CN113337627A - 基于CRISPR/Cas12a的免标记可视化检测副溶血弧菌基因的方法 - Google Patents

基于CRISPR/Cas12a的免标记可视化检测副溶血弧菌基因的方法 Download PDF

Info

Publication number
CN113337627A
CN113337627A CN202110620005.4A CN202110620005A CN113337627A CN 113337627 A CN113337627 A CN 113337627A CN 202110620005 A CN202110620005 A CN 202110620005A CN 113337627 A CN113337627 A CN 113337627A
Authority
CN
China
Prior art keywords
cas12a
lamp
vibrio parahaemolyticus
primer
crispr
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN202110620005.4A
Other languages
English (en)
Other versions
CN113337627B (zh
Inventor
王柳
陈雪雲
何开雨
徐霞红
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Zhejiang Academy of Agricultural Sciences
Original Assignee
Zhejiang Academy of Agricultural Sciences
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Zhejiang Academy of Agricultural Sciences filed Critical Zhejiang Academy of Agricultural Sciences
Priority to CN202110620005.4A priority Critical patent/CN113337627B/zh
Publication of CN113337627A publication Critical patent/CN113337627A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN113337627B publication Critical patent/CN113337627B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
    • C12Q1/689—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for bacteria
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明公开了一种基于CRISPR/Cas12a的免标记可视化检测副溶血弧菌基因的方法。本发明通过LAMP对副溶血弧菌的特征基因进行扩增，利用Cas12a和crRNA组装的复合物识别并结合LAMP扩增的特异产物上的特征序列以激活Cas12a的附属切割活性，从而对G四联体进行切割，使其无法与硫磺素T(ThT)结合并丧失增强荧光的能力，最终将副溶血弧菌的基因信息转换为可视的荧光变化。本发明实现了对副溶血弧菌基因的特异、免标记、可视化检测。

