CN105300950A - 基于部分还原氧化石墨烯的dna荧光检测方法及其试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种<b>基于部分还原氧化石墨烯的</b><b>DNA</b><b>荧光检测方法及其试剂盒</b>，本发明利用部分还原氧化石墨烯纳米探针可吸附单链DNA而不吸附双链DNA的特性，提供了一种快速、简便、超灵敏的DNA检测新方法。该检测新方法所用部分还原氧化石墨烯纳米探针制备方法简便，具有吸附单链DNA能力强，用量少，反应迅速等优点。所构建的检测试剂盒荧光背景低，测定选择性和灵敏度高，DNA检测限为50pmol/L。本发明可用于生物及生命科学体系中DNA的高灵敏测定。
Description
技术领域
本发明涉及一种基于部分还原氧化石墨烯荧光共振能量转移纳米探针的DNA荧光检测方法及其试剂盒，属于分析化学及纳米技术领域。
背景技术
氧化石墨烯是一种性能优异的新型碳纳米材料，具有较高的比表面积和丰富的表面官能团，其理想的晶格结构和独特的光学、表面、机械、电学及热学性质在生物和化学传感器、储能器件及复合材料等诸多领域都具有良好的应用前景。
荧光共振能量转移是能量由供体荧光团经无辐射途径转移给受体荧光团，并引起供体荧光猝灭和受体荧光增强的光学现象。近年来，人们致力于开发基于氧化石墨烯荧光淬灭效应的荧光共振能量转移传感器，并将其用于生物及化学检测。研究表明，由于氧化石墨烯的结构特点，其对带有裸露的环状结构的化合物具有强烈的吸附能力。单链DNA（ssDNA）中的碱基包含六元环结构，氧化石墨烯会与裸露的碱基发生强烈的π-π相互作用、疏水作用等，从而吸附ssDNA。而在双链DNA（dsDNA）中磷酸骨架将碱基有效屏蔽在其中，使氧化石墨烯无法与碱基接触，从而造成结合能力的减弱。利用氧化石墨烯结合不同分子结构的DNA能力的差异，以氧化石墨烯作为荧光共振能量转移纳米探针，可以测定特定序列的DNA含量。
本发明提供了一种基于部分还原氧化石墨烯荧光共振能量转移纳米探针的DNA荧光检测方法及其试剂盒。部分还原氧化石墨烯通过氧化石墨烯在碱性溶液中的室温控制还原得到，在保持水溶液体系稳定性的基础上，有效增加了sp2杂化晶域，对荧光分子修饰ssDNA的荧光猝灭效率和猝灭速度均大幅度提高。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种基于部分还原氧化石墨烯荧光共振能量转移纳米探针的DNA检测方法。
本发明的另一个目的在于提供一种基于部分还原氧化石墨烯的DNA荧光检测试剂盒。试剂盒中包括提供部分还原氧化石墨烯（a液），探针链DNA溶液（b液）。
为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：本发明所述的一种基于部分还原的氧化石墨烯的DNA荧光检测方法，其特征是将6-羧基荧光素标记单链DNA与目标链DNA加入到Tris-HCl缓冲液中，杂交反应后加入部分还原氧化石墨烯，室温反应，测定520nm处的荧光强度，激发波长为494nm；所使用的部分还原氧化石墨烯由以下方法制备而得：将4mg/mL氧化石墨烯水溶液与10mmol/LNaOH水溶液等体积混合，将混合物在室温条件下搅拌反应后所得的悬浮液离心分离，并用纯净水洗涤至中性，干燥，获得的沉淀物为部分还原氧化石墨烯。
所述的部分还原氧化石墨烯对6-羧基荧光素标记单链DNA的荧光猝灭率为99.3%。
将40mL500nmol/L6-羧基荧光素标记单链DNA与40mL目标链DNA加入到405mL浓度为10mmol/L的pH为8.0且含50mmol/LNaCl和1mmol/LEDTA的Tris-HCl缓冲液中，37℃条件下杂交30分钟，加入15mL100mg/mL部分还原氧化石墨烯，室温反应30秒，测定520nm处的荧光强度，激发波长为494nm。
上述的目标链DNA检测线性范围为0.2~40nmol/L，检测限为50pmol/L。
本发明所述的一种基于部分还原氧化石墨烯的DNA荧光检测试剂盒，其特征是试剂盒包括a液和b液；a液为部分还原氧化石墨烯溶液，b液为含探针链FAM-ssDNA的Tris-HCl缓冲液。
上述的a液为浓度为100mg/mL的部分还原氧化石墨烯水溶液。
