物检测时，主要依赖Cas12a对同时标记荧光基团和淬灭基团的ssDNA探针进行切割，检测成本较高。减少ssDNA探针的修饰，将有利于节约检测成本。

发明内容

为了解决基于CRISPR/Cas12a的核酸检测对同时修饰荧光基团和淬灭基团标记的ssDNA探针的依赖问题，本发明提供了一种利用CRISPR/Cas12a切割单标记的ssDNA报告探针，并利用GO对ssDNA的强吸附能力和对荧光的淬灭能力，实现沙门氏菌基因检测的方法。

本发明采用的技术方案包括以下步骤：

1)提取待测样品的基因组DNA；

2)表达并纯化Cas12a；

3)设计并合成RPA引物和crRNA；

4)RPA扩增：以步骤1)提取的基因组DNA作为模板，在含有RPA引物的RPA体系中进行扩增，得到RPA产物；

5)荧光可视检测：将步骤4)的RPA产物、步骤2)的Cas12a、步骤3)的crRNA、单荧光基团标记的ssDNA探针和NEBuffer2.1缓冲液混匀后，孵育10～60min，再添加GO(氧化石墨烯)，通过荧光信号判断待测样品中是否含有沙门氏菌基因。

所述步骤3)中的设计并合成RPA引物具体为：针对沙门氏菌的侵袭蛋白A基因(InvA基因)合成RPA引物；

所述RPA引物包括RPA引物1、RPA引物2；RPA引物1序列为：GTCATTCCATTACCTACCTATCTGGTTGATTTCC；RPA引物2序列为：GCATCGGCTTCAATCAAGATAAGACGACTGGT。

所述步骤3)中设计并合成crRNA具体为：

根据RPA的靶标序列以及PAM序列选定crRNA的识别序列为：GTCAATGTAGAACGACCCCA，根据碱基互补配对的原则设计并合成crRNA的识别序列对应的crRNA序列为：

所述RPA的靶标序列为：

所述PAM序列为：TTTN。

所述步骤4)中：

50μL RPA体系包括13.2μL模板DNA、0.48μM RPA引物1、0.48μM RPA引物2、29.5μLRehydration buffer、14mM醋酸镁；

扩增条件为：37℃孵育10-20min。

所述步骤5)具体为：

取体积为1-10μL的RPA扩增产物、浓度为0.2-0.6μM Cas12a、浓度为0.2-0.6μM的crRNA、浓度为1μM的单荧光基团标记的ssDNA探针和1×NEB buffer 2.1，用DEPC处理水补足至20μL后混匀，35-37℃孵育10-60min后，添加0.2mg/mL GO。

所属步骤5)中，标记在ssDNA上的荧光染料为FAM、Cy5、HEX；荧光基团标记方式优选为：在ssDNA探针的3’最末端的位点修饰FAM荧光基团。

所属步骤5)中，ssDNA的长度优选为12个碱基。

所述步骤5)中：当RPA产物中含有沙门氏菌的特异扩增基因时，Cas12a-crRNA与特征序列结合，进而激活Cas12a的附属切割活性，切割荧光基团标记的ssDNA探针，使其无法被GO吸附，溶液发射荧光；

特征序列为能与crRNA的识别区域互补的序列，即识别序列；

当RPA产物中不含有沙门氏菌的特异扩增基因时，Cas12a的附属切割活性无法被激活，无法切割单荧光基团标记的ssDNA，使其被GO吸附，溶液不发射荧光。

本发明的有益效果是：

本发明采用RPA将沙门氏菌的特征基因信号进行放大，利用Casl2a和crRNA组装的复合物识别RPA特异产物上的特征序列以激活Cas12a的附属切割活性，对荧光基团标记的ssDNA进行切割，再利用GO对ssDNA的强吸附性能和对荧光的强淬灭能力进行信号输出，实现沙门氏菌可视化检测。

