CN114480598B - 一种端粒酶活性检测试剂盒及检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种端粒酶活性检测试剂盒及检测方法，属于纳米孔传感技术领域。本发明利用端粒酶在引物作用下以特定序列(TTAGGG)n对端粒进行延伸，扩增得到富含G碱基的DNA序列与钾离子和氯化血红素结合形成G‑四链体结构，其产生的G‑四链体具有类过氧化物酶活性，可以催化双氧水反应并对贵金属纳米颗粒进行形貌调控，反应前后的纳米颗粒产物在固态纳米孔中进行信号检测，从而实现对端粒酶活性的高灵敏检测。本发明将端粒酶的活性反应和纳米颗粒形貌调控相结合，无需标记，反应高效，同时将端粒的延伸转化为单纳米颗粒形貌变化，具有信号放大和提高通量的作用，有利于实现低样本、低浓度条件下的端粒酶活性的高灵敏检测。

Description

一种端粒酶活性检测试剂盒及检测方法
技术领域
本发明提供了一种端粒酶活性检测试剂盒及检测方法，结合端粒酶延伸特定序列形成类过氧化氢酶反应和金纳米棒刻蚀技术，将端粒酶活性通过金纳米棒的刻蚀过程中形貌改变，在纳米孔中进行信号检测，从而实现了固态纳米孔对端粒酶活性的高灵敏检测，属于纳米孔传感器检测领域。
背景技术
端粒是真核生物染色体末端的特殊结构，在每个细胞分裂周期的DNA复制过程中，端粒会逐渐缩短，当端粒缩短到临界长度将导致细胞程序性死亡。端粒酶是一种可以维持染色体端粒长度的逆转录酶，通过在端粒的3’端不断的复制(TTAGGG)n的重复序列达到维持端粒长度以及细胞活性的目的。因此端粒酶活性与细胞的凋亡、衰老、永生化有密切关系，在大多数约90％的癌细胞系中可以观察到端粒酶异常激活，而在正常细胞中端粒酶的活性被抑制，因此端粒酶是细胞衰老以及癌变等疾病诊断、预防和治疗的重要生物标记物和潜在的治疗靶点。
因此端粒酶活性的检测是生命科学研究的重点，其中目前常用的方法是基于聚合酶链反应(PCR)的端粒重复扩增方法(TRAP)测定端粒酶活性，其具有高的特异性，但也有扩增错误、耗时较长，样品量大等问题。因此不同生物传感的方法被相继研发，这些方法主要利用端粒酶活性反应特点，利用引物延伸，探针标记、氧化还原等反应特点，通过电化学分析，比色法以及各种光谱分析方法进行检测。
有关生物传感现有技术中一大类是利用碱基互补对端粒延伸序列设计分子探针或分子信标原理通过光电信号检测端粒酶，如文献Arobust probe for lighting upintra cellular telomerase via primer extension to open a nicked molecularbeacon(JACS.136(2014)8205e8208)，公开了一种带切口的分子信标，一端连接在金纳米颗粒上，另一端标记荧光探针，在初始状态，荧光探针被金纳米颗粒猝灭，当端粒酶延伸端粒序列，引起分子信标打开，探针荧光恢复，检测端粒酶活性。
同样地，申请号201910776813.2的专利公开了一种端粒酶活性检测试剂盒及端粒酶活性检测方法，利用端粒酶延伸序列、磁珠标记体系以及底物的信号生成实现端粒酶活性检测；再如公开号为CN 103529023 B的专利公开了一种端粒酶活性检测方法，利用端粒酶活性延伸反应产物与报告标签溶液进行DNA杂交反应，引起纳米材料的聚集反应；通过比色法观察颜色或采用SERS技术双信号通道检测得到端粒酶活性。