Description

基于CRISPR/Cas12a的免标记可视化检测副溶血弧菌基因的 方法
技术领域
本发明属于微生物检测领域，具体涉及了一种利用CRISPR/Cas12a切割G四联体并调节硫磺素T(ThT)的荧光发射而实现特异、免标记且可视地检测副溶血弧菌的方法。
背景技术
副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)是一种主要的食源性致病菌。人们食用被副溶血弧菌污染的食物后极可能会引起以腹痛、腹泻、恶心、呕吐、发热等为主要症状的急性肠胃炎。副溶血弧菌广泛存在于海水、海底沉积物以及鱼贝虾蟹等海产品中。目前，副溶血弧菌成为我国主要的食源性致病菌，且因副溶血弧菌污染而引起的食物中毒事件已在数量上超过沙门氏菌。特别是在一些沿海城市，由该菌引起的食物中毒事件占细菌性食物中毒总数的60％以上。因此，为了保证食品安全，准确、高效地检测副溶血弧菌也变得越来越重要。
食品中副溶血弧菌的常规检测方法是平板培养法，包括菌落计数和标准生化鉴定，一般需要2到3天对致病菌进行初步鉴定，额外需要长达一周的时间进一步确认致病菌的种类，检测周期长，工作量大。免疫学检测方法主要是基于抗原和抗体间的相互作用而实现的，相比于传统的平板培养分离鉴定法检测时间已经大幅度缩短，但抗原和抗体之间的结合强度及细菌抗原交叉反应常影响检测结果的灵敏度和准确性。基于生物遗传信息发展起来的核酸检测技术具有特异性强、灵敏度高等优点，如聚合酶链式反应(PCR)。但PCR需要精密的温控设备，不适用于现场检测。
环介导等温扩增(LAMP)不需要模板的热变性，在等温条件下即可实现目标序列的指数复制，仅简单的金属浴或水浴锅即可满足温控需求，避免对昂贵的仪器设备的依赖，具有省时、易操作、低成本的特点，且灵敏度极高。常规用于LAMP检测的方法主要包括实时荧光采集和凝胶电泳，前者需要精密的荧光采集装置，后者操作时间长，两者在现场检测领域都受到一定的限制。可视化检测法具有操作方便、结果直观等优点，在现场检测领域具有巨大的优势。LAMP体系中各成分(如焦磷酸根离子、镁离子、氢离子等)在反应前后发生较大幅度变化，常被用于构建可视化判断LAMP反应进程的方法，例如HNB法、钙黄绿素法、浊度法、pH染料法等。但引物设计、反应温度、缓冲溶液、酶等任一因素的非最佳条件都可能导致LAMP反应过程中非特异性核酸链延伸与积累，而上述方法无法排除非特异信号所产生的干扰，进而影响检测结果的准确性。
CRISPR(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)是一种存在于几乎所有古生菌和多数细菌中的抵御病毒入侵的一种获得性免疫方式，可用来对抗入侵的病毒及外源DNA。Cas12a是一种与CRISPR相关的DNA内切酶，在crRNA的引导下依赖PAM序列特异性识别双链DNA序列，形成三体复合物。与此同时，Cas12a的附属切割活性被激活，不加选择地切割体系中的所有单链DNA。CRISPR/Cas12a的这种特性已被成功应用于开发快速、低成本且高灵敏的核酸检测工具上，在核酸分子诊断领域具有重要的应用潜力。但是，CRISPR/Cas12a仅能检测pM甚至更高浓度的核酸序列，其灵敏度无法满足实际生产中副溶血弧菌的检测需求。利用LAMP的高灵敏度的特点，将其与CRISPR/Cas技术联用，能够很好的解决CRISPR自身灵敏度受限的问题，并排除LAMP的非特异信号的干扰，实现副溶血弧菌的特异检测。但是，当前利用CRISPR/Cas进行目标物检测时，主要依赖Cas12a对荧光/淬灭基团或纳米材料标记的单链DNA进行切割，检测成本较高。
G四联体是由富G序列形成的特定空间结构，当其与一些特定的荧光染料如酞菁染料、三苯甲烷、卟啉衍生物、结晶紫等结合后，能够很大程度地增强染料自身的荧光强度。其增强的原理是，荧光分子之间相互靠近后会发生自淬灭的现象，而G四联体形成的空间结构能够给染料分子提供一个疏水环境，防止他们相互靠近，导致荧光淬灭。当富G序列被切断时，无法形成四联体结构，其结合上述荧光染料的能力丧失，荧光增强效应消失。本申请将G四联体-硫磺素T(ThT)与CRISPR/Cas12a耦联，利用Cas12a的附属切割活性切割G四联体，从而抑制ThT的荧光发射，并通过荧光信号变化实现对副溶血弧菌可视检测。
发明内容
为了解决基于CRISPR/Cas12a的核酸检测依赖纳米材料或荧光标记的问题，本发明提供了一种利用CRISPR/Cas12a切割G-四联体，使其无法结合ThT而不能增强ThT的荧光发射，实现副溶血弧菌基因检测的方法。
本发明采用的技术方案包括以下步骤：
1)提取待测样品的基因组DNA；
2)表达并纯化Cas12a；
3)设计crRNA和LAMP引物；
4)LAMP扩增：以步骤1)提取的基因组DNA作为模板，在含有LAMP引物的LAMP体系中进行扩增，得到LAMP产物；
5)荧光可视检测：将含有LAMP产物、Cas12a、crRNA、硫磺素T(ThT)、富G序列和NEBuffer2.1缓冲液混匀后，孵育10～60min，通过荧光可视检测样品中是否含有副溶血弧菌基因。
所述步骤3)中设计LAMP引物具体为：针对副溶血弧菌的Tlh基因合成LAMP引物，所述LAMP引物包括内引物1、内引物2、外引物1、外引物2、环引物1和环引物2。
所述步骤3)中设计crRNA具体为：
根据LAMP的靶标序列以及PAM序列(TTTN)选定crRNA的识别序列为TGTTCTACACCAACACGTCGCAAA；