附图说明

图1为基于CRISPR/Cas12a的单标记ssDNA探针可视化检测沙门氏菌基因的示意图。图中A表示沙门氏菌DNA经RPA扩增，所得产物与Cas12a-crRNA结合形成三元复合物激活Cas12a的附属切割活性，将荧光基团标记的ssDNA探针切割为小片段，加入GO后发射明显的荧光。图中B表示非沙门氏菌DNA经过RPA扩增后无特异扩增产物，无法与Cas12a-crRNA形成三元复合物，无法切割荧光基团标记的ssDNA探针，加入GO后单荧光基团标记的ssDNA被GO吸附从而无荧光发射。

图2为Cas12a被dsDNA目标物激活后切割FAM标记的不同长度的ssDNA探针结合GO进行荧光检测的结果。A为荧光可视化图。B为荧光值柱状图以及信噪比趋势。N表示无dsDNA目标物激活Cas12a。P表示有dsDNA目标物激活Cas12a。

图3ssDNA探针上单荧光基团标记位点对荧光发射的影响。图中A和C为长度相同但荧光标记位点不同的ssDNA探针在经Cas12a切割后利用GO进行可视化检测结果。图中B和D为长度相同但荧光标记位点不同的ssDNA探针在经Cas12a切割后利用GO进行荧光检测的荧光值结果及阳性样本与阴性样本的荧光比值。N表示无dsDNA目标物激活Cas12a，P表示有dsDNA目标物激活Casl2a。

图4为RPA扩增产物激活Cas12a附属切割活性并切割单荧光基团标记的ssDNA并利用GO实现荧光可视化检测沙门氏菌基因的灵敏度。图A为可视化检测结果，图B为实时荧光PCR结果。NTC表示无模板的对照。

图5为RPA扩增产物激活Cas12a附属切割活性切割单荧光基团标记的ssDNA并利用GO实现荧光可视化检测沙门氏菌基因的特异性。所选用于特异性验证的菌种包括副溶血弧菌ATCC 17802(V.P 17802)、鼠伤寒沙门氏菌CMCC(B)50115(Salm 50115)、不动杆菌DSM25388(A.B 25388)、费格森埃希ATCC 35469(E.fergusonii 35469)以及大肠杆菌ATCC25922(E.Coli 25922)。图A为可视化检测结果。图B为RPA产物的凝胶电泳图。NTC表示无模板的对照。

图6为被不同浓度的沙门氏菌污染的鸡蛋样本经DNA提取后，采用RPA扩增，产物利用Cas12a切割单荧光标记的ssDNA，并结合GO进行荧光检测的结果。图中曲线图为实时荧光PCR的结果，嵌入的照片表示可视化检测结果。NTC表示无模板的对照。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明进一步说明。

本发明的实施过程具体如下：

1、RPA引物及crRNA设计

针对沙门氏菌的侵袭蛋白A基因(InvA，GenBank编号NC_003197)合成了RPA引物。根据RPA的靶标序列以及PAM序列(TTTN)选定crRNA的识别序列为GTCAATGTAGAACGACCCCA，根据碱基互补配对的原则设计并合成相应的crRNA序列为：

RPA的靶标序列：

RPA引物1：GTCATTCCATTACCTACCTATCTGGTTGATTTCC

RPA引物2：GCATCGGCTTCAATCAAGATAAGACGACTGGT

2、Cas12a的表达与纯化

将Addgene上购买的含有编码LbCas12a蛋白基因和氨苄抗性基因的质粒转化到大肠杆菌rosetta(DE3)感受态细胞中，然后接种到LB固体培养基上，于恒温培养箱中37℃过夜培养；待LB固体培养基上长出菌落之后挑取单菌落转入LB液体培养基中，于摇床上37℃、250rpm培养12-14h的菌液；所述LB液体培养基中预先加入0.1mg/mL的氨苄。

将上述LB液体培养基中培养所得的菌液用重新配置且添加了0.1mg/mL氨苄的LB液体培养基稀释，其稀释比例为重新配置的LB液体培养基∶菌液＝100∶1，再将所得稀释后的菌液在摇床中以37℃、250rpm培养直至菌液的吸光值为0.6-0.8，实现大量扩培；然后向扩培后的菌液中添加IPTG诱导剂，所述诱导剂的添加量为每100mL菌液加入24μL0.2g/mLIPTG诱导剂，再将添加了诱导剂的菌液在低温培养箱中以16℃、180rpm培养16h，诱导细菌表达LbCas12a蛋白。