上述公开的现有技术对端粒酶活性都做出了积极的探索，一定程度上提高了灵敏度，但是这些现有技术手段多是对溶液环境中大量分子群体行为的平均化检测，缺少单分子、单颗粒行为的特异性和灵敏性；同时涉及分子探针标记，染料猝灭以及样品量大，易受干扰等问题，限制了其应用。
纳米孔是一种新型的单分子传感器，具有操作简单、低成本、高分辨的特性，目前主要用在DNA测序，同时也被开发用于各种生物传感检测应用。在纳米孔传感中，当单个分子通过纳米孔通道时，离子电流会发生波动，通过对电流信号的统计分析，电流信号包含两个特征量：电流阻滞振幅(amplitude)和电流阻滞时间(dwell time)，从中可以推断得出待测物的种类、表面荷电、构象变化和相互作用等信息，从而实现单分子水平的传感和分析。同时该技术具有无标记、高通量、低样本需求等显著优势，节约成本，对分子信息进行直接读取，减少误差，因此非常适用于体内外低丰度生物靶分子的检测和筛选。
针对端粒酶活性的高灵敏检测，本课题组利用纳米孔传感器进行了系统的研究，首先利用碱基互补原理对端粒延伸序列设计分子探针，如本课题组申请的申请号为202210071448.7、名称为“一种检测探针、试剂盒及端粒酶活性的直接检测方法”的专利，公开了一种通过设计DNA链接的金纳米颗粒组装体，端粒酶延伸反应引起纳米颗粒组装体解离，并在纳米孔内进行单颗粒检测的方法，该方法具有高的灵敏度，同时解决了传统纳米孔传感中借助纳米孔内分子修饰效率低，芯片损坏，用途单一等问题，开拓了纳米孔传感作为lab-on-Chip用于蛋白酶等结构和活性功能检测的新途径。上述纳米颗粒组装用于纳米孔传感能更好的进行信号放大，组装体积的增大对与纳米孔的尺寸有高的要求。
发明内容
为了进一步提高端粒酶活性检测的灵敏度和可靠性、降低纳米孔检测端粒酶活性的成本，我们针对端粒酶活性扩增得到的端粒序列在一定条件下形成G-四链体结构，开发一种新的纳米孔检测方法。
由于G-四链体结构具有类过氧化氢酶活性，现有检测方法多利用DNA杂交置换，染料探针以及氧化还原反应中电子转移进行大量溶液环境的光电信号测量，这对检测样品用量和测试环境干扰都有较高的要求。因此借助纳米孔的单分子单颗粒水平高分辨特性，我们将端粒酶活性反应得到的G-四链体结构和具有特定形貌的贵金属纳米颗粒形貌调控结合，设计合适的纳米孔传感平台进行检测。首先端粒酶在引物作用下以特定序列(TTAGGG)n对端粒进行延伸，扩增得到富含G碱基的DNA序列与钾离子和氯化血红素结合形成G-四链体结构。然后其产生的G-四链体具有类过氧化氢酶活性，可以催化双氧水反应并对金纳米颗粒进行形貌刻蚀。最后刻蚀前后的纳米颗粒产物在固态纳米孔中进行信号检测，从而实现对端粒酶活性的高灵敏检测。本发明将端粒酶的活性反应产物用于纳米孔传感检测，无需标记，反应高效，同时将端粒的延伸转化为纳米颗粒形貌变化(单颗粒形貌变化)，在纳米孔中具有信号放大和提高通量的作用，同时纳米孔检测具有低样本、低浓度、高灵敏特性，能更好的实现端粒酶的高效灵敏、稳定可靠、且经济便携的检测应用。
本发明所采用的技术方案是：
如图1所示，一种端粒酶活性检测方法，所述方法包括：
步骤S1：获取端粒酶样品；
步骤S2：向所述端粒酶样品中加入端粒酶引物、dNTPs、端粒酶逆转录缓冲液在pH6.0-8.0条件下进行反应，加入终止液终止端粒酶的延伸反应降温后得到延伸反应产物；
