CN101846648A - 石墨烯量子点修饰的电化学生物传感器及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种石墨烯量子点修饰的电化学生物传感器及其制备方法。该电化学生物传感器为三电极体系传感器，所述的三电极中的对电极是铂电极，参比电极是饱和甘汞电极，工作电极为表面包覆有1～4层石墨烯量子点的玻碳电极。本发明的石墨烯量子点修饰的电化学生物传感器能成功识别最低浓度为50nM的目标单链DNA的电化学生物传感器，当有目标单链DNA时，取等量互补单链DNA与其形成双链DNA，其电化学信号与仅有互补单链DNA有明显差别，便能起到快速检测目标单链DNA的作用。而且该段单链DNA不需巯基或荧光基团修饰，应用方便。本发明所检测的单链DNA是一段任意序列的核酸，理论上，该发明适用于不能形成内部双链的任意单链核酸序列，因此，将其置换成跟疾病相关的特异序列基因，即可用于疾病相关的基因检测，应用前景广泛。

Description

石墨烯量子点修饰的电化学生物传感器及其制备方法
技术领域
本发明涉及一种电化学生物传感器及其制备方法，特别是一种石墨烯量子点修饰的电化学生物传感器及其制备方法。
发明背景
DNA作为所有生物的基本遗传物质，其检测在医学诊断、生物工程及环保等领域都起着至关重要的作用。DNA电化学生物传感器作为一种新型检测手段，所需仪器简单，检测快速而灵敏，故发展迅速，迄今为止已有大量文献报道。
电化学生物传感器是一类以电极作为信号转换器，以电位或电流加以测量的生物传感器。电化学体系借助电极实现电能的输入或输出，从而获得电极表面修饰物质的电信号，常用的为三电极体系。三电极体系包括工作电极、辅助电极(也称对电极)和参比电极，电流流经工作电极和对电极。工作电极所测得的电位是相对于参比电极而言。电化学方法作为一种分析检测方法，具有设备低廉、灵敏度高、简便快捷等优点。其中，循环伏安法是最常用的一种方法，它在解释电子传递机理方面有独特的优势；而差分脉冲伏安法则拥有更高的灵敏度，因此常用作高灵敏度的检测。
近些年来，纳米科技的迅速发展为发展新型高灵敏度、高稳定性、低成本生物传感器提供了新的途径。基于金纳米粒子，碳纳米管，量子点等纳米材料的DNA生物传感器已成功构建。而石墨烯作为纳米科技领域的一颗闪亮新星，自2004年由英国科学家Geim首次报道以来，短时间内便成为国内外研究热点。石墨烯是目前发现的唯一存在的二维自由态原子晶体，具有很多优于其它纳米材料的奇特电子及机械性能。这些性质使得它在生物传感器领域有极大的应用前景，已有多篇研究石墨烯作为膜材料的电化学生物传感器的文章发表，但针对石墨烯量子点的DNA生物传感器还未见报道。
发明内容
本发明的目的之一在于提供一种石墨烯量子点修饰的电化学生物传感器，该传感器用于单链DNA的检测。
本发明的目的之二在于提供该传感器的制备方法
为达到上述目的，本发明采用如下机理：石墨烯表面可以吸附单链DNA碱基的苯环状结构，使单链DNA平铺在石墨烯表面，而双链DNA的碱基由于层层堆积形成牢固的双螺旋结构，所以无法结合到石墨烯表面，造成石墨烯对单双链DNA的结合能力不同，表现为石墨烯对单双链DNA具有吸附性差异。
根据上述机理，本发明采用如下技术方案：
一种石墨烯量子点修饰的电化学生物传感器，为三电极体系传感器，其特征在于所述的三电极中的对电极是铂电极，参比电极是饱和甘汞电极，工作电极为表面包覆有1～4层石墨烯量子点的玻碳电极。
一种制备上述的石墨烯量子点修饰的电化学生物传感器的方法，其特征在于该方法的具体步骤为：将浓度为15mg/L的石墨烯量子点的水溶液10μL均匀涂覆至经表面处理的裸玻碳电极的表面，并用Eppendorf管覆盖2小时，使溶剂缓慢挥发，从而形成均一的覆盖层，涂覆层数为1～4层；然后在室温条件下自然干燥，即得到石墨烯量子点修饰的玻碳电极，将该玻碳电极与铂电极和饱和甘汞电极一起形成三电极体系电化学生物传感器。