上述的b液为含44.94nmol/L探针链FAM-ssDNA的10mmol/L的Tris-HCl缓冲液，所述的Tris-HCl缓冲液其pH为8.0，且含50mmol/LNaCl和1mmol/LEDTA。
本发明所述的一种基于部分还原氧化石墨烯的DNA荧光检测试剂盒的使用方法为：40mL目标链DNA加入到445mLb液中，混合后在37℃条件下杂交反应30分钟，在混合溶液中加入15mLa液，混合后室温反应30秒，测定520nm处的荧光强度F，激发波长为494nm。
上述的目标链DNA检测线性范围为0.2~40nmol/L，检测限为50pmol/L。
所述的方法，能区分单碱基错配DNA和目标链DNA。
本发明采用的技术方案为：
（一）氧化石墨烯的制备
氧化石墨烯的制备：称取325目鳞片石墨，加入到体积比为9:1的浓硫酸和磷酸混合溶液中。充分搅拌后，置于在0℃冰浴中。将高锰酸钾少量多次，缓慢加入到以上混合溶液中。保持0℃冰浴，磁力搅拌3小时后，将所得墨绿混悬液转移至35℃温水浴中，控温1小时，然后再将混悬液转移至50℃温水浴中，控温12小时。将一定量的冰水混合物缓慢加入到得到的紫黑色混悬液中，剧烈搅拌1小时。继而往溶液中逐滴滴加30%过氧化氢溶液，至溶液颜色突变为亮黄色。所得溶液经G1砂芯漏斗（孔径20-30微米）过滤，继而4000转/分钟离心30分钟，分别经过水洗一次，酸洗一次，醇洗至中性，最后用乙醚冲洗后经G5砂芯漏斗（孔径1.5-2.5微米）过滤。滤饼在室温下过夜晾干，得到氧化石墨烯固体。
（二）部分还原氧化石墨烯荧光共振能量转移纳米探针的制备
将4mg/mL上述方法制备的氧化石墨烯水溶液与10mmol/L的NaOH水溶液等体积混合，室温条件下搅拌反应2小时，12000转/分钟离心30分钟，并用水洗涤至中性。最后置于恒温干燥箱50℃干燥12小时，得到部分还原氧化石墨烯固体。
（三）DNA检测
将40nmol/L6-羧基荧光素标记单链DNA（FAM-ssDNA）与不同浓度目标链DNA混合，37℃条件下杂交30分钟，杂交缓冲液为10mmol/L的Tris-HCl缓冲液（pH8.0，含50mmol/LNaCl和1mmol/LEDTA）。加入3mg/mL部分还原氧化石墨烯，反应30秒，用荧光分光光度计检测荧光（激发波长494nm）。
为了实现上述试剂盒的目的，本发明采用以下技术方案：
（四）试剂盒组成
a液包括上述技术方案（二）制备的部分还原氧化石墨烯加入超纯水超声分散所形成的溶液，其浓度为100mg/mL。b液为含44.94nmol/L探针链DNA的10mmol/LTris-HCl缓冲液（pH8.0，含50mmol/LNaCl和1mmol/LEDTA）。
（五）试剂盒使用方法
将目标链DNA40mL加入到445mL技术方案（四）的b液，混合后37℃杂交30分钟。加入15mL技术方案（四）的a液，混合后室温条件下反应30秒，立即用494nm激发波长检测其520nm处荧光强度（F）。以F（含有目标链DNA）与F0（空白）的差值（F-F0）对目标链DNA绘制标准曲线进行定量。荧光分光光度法测定的检测限为50pmol/L。
本发明的优点：
（1）本发明使用部分还原的氧化石墨烯为探针，吸附单链DNA能力强，用量少，反应迅速等特点。
（2）本发明使用的部分还原的氧化石墨烯纳米材料其本身具有良好的水溶性，荧光背景低等性质，不需要任何前修饰步骤。
（3）本发明在检测DNA中测定灵敏度高，DNA检测限为50pmol/L。
（4）本发明检测DNA选择性好，能有效区分单碱基错配和非互补DNA序列。
附图说明
图1为氧化石墨烯、部分还原氧化石墨烯与FAM-ssDNA作用的荧光光谱图。
图2为部分还原氧化石墨烯对FAM-ssDNA的猝灭动力学曲线。
图3为检测不同浓度目标DNA时的荧光光谱图。
图4为目标DNA的标准曲线。
图5为DNA检测特异性图。
具体实施方式
本发明的一个方面在于提供一种基于部分还原氧化石墨烯的DNA荧光检测方法。以下结合附图及若干实施例对本发明检测方法的技术方案作进一步的说明。
实例1：