步骤S3：在步骤S2得到的延伸反应产物中加入钾离子和氯化血红素，在pH6.0-8.0条件下反应形成具有过氧化氢酶活性的G-四链体产物；
步骤S4：步骤S3得到的G-四链体产物中加入双氧水、CTAB和贵金属纳米颗粒，在PH3.0-5.0下反应，此过程中，G-四链体催化双氧水反应生成具有氧化性的羟基自由基，对特定形貌的贵金属纳米颗粒进行刻蚀反应，随着刻蚀的进行，纳米颗粒的形貌发生改变，体积变小；
步骤S5：采用固态纳米孔传感器对未经步骤S4处理和经步骤S4处理后的贵金属纳米颗粒分别进行过孔信号检测，在此过程中，所述固态纳米孔传感器对贵金属纳米颗粒刻蚀反应前后的形貌变化进行单颗粒水平检测，通过对固态纳米孔过孔信号的电流幅值和过孔滞留时间的统计分析，最终能实现对端粒酶活性的定量分析。
其中，所述贵金属纳米颗粒为金、银纳米颗粒中的任意一种或两种的组合，进一步优选金纳米颗粒，其中所述贵金属纳米颗粒尺寸与所述纳米孔的直径匹配，根据目前纳米孔的加工成本和加工难度，大孔径的纳米孔加工难度小、成本低，本发明的贵金属纳米颗粒本身就具备信号放大的作用；本发明优选较大的固态纳米孔，可以避免贵金属纳米颗粒堵塞孔现象，具体选用直径为贵金属纳米颗粒直径2倍以上的纳米孔进行过孔检测。
进一步的，所述金纳米颗粒优选为棒状、片状等多面体结构，具有高比表面积和荷电特性。
优选的，本发明所述金纳米颗粒为棒状金纳米颗粒，一方面，根据纳米孔传感原理，颗粒在纳米内遵从体积排阻效应(J Am Chem Soc 2009,131:9287–9297)，引起的离子电流的波动符合公式其中Λ(t)为单颗粒体积，σ为溶液电导率，/>为施加电压，Heff为膜的有效厚度，当颗粒在纳米孔中体积比越大具有越高的信噪比，为了在能够实现过孔的前提下提高纳米颗粒的体积，本发明优选棒状纳米颗粒，棒状纳米颗粒和其他结构的纳米颗粒在直径相同的情况下有加大的体积放大效应，从而在纳米孔中有高的信噪比，从理论上来讲，金棒的长径比越大，直径不变的条件下体积相对越大，过孔信号越明显，具体的，选择长径比≥3：1的金棒进行纳米孔，具有纳米孔信号信噪比高的优势，同时刻蚀前后具有较大的形貌变化和信号差异，但是，综合考虑到本发明检测获得的过孔信号能够满足一定的显著性即可，过于放大对于检测结果无影响且综合考虑到金棒的制备成本、过长易堵塞的问题，金棒的长径比宜控制在合理的范围内，本发明优选的金棒长径比为3：1～5:1。另一方面，棒状结构在刻蚀过程中由棒到球，体积变化大，信号差异也比较明显，进一步提高检测结果的可靠性。所述金纳米棒的长径长径比的调控通过制备中硝酸银溶液与种子液的比例来调控，制备不同直径的金纳米棒；进一步优选的，为了在保持较低成本的前提下提高纳米孔信噪比，所述金纳米棒长径比约4：1。
根据纳米孔的Smoluchowski theory(Nat Nanotechnol 2010,5:160–165)，纳米孔的尺寸和颗粒进孔的通量紧密相关，颗粒进入纳米孔的捕获半径遵从公式其中r*为颗粒进入纳米孔的捕获区半径，dpore和lpore为孔的直径和长度，μ为电泳迁移率，/>为施加电压，Ddiffusion为棒的迁移率，可以看出较大孔可以提高纳米孔的检测通量，但是盲目增大纳米孔的直径会造成信噪比下降和多颗粒同时过孔的现象，从而无法实现单颗粒的过孔检测降低检测结果的灵敏性和可靠性，因此本发明优选的，所述纳米孔的直径为贵金属纳米颗粒直径的2-10倍。