本发明第一次将石墨烯量子点用于修饰玻碳电极表面，观察电化学探针K3[Fe(CN)6]/K4[Fe(CN)6]在电极表面的电子传递特性，研究Tris-HCl缓冲溶液的不同pH值及石墨烯量子点的层层吸附对电信号的影响，同时观察在单链DNA和双链DNA分别存在的情况下，电极表面电化学响应的不同。结果证明，石墨烯量子点增强了玻碳电极表面的电子传递，并且当Tris-HCl缓冲溶液pH值为6、层层吸附上两层石墨烯量子点时电化学信号达到最大值。该电化学体系能有效识别浓度低至50nM的目标单链DNA。
本发明构建了一种检测无修饰DNA的新型电化学传感器，将石墨烯量子点应用于无修饰DNA的电化学检测，取得了满意的结果。同样的原理还可推广到其它物质的检测，应用前景广泛。
附图说明
图1为在10mM Tris-HCl和5mM K3[Fe(CN)6]/K4[Fe(CN)6]溶液中，玻碳电极(GC)和石墨烯量子点修饰过的玻碳电极(GQD-GC)的循环伏安曲线。
图2为在10mM Tris-HCl和5mM K3[Fe(CN)6]/K4[Fe(CN)6]溶液中，石墨烯量子点修饰过的玻碳电极从pH值4.0至9.0的差分脉冲伏安曲线。
图3为在10mM Tris-HCl和5mM K3[Fe(CN)6]/K4[Fe(CN)6]溶液中，从1到4层石墨烯量子点修饰过的玻碳电极的差分脉冲伏安曲线。
图4为在10mM Tris-HCl和5mM K3[Fe(CN)6]/K4[Fe(CN)6]溶液中，不同浓度单链DNA(ssDNA)存在下石墨烯量子点修饰过的玻碳电极的差分脉冲伏安曲线。
图5为在10mM Tris-HCl和5mM K3[Fe(CN)6]/K4[Fe(CN)6]溶液中，双链DNA(dsDNA)存在下石墨烯量子点修饰过的玻碳电极的差分脉冲伏安曲线。
图6为在10mM Tris-HCl和5mM K3[Fe(CN)6]/K4[Fe(CN)6]溶液中，单链DNA(a)和双链DNA(b)存在下的裸玻碳电极的差分脉冲伏安曲线。
具体实施方式
实施例一：玻碳电极的修饰
将玻碳电极先在粗刚玉砂纸(400目)上打磨，然后再在细刚玉砂纸(1000目)上打磨，最后在含有氧化铝(粒度为0.05μm)砂浆的丝绸上抛光，再用乙醇、水分别超声清洗5min，即得到表面处理干净的裸玻碳电极。将浓度为15mg L-1的石墨烯量子点水溶液10μL滴加至处理好的电极表面，在最初的两个小时内，电极表面用Eppendorf管盖着，使溶液缓慢挥发，从而形成均一的覆盖层，然后在室温条件下自然干燥，即得到石墨烯量子点修饰的玻碳电极，将其保存在4℃的冰箱中备用。
本发明所用的氧化石墨烯根据Hemmers法由石墨粉合成，后经水热法切割成量子点大小，具体制备方法参见文献(Pan，D.Y.，Zhang，J.C.，Li，Z.，Wu，M.H.，Adv.Mater.，2010，22，734-738)。
实施例二：石墨烯量子点在电极表面的电子传递作用
将表面处理干净的裸玻碳电极和本发明制备的石墨烯量子点修饰的玻碳电极，在CHI660c电化学工作站上分别测定它们在含K3[Fe(CN)6]/K4[Fe(CN)6]探针的电解缓冲液中循环伏安信号的大小。实验结果参见图1，石墨烯量子点修饰的电极电信号明显大于裸玻碳电极。由此可知石墨烯量子点确实是一种理想的电极表面膜材料。
实施例三：溶液不同的pH值对电化学信号的影响
采用差分伏安脉冲法，将石墨烯量子点修饰的玻碳电极分别浸入含单链DNA或双链DNA的缓冲溶液(10mM Tris-HCl，1mM EDTA，0.1M NaCl，pH为4～9)中各1小时，测量电信号。其中单链DNA1链序列：5’-TCT CTC AGT CCG TGG TAG GGC AGG TTG GGG TGA CT-3’，2链为1链的互补序列：5’-AG TCA CCC CAA CCT GCC CTA CCA CGG ACT GAG AGA-3’。结果参见图2，当溶液pH值为4或5时其电信号差别不大，而pH值为6时电信号有较大增加，pH7至pH9其电信号又有明显降低，可见溶液在pH6时石墨烯量子点修饰的电极能获得最大电信号，pH6为最优pH值。对于造成这一结果的机理，是由于石墨烯量子点在不同pH时其表面所带电荷有所不同，在pH6时尤其有利于电化学探针在电极表面的电子传递。