称取325目鳞片石墨2.7g，加入到316mL浓度为18.4mol/L的浓硫酸和36mL浓度为14.7mol/L的磷酸的混合溶液中。充分搅拌后，置于在0℃冰浴中。将16.2g高锰酸钾少量多次，缓慢加入到以上混合溶液中。保持0℃冰浴，磁力搅拌3小时后，将所得墨绿混悬液转移至35℃温水浴中，控温1小时，然后将所得墨绿混悬液转移至50℃温水浴中，控温12小时。360mL冰水缓慢加入到得到的紫黑色混悬液混合物中，剧烈搅拌1小时。继而往溶液中逐滴滴加12mL30wt%过氧化氢溶液，溶液颜色突变为亮黄色，搅拌30分钟。所得溶液经G1砂芯漏斗（孔径20-30微米）过滤，继而4000转每分钟离心30分钟，弃去上清液；加入180mL超纯水充分振荡洗涤，4000转每分钟离心30分钟，弃去上清液，沉淀颜色呈土黄色；再加入180mL30wt%盐酸充分振荡洗涤，经G1砂芯漏斗（孔径20-30微米）过滤去除不溶颗粒，滤液4000转每分钟离心30分钟，弃去上清液，沉淀颜色继续加深；接着多次用无水乙醇将沉淀物洗至pH值为中性，4000转每分钟离心30分钟，弃去上清液，沉淀呈棕黄色；最后用乙醚冲洗沉淀，经G5砂芯漏斗（孔径1.5-2.5微米）过滤。滤饼在室温下过夜晾干，得到棕色的氧化石墨烯。
实例2
将20mL4mg/mL实施例1制备的氧化石墨烯水溶液与20mL10mmol/L的NaOH水溶液等体积混合，将混合物在室温条件下搅拌反应2小时。然后将悬浮液12000转/分钟离心30分钟，并用超纯水洗涤至中性。最后置于恒温干燥箱50℃干燥12小时，得到棕黑色的部分还原氧化石墨烯。
实例3
在445mL浓度为10mmol/L的Tris-HCl缓冲液（pH8.0，含50mmol/LNaCl和1mmol/LEDTA）中加入40mL浓度为500nmol/LFAM-ssDNA溶液和15mL浓度为100mg/mL的部分还原氧化石墨烯水溶液，室温反应30秒，测定荧光光谱（激发波长494nm）。由图1可知，部分还原氧化石墨烯的荧光猝灭率为99.3%，显著高于氧化石墨烯的28.4%。
实例4：
在445mL浓度为10mmol/L的Tris-HCl缓冲液（pH8.0，含50mmol/LNaCl和1mmol/LEDTA）中加入40mL浓度为500nmol/LFAM-ssDNA溶液和15mL浓度为100mg/mL的部分还原氧化石墨烯水溶液，室温反应0~10min，测定520nm处的荧光强度（激发波长494nm）。由图2可知，部分还原氧化石墨烯可在30秒内猝灭FAM-ssDNA的荧光。
实例5：
将40mL500nmol/L6-羧基荧光素标记单链DNA（FAM-ssDNA）与40mL不同浓度目标链DNA（0~500nmol/L）加入到405mL10mmol/L的Tris-HCl缓冲液（pH8.0，含50mmol/LNaCl和1mmol/LEDTA）中，37℃条件下杂交30分钟。加入15mL100mg/mL部分还原氧化石墨烯，室温反应30秒，用荧光分光光度计检测荧光光谱（激发波长494nm）。如图3所示，荧光强度随着目标链DNA浓度的增大而减小。
实例6：
将40mL500nmol/L6-羧基荧光素标记单链DNA（FAM-ssDNA）与40mL不同浓度目标链DNA（0~500nmol/L）加入到405mL10mmol/L的Tris-HCl缓冲液（pH8.0，含50mmol/LNaCl和1mmol/LEDTA）中，37℃条件下杂交30分钟。加入15mL100mg/mL部分还原氧化石墨烯，室温反应30秒，测定520nm处的荧光强度（激发波长494nm）。如图4所示，目标链检测线性范围为0.2~40nmol/L，检测限为50pmol/L。
实例7：
将40mL500nmol/L6-羧基荧光素标记单链DNA（FAM-ssDNA）与40mL500nmol/L目标链DNA或单碱基错配链DNA或非互补链DNA，加入到405mL10mmol/L的Tris-HCl缓冲液（pH8.0，含50mmol/LNaCl和1mmol/LEDTA）中，37℃条件下杂交30分钟。加入15mL100mg/mL部分还原氧化石墨烯，室温反应30秒，测定520nm处的荧光强度（激发波长494nm）。如图5所示，该检测方法具有良好的特异性，可区分目标链与单碱基错配链，单碱基错配链荧光恢复仅相当于目标链的45%。
本发明的另一个目的在于提供一种基于部分还原氧化石墨烯的DNA荧光检测试剂盒。试剂盒中包括提供部分还原氧化石墨烯（a液），含探针链DNA（FAM-ssDNA）的Tris-HCl缓冲液（b液）。
实例8：