优选的，综合考虑检测对象的浓度范围下产生的G-四链体的浓度数量级，以棒状金纳米颗粒为例，所述棒状金纳米颗粒长度优选为30～100nm、直径为10～20nm；与之匹配的，所述固态纳米孔传感器中纳米孔的孔径为40～200nm，厚度为20～100nm。进一步优选的，所述金纳米棒的直径15nm，长度60nm，所述纳米孔的直径为80nm，厚度50nm，在这种配比下，在纳米孔传感器中可以获得高的信噪比，同时提高捕获率，避免颗粒堵孔现象的发生，使用周期长，同时对金棒具有高的通量，提高反应效率，节约成本。
作为同一技术构思，本发明还提供了一种端粒酶活性检测试剂盒，所述试剂盒包括上述的检测方法中所述核酸序列、原料和试剂；具体的，所述检测试剂盒至少包括以下成分：所述端粒酶引物、所述dNTPs、所述端粒酶逆转录缓冲液、所述钾离子、所述终止液、所述氯化血红素、所述双氧水、所述贵金属纳米颗粒、CTAB。
进一步的，上述的检测试剂盒包括第一容器，所述第一容器包含所述端粒酶引物，使用前用PBS缓冲液(pH 7.4，0.01M)稀释成浓度为10uM；
进一步的，上述的检测试剂盒包括第二容器，所述第二容器包含所述dNTPs，使用PBS缓冲液(pH 7.4，0.01M)稀释成浓度为2mM；
进一步的，上述的检测试剂盒包括第三容器，所述第三容器包含所述端粒酶逆转录缓冲液；
作为本发明一种优选方案，所述第一容器、第二容器和第三容器中所述成分可合并存放在一个容器中。
进一步的，上述的检测试剂盒包括第四容器，所述第四容器包含所述终止液为SDS溶液，优选的所述SDS浓度为1％质量比；
进一步的，上述的检测试剂盒包括第五容器，所述第五容器包含所述钾离子，使用前用PBS缓冲液(pH 5.0，0.01M)稀释成浓度为5mM；
进一步的，上述的检测试剂盒包括第六容器，所述第六容器包含所述氯化血红素，优选的所述氯化血红素Hemin先溶于二甲基亚砜(DMSO)溶剂，使用前用PBS缓冲液(pH 5.0，0.01M)稀释成浓度为2uM；
进一步的，上述的检测试剂盒包括第七容器，所述第七容器包含所述双氧水，使用前用PBS缓冲液(pH 5.0，0.01M)稀释成浓度为10-100uM，优选的，所述双氧水浓度为60uM；
进一步的，上述的检测试剂盒包括第八容器，所述第八容器包含所述贵金属纳米颗粒，贵金属纳米颗粒浓度范围为0.01-1nM，优选的所述实验浓度为0.1nM。
进一步的，上述检测试剂盒包括第九容器，所述第九容器包含所述CTAB，浓度为1mM，用于稳定贵金属纳米颗。
作为本发明一种优选方案，所述第七容器、第八容器和第九容器中所述成分可合并存放在一个容器中。
使用过程：从待检测样本中提取端粒酶后，在端粒酶溶液中加入第一容器、第二容器和第三容器中的试剂，室温下混合反应后，加入第四容器中的终止液获得延伸产物；加入第五容器中的钾离子和第六容器中的所述氯化血红素，形成具有过氧化氢酶活性的G-四链体产物；加入第七容器中的双氧水、第八容器中的贵金属纳米颗粒和第九容器中的CTAB，对反应前后的贵金属纳米颗粒通过纳米孔进行信号检测。
有益效果：
本发明具有突出的实质性特点和显著的技术进步，具体如下：
本发明提供的一种基于固态纳米孔传感器的端粒酶活性检测方法，如图1所示，通过提取的端粒酶结合引物(TS)以特定序列(TTAGGG)对端粒进行延伸，扩增出来的富含G的DNA序列与钾离子和氯化血红素结合形成G-四链体结构，该结构具有类过氧化氢酶活性，可以催化双氧水反应并对纳米颗粒进行刻蚀，调控纳米颗粒形貌变化，刻蚀前后的纳米颗粒在固态纳米孔中的过孔电流有显著的差异，从而实现固态纳米孔传感器对端粒酶活性的定量检测。