将已表达LbCasl2a蛋白的菌液以8000rpm离心6分钟，弃掉上清液；用Bindingbuffer(50mM Tris-HCl、1.5M NaCl)重悬沉淀；然后用超声波细胞破碎仪破碎30min，使蛋白从细胞中释放到重悬液中，之后在4℃下，以10000rpm离心15分钟，取上清液；

先用Ni柱除去上清液中除目的蛋白外的杂蛋白，然后用Wash buffer(50mM Tris-HCl、1.5M NaCl、30mM咪唑)洗去杂蛋白，再用Elution buffer(50mM Tris-HCl，1.5M NaCl、600mM咪唑)将目的蛋白Cas12a从Ni柱中洗脱下来，再用脱盐柱进行脱盐纯化，将蛋白液先挂在脱盐柱上，然后用脱盐液(20mM Tris-HCl、600mM NaCl、2mM DTT、10％甘油)将目的蛋白Cas12a洗脱下来并用离心管收集，得到纯化后的LbCas12a蛋白。

3、RPA扩增得到RPA产物

RPA的扩增条件如下：RPA总体系为50μL，包括13.2μL模板DNA、0.48μM引物1、0.48μM引物2、29.5μL Rehydration buffer、14mM醋酸镁。

扩增条件为：37℃孵育10-20min。

4、CRISPR/Cas12a切割单荧光标记的ssDNA探针结合GO淬灭荧光的可视化检测

RPA扩增产物的体积为1-10μL、Cas12a的浓度为0.2-0.6μM、crRNA的浓度为0.2-0.6μM、FAM标记的ssDNA探针浓度为1μM、1×NEB buffer 2.1、用DEPC处理水补足至20μL。35-37℃孵育10-60min后，添加0.2mg/mL GO。

单荧光标记的ssDNA序列为：AAAAAAAAAAAA-FAM

5、结果判断

样品中存在沙门氏菌基因时，RPA特异性扩增目标序列，进而激活Cas12a的附属切割活性，切割FAM标记的ssDNA探针，使ssDNA无法被GO吸附，溶液发射荧光；

反之，当样品中不存在沙门氏菌基因时，RPA无法扩增特异性目标序列，Cas12a的附属切割活性无法被激活，无法切割FAM标记的ssDNA探针，使ssDNA被GO吸附，溶液不发射荧光。

实施例1：单荧光基团标记的ssDNA长度对荧光发射的影响

CRISPR反应总体积为20μL，其中包括2μL dsDNA目标物、400nM Cas12a蛋白、450nMcrRNA、750nM FAM标记的不同长度ssDNA探针、1×NEB buffer 2.1。37℃孵育15min，孵育结束后添加0.2mg/mL GO和5μL DEPC处理水。在蓝光切胶仪下观察荧光变化并使用手机拍照成像。

其中，单荧光基团标记的ssDNA探针分别为：

8A-FAM：AAAAAAAA-FAM

10A-FAM：AAAAAAAAAA-FAM

12A-FAM：AAAAAAAAAAAA-FAM

15A-FAM：AAA AAAAAAAAAAAA-FAM

结果如图2所示，12A-FAM表现出最强的信噪比。

实施例2：ssDNA探针的荧光基团修饰位点对荧光发射的影响

CRISPR反应总体积为20μL，其中包括2μL dsDNA目标物、400nM Cas12a蛋白、450nMcrRNA、750nM FAM标记的修饰位点不同的ssDNA探针、1×NEB buffer 2.1。37℃孵育15min，孵育结束后添加0.2mg/mL GO和5μL DEPC处理水。在蓝光切胶仪下观察荧光变化并使用手机拍照成像。