然后根据碱基互补配对的原则设计并合成对应的crRNA序列为：UAAUUUCUACUAAGUGUAGAUCGACGUGUUGGUGUAGAACA。
所述步骤4)中：
LAMP体系包括2μL模板DNA、1.6μM内引物1和内引物2、0.2μM外引物1和外引物2、0.4μM环引物1和环引物2、1.4mM dNTPs、8U Bst DNA Polymerase Large Fragment和1×NEBuffer2.1；
扩增条件为：65℃孵育60min。
所述步骤5)中：
LAMP扩增产物的体积为1-10μL，Cas12a的浓度为200nM-500nM，crRNA的浓度为300nM-750nM，富G序列的浓度为150nM-750nM，ThT浓度为8.0μM-25.0μM。
所述步骤5)中的孵育温度为35-37℃，缓冲条件包含10-100mM Na+或K+，pH 7.0-8.5；富G序列在该条件下形成G四联体结构。
所述步骤5)中：
当LAMP产物中含有副溶血弧菌的特异扩增基因时，Cas12a-crRNA与特征序列结合，进而激活Cas12a的附属切割活性，切割G四联体结构并使其无法增强ThT荧光，溶液不发射荧光；
当LAMP产物中不含有副溶血弧菌的特异扩增基因时，Cas12a的附属切割活性无法被激活，G四联体结构保持完整，溶液发射绿色荧光。
所述步骤2)具体为：将含有编码LbCas12a蛋白基因和氨苄抗性基因的质粒转化到大肠杆菌rosetta(DE3)感受态细胞中后，然后涂布在LB固体培养基上，于恒温培养箱中37℃过夜培养；长出菌落之后挑取单菌落转入LB液体培养基，于摇床上37℃、250rpm培养12-14h；
所述LB液体培养基中预先加入0.1mg/mL的氨苄。
将上述LB液体培养基中培养所得的菌液用重新配置且添加了0.1mg/mL氨苄的LB液体培养基稀释，其稀释比例为重新配置的LB液体培养基：菌液＝100:1，再将所得稀释后的菌液在摇床中以37℃、250rpm培养直至菌液的吸光值为0.6-0.8，实现大量扩培；然后向扩培后的菌液中添加IPTG诱导剂，所述诱导剂的添加量为每100mL菌液加入24μL 0.2g/mLIPTG诱导剂，再将添加了诱导剂的菌液在低温培养箱中以16℃、180rpm培养16h，诱导细菌表达LbCas12a蛋白。
将已表达LbCas12a蛋白的菌液以8000rpm离心6分钟，弃掉上清液；用Bindingbuffer(50mM Tris-HCl、1.5M NaCl)重悬沉淀；然后用超声波细胞破碎仪破碎30min，使蛋白从细胞中释放到重悬液中，之后在4℃下，以10000rpm离心15分钟，取上清液；
先用Ni柱除去上清液中的除目的蛋白外的杂蛋白，然后用Wash buffer(50mMTris-HCl、1.5M NaCl、30mM咪唑)洗去杂蛋白，再用Elution buffer(50mM Tris-HCl、1.5MNaCl、600mM咪唑)将目的蛋白Cas12a从Ni柱中洗脱下来，再用脱盐柱进行脱盐纯化，将蛋白液先挂在脱盐柱上，然后用脱盐液(20mM Tris-HCl、600mM NaCl、2mM DTT、10％甘油)将目的蛋白Cas12a洗脱下来并用离心管收集，得到纯化后的LbCas12a蛋白。
本发明的有益效果是：
本发明采用LAMP将副溶血弧菌的特征基因信号进行放大，利用Cas12a和crRNA组装的复合物识别LAMP特异产物上的特征序列以激活Cas12a的附属切割活性，从而对G四联体进行切割，使其无法与ThT结合并丧失增强荧光的能力，实现对副溶血弧菌的特异、免标记、可视化检测。
附图说明
图1为基于CRISPR/Cas12a的免标记可视化检测副溶血弧菌基因的示意图。图中A表示副溶血弧菌提取后经LAMP扩增，所得产物与Cas12a-crRNA结合形成三元复合物激活Cas12a的附属切割活性，将G四联体切割为小片段，加入ThT后无荧光发射。图中B表示从无副溶血弧菌的样本中提取DNA，经过LAMP扩增后无特异产物，无法与Cas12a-crRNA形成三元复合物，无法切割G四联体，加入ThT后发射强烈的荧光。
图2为LAMP扩增产物激活Cas12a附属切割活性并切割G四联体以可视化检测副溶血弧菌基因的灵敏度。NTC表示没有模板的对照。
图3为LAMP扩增产物激活Cas12a附属切割活性并切割G四联体以可视化检测副溶血弧菌基因的特异性。所选用于特异性验证的菌种包括副溶血弧菌ATCC 17802、鼠伤寒沙门氏菌CMCC(B)50115(Salm 50115)、不动杆菌DSM 25388(A.B 25388)、费格森埃希ATCC35469(E.fergusonii 35469)以及大肠杆菌ATCC 25922(E.Coli 25922)。NTC表示没有模板的对照。
图4为被不同浓度的副溶血弧菌污染的明虾样本经DNA提取后，采用LAMP扩增，产物利用Cas12a-crRNA结合G四联体-ThT荧光可视化检测的结果。NTC表示没有模板的对照。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明进一步说明。
本发明的实施过程具体如下：
1、LAMP引物及crRNA设计
针对副溶血弧菌的不耐热溶血素基因(thermolabile hemolysin gene，Tlh，GenBank编号M36437.1)合成了LAMP引物。根据LAMP的靶标序列以及PAM序列(TTTN)选定crRNA的识别序列为TGTTCTACACCAACACGTCGCAAA，根据碱基互补配对的原则设计并合成相应的crRNA序列为：UAAUUUCUACUAAGUGUAGAUCGACGUGUUGGUGUAGAACA
LAMP的靶标序列：