实施例四：石墨烯量子点的层数对电化学信号的影响
采用差分伏安脉冲法，将石墨烯量子点的修饰层数为1～4层的玻碳电极分别浸入含单链DNA或双链DNA的缓冲溶液(10mM Tris-HCl，1mM EDTA，0.1M NaCl，pH为6)中各1小时，测量电信号。其中单链DNA1链序列：5’-TCT CTC AGT CCG TGG TAG GGC AGG TTGGGG TGA CT-3’，2链为1链的互补序列：5’-AG TCACCC CAACCT GCC CTACCACGGACT GAG AGA-3’。结果参见图3，在修饰2层时电信号有明显增加，而当修饰更多层时，电信号又降低至只修饰1层时的大小。造成这一结果的原因可能是电极表面覆盖过多石墨烯量子点不仅不能帮助电子传递，反而会起到空间上的阻碍作用。
实施例五：单链DNA和双链DNA存在下的电化学响应
采用差分伏安脉冲法，把石墨烯量子点的修饰层数为2层的玻碳电极浸入单链DNA溶液的缓冲溶液(10mM Tris-HCl，1mM EDTA，0.1M NaCl，pH为6)中1小时后，测量差分脉冲伏安信号，发现电信号较浸入单链DNA溶液之前有明显的降低。并且随着DNA浓度的不断增加，电信号不断下降，结果参见图4，当单链DNA浓度最低为50nM时就能明显检测出电信号变化。而当浓度为50nM目标单链DNA存在时，其与相同浓度的等量互补单链DNA形成双链，再该玻碳电极浸入双链DNA溶液(10mM Tris-HCl，1mM EDTA，0.1M NaCl，pH为6)中1小时，发现电信号几乎不变，结果参见图5。从文献中得知，石墨烯量子点能够共价结合单链DNA，而不能结合双链DNA，所以当石墨烯量子点修饰的玻碳电极浸入单链DNA溶液中，单链DNA会通过共价结合石墨烯量子点，从而覆盖在玻碳电极表面，阻碍了电化学探针在电极表面的电子传递，导致电信号降低。而双链DNA没有这一特性，无法结合石墨烯量子点，也就不能阻碍电化学探针在电极表面的电子传递，所以对电信号没有影响。
将未修饰石墨烯的裸玻碳电极分别浸入单链DNA溶液和双链DNA溶液的缓冲溶液(10mMTris-HCl，1mM EDTA，0.1M NaCl，pH为6)做了对照实验，结果参见图6，其中单链DNA和双链DNA浓度均为50nM，我们可以看到不论单链DNA还是双链DNA存在，均造成电信号明显降低，因而不能区分出单链DNA与双链DNA。这是因为裸玻碳电极表面能够大量非特异性地吸附DNA链，对于单双链DNA没有特异选择性。这个实验验证了石墨烯量子点对检测单链DNA起着至关重要的作用，裸玻碳电极是无法检测无修饰DNA的。
本发明的石墨烯量子点修饰的电化学生物传感器能成功识别最低浓度为50nM的目标单链DNA的电化学生物传感器，当有目标单链DNA时，取等量互补单链DNA与其形成双链DNA，其电化学信号与仅有互补单链DNA有明显差别，便能起到快速检测目标单链DNA的作用。而且该段单链DNA不需巯基或荧光基团修饰，应用方便。本发明所检测的单链DNA是一段任意序列的核酸，理论上，该发明适用于不能形成内部双链的任意单链核酸序列，因此，将其置换成跟疾病相关的特异序列基因，即可用于疾病相关的基因检测，应用前景广泛。

Claims (2)

1.一种石墨烯量子点修饰的电化学生物传感器，为三电极体系传感器，其特征在于所述的三电极中的对电极是铂电极，参比电极是饱和甘汞电极，工作电极为表面包覆有1～4层石墨烯量子点的玻碳电极。
2.一种制备根据权利要求1所述的石墨烯量子点修饰的电化学生物传感器的方法，其特征在于该方法的具体步骤为：将浓度为15mg/L的石墨烯量子点的水溶液均匀涂覆至经表面处理的裸玻碳电极的表面，并用Eppendorf管覆盖2小时，使溶剂缓慢挥发，从而形成均一的覆盖层，涂覆层数为1～4层；然后在室温条件下自然干燥，即得到石墨烯量子点修饰的玻碳电极，将该玻碳电极与铂电极和饱和甘汞电极一起形成三电极体系电化学生物传感器。
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