首先端粒酶结合引物以特定序列(TTAGGG)对端粒进行延伸，扩增出来的富含G的DNA序列与钾离子和氯化血红素结合形成G-四链体结构，该结构具有类过氧化氢酶活性，可以催化双氧水反应并对纳米颗粒进行刻蚀，调控纳米颗粒形貌变化，刻蚀前后的纳米颗粒在固态纳米孔中的过孔电流有显著的差异，从而实现固态纳米孔对端粒酶活性的定量检测；
本发明利用端粒酶活性扩增得到的端粒序列形成G-四链体结构直接进行刻蚀反应，反应过程中，无需其他的DNA探针标记和杂交替换，减少了分子错配问题，过程简单，降低成本，同时消除了其他生物分子背景干扰，具有高的特异性，减少了假阳性问题。
本发明以金纳米颗粒为刻蚀反应载体，性质稳定，该结构具有可控的长径比和高表面、荷电特性，刻蚀前后具有可控的形貌差异，对比光学等方法利用形貌差异引起等颜色等光谱特性改变进行检测，纳米孔可以更直接的反应金纳米棒形貌的细微改变，特别是刻蚀反应的早期以及微量反应(光谱不敏感时期)。同时金纳米棒在纳米孔中具有高的信噪比和检测通量，随着刻蚀反应体积变小，更容易通过纳米孔，避免了堵孔现象发生，因此金纳米棒是一个优良的反应载体，通过优化合成方案和可控的形貌调控，可以更好的用于纳米孔传感，极大地提高反应效率，节约成本。
本发明以固态纳米孔传感平台进行检测，固态孔的尺寸可控，性质稳定，从单分子、单颗粒水平去检测反应产物的结构功能变化，其高分辨率可以实时地，精准地进行端粒酶活性的定量分析，同时该技术具有无标记、高通量、低样本需求等优势，节约成本，非常适用于体内外低丰度生物分子的早期检测和精准筛选。
本发明将端粒酶的活性和金纳米颗粒刻蚀反应结合，同时借助纳米孔传感平台实现信号检测，开拓了纳米孔用于蛋白酶活性高灵敏检测的新途径。通过实验设计和优化反应条件，将端粒酶活性分析转换为纳米颗粒的形貌调控，利用了酶活的高效性和特异性进行级联反应和信号放大，提高反应效率，同时纳米颗粒反应载体承接酶促反应和纳米孔信号检测，其特有的形貌变化在纳米孔内具有高信噪比和高通量，进一步提高了纳米孔的分辨率，克服了纳米孔与待测分子尺寸相近的限制，解决了蛋白酶等生物分子直接在固态纳米孔内易位时信噪比差、通量低等问题，有利于纳米孔开发为一个更为便携的高灵敏传感平台。
附图说明
图1为本发明所述固态纳米孔用于端粒酶活性检测原理示意图；
图2a为本发明制备不同长径比的金纳米棒紫外表征图，其中长径比AR为5:1的金纳米棒长60nm左右，直径12nm左右；长径比AR为4:1的金纳米棒长约60nm，直径约15nm；长径比AR为3:1的金纳米棒长约60nm，直径20nm；
图2b为本发明根据多物理场对不同相貌金纳米颗粒在纳米孔中易位引起的电流信号仿真图；
图3为纳米颗粒产物在纳米孔中电信号轨迹图，其中图a为纳米孔基线电流轨迹图；图b为反应前金纳米棒在纳米孔中的脉冲电流轨迹图；图c为刻蚀反应后金纳米棒产物在纳米孔中的电流轨迹图；
图4a为纳米孔实验条件过氧化氢的浓度优化图，最佳反应浓度为60uM；
图4b为纳米孔实验条件氯化血红素浓度优化图，最佳反应浓度为2.0uM；
图5为纳米孔对不同数量的HeLa细胞端粒酶定量分析曲线；
图6为纳米孔对于不同癌细胞的检测结果柱状图，其中人宫颈癌细胞(HeLa)、人乳腺癌细胞(MCF-7)、人正常肝细胞(LO2)和热失活的HeLa细胞；
图7为纳米孔检测中端粒酶活性的特异性图，其中端粒酶(TE),抗坏血酸(AA)，溶菌酶(LZM)、半胱氨酸(CYS)、牛血清蛋白(BSA)和磷酸缓冲液(PBS)。
具体实施方式
下面结合说明书附图和具体实施例来对本发明的技术方案做进一步的说明。
实施例1：金纳米棒的合成
首先是合成种子：取10mL,0.1M的CTAB溶液和0.25mL,0.01M的HAuCl4混合，加入磁子，然后加0.6mL 0.01mol/L的新鲜制备的NaBH4溶液，边加边剧烈搅拌2min，30℃水浴2h；
其次是金纳米棒的生长：取40mL 0.1M CTAB溶液，2mL 0.01M的HAuCl4溶液和350uL 0.01M的AgNO3溶液混合，并加入磁子搅拌，加入800uL 1M的HCl溶液调节PH为2左右，加入200uL的0.1M的抗坏血酸溶液，搅拌至溶液变为无色，加入200uL制备的金种子溶液，搅拌混匀放置30℃水浴锅内生长8h。将生长8h后的金纳米棒溶液使用50mL离心管使用8000rpm进行离心30min，吸取上清液保留沉淀，加入超纯水进行复溶，重复三次，将离心后的金纳米棒溶液集中后使用广口瓶密封保存。合成的纳米材料性质稳定，大小均一，并且在溶液中有良好的分散性；
如图2a所示，在上述金棒合成方法的基础上，本实施例修改了加入的金种子的体积，分别改为160uL、200uL和240uL，合成了三种不同长径比的金纳米棒，长径比AR分别为5:1、4:1和3:1。本实施例中，金纳米棒长度保持约60nm，直径从20-10nm，当金棒直径变小，在刻蚀反应中具有更快的反应效率和形貌变化；
如图2b所示，与相同直径条件下的其他形状金纳米颗粒相比，长径比高的的金纳米棒在进入纳米孔中具有更高的信噪比，图中长短金纳米棒长径比约为4：1和3：1，选用的纳米孔约直径约80nm，厚度约50nm的纳米孔进行仿真的。
实施例2：端粒酶活性检测的方法
步骤1，端粒酶的提取：在细胞培养皿中加入4mL培养液，取出离心管中的细胞溶液约300uL，加入到培养皿中，轻轻摇晃使细胞分布均匀，放入培养箱生长以维持HeLa，MCF-7和LO2细胞。在指数生长期收集各种细胞，并用冰冷的PBS缓冲液(0.01M，pH 7.4)洗涤两次，然后将细胞重悬于200μL冰冷的CHAPS裂解缓冲液(10mM pH 7.5Tris-HCl，1mM MgCl2，1mMEGTA，0.5％CHAPS，10％甘油，0.1mM PMSF)中。将裂解物在冰水浴中孵育10min，然后在4℃下以15000rpm的转速离心30min。最后，收集上清液并小心地转移到新鲜的RNase-free的试管中，并保存在-80℃以便后期使用。
步骤2，端粒酶引物序列的延伸：取20uL 50uM端粒酶引物序列溶液，具体端粒酶引物序列如SEQ ID NO：1所示，加入2uL 100mM dNTPs溶液和48uL的端粒酶逆转录缓冲液(20mM Tris-HCl，pH 8.3，1mM EDTA，0.05％Tween 20，63mM KCl，0.1mg/mL BSA，1.5mMMgCl2)和30uL步骤1中提取的端粒酶混合物，混合均匀，放置到500rpm，37℃的摇床反应1h；在反应时间后，将制备的延伸后产物的溶液加入10uL 1％质量比的SDS变性剂溶液，终止端粒酶的延伸反应，将产物放置到4℃降温30min，得到最终延伸产物。
步骤3，G-四链体的合成：取步骤2中的最终延伸产物100uL加入到离心管中，加入392.5uL PBS缓冲液(10mM,PH5.0)，然后加入2.5uL,1M的KCl和5uL 200uM的Hemin，混合均匀，室温下静置30min，最终得到具有类过氧化氢活性的G-四链体产物。
步骤4刻蚀反应过程：取150uL实施例1中制备的长径比为4:1的金纳米棒作为检测探针，加入120uL步骤3制备的G-四链体产物，10uL 300uM H2O2，50uL 0.01M CTAB，170uL0.01M PH5.0的PBS缓冲液，总体积为500uL，充分摇晃，在室温下反应25min，加入10uL 5M的HCl终止反应。此步骤利用制备的具有类过氧化氢活性的G-四链体产物催化H2O2反应生成具有较强氧化活性的羟基自由基，对金纳米棒探针进行刻蚀，使金纳米棒的长径比发生改变；
步骤5纳米孔检测过程：搭建纳米孔平台，选用直径为80nm，厚度约50nm的氮化硅纳米孔芯片，10mM的KCl作为电解质溶液，通过施加电压约600mV对刻蚀前后的金纳米颗粒产物进行过孔实验。将实施例2步骤4中得到的刻蚀后产物进行纳米孔信号检测，得到最终样品溶液的纳米孔信号，反应前后的金纳米颗粒在纳米孔中的离子电流轨迹图如图3所示。其中图3中a图为纳米孔基线电流图，当施加电压后，纳米孔中形成稳定的离子电流。当加入金纳米棒，形成一系列电流脉冲信号，见图3中b图。当加入纳米颗粒反应后产物，纳米孔中形成一系列新的电流脉冲信号，见图3中c图。通过统计其离子电流脉冲值，计算其离子电流脉冲幅值的峰位变化值(△IP)，可定量检测出反应产物的信号变化，从而实现待测样品的端粒酶活性分析。
图4a和图4b为本发明中两个关键实验条件的优化图。图4a为H2O2的浓度优化，其他实验条件与步骤4的条件一致，配置不同浓度的H2O2溶液参与反应，具体浓度为0uM、10uM、20uM、30uM、40uM、50uM、60uM、70uM，兼顾高的反应效率和降低成本，最佳浓度60uM，；图4b为氯化血红素Hemin的浓度优化，其他实验条件与步骤3的条件一致，配置不同浓度的Hmein溶液参与反应，具体浓度为1.25uM、1.5uM、1.75uM、2uM、2.25uM、2.5uM、2.75uM，考虑高的反应效率和降低成本，最终选择浓度2.0uM；
图5为纳米孔检测不同数量HeLa细胞中端粒酶活性定量检测曲线图，随着HeLa细胞的数量从0增加到1000，由于端粒酶存在而触发的端粒酶引物序列的伸长，能够合成更多具有类过氧化氢活性的G-四链体催化H2O2反应产生OH·，从而导致更多的金纳米棒被刻蚀，如图5所示，纳米孔离子电流脉冲幅值的峰位变化值(ΔIp)与细胞数目线性增长关系,其函数关系式为y＝0.00468+0.000108x(R2＝0.998)，按照信噪比S/N＝3进行计算，相对应的可以得到该方案的检出限约为3个细胞。
图6为本发明方法对不同细胞检测的普适性图。为了验证所提出的端粒酶活性检测方法的普适性，我们使用该方法对几种不同的细胞进行了检测，例如人宫颈癌细胞(HeLa)、人乳腺癌细胞(MCF-7)、人正常肝细胞(LO2)和热失活的HeLa细胞，图6中显示本发明方法可以在不同癌细胞中检测出端粒酶活性，并且对于正常细胞和热失活的癌细胞也存在着良好的区分，显示了该方法的适用性和可靠性。
图7为本发明方法对端粒酶和不同干扰物质的特异性图。为了验证所提出的检测端粒酶活性的方法的特异性，我们在细胞提取物中检测到了共存的干扰物质，例如抗坏血酸(AA)，溶菌酶(LZM)、半胱氨酸(CYS)、牛血清蛋白(BSA)和磷酸缓冲液(PBS)，图7中显示的结果表明，与端粒酶(TE)相比，所有这些干扰物种对金纳米棒的刻蚀均没有明显的影响，显示了该方法的高特异性和可靠的选择性。
序列表
<110> 南京邮电大学
<120> 一种端粒酶活性检测试剂盒及检测方法
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 2
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
aatccgtcga gcagagtt 18

Claims (4)

1.一种非诊断目的的端粒酶活性检测方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
步骤S1：获取端粒酶样品；
步骤S2：向所述端粒酶样品中加入端粒酶引物、dNTPs、端粒酶逆转录缓冲液在pH6.0-8.0条件下进行反应，加入终止液终止端粒酶的延伸反应降温后得到延伸反应产物；
其中，反应时端粒酶引物的终浓度为10uM，dNTPs的终浓度为2mM；
步骤S3：在步骤S2得到的延伸反应产物中加入钾离子和氯化血红素配在pH6.0-8.0条件下反应形成具有过氧化氢酶活性的G-四链体产物；
其中，反应时钾离子的终浓度为5mM，氯化血红素的终浓度为2uM；
步骤S4：步骤S3得到的G-四链体产物中加入双氧水、CTAB和贵金属纳米颗粒在PH3.0-5.0下反应25min后终止反应；
其中，反应时双氧水的终浓度为40-70uM，CTAB的终浓度为1mM；
所述贵金属纳米颗粒为棒状金纳米颗粒；所述棒状金纳米颗粒直径15nm，长度60nm；
步骤S5：采用固态纳米孔传感器对未经步骤S4处理和经步骤S4处理后的贵金属纳米颗粒分别进行过孔信号检测，通过对固态纳米孔过孔信号的电流幅值和过孔滞留时间的统计分析，实现对端粒酶活性的定量分析；其中，所述固态纳米孔传感器选用直径为80nm，厚度约50nm的氮化硅纳米孔芯片，10mM的KCl作为电解质溶液，通过施加电压600mV对刻蚀前后的金纳米颗粒产物进行过孔信号检测。
2.如权利要求1所述一种非诊断目的的端粒酶活性检测方法，其特征在于，步骤S4中所述H2O2的浓度为60uM。
3.如权利要求1所述一种非诊断目的的端粒酶活性检测方法，其特征在于，步骤S2中所述终止液为1％质量比的SDS变性剂溶液。
4.如权利要求1所述一种非诊断目的的端粒酶活性检测方法，其特征在于，步骤S1中获取端粒酶样品包括以下步骤：在细胞培养皿中加入4mL培养液，取出离心管中的细胞溶液约300uL，加入到培养皿中，轻轻摇晃使细胞分布均匀，放入培养箱生长以维持HeLa，MCF-7和LO2细胞；在指数生长期收集各种细胞，并用冰冷的PBS缓冲液洗涤两次，然后将细胞重悬于200μL冰冷的CHAPS裂解缓冲液中；将裂解物在冰水浴中孵育10min，然后在4℃下以15000rpm的转速离心30min；最后，收集上清液并小心地转移到新鲜的RNase-free的试管中，并保存在-80℃以便后期使用。
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