AGCTACTCGAAAGATGATCCAGCGACCGATTGGGAATGGGCAAAAAACGAAGATGGTAGCTACTTCACCATTGACGGCTACTGGTGGAGCTCCGTTTCATTTAAAAACATGTTCTACACCAACACGTCGCAAAACGTTATCCGTCAGCGTTGTGAAGCAACATTAGATTTGGCGAACGAGAACGCAGACATTACGTTCTTCGCCGCTGACAATCGCTTCTCATACAACC
LAMP内引物1：ATGTTTTTAAATGAAACGGAGCTCCGGCAAAAAACGAAGATGGT
LAMP的内引物2：ACGTCGCAAAACGTTATCCGGCGAAGAACGTAATGTCTG
LAMP的外引物1：AGCTACTCGAAAGATGATCC
LAMP的外引物2：GGTTGTATGAGAAGCGATTG
LAMP的环引物1：ACCAGTAGCCGTCAATG
LAMP的环引物2：TTAGATTTGGCGAACGAGA
用于形成G四联体的富G序列：GGGAAGGGAGGGATGGGA
2、Cas12a的表达与纯化
将Addgene上购买的含有编码LbCas12a蛋白基因和氨苄抗性基因的质粒转化到大肠杆菌rosetta(DE3)感受态细胞中，然后接种到LB固体培养基上，于恒温培养箱中37℃过夜培养；待LB固体培养基上长出菌落之后挑取单菌落转入LB液体培养基中，于摇床上37℃、250rpm培养12-14h得菌液；所述LB液体培养基中预先加入0.1mg/mL的氨苄。
将上述LB液体培养基中培养所得的菌液用重新配置且添加了0.1mg/mL氨苄的LB液体培养基稀释，其稀释比例为重新配置的LB液体培养基：菌液＝100:1，再将所得稀释后的菌液在摇床中以37℃、250rpm培养直至菌液的吸光值为0.6-0.8，实现大量扩培；然后向扩培后的菌液中添加IPTG诱导剂，所述诱导剂的添加量为每100mL菌液加入24μL 0.2g/mLIPTG诱导剂，再将添加了诱导剂的菌液在低温培养箱中以16℃、180rpm培养16h，诱导细菌表达LbCas12a蛋白。
将已表达LbCas12a蛋白的菌液以8000rpm离心6分钟，弃掉上清液；用Bindingbuffer(50mM Tris-HCl、1.5M NaCl)重悬沉淀；然后用超声波细胞破碎仪破碎30min，使蛋白从细胞中释放到重悬液中，之后在4℃下，以10000rpm离心15分钟，取上清液；
先用Ni柱除去上清液中的除目的蛋白外的杂蛋白，然后用Wash buffer(50mMTris-HCl、1.5M NaCl、30mM咪唑)洗去杂蛋白，再用Elution buffer(50mM Tris-HCl，1.5MNaCl、600mM咪唑)将目的蛋白Cas12a从Ni柱中洗脱下来，再用脱盐柱进行脱盐纯化，将蛋白液先挂在脱盐柱上，然后用脱盐液(20mM Tris-HCl、600mM NaCl、2mM DTT、10％甘油)将目的蛋白Cas12a洗脱下来并用离心管收集，得到纯化后的LbCas12a蛋白。
3、LAMP扩增
LAMP的扩增条件如下：LAMP反应总体积为12.5μL，其中包括2μL模板DNA、1.6μM内引物1和内引物2、0.2μM外引物1和外引物2、0.4μM环引物1和环引物2、1.4mM dNTPs、8U BstDNA Polymerase Large Fragment和1×NEBuffer2.1，65℃孵育60min。
4、CRISPR/Cas12a切割及G四联体-ThT荧光检测
20μL体系中包括1μL的LAMP扩增产物、300nM Cas12a、375nM crRNA、15μM ThT、600nM富G序列和1×NEBuffer2.1缓冲液，37℃孵育10～60min。
5、结果判断
样品中存在目标基因时，LAMP特异性扩增目标序列，进而激活Cas12a的附属切割活性，切割G四联体结构使其无法增强ThT荧光，溶液无荧光发射。而当样品中没有副溶血弧菌时，LAMP反应后无特异序列产生，Cas12a的附属切割活性无法被激活，G四联体结构完整，与ThT结合产生强烈的绿色荧光，整个反应过程如图1所示。
实施例1：灵敏度测试
利用市售的细菌基因组DNA提取试剂盒(北京百泰克生物技术有限公司)提取副溶血弧菌ATCC 17802的基因组DNA，通过微量紫外分光光度计(Thermo Fisher，美国)测其浓度，算出拷贝数。
将所述提取的副溶血弧菌基因组DNA用无菌水进行十倍梯度稀释，使其浓度为104，103，102，101拷贝/μL(copies/μL)。
将所述梯度稀释的副溶血弧菌基因组DNA作为模板，利用LAMP扩增：12.5μL的扩增体系中包括2μL副溶血弧菌DNA模板、1.6μM内引物1和内引物2、0.2μM外引物1和外引物2、0.4μM环引物1和环引物2、1.4mM dNTPs、8U Bst DNA Polymerase Large Fragment、1×NEBuffer2.1，65℃孵育60min得到LAMP产物。
取出1μL LAMP产物加入到20μL含300nM Cas12a、375nM crRNA、600nM富G序列、15μM ThT和1×NEBuffer2.1的缓冲液中，37℃孵育60min。结果如图2所示，当副溶血弧菌DNA浓度为2.03×102拷贝/反应时，样本无荧光。而当副溶血弧菌DNA浓度为2.03×101拷贝/反应或更低时，样本发射明显的荧光，表明可视化检测灵敏度为2.03×102拷贝/反应。
实施例2：特异性实验