a液的制备：称取10mg上述实例2制备所得部分还原氧化石墨烯，加入10mL超纯水，超声5小时，得到浓度为100mg/mL的部分还原氧化石墨烯水溶液。
实例9：
b液的制备：将40mL500nmol/LFAM-ssDNA溶解于405mL浓度为10mmol/L的Tris-HCl缓冲液（pH8.0，含50mmol/LNaCl和1mmol/LEDTA），得到浓度为44.94nmol/L的FAM-ssDNA。
实例10：
试剂盒使用方法：40mL目标链DNA分别加入到445mL实施例9制备的b液，混合后在37℃条件下杂交反应30分钟。然后，在混合溶液中加入15mL实施例8制备的a液，混合后室温反应30秒，测定520nm处的荧光强度F（激发波长494nm）。根据F（含有目标链DNA）与F0（空白）的差值（F-F0）对目标链浓度绘制标准曲线，在0.2~40nmol/L范围内F-F0与目标链DNA浓度呈线性关系，检测限为50pmol/L。
以上所述仅为本发明的典型实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改，等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种基于部分还原的氧化石墨烯的DNA荧光检测方法，其特征是将6-羧基荧光素标记单链DNA与目标链DNA加入到Tris-HCl缓冲液中，杂交反应后加入部分还原氧化石墨烯，室温反应，测定520nm处的荧光强度，激发波长为494nm；所使用的部分还原氧化石墨烯由以下方法制备而得：将4mg/mL氧化石墨烯水溶液与10mmol/LNaOH水溶液等体积混合，将混合物在室温条件下搅拌反应后所得的悬浮液离心分离，并用纯净水洗涤至中性，干燥，获得的沉淀物为部分还原氧化石墨烯。
2.根据权利要求1所述的一种基于部分还原的氧化石墨烯的DNA荧光检测方法，其特征是部分还原氧化石墨烯对6-羧基荧光素标记单链DNA的荧光猝灭率为99.3%。
3.根据权利要求1所述的一种基于部分还原的氧化石墨烯的DNA荧光检测方法，其特征是将40mL500nmol/L6-羧基荧光素标记单链DNA与40mL目标链DNA加入到405mL浓度为10mmol/L的pH为8.0且含50mmol/LNaCl和1mmol/LEDTA的Tris-HCl缓冲液中，37℃条件下杂交30分钟，加入15mL100mg/mL部分还原氧化石墨烯，室温反应30秒，测定520nm处的荧光强度，激发波长为494nm。
4.根据权利要求1或3所述的一种基于部分还原的氧化石墨烯的DNA荧光检测方法，其特征是目标链DNA检测线性范围为0.2~40nmol/L，检测限为50pmol/L。
5.一种基于部分还原氧化石墨烯的DNA荧光检测试剂盒，其特征是试剂盒包括a液和b液；a液为部分还原氧化石墨烯溶液，b液为含探针链FAM-ssDNA的Tris-HCl缓冲液。
6.根据权利要求5所述的一种基于部分还原氧化石墨烯的DNA荧光检测试剂盒，其特征是a液为浓度为100mg/mL的部分还原氧化石墨烯水溶液。
7.根据权利要求5或6所述的一种基于部分还原氧化石墨烯的DNA荧光检测试剂盒，其特征是b液为含44.94nmol/L探针链FAM-ssDNA的10mmol/L的Tris-HCl缓冲液，所述的Tris-HCl缓冲液其pH为8.0，且含50mmol/LNaCl和1mmol/LEDTA。
8.权利要求5-7任一所述的一种基于部分还原氧化石墨烯的DNA荧光检测试剂盒的使用方法为：40mL目标链DNA加入到445mLb液中，混合后在37℃条件下杂交反应30分钟，在混合溶液中加入15mLa液，混合后室温反应30秒，测定520nm处的荧光强度F，激发波长为494nm。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征是目标链DNA检测线性范围为0.2~40nmol/L，检测限为50pmol/L。
10.根据权利要求8或9所述的方法，其特征是区分单碱基错配DNA和目标链DNA。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20160203 |
|
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |