CN110208348B - 一种以Nafion为引发剂通过电化学介导的原子转移自由基聚合反应的肺癌检测盒 - Google Patents

一种以Nafion为引发剂通过电化学介导的原子转移自由基聚合反应的肺癌检测盒 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种以Nafion为引发剂通过电化学介导的原子转移自由基聚合反应的肺癌检测盒，包括金电极、PNA溶液、[Fe(CN)6)]3‑/4‑溶液、MCH溶液、ZrOCl2溶液、Nafion溶液、eATRP混合液、LiClO4溶液。本发明首先将PNA探针通过Au‑S键固定在金电极表面，然后将电极浸泡在MCH中封闭剩余的活性位点，其次在电极片上滴加tDNA的溶液与PNA杂交形成PNA/DNA异型双链。再将杂交后的电极浸泡在ZrClO4溶液中形成PNA/MCH/tDNA/Zr4+活性探针，引发剂Nafion上的磺酸基团与Zr4+结合，将Nafion连接到该探针上。最后，以FMMA为单体，能通过eATRP反应与上述探针配位连接，得到聚合物链。本发明方法对CYFRA21‑1 DNA的检测具有较高灵敏度、选择性、抗干扰性以及准确性。

Description

一种以Nafion为引发剂通过电化学介导的原子转移自由基聚 合反应的肺癌检测盒
技术领域
本发明涉及一种以Nafion为引发剂，通过电化学介导的原子转移自由基聚合反应的肺癌检测盒，属于生物检测技术领域。
背景技术
肺癌是世界上发病率最高的恶性肿瘤之一，其发病率和死亡率大致相同。按生物学特征分为非小细胞肺癌(NSCLC)(包括鳞状细胞癌、腺癌、大细胞癌)和小细胞肺癌(SCLC)。前者通常通过化疗和放疗来治疗，而占肺癌的绝大部分的后者是通过手术来治疗的。癌症经确诊后，患者的5年生存率只有15％，所以早期阶段筛查是非常关键的。在体内发生癌变的情况下，肿瘤组织和体液中的某些分子，如蛋白质、核酸或小分子的水平发生了变化，经过筛选其中一些可以作为肿瘤标记物。CYFRA21-1细胞角蛋白片段被认为是诊断非小细胞肺癌最重要的生物标志物，当肿瘤细胞发生溶解或坏死时便将细胞角质蛋白释放入体液中，在血液中的升高多见于NSCLC，目前被认为是检测肺鳞癌的首选。Mei Chen等已利用CYFRA21-1细胞角质蛋白的部分DNA片段(5'-CGCCCCTGACACCATTCCTCCCTTC-3')实现了对CYFRA21-1的检测(Three-dimensional electrochemical DNA biosensor based on 3Dgraphene-Ag nanoparticles for sensitive detection of CYFRA21-1 in non-smallcell lung cancer)。
电化学DNA生物传感器具有特异性和敏感性高、响应速度快、成本低等优点，已成功应用于低分子水平生物标志物的超灵敏检测。为了进一步提高生物传感器的灵敏度，采用了不同类型的聚合反应放大检测DNA地信号，如原子转移自由基聚合(ATRP)、光聚合、可逆加成-碎裂链转移聚合、点击化学。ATRP是个可靠稳定的反应能应用于实验室和工厂，它提供了一种有效的方法来制备分子量可控和结构良好的结构。与其它ATRP方法相比，电化学介导的ATRP(eATRP)能够实时监测聚合反应过程。因此，迫切需要建立一种能检测痕量目标DNA(tDNA)的eATRP扩增策略。
发明内容
为提高现有信号放大方法的灵敏度、降低现有方法的检测限，本发明的目的是提供一种以Nafion为引发剂，通过电化学介导的原子转移自由基聚合反应的肺癌检测盒。
为了实现上述目的，本发明的技术方案是：
一种以Nafion为引发剂通过电化学介导的原子转移自由基聚合反应的肺癌检测盒，包括金电极、PNA溶液、[Fe(CN)6)]3-/4-溶液、MCH溶液、ZrOCl2溶液、Nafion溶液、eATRP混合液、LiClO4溶液。
PNA溶液的浓度为0.5μM，[Fe(CN)6)]3-/4-溶液浓度为5mM，MCH溶液浓度为2mM，ZrOCl2溶液浓度为5nM，Nafion溶液为
Figure BDA0002114899640000021
117溶液，LiClO4溶液浓度为0.1M。
eATRP混合液的制备方法为：将1.8mL DMF、10mM配合物CuIIBr/Me6TREN溶液0.1mL、10mM FMMA溶液0.1mL、1.0M KBr溶液1mL、0.1M KPF6溶液7mL混匀，得到eATRP混合液。
所述的检测盒，还包括10％(v/v)乙醇溶液、PBS、超纯水。
金电极的预处理为：
①将金电极抛光至镜面状，分别使用无水乙醇和超纯水进行超声波清洗；
②将步骤①的金电极浸泡在“水虎鱼”溶液中15-20min，取出并用超纯水冲洗；
③将步骤②的金电极置于0.5M H2SO4溶液中用循环伏安法进行扫描处理，直至获得重合的循环伏安图；
④用超纯水冲洗金电极，氮气吹干。
“水虎鱼”溶液的制备方法为：将30％(v/v)的过氧化氢溶液和98％(w/v)硫酸溶液按照体积比为1：3混合，即得；MCH溶液的制备方法为：量取适量MCH用60％(v/v)乙醇溶液稀释至MCH终浓度为2mM。
循环伏安法处理的电位范围为-0.3-1.5V，扫描速率为0.1Vs-1。
PNA的序列为5’-SH-(CH2)11-(O linker)3-GAAGGGAGGAATGGTGTCAGGGGCG-3’。
[Fe(CN)6)]3-/4-溶液的制备方法为：
①量取0.1646g的K3[Fe(CN)6]和0.2112g的K4[Fe(CN)6]·3H2O分别加入50mL的容量瓶中；
②量取两份0.5055g的KNO3分别置于步骤①的容量瓶中，并分别加水定容至50mL；
③分别量取步骤②的两种溶液各10mL，混合，得到浓度为5mM的[Fe(CN)6)]3-/4-溶液，常温避光保存备用。
一种利用上述检测盒的检测方法，包括以下步骤：
(1)PNA的修饰
①吸取5μL的PNA溶液滴加至金电极表面，在37℃下反应1.5h，用超纯水冲洗；
②将金电极放入[Fe(CN)6)]3-/4-溶液中，用电化学阻抗法测量修饰之后金电极的电阻；
(2)MCH的修饰
①将修饰过PNA的金电极浸泡在300μL的MCH溶液中，在37℃下反应30min，用60％(v/v)的乙醇溶液和超纯水冲洗；
②将金电极放入[Fe(CN)6)]3-/4-溶液中，用电化学阻抗法测量修饰之后金电极的电阻；
(3)目标DNA(tDNA)的修饰
①吸取10μL的检测样品滴加至MCH修饰后的金电极表面，在37℃下反应1.5h，用PBS冲洗；
②将金电极放入[Fe(CN)6)]3-/4-溶液中，用电化学阻抗法测量修饰之后金电极的电阻；
(4)Zr4+的修饰
①将金电极浸泡在300μL的ZrOCl2溶液，在37℃下反应15min，用10％(v/v)乙醇溶液和超纯水冲洗；
②将金电极放入[Fe(CN)6)]3-/4-溶液中，用电化学阻抗法测量修饰之后金电极的电阻；
(5)Nafion的修饰
①量取5μL的Nafion溶液滴加至金电极表面，在37℃下反应15min，用超纯水冲洗；
②将金电极放入[Fe(CN)6)]3-/4-溶液中，用电化学阻抗法测量修饰之后金电极的电阻；
(6)eATRP反应
①将金电极浸入eATRP混合溶液中，在37℃下反应40min，用DMF和超纯水冲洗；
②将金电极浸入LiClO4溶液中，用方波伏安法记录电化学信号。
本发明检测方法的原理示意图如图1所示。
本发明首次报道了以Nafion为引发剂的eATRP扩增技术在超敏检测CYFRA21-1中的应用。首先，肽核酸(PNA)探针通过Au-S键固定在金电极表面，再将电极浸泡在6-巯基-1-己醇(MCH)中封闭剩余的活性位点，其次在电极片上滴加tDNA的溶液与PNA杂交形成PNA/DNA异型双链。然后，再将杂交后的电极浸泡在ZrClO4溶液中形成PNA/MCH/tDNA/Zr4+活性探针，引发剂Nafion上的磺酸基团与Zr4+结合，将Nafion连接到该探针上。最后，以二茂铁甲醇异丁烯酸酯(FMMA)为单体，能通过eATRP反应与PNA/MCH/DNA/Zr4+/Nafion探针配位连接，得到聚合物链。因此，将eATRP聚合作为信号放大策略并使用Nafion作为大引发剂，达到了很好的放大效果，在超灵敏检测低分子水平DNA片段有很大的潜力。
本发明的有益效果：
1、相对于传统的ATRP引发剂，Nafion有更多的反应位点，并且在水相溶液中较稳定。能够结合更多单体，能有效提高ATRP反应的灵敏度。
2、使用电化学介导的原子转移自由基聚合作为信号放大策略，操作简单，实验周期短。灵敏度得到有效提高的同时，稳定性和重现性也有提高。
3、在ATRP反应后，大量的FMMA单体聚集在金电极表面，经方波伏安法(SWV)在三电极体系中扫描反应后的电极，成功实现了对肺癌生物标志物CYFRA21-1准确测定。结果表明，在最佳实验条件下，0.1fM到10pM的浓度范围内，SWV的电流响应值与tDNA浓度的对数值呈线性关系，线性方程为I(μA)＝10.6594+2.10869log[CtDNA/pM](R2＝0.997)，检出限低至0.0642fM。采用本发明的方法对相同浓度的一碱基错配(SBM)、三碱基错配(TBM)、全错配(Control)的DNA进行检测，所测得的电流强度分别是同浓度tDNA产生信号强度的27.97％、21.24％、13.38％，与空白背景信号基本相当，说明本发明方法具有很高的选择性。此外，采用本发明方法检测浓度分别是1pM、0.01pM、0.1fM含5％正常人血清(NHS)的tDNA信号，响应值分别为95.90％、95.66％、96.74％。综上所述，本发明方法对tDNA的检测具有较高灵敏度、选择性、抗干扰性以及准确性，在实际临床监测中具有巨大的应用价值。
附图说明
图1为本发明检测方法的原理示意图。
图2为反应过程的阻抗图。图中，a为裸电极的电阻，b为修饰PNA后电极的电阻，c为修饰MCH后电极的电阻，d为修饰tDNA后电极的电阻，e为修饰Zr4+后电极的电阻，f为修饰Nafion后电极的电阻，g为修饰FMMA后电极的电阻。
图3为可行性实验的结果图。
图4为Nafion反应时间的优化。
图5为eATRP反应时间优化的CV图。图中，箭头指向代表随着时间延长电流值逐渐增加。
图6为eATRP反应时间优化的曲线图。
图7为不同浓度的tDNA测量得到SWV图。
图8为不同浓度的tDNA和对应电流值的关系图。
图9为选择性实验的结果图。
图10为抗干扰性实验的结果图。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。
PNA购自韩国Panagene公司。
PNA的序列为：
5’-SH-(CH2)11-(O linker)3-GAAGGGAGGAATGGTGTCAGGGGCG-3’(SEQ ID NO.1)。
tDNA的序列(CYFRA21-1部分序列)为：5’-CGCCCCTGACACCATTCCTCCCTTC-3’(SEQID NO.2)。
SBM的序列为：5’-CGCCCCTAACACCATTCCTCCCTTC-3’(SEQ ID NO.3)。
TBM的序列为：5’-CGCCCATGACACTATTCCTCGCTTC-3’(SEQ ID NO.4)。
Control的序列为：5’-TATTATCCGTCAGTGGAAAGGACCG-3’(SEQ ID NO.5)。
“水虎鱼”溶液的制备方法为：将30％(v/v)的过氧化氢溶液和98％(w/v)硫酸溶液按照体积比为1：3混合，常温避光保存备用。
实施例1：检测盒
一种以Nafion为引发剂通过电化学介导的原子转移自由基聚合反应的肺癌检测盒，包括金电极、肽核酸(PNA)溶液、[Fe(CN)6)]3-/4-溶液、MCH溶液、ZrOCl2溶液、Nafion溶液、eATRP混合液、LiClO4溶液、10％(v/v)乙醇溶液、PBS(0.1M，pH 7.0)、超纯水。
肽核酸(PNA)溶液的浓度为0.5μM，[Fe(CN)6)]3-/4-溶液浓度为5mM，MCH溶液浓度为2mM，ZrOCl2溶液浓度为5nM，Nafion溶液为
Figure BDA0002114899640000051
117溶液，LiClO4溶液浓度为0.1M。
eATRP混合液的制备方法为：将1.8mL N,N-二甲基甲酰胺(DMF)、10mM配合物CuIIBr/Me6TREN溶液0.1mL、10mM FMMA溶液0.1mL(溶解在DMF)、1.0M KBr溶液1mL、0.1MKPF6溶液7mL混匀，得到eATRP混合液。
配合物CuIIBr/Me6TREN溶液：将CuBr2和Me6TREN分别溶于DMF中配成浓度分别为20mM的CuBr2溶液和22mM的Me6TREN溶液，等体积混合，制得10mM的CuIIBr/Me6TREN混合液。
MCH溶液的制备方法为：量取适量MCH用60％(v/v)乙醇溶液稀释至5mL，使MCH最终浓度为2mM。
[Fe(CN)6)]3-/4-溶液的制备方法为：
①量取0.1646g的K3[Fe(CN)6]和0.2112g的K4[Fe(CN)6]·3H2O分别加入50mL的容量瓶中；
②量取两份0.5055g的KNO3分别置于步骤①的容量瓶中，并分别加水定容至50mL；
③分别量取步骤②的两种溶液各10mL，混合，常温避光保存备用。
实施例2：检测方法
一种利用实施例1检测盒的检测方法，包括以下步骤：
(1)金电极的预处理
①将金电极在绒布上依次用0.3μm和0.05μm的氧化铝浆连续抛光至镜面状，分别使用无水乙醇和超纯水进行超声波清洗；
②将步骤①的金电极浸泡在新制备的“水虎鱼”溶液中15min，取出并用超纯水冲洗；
③将步骤②的金电极置于H2SO4溶液(0.5M)中用循环伏安法(CV)进行扫描处理，直至获得重合的循环伏安图，电位范围设置为-0.3-1.5V，扫描速率为0.1Vs-1；
④用超纯水冲洗金电极，氮气吹干；
(2)PNA的修饰
①吸取5μL的PNA溶液(0.5μM)滴加至金电极表面，在37℃下反应1.5h，用超纯水冲洗；
②将金电极放入20mL的[Fe(CN)6)]3-/4-溶液(5mM)中，用电化学阻抗法测量修饰之后金电极的电阻；
(3)MCH的修饰
①将修饰过PNA的金电极浸泡在300μL的MCH(2mM)溶液中，在37℃下反应30min，用60％(v/v)的乙醇溶液和超纯水冲洗；
②将金电极放入20mL的[Fe(CN)6)]3-/4-溶液(5mM)中，用电化学阻抗法测量修饰之后金电极的电阻；
(4)tDNA的修饰
①吸取10μL的tDNA(0.1nM)滴加至MCH修饰后的金电极表面，在37℃下反应1.5h，用PBS冲洗；
②将金电极放入20mL的[Fe(CN)6)]3-/4-溶液(5mM)中，用电化学阻抗法测量修饰之后金电极的电阻；
(5)Zr4+的修饰
①将步骤(4)所得金电极浸泡在300μL的ZrOCl2溶液(5nM)，在37℃下反应15min，用10％(v/v)的乙醇溶液和超纯水冲洗；
②将金电极放入20mL的[Fe(CN)6)]3-/4-溶液(5mM)中，用电化学阻抗法测量修饰之后金电极的电阻；
(6)Nafion的修饰
①量取5μL的Nafion溶液滴加至Zr4+修饰后的金电极表面，在37℃下反应15min，用超纯水冲洗；
②将金电极放入20mL的[Fe(CN)6)]3-/4-溶液(5mM)中，用电化学阻抗法测量修饰之后金电极的电阻；
(7)eATRP反应
①将Nafion修饰后的金电极浸入eATRP混合液(pH 7.0)中，在37℃下反应40min，用DMF和超纯水冲洗；
②将金电极浸入LiClO4溶液(0.1M)中用方波伏安法(初始电位：0V，最终电位：0.6V，电位增量：4.0mVs-1，振幅：25mV)记录电化学信号。根据SWV的电流响应值计算tDNA浓度。
将每个步骤电化学阻抗法测量所得到的全部阻抗图叠加得到图2。从图2可知，随着反应的进行，电极表面修饰的物质逐渐增加，阻抗值逐渐增大。同时证明实验的可行性。
实施例3：可行性验证
用SWV研究了以Nafion作为引发剂的eATRP聚合反应电化学生物反应的可行性，结果如图3所示。在不添加PNA(a)、DNA(b)、Zr4+(c)、Nafion(d)、FMMA(e)、CuIIBr/Me6TREN(f)组分的情况下，各曲线均没有反映出明显的氧化电流。当所有实验条件都具备时，曲线(g)在0.35V(vs SCE)时出现强烈地氧化电流，氧化峰是二茂铁氧化生成二茂铁盐的产物，属于典型的二茂铁氧化还原电位范围。这些结果表明，缺少任一实验步骤的电极不能被成功修饰。因此，这些试验有力地证明了该方法的可行性和可靠性。
实施例4：检测条件优化
(1)引发剂Nafion反应时间的优化
在eATRP反应是基于是以有机卤化物为引发剂、过渡金属配合物为卤原子载体，通过氧化还原反应，在活性种与休眠种之间建立可逆的动态平衡，从而实现对聚合反应加以控制，所以eATRP技术的核心是引发剂的使用。卤素原子在实验中的转移中，Nafion含有多个C-F键，生成多个活性自由基(Rn·)和F-。建立了自由基活性组分(F-)与大分子有机卤化物休眠组分(Rn-F-)之间的可逆动态平衡，有效地控制了聚合反应。因此，实验的核心是正确使用引发剂。如图4所示，在前15min，电流值显著增加，15min后，电流值没有明显变化。因此引发剂Nafion的最佳反应时间为15min。
(2)eATRP混合液pH的优化
根据前人的研究，eATRP反应最适宜的pH值为7.0。在酸性条件下，易发生配合物的离解和CuⅠ的歧化；在碱性条件下，OH-离子相比较F-更易与CuⅡ结合。因此eATRP混合液的最佳pH为7.0。
(3)eATRP反应时间的优化
在eATRP混合液中，较长的聚合时间可以保证更多的二茂铁单体固定到Au电极表面，从而使聚合物链更长。为了确定聚合物的最佳聚集时间，采用CV法对聚合物的动态生长过程进行了监测，在eATRP溶液中对PNA/MCH/tDNA/Zr4+/Nafion修饰电极每10min扫描一次CV(初始电位0V，终电位0.2V，扫描速率1.0Vs-1)。图5、6显示了eATRP聚合的动态过程。如图所示，氧化电流在前40min随eATRP时间的延长而明显增加，而在40-90min的时间段，氧化电流没有明显增加，可能是长聚合物链的空间位阻效应所致。因此eATRP的最佳反应时间为40min。
综上所述，eATRP最佳优化条件为：Nafion的反应时间为15min，eATRP反应时间为40min，eATRP混合液pH为7.0。
实施例5：灵敏度实验
根据实施例4条件优化所得出的最佳实验条件，检测目标液中不同浓度的DNA(0.1fM、1fM、10fM、100fM、1pM、10pM)产生的电流信号大小，来研究本发明方法对于tDNA的检测性能。如图7、8所示，SWV的电流响应值随着tDNA的浓度增加而增加，这是因为tDNA浓度越大，结合的FMMA单体越多，形成的聚合链越长，产生的电流信号强度越强。电流峰值与tDNA浓度的对数值在0.1fM到10pM范围呈现良好的线性关系，线性方程为I(μA)＝10.6594+2.10869log[CtDNA/pM](R2＝0.997)，检测限为0.0642fM。结果表明本发明方法具有较高的检测灵敏度，较低的检测限，性能优异。
实施例6：选择性实验
根据实施例4条件优化所得出的最佳实验条件，研究不同碱基错配的DNA片段产生的信号强度。用SWV对方法的选择性进行了测试，从图9中可以看出，tDNA与其他3种DNA(SBM、TBM和Control)有明显的信号差异，SBM、TBM和Control的电流强度分别约为tDNA值的27.97％、21.24％和13.38％，与空白背景信号基本相当，说明本发明方法具有很高的选择性。本发明的高选择性可归因于SWV对背景电流的消除具有良好的免疫力，以及PNA探针具有良好的特异性。
实施例7：抗干扰性能检测
应用SWV评价本发明方法在NHS中的应用潜力和可行性。用0.1M PBS稀释tDNA样品和用5％(v/v)NHS稀释tDNA样品，对氧化电流值进行了对比分析。从图10中可以看出，5％NHS样品中不同浓度的tDNA的回收率分别为PBS的95.90％、95.66％和96.74％。结果表明，本发明方法具有较高的抗干扰能力，具有良好的临床应用前景。
序列表
<110> 河南中医药大学
<120> 一种以Nafion为引发剂通过电化学介导的原子转移自由基聚合反应的肺癌检测盒
<160> 5
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 1
gaagggagga atggtgtcag gggcg 25
<210> 2
<211> 25
<212> DNA
<213> 人(Homo sapiens)
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cgcccctgac accattcctc ccttc 25
<210> 3
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 3
cgcccctaac accattcctc ccttc 25
<210> 4
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 4
cgcccatgac actattcctc gcttc 25
<210> 5
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 5
tattatccgt cagtggaaag gaccg 25

Claims (8)

1.一种以Nafion为引发剂通过电化学介导的原子转移自由基聚合反应的肺癌检测盒，其特征在于，包括金电极、PNA溶液、[Fe(CN)6)]3-/4-溶液、MCH溶液、ZrOCl2溶液、Nafion溶液、eATRP混合液、LiClO4溶液；其中，PNA的序列为5’-SH-(CH2)11-(O linker)3-GAAGGGAGGAATGGTGTCAGGGGCG-3’；其使用方法为：
（1）PNA的修饰
①吸取5μL的PNA溶液滴加至金电极表面，在37℃下反应1.5h，用超纯水冲洗；
②将金电极放入[Fe(CN)6)]3-/4-溶液中，用电化学阻抗法测量修饰之后金电极的电阻；
（2）MCH的修饰
①将修饰过PNA的金电极浸泡在300μL的MCH溶液中，在37℃下反应30min，用60% v/v的乙醇溶液和超纯水冲洗；
②将金电极放入[Fe(CN)6)]3-/4-溶液中，用电化学阻抗法测量修饰之后金电极的电阻；
（3）目标DNA（tDNA）的修饰
①吸取10μL的检测样品滴加至MCH修饰后的金电极表面，在37℃下反应1.5h，用PBS冲洗；
②将金电极放入[Fe(CN)6)]3-/4-溶液中，用电化学阻抗法测量修饰之后金电极的电阻；
（4）Zr4+的修饰
①将金电极浸泡在300μL的ZrOCl2溶液，在37℃下反应15min，用10% v/v乙醇溶液和超纯水冲洗；
②将金电极放入[Fe(CN)6)]3-/4-溶液中，用电化学阻抗法测量修饰之后金电极的电阻；
（5）Nafion的修饰
①量取5μL的Nafion溶液滴加至金电极表面，在37℃下反应15min，用超纯水冲洗；
②将金电极放入[Fe(CN)6)]3-/4-溶液中，用电化学阻抗法测量修饰之后金电极的电阻；
（6）eATRP反应
①将金电极浸入eATRP混合溶液中，在37℃下反应40 min，用DMF和超纯水冲洗；
②将金电极浸入LiClO4溶液中，用方波伏安法记录电化学信号。
2.根据权利要求1所述的检测盒，其特征在于， PNA溶液的浓度为0.5μM，[Fe(CN)6)]3-/4-溶液浓度为5mM，MCH溶液浓度为2mM，ZrOCl2溶液浓度为5nM，Nafion溶液为Nafion®117 溶液，LiClO4溶液浓度为0.1M。
3.根据权利要求1所述的检测盒，其特征在于，eATRP混合液的制备方法为：将1.8mLDMF、10mM配合物CuIIBr/Me6TREN溶液0.1mL、10mM FMMA溶液0.1mL、1.0M KBr溶液1 mL、0.1MKPF6溶液7mL混匀，得到eATRP混合液；MCH溶液的制备方法为：量取适量MCH用60% v/v乙醇溶液稀释至MCH终浓度为2mM。
4.根据权利要求1所述的检测盒，其特征在于，还包括10% v/v乙醇溶液、PBS、超纯水。
5.根据权利要求1-4任一项所述的检测盒，其特征在于，金电极的预处理为：
①将金电极抛光至镜面状，分别使用无水乙醇和超纯水进行超声波清洗；
②将步骤①的金电极浸泡在“水虎鱼”溶液中15-20min，取出并用超纯水冲洗；
③将步骤②的金电极置于0.5M H2SO4溶液中用循环伏安法进行扫描处理，直至获得重合的循环伏安图；
④用超纯水冲洗金电极，氮气吹干。
6.根据权利要求5所述的检测盒，其特征在于，“水虎鱼”溶液的制备方法为：将30% v/v的过氧化氢溶液和98% w/v硫酸溶液按照体积比为1：3混合，即得。
7.根据权利要求5所述的检测盒，其特征在于，循环伏安法处理的电位范围为-0.3-1.5V，扫描速率为0.1Vs-1。
8.根据权利要求1所述的检测盒，其特征在于，[Fe(CN)6)]3-/4-溶液的制备方法为：
①量取0.1646g的K3[Fe(CN)6]和0.2112g的K4[Fe(CN)6]· 3H2O分别加入50mL的容量瓶中；
②量取两份0.5055g的KNO3分别置于步骤①的容量瓶中，并分别加水定容至50mL；
③分别量取步骤②的两种溶液各10mL，混合，得到浓度为5mM的[Fe(CN)6)]3-/4-溶液，常温避光保存备用。
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