利用市售的细菌基因组DNA提取试剂盒(北京百泰克生物技术有限公司)从副溶血弧菌ATCC 17802、鼠伤寒沙门氏菌CMCC(B)50115(Salmonella 50115)、不动杆菌DSM 25388(Acinetobacter 25388)、费格森埃希056(Escherichia ferguson 056)以及大肠杆菌ATCC25922(Escherichia coli 25922)中提取基因组DNA，通过微量紫外分光光度计(ThermoFisher，美国)测其浓度，算出拷贝数。
以上述五种细菌的DNA作为模板，分别以Tlh引物进行扩增得到五种扩增产物：12.5μL扩增体系包括2μL对应细菌的DNA模板，1.6μM内引物1和内引物2、0.2μM外引物1和外引物2、0.4μM环引物1和环引物2、1.4mM dNTPs、8U Bst DNA Polymerase Large Fragment、1×NEBuffer2.1、65℃孵育60min得到LAMP产物。
从五种LAMP扩增产物中分别取出1μL加入到20μL含300nM Cas12a、375nM crRNA、600nM富G序列、15μM ThT和1×NEBuffer2.1的缓冲液中，37℃孵育60min。在蓝光切胶仪下观察荧光变化。
结果如图3所示，当检测的样本为副溶血弧菌时，样本不发射荧光。而含其它菌的样本都发射明显的荧光，表明该方法具有良好的特异性。
实施例3：新鲜明虾中副溶血弧菌检测
副溶血弧菌保藏菌株在平板培养基上划线分离后挑取单一菌落转接至LB肉汤液体培养基，37℃培养6小时，用生理盐水进行10倍梯度稀释，根据平板计数算出稀释液中分别含6.1×105CFU/mL至6.1×100CFU/mL的副溶血弧菌。将无菌明虾浸入到稀释液中进行染菌，再在无菌环境下室温静置30分钟使副溶血弧菌紧密附着在虾表面。
以上述副溶血弧菌污染的明虾作为样本，利用市售的细菌基因组DNA提取试剂盒(北京百泰克生物技术有限公司)从中提取DNA。
将所述从污染的明虾中提取的DNA作为模板，以Tlh为靶标进行LAMP扩增：12.5μL扩增体系中包括2μL DNA模板、1.6μM内引物1和内引物2、0.2μM外引物1和外引物2、0.4μM环引物1和环引物2、1.4mM dNTPs、8U Bst DNA Polymerase Large Fragment、1×NEBuffer2.1、65℃孵育60min。
取出1μL LAMP产物加入到20μL含300nM Cas12a、375nM crRNA、600nM富G序列、15μM ThT的1×NEBuffer2.1的缓冲液中，37℃孵育60min。在蓝光切胶仪下观察荧光变化。
结果如图4所示，当用6.1×102CFU/g或更高浓度的副溶血弧菌污染虾时，样本无明显的荧光发射。而污染虾的副溶血弧菌浓度为6.1×101CFU/g或更低时，样本发射明显的绿色荧光。
序列表
<110> 浙江省农业科学院
<120> 基于CRISPR/Cas12a的免标记可视化检测副溶血弧菌基因的方法
<130> 2021.6.2
<160> 9
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
atgtttttaa atgaaacgga gctccggcaa aaaacgaaga tggt 44
<210> 2
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
acgtcgcaaa acgttatccg gcgaagaacg taatgtctg 39
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
agctactcga aagatgatcc 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
ggttgtatga gaagcgattg 20
<210> 5
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
accagtagcc gtcaatg 17
<210> 6
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
ttagatttgg cgaacgaga 19
<210> 7
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
gggaagggag ggatggga 18
<210> 8
<211> 229
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
agctactcga aagatgatcc agcgaccgat tgggaatggg caaaaaacga agatggtagc 60
tacttcacca ttgacggcta ctggtggagc tccgtttcat ttaaaaacat gttctacacc 120
aacacgtcgc aaaacgttat ccgtcagcgt tgtgaagcaa cattagattt ggcgaacgag 180
aacgcagaca ttacgttctt cgccgctgac aatcgcttct catacaacc 229
<210> 9
<211> 41
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
uaauuucuac uaaguguaga ucgacguguu gguguagaac a 41

Claims (7)

1.一种基于CRISPR/Cas12a的免标记可视化检测副溶血弧菌基因的方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)提取待测样品的基因组DNA；
2)表达并纯化Cas12a；
3)设计crRNA和LAMP引物；
4)LAMP扩增：以步骤1)提取的基因组DNA作为模板，在含有LAMP引物的LAMP体系中进行扩增，得到LAMP产物；
5)荧光可视检测：将含有LAMP产物、Cas12a、crRNA、硫磺素T、富G序列和NEBuffer2.1缓冲液混匀后，孵育10～60min，通过荧光可视检测样品中是否含有副溶血弧菌基因。
2.根据权利要求1所述的一种基于CRISPR/Cas12a的免标记可视化检测副溶血弧菌基因的方法，其特征在于，所述步骤3)中设计LAMP引物具体为：针对副溶血弧菌的Tlh基因合成LAMP引物，所述LAMP引物包括内引物1、内引物2、外引物1、外引物2、环引物1和环引物2。
3.根据权利要求1所述的一种基于CRISPR/Cas12a的免标记可视化检测副溶血弧菌基因的方法，其特征在于，所述步骤3)中设计crRNA具体为：
根据LAMP的靶标序列以及PAM序列选定crRNA的识别序列为TGTTCTACACCAACACGTCGCAAA；
然后根据碱基互补配对的原则设计并合成对应的crRNA序列为：UAAUUUCUACUAAGUGUAGAUCGACGUGUUGGUGUAGAACA。
4.根据权利要求1所述的一种基于CRISPR/Cas12a的免标记可视化检测副溶血弧菌基因的方法，其特征在于，所述步骤4)中：
LAMP体系包括2μL模板DNA、1.6μM内引物1和内引物2、0.2μM外引物1和外引物2、0.4μM环引物1和环引物2、1.4mM dNTPs、8U Bst DNA Polymerase Large Fragment和1×NEBuffer2.1；
扩增条件为：65℃孵育60min。
5.根据权利要求1所述的一种基于CRISPR/Cas12a的免标记可视化检测副溶血弧菌基因的方法，其特征在于，所述步骤5)中：
LAMP扩增产物的体积为1-10μL，Cas12a的浓度为200nM-500nM，crRNA的浓度为300nM-750nM，富G序列的浓度为150nM-750nM，ThT浓度为8.0μM-25.0μM。
6.根据权利要求1所述的一种基于CRISPR/Cas12a的免标记可视化检测副溶血弧菌基因的方法，其特征在于，所述步骤5)中的孵育温度为35-37℃，缓冲条件包含10-100mM Na+或K+，pH 7.0-8.5；富G序列在该条件下形成G四联体结构。
7.根据权利要求1所述的一种基于CRISPR/Cas12a的免标记可视化检测副溶血弧菌基因的方法，其特征在于，所述步骤5)中：
当LAMP产物中含有副溶血弧菌的特异扩增基因时，Cas12a-crRNA与特征序列结合，进而激活Cas12a的附属切割活性，切割G四联体结构并使其无法增强ThT荧光，溶液不发射荧光；
当LAMP产物中不含有副溶血弧菌的特异扩增基因时，Cas12a的附属切割活性无法被激活，G四联体结构保持完整，溶液发射绿色荧光。
CN202110620005.4A 2021-06-03 2021-06-03 基于CRISPR/Cas12a的免标记可视化检测副溶血弧菌基因的方法 Active CN113337627B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202110620005.4A CN113337627B (zh) 2021-06-03 2021-06-03 基于CRISPR/Cas12a的免标记可视化检测副溶血弧菌基因的方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202110620005.4A CN113337627B (zh) 2021-06-03 2021-06-03 基于CRISPR/Cas12a的免标记可视化检测副溶血弧菌基因的方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN113337627A true CN113337627A (zh) 2021-09-03
CN113337627B CN113337627B (zh) 2022-08-05

Family

ID=77473334

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202110620005.4A Active CN113337627B (zh) 2021-06-03 2021-06-03 基于CRISPR/Cas12a的免标记可视化检测副溶血弧菌基因的方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN113337627B (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113817854A (zh) * 2021-09-28 2021-12-21 浙江省农业科学院 一种单标记ssDNA探针可视化检测沙门氏菌基因的方法

Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101153330A (zh) * 2007-09-21 2008-04-02 珠海市疾病预防控制中心 副溶血性弧菌检测用引物、检测方法、检测试剂盒
CN101178363A (zh) * 2007-10-19 2008-05-14 华南理工大学 副溶血弧菌恒温基因扩增快速检测试剂盒及方法
CN109097446A (zh) * 2018-08-02 2018-12-28 福州大学 一种检测miRNA的方法及试剂盒
CN109837356A (zh) * 2019-03-14 2019-06-04 中山大学肿瘤防治中心（中山大学附属肿瘤医院、中山大学肿瘤研究所） 基于CRISPR-Cas12a和G四链体-血红素的HBV的检测方法及应用
CN112080549A (zh) * 2020-09-17 2020-12-15 中国科学院精密测量科学与技术创新研究院 一种新型的核酸检测方法
CN112816682A (zh) * 2021-01-28 2021-05-18 浙江省农业科学院 三螺旋dna分子开关探针及其在ota比色快速检测中的应用
CN112831580A (zh) * 2021-02-04 2021-05-25 江苏大学 一种用于检测副溶血性弧菌dna的反应体系、试剂盒及其应用

Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101153330A (zh) * 2007-09-21 2008-04-02 珠海市疾病预防控制中心 副溶血性弧菌检测用引物、检测方法、检测试剂盒
CN101178363A (zh) * 2007-10-19 2008-05-14 华南理工大学 副溶血弧菌恒温基因扩增快速检测试剂盒及方法
CN109097446A (zh) * 2018-08-02 2018-12-28 福州大学 一种检测miRNA的方法及试剂盒
CN109837356A (zh) * 2019-03-14 2019-06-04 中山大学肿瘤防治中心（中山大学附属肿瘤医院、中山大学肿瘤研究所） 基于CRISPR-Cas12a和G四链体-血红素的HBV的检测方法及应用
CN112080549A (zh) * 2020-09-17 2020-12-15 中国科学院精密测量科学与技术创新研究院 一种新型的核酸检测方法
CN112816682A (zh) * 2021-01-28 2021-05-18 浙江省农业科学院 三螺旋dna分子开关探针及其在ota比色快速检测中的应用
CN112831580A (zh) * 2021-02-04 2021-05-25 江苏大学 一种用于检测副溶血性弧菌dna的反应体系、试剂盒及其应用