其中，ssDNA探针上荧光基团修饰位点分别为(从5’端开始计)：

12号位点修饰：AAAAAAAAAAAA-FAM

11号位点修饰：AAAAAAAAAA/i6FAMdT/A

10号位点修饰：AAAAAAAAA/i6FAMdT/AA

9号位点修饰：AAAAAAAA/i6FAMdT/AAA

6号位点修饰：AAAAA/i6FAMdT/AAAAAA

3号位点修饰：AA/i6FAMdT/AAAAAAAAA

2号位点修饰：A/i6FAMdT/AAAAAAAAAA

1号位点修饰：FAM-AAAAAAAAAAAA

结果如图3所示，ssDNA探针在12号位点修饰荧光基团表现出最强的信噪比。

实施例3：灵敏度测试

利用市售的细菌基因组DNA提取试剂盒(北京百泰克生物技术有限公司)提取沙门氏菌CMCC(B)50115的基因组DNA，通过微量紫外分光光度计(Thermo Fisher，美国)测其浓度，算出拷贝数。

将所述提取的沙门氏菌基因组DNA用无菌水进行十倍梯度稀释，使其浓度为10⁴，10³，10²，10¹拷贝/μL(copies/μL)。

将所述梯度稀释的沙门氏菌基因组DNA作为模板，利用RPA扩增：50μL体系包括13.2μL模板DNA、0.48μM引物1、0.48μM引物2、29.5μL Rehydration buffer、14mM醋酸镁。37℃孵育10-20min。得到RPA产物。

取出1μL RPA产物加入到20μL含400nM Cas12a蛋白、450nM crRNA、750nM FAM标记的ssDNA探针、1×NEB buffer 2.1的缓冲溶液中。35-37℃孵育10-60min，孵育结束后添加0.2mg/mL GO。

结果如图4所示，当沙门氏菌DNA浓度为5×10⁰拷贝/反应时，样本无荧光。而当沙门氏菌DNA浓度为5×10¹拷贝/反应或更低时，样本发射明显的荧光，表明可视化检测灵敏度为5×10¹拷贝/反应。

实施例4：特异性实验

利用市售的细菌基因组DNA提取试剂盒(北京百泰克生物技术有限公司)从副溶血弧菌ATCC 17802、鼠伤寒沙门氏菌CMCC(B)50115(Salmonella 50115)、不动杆菌DSM 25388(Acinetobacter 25388)、费格森埃希056(Escherichia ferguson 056)以及大肠杆菌ATCC25922(Escherichia coli 25922)中提取基因组DNA，通过微量紫外分光光度计(ThermoFisher，美国)测其浓度，算出拷贝数。

以上述五种细菌的DNA作为模板，分别以InvA引物进行扩增得到五种扩增产物：50μL体系包括13.2μL模板DNA、0.48μM引物1、0.48μM引物2、29.5μL Rehydration buffer、14mM醋酸镁。37℃孵育10-20min。得到RPA产物。

从五种RPA扩增产物中分别取出1μL加入到20μL含400nM Cas12a蛋白、450nMcrRNA、750nM FAM修饰的ssDNA探针、1×NEB buffer 2.1的缓冲溶液中。35-37℃孵育10-60min，孵育结束后添加0.2mg/mL GO。在蓝光切胶仪下观察荧光变化。

结果如图5所示，当检测的样本为沙门氏菌时，样本不发射荧光。而检测其他细菌样本都发射明显的荧光，表明该方法具有良好的特异性。

实施例5：鸡蛋中沙门氏菌检测

沙门氏菌保藏菌株在平板培养基上划线分离后挑取单一菌落转接至LB肉汤液体培养基，37℃培养6小时，用生理盐水进行10倍梯度稀释，根据平板计数算出稀释液中分别含8×10⁴CFU/mL至6.1×10⁰CFU/mL的沙门氏菌。再分别取1ml稀释液接种到鸡蛋液中加无菌水进行100倍稀释。

以上述沙门氏菌污染的鸡蛋作为样本，利用市售的细菌基因组DNA提取试剂盒(北京百泰克生物技术有限公司)从中提取DNA。

将所述从污染的鸡蛋中提取的DNA作为模板，以InvA为靶标进行RPA扩增：50μL体系包括13.2μL模板DNA、0.48μM引物1、0.48μM引物2、29.5μL Rehydration buffer、14mM醋酸镁。37℃孵育10-20min。得到RPA产物。

取出1μL RPA产物加入到20μL含400nM Cas12a蛋白、450nM crRNA、750nM FAM修饰的ssDNA探针、1×NEB buffer 2.1的缓冲溶液中。35-37℃孵育10-60min，孵育结束后添加0.2mg/mL GO。在蓝光切胶仪下观察荧光变化。

结果如图6所示，当用8×10¹CFU/g或更高浓度的沙门氏菌污染鸡蛋时，样本呈现明显的荧光发射。而污染鸡蛋的沙门氏菌浓度为8×10⁰CFU/g或更低时，样本无明显的绿色荧光。

序列表

<110> 浙江省农业科学院

<120> 一种单标记ssDNA探针可视化检测沙门氏菌基因的方法

<130> 2021.9.28

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

gtcattccat tacctaccta tctggttgat ttcc 34

<210> 2

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gcatcggctt caatcaagat aagacgactg gt 32

<210> 3

<211> 200

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

gcatcggctt caatcaagat aagacgactg gtactgatcg ataatgccag acgaaagagc 60

gtggtaatta acagtaccgc aggaaacgtt gaaaaactga ggattctgtc aatgtagaac 120

gaccccataa acaccaatat cgccagtacg atattcagtg cgatcaggaa atcaaccaga 180

taggtaggta atggaatgac 200

<210> 4

<211> 41

<212> RNA

<213> crRNA

<400> 4

uaauuucuac uaaguguaga uuggggucgu ucuacauuga c 41

Claims

1.一种单标记ssDNA探针可视化检测沙门氏菌基因的方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)提取待测样品的基因组DNA；

2)表达并纯化Cas12a；

3)设计并合成RPA引物和crRNA；

5)荧光可视检测：将步骤4)的RPA产物、步骤2)的Cas12a、步骤3)的crRNA、单荧光基团标记的ssDNA探针和NEBuffer2.1缓冲液混匀后，孵育10～60min，再添加GO，通过荧光信号判断待测样品中是否含有沙门氏菌基因。

2.根据权利要求1所述的一种单标记ssDNA探针可视化检测沙门氏菌基因的方法，其特征在于，所述步骤3)中的设计并合成RPA引物具体为：针对沙门氏菌的侵袭蛋白A基因合成RPA引物；

3.根据权利要求1所述的一种单标记ssDNA探针可视化检测沙门氏菌基因的方法，其特征在于，所述步骤3)中设计并合成crRNA具体为：

UAAUUUCUACUAAGUGUAGAUUGGGGUCGUUCUACAUUGAC。

4.根据权利要求3所述的一种单标记ssDNA探针可视化检测沙门氏菌基因的方法，其特征在于，所述RPA的靶标序列为：

GCATCGGCTTCAATCAAGATAAGACGACTGGTACTGATCGATAATGCCAGACGAAAGAGCGTGGTAATTAACAGTACCGCAGGAAACGTTGAAAAACTGAGGATTCTGTCAATGTAGAACGACCCCATAAACACCAATATCGCCAGTACGATATTCAGTGCGATCAGGAAATCAACCAGATAGGTAGGTAATGGAATGAC；

所述PAM序列为：TTTN。

5.根据权利要求1所述的一种单标记ssDNA探针可视化检测沙门氏菌基因的方法，其特征在于，所述步骤5)具体为：

6.根据权利要求5所述的一种单标记ssDNA探针可视化检测沙门氏菌基因的方法，其特征在于，所属步骤5)中，标记在ssDNA上的荧光染料为FAM、Cy5、HEX；荧光基团标记方式优选为：在ssDNA探针的3’最末端的位点修饰FAM荧光基团。

7.根据权利要求5所述的一种单标记ssDNA探针可视化检测沙门氏菌基因的方法，其特征在于，所属步骤5)中，ssDNA的长度优选为12个碱基。

8.根据权利要求1所述的一种单标记ssDNA探针可视化检测沙门氏菌基因的方法，其特征在于，所述步骤5)中：当RPA产物中含有沙门氏菌的特异扩增基因时，Cas12a-crRNA与特征序列结合，进而激活Cas12a的附属切割活性，切割荧光基团标记的ssDNA探针，使其无法被GO吸附，溶液发射荧光；

当RPA产物中不含有沙门氏菌的特异扩增基因时，Cas12a的附属切割活性无法被激活，无法切割荧光基团标记的ssDNA，使其被GO吸附，溶液不发射荧光。