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
JAMES P. BROUGHTON等: "CRISPR–Cas12-based detection of SARS-CoV-2", 《NATURE BIOTECHNOLOGY》 *
SHAOCHUN JING等: "Dimeric G‑Quadruplex: An Effective Nucleic Acid Scaffold for Lighting Up Thioflavin T", 《ANALYTICAL CHEMISTRY》 *
XUEYUN CHEN等: "Label-Free Colorimetric Method for Detection of Vibrio parahaemolyticus by Trimming the G‑Quadruplex DNAzyme with CRISPR/Cas12a", 《ANAL. CHEM.》 *
YING LI等: "CRISPR-Cas12a trans-cleaves DNA G-quadruplexes", 《CHEM.COMMUN.》 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113817854A (zh) * 2021-09-28 2021-12-21 浙江省农业科学院 一种单标记ssDNA探针可视化检测沙门氏菌基因的方法
CN113817854B (zh) * 2021-09-28 2024-02-20 浙江省农业科学院 一种单标记ssDNA探针可视化检测沙门氏菌基因的方法

Also Published As

Publication number Publication date
CN113337627B (zh) 2022-08-05

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP0168933B1 (en) Detection and/or identification of microorganisms in a test sample using bioluminescence or other exogenous genetically-introduced marker
US4861709A (en) Detection and/or identification of microorganisms in a test sample using bioluminescence or other exogenous genetically-introduced marker
CN111321234B (zh) 一种基于CRISPR-Cas13a系统检测微生物的方法及应用
Gao et al. The diagnostic tools for viable but nonculturable pathogens in the food industry: Current status and future prospects
Garrido‐Maestu et al. Combination of immunomagnetic separation and real‐time recombinase polymerase amplification (IMS‐qRPA) for specific detection of Listeria monocytogenes in smoked salmon samples
US4348477A (en) Method for preparing a recombinant DNA phage
CN112159854B (zh) 一种大肠杆菌O157:H7的CRISPR/Cas12a检测用引物组合物和检测方法
JP2000513933A (ja) 平均化ｄｎａライブラリーの作製および使用
CN107190063B (zh) 一种等温快速扩增检测食品中致病菌的方法
JP2016521996A (ja) ファージベースの細菌検出アッセイ
JP3229884B2 (ja) 細菌を検出する方法及びキット
Tolker-Nielsen et al. Visualization of specific gene expression in individual Salmonella typhimurium cells by in situ PCR
US20160047826A1 (en) Compositions and methods for detection of a target in a molecular assay using ph changes
CN113337627B (zh) 基于CRISPR/Cas12a的免标记可视化检测副溶血弧菌基因的方法
Sails et al. A reverse transcriptase polymerase chain reaction assay for the detection of thermophilicCampylobacterspp.
CN112680536A (zh) 一种基于crispr-cas12f1检测病原微生物RNA的方法
CN114207154A (zh) 用于检测一种或多种病原体的选择性富集肉汤
US20080014607A1 (en) Atp-metry based on intracellular adenyl nucleotides for detecting and counting cells, use and implementing method for determining bacteria in particular devoid of atp
CN113817854B (zh) 一种单标记ssDNA探针可视化检测沙门氏菌基因的方法
US9624551B2 (en) Catalytic nucleic acid probes as microbial indicators
JP5006607B2 (ja) 核酸増幅反応における阻害を回避する方法
KR100459107B1 (ko) 녹색형광단백질 유전자를 이용한 삭시톡신 검출용바이오센서
Azhari et al. Vibrio cholerae Test on Fishery Products at Cirebon Test and Application of Fishery Products Technical Unit Agency, West Java, Indonesia
CN114262707B (zh) 用于检测空肠弯曲杆菌基因的sgRNA、CRISPR/Cas12a体系、试剂盒、检测方法和应用
JP4674073B2 (ja) 核酸増幅反応における阻害を回避する方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant