KR102625649B1 - 핵산 증폭 기술에서 신호전달물질을 이용한 핵산의 전기화학적 검출방법 - Google Patents

핵산 증폭 기술에서 신호전달물질을 이용한 핵산의 전기화학적 검출방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 신호전달물질의 이동 조절을 이용한 전기화학적 핵산 검출에 관한 것으로, 보다 상세하게는 핵산 증폭 기술에서 신호전달물질을 이용한 핵산의 전기화학적 검출방법에 관한 것이다. 이를 위해, 검체로부터 분석 대상이 되는 핵산을 추출하여 농축하는 단계; 핵산이 용출된 용액에 중합효소, 프라이머 및 dNTPs를 첨가하는 단계; 신호전달물질이 결합된 시그널 프로브를 첨가하는 단계; 혼합물에 대해 PCR과정을 수행하는 단계; 핵산외부가수분해효소(엑소뉴클리아제, exonuclease) 활성에 의해 올리고뉴클레오타이드와 신호전달물질이 분해되는 단계; 분해되어 생성된 신호전달물질이 전극 표면의 극성 필터를 반응 전후로 통과하는 단계; 전극 주위에 또다른 효소-기질 반응에 의해 전자가 축적되는 단계; 전극으로부터 신호전달물질의 산화 및/또는 환원 전위에 기초하여 직접과 별도의 효소-기질 반응에 의해 축적된 전자를 연속적으로 순환하면서 전달하여 전기신호를 측정하는 단계; 및 전기신호에 기초하여 핵산을 정성 또는 정량적으로 산출하는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 핵산 증폭 기술에서 신호전달물질을 이용한 핵산의 전기화학적 검출방법에 의해 달성될 수 있다.

Description

핵산 증폭 기술에서 신호전달물질을 이용한 핵산의 전기화학적 검출방법{Electrochemical detection method of nucleic acid using signal transmitter in polymerase chain reaction}
본 발명은 신호전달물질의 이동 조절을 이용한 전기화학적 핵산 검출에 관한 것으로, 보다 상세하게는 핵산 증폭 기술에서 신호전달물질을 이용한 핵산의 전기화학적 검출방법에 관한 것이다.
핵산증폭 기술은 분자생물학 및 생명공학 분야에서 주로 사용되는 기술로 소량의 핵산을 검출하고 분석할 수 있는 방법이다. 핵산증폭을 위해 내열성 효소(thermostable enzyme)를 사용하여 DNA/RNA를 분석하는 PCR(Polymerase chain reaction) 기술이 가장 널리 사용되는 방법이다. PCR 기술은 높은 온도조건에서 이중가닥 DNA를 단일가닥 DNA로 변성시킨 후, 온도를 낮추어 단일가닥에 시발체(primer)가 결합하고 내열성 효소인 Taq 중합효소(polymerase)가 이중가닥 DNA로 연장시키는 과정이 반복되는 방법이다.
형광물질을 이용한 실시간 PCR 방법은 PCR 과정 중에 형광의 발광세기에 따라 핵산을 검출하는 방법으로 PCR 반응물 중간 위치에 해당하는 상보적인 서열을 갖는 올리고뉴클레오타이드(oligonucleotide)의 5' 말단에 리포터 염료를 부착시키고, 3' 말단에 퀀처가 부착된 단일가닥의 프로브를 추가하여 Taq 중합효소의 5' -> 3' 핵산외부 가수분해효소(exonuclase) 활성에 의해 PCR 반응 시 단일가닥의 프로브가 상보적인 서열에 결합하고 Taq 중합효소의 연장반응에 의해 프로브가 5'말단부터 가수분해되어 리포터 염료가 퀀처로부터 멀어져 형광을 발광하여 실시간 PCR 장비의 형광 탐지기에 의해 형광량을 표시해준다. 실시간 PCR 장비의 형광 탐지기에 따라 형광 파장을 다르게 하여 두 개 이상의 타겟을 검출하는 동시 다중 검출이 가능하여 병원체 검출 및 돌연변이 검출 등 진단 분야에서 많이 사용되는 기술로 고가의 실시간 PCR 장비와 숙련된 기술자가 필요하다는 단점을 가지고 있다.
고가의 실시간 PCR 장비 없이 등온조건에서 DNA/RNA를 검출하고, PCR 방법보다 더 빠른 시간 안에 핵산을 검출하는 등온증폭법(Isothermal amplification method) 방법들도 개발되고 있다. RNA 증폭을 위해 RNA polymerase, reverse transcriptase, RNase H와 같은 효소를 사용하는 Transcription Mediated Amplification(TMA), Nucleic Acid Sequence-Based Amplification(NASBA) 방법이 있다. Strand Displacement Amplification(SDA)는 exonuclase-deficient DNA polymerase가 이중 가닥의 핵산을 합성하기 위해 기존 가닥 하나를 변형(displacement)시키고 제한 효소(restriction enzyme)로 결함(nick)을 형성시켜 이 과정이 반복되면서 핵산이 증폭되는 방법이다.
이와 유사한 Nicking and Extension Amplification Reaction(NEAR)는 restriction enzyme 대신 절단효소(nicking enzyme)를 사용하는 방법이다. Helicase-Dependent Amplification(HDA)는 5'말단과 3'말단부터 이중가닥을 풀어주는 나선효소(Helicase)의 기능을 사용한 것이며 이와 유사한 Recombinase Polymerase Amplification(RPA)는 이중가닥을 풀어주는 재조합효소를 이용한 방법이다.
Loop-mediated isothermal amplification(LAMP)는 4~6개의 specific 프라이머와 strand displacement activity를 갖는 DNA 중합효소를 이용하는 핵산 증폭 기술(Patent. No. PCT/JP2000/001919)이다.
이러한 LAMP의 측정 방법으로는 아가로즈 겔 전기영동분석법을 통해 스미어 패턴(smeared pattern)의 밴드를 확인하여 특정 유전자 핵산 증폭 반응의 유무를 분석할 수 있지만, 아가로즈 겔 전기영동분석 시, 반응 튜브를 개봉하여 핵산 오염의 원인이 될 수 있었다.
따라서, 핵산 오염원 차단을 위하여 반응 튜브를 개봉하지 않고 측정할 수 있는 기술이 개발되고 있으며, 일반적으로 LAMP에서 사용되고 있는 탁도 측정법(Mori.Y. et al., Biochemical and Biophysical Research Communications, 2001, 289:150-154)은 등온 핵산 증폭 반응물 증가에 따라 피로인산마그네슘(Magnesium pyrophosphate, Mg2P2O7)에 의한 백색 침전물이 축적되어 400nM의 파장의 탁도를 측정하여 실시간 검출 및 end-point 검출이 가능하여 반응 튜브의 개봉 없이 핵산 증폭 여부를 확인할 수 있다.
그러나, 2개 이상의 타겟 구별과 같은 동시 다중 검출은 불가하며 측정하고자 하는 피로인산마그네슘의 침전으로 인해 측정법에 대한 정확도가 낮다는 단점이 있다. LAMP에서 핵산 증폭 여부를 실시간 측정하기 위한 형광검출법은 반응 튜브 개봉 없이 형광물질만을 측정하여 오염 발생을 제거시켰으며, 침전물 발생으로 인한 정확도 감소 효과도 없앨 수 있는 장점을 가지고 있다.
LAMP에 의한 핵산 증폭 서열 특이적으로 형광을 검출하기 위한 기술들이 개발되었다. 동화 프로브(Assimilating probe)는 핵산 증폭 서열 특이적으로 설계된 두가닥의 프로브로 FRET(Fluorescence Resonance Energy Transfer) 원리를 이용하여 실시간 측정하는 방법(Patent.No. PCR/US11/41540)이다. 두 가닥의 프로브 중 한 가닥은 리포터 염료가 5' 말단에 부착되고, 다른 한쪽 가닥은 3' 말단에 퀀처가 위치한다.
LAMP 핵산 증폭에 사용되는 올리고뉴클레오타이드의 수는 6가지로 다수의 프라이머가 포함되는데 동화 프로브는 이들 중 루프 프라이머의 하나를 대상으로 5'말단에 리포터 염료를 부착시킨 한쪽 가닥의 프로브를 설계한다. 그리고, 이에 상보적인 서열을 일부 설계하여 3' 말단에 퀀처를 부착시킨 다른 가닥의 프로브를 설계하여 7종의 올리고뉴클레오타이드를 합성해야 한다. 동화 프로브는 LAMP 반응 이전에 2개의 프로브를 고온에서부터 저온으로 천천히 온도를 감소시켜 한쌍의 프로브로 합성하여 핵산 증폭에 사용되어 진다. LAMP에서 유전자 서열 특이적인 실시간 검출을 위해 동화 프로브를 사용하여 핵산 증폭 반응시 LAMP 반응의 억제효과가 나타나 검출 시간과 실시간 측정 시간이 길어진다.
현재의 리얼타임 PCR 등을 비롯한 핵산 분석 방법들은 대부분 형광 신호를 기반으로 하기 때문에, 크고 값비싼 분석 장비와 고가의 형광 물질, 그리고 숙련된 전문인력 등이 반드시 필요하다는 단점이 있었다. 따라서 현재 핵산 분석을 기반으로 한 진단은 반드시 대학/종합 병원 또는 전문 진단 기관에의 의뢰를 통해서만 가능한 실정이어서 시료의 채취로부터 결과 통보까지 많은 시간과 비용이 소비된다. 이런 한계를 극복하기 위해서, 지역 소규모 병원 및 보건소, 또는 심지어 가정에서도 활용할 수 있도록, 저렴하고 소형의 장치에서도 간편하게 체외 분자 분석을 수행할 수 있는 새로운 방법의 개발이 필요하다.
대한민국 특허공개 제 10-2017-0132861호(분석물의 신속 검출용 바이오센서 시스템).
따라서, 본 발명은 상기 종래 기술의 문제점을 해결하기 위한 것으로서, 본 발명의 제 1 목적은 본 발명은 세척을 포함한 복잡한 여러 단계를 거치지 않고, 신호전달물질의 전극으로 이동 조절을 이용하여 실시간으로 핵산을 검출할 수 있는 핵산 증폭 기술에서 신호전달물질(전자전달매개체)을 이용한 핵산의 전기화학적 검출방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 제 2 목적은 대부분의 핵산 분석 방법에 이용되는 형광 신호를 대신하여 전기화학적인 신호전달물질을 이용함으로써 형광 물질의 냉장 보관 등 사용기간의 제한이라는 단점을 해소하고, 신호측정 전극을 2차원뿐만 아니라 3차원 적층 구조를 이용한 센서에 적용하여 정성 및/또는 정량적 핵산 측정이 가능한 검출방법을 제공하는 것이다.
다만, 본 발명에서 이루고자 하는 기술적 과제들은 이상에서 언급한 기술적 과제들로 제한되지 않으며, 언급하지 않은 또 다른 기술적 과제들은 아래의 기재로부터 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
상기의 기술적 과제를 달성하기 위하여, 검체로부터 분석 대상이 되는 핵산을 추출하여 농축하는 단계; 핵산이 용출된 용액에 중합효소, 프라이머 및 dNTPs(deoxynucleotide triphosphate)를 첨가하는 단계; 신호전달물질이 결합된 시그널 프로브를 첨가하는 단계; 생성된 혼합물에 대해 PCR과정을 수행하는 단계; 핵산외부가수분해효소(엑소뉴클리아제, exonuclease) 활성에 의해 올리고뉴클레오타이드와 상기 신호전달물질이 분해되는 단계; 분해되어 생성된 신호전달물질이 전극 표면의 극성 필터를 반응 전후로 통과하는 단계; 전극 주위의 효소-기질 반응에 의해 전자가 축적되는 단계; 전극으로부터 신호전달물질의 산화 및/또는 환원 전위에 기초하여 축적된 전자의 전기신호를 측정하는 단계; 및 전기신호에 기초하여 핵산을 정성 또는 정량적으로 산출하는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 핵산 증폭 기술에서 신호전달물질을 이용한 핵산의 전기화학적 검출방법에 의해 달성될 수 있다.
또한, 시그널 프로브는 올리고뉴클레오타이드의 5' 말단과 3'말단을 포함할 수 있다. 선택적으로, 시그널 프로브는 올리고뉴클레오타이드의 3'말단의 -OH기가 -NH2기로 변형되어 신장(extension)을 못하게 할 수 있다. 또한, 시그널 프로브를 사용하지 않는 경우에는 프라이머에 직접 신호전달물질을 결합시켜 PCR 반응을 진행시킬 수도 있다.
또한, 전기신호의 측정단계는 전극 표면을 음전하로 직접 코팅을 하거나 음전하 필터 형태로 하여, 전극으로의 물질 이동을 조절함으로서 전기신호를 정성 또는 정량적으로 측정할 수 있다.
또한, 서로 상이한 복수개의 핵산에 대해 시그널 프로브를 산화 및/또는 환원 전위가 다른 신호전달물질과 결합시켜 핵산의 프라이머와 같이 PCR과정을 수행함으로써 전기신호의 측정단계에서 각각의 핵산들을 정성 및 정량적 측정할 수 있다.
또한, 신호전달물질은 도파민, 니코틴아마이드 아데닌 다이뉴클레오타이드(NAD), 메틸렌블루(Methylene Blue), 철, 퀴논(quinones), 페로세인(ferrocene), 페로시아니드 (ferrocyanide), 오스뮴, 유로퓸 또는 루테늄 함유 유무기 복합체 중 하나이다.
또한, 신호전달물질은 또 다른 효소와 기질에 의하여 연속적인 신호전달을 수행하여 신호 증폭을 진행할 수 있다.
또한, 전기신호의 측정단계에서, 전기화학적 신호 측정모듈은 임피던스계(impedance), 양극 벗김 전압전류계(anodic stripping voltammetry, ASV), 대시간 전류계 (chronoamperometry, CA), 순환 전압전류계(cyclic voltammetry), 네모파 전압전류계(square wave voltammetry, SWV), 및 펄스 전압전류계(differential pulse voltammetry, DPV)로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다.
또한, 신호전달물질은 1 ~ 1000 Dalton 범위의 저분자이다.
또한, 시그널 프로브에 표지되는 전기화학적 물질은, 구리(Cu), 아연(Zn), 갈륨(Ga), 제마늄 (Ge), 인듐(In), 카드뮴(Cd), 니켈(Ni), 납(Pb), 안티몬(Sb), 비스무트(Bi), 주석(Sn), 탈륨(Tl), 수은(Hg), 금(Au), 은(Ag), 백금(Pt), 철(Fe), 오스뮴(Os), 유로퓸(Eu) 및 루테늄(Ru) 중 하나이다.
또한, 전기화학적 물질은 표지를 용이하게 하기 위해 이온(ion), 나노입자 (nanoparticle), 양자점(quantum dot), 및 그래핀(graphene) 형태로 사용가능하다.
또한, 전기화학적 물질은, 다중표적 핵산을 검출하는 경우 각각 서로 다른 산화/환원의 전위를 가진 신호전달물질을 각각의 프로부에 결합시켜야 하며, 신호의 민감도를 향상시키기 위해 수은(Hg) 또는 비스무트(Bi)를 첨가제로 사용할 수 있다.
또한, 핵산과 올리고뉴클레오타이드는 정전기적으로 음전하를 띈다.
선택적으로, 핵산의 추출하여 농축하는 단계는 추출 키트로 핵산을 정제하여 추출하는 단계, 검체를 일정온도로 상승시켜 핵산이 직접 용출되도록 하는 단계, 및 검체에 세제를 이용함으로서 핵산이 직접 용출되도록 하는 단계 중 하나가 사용될 수 있다.
선택적으로, PCR과정의 수행단계는 Reverse transcription PCR 과정 또는 핵산외부가수분해효소(exonuclase) 기능이 포함된 LAMP(Loop-mediated isothermal amplification) 과정으로 대체될 수 있다.
본 발명의 일실시예에 따르면, 타겟 핵산의 시그널 올리고뉴클레오타이드에 직접 전극의 신호전달물질을 결합시키고, 전극의 표면에 정전기적 필터를 통하여 신호전달과 별도의 효소반응에서 생성된 전기신호를 이용하여 특정반응의 신호로 증폭이 되도록 디자인함으로 신호검출을 위한 추가 시약 도입 없이도 핵산증폭결과 검출되는 여러종류의 신호 발생원을 하나의 챔버 또는 각각의 챔버에서 동시에 측정할 수 있는 정성 또는 정량적 측정방법을 제공할 수 있다.
다만, 본 발명에서 얻을 수 있는 효과는 이상에서 언급한 효과들로 제한되지 않으며, 언급하지 않은 또 다른 효과들은 아래의 기재로부터 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
본 명세서에서 첨부되는 다음의 도면들은 본 발명의 바람직한 실시예를 예시하는 것이며, 후술하는 발명의 상세한 설명과 함께 본 발명의 기술사상을 더욱 이해시키는 역할을 하는 것이므로, 본 발명은 그러한 도면에 기재된 사항에만 한정되어서 해석되어서는 아니된다.
도 1은 핵산 증폭과정에서 교정(Proofreading) 반응에 대한 반응도,
도 2는 핵산 증폭 과정의 생성물인 신호전달물질의 전극 전달 모식도,
도 3a는 바이오센서 중 한쌍의 3차원 전극(60a, 60b)의 사시도,
도 3b는 도 3a에 도시된 3차원 전극(60a, 60b)의 표면에 필터(50)로 코팅된 3차원 전극(70a, 70b)을 나타내는 사시도,
도 3c는 본 발명의 또 다른 실시예로서 도 3a에 도시된 바이오센서 중 한쌍의 2차원 전극(75a, 75b)의 사시도,
도 4는 본 발명의 제 1 실시예에 따른 핵산 증폭 기술에서 신호전달물질을 이용한 핵산의 전기화학적 검출방법의 개략적인 흐름도,
도 5는 본 발명의 제 2 실시예에 따른 핵산 증폭 기술에서 신호전달물질을 이용한 핵산의 전기화학적 검출방법의 개략적인 흐름도,
도 6은 본 발명의 제 3 실시예에 따른 핵산 증폭 기술에서 신호전달물질을 이용한 핵산의 전기화학적 검출방법의 개략적인 흐름도이다.
아래에서는 첨부한 도면을 참고로 하여 본 발명의 실시예에 대하여 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있도록 상세히 설명한다. 그러나 본 발명에 관한 설명은 구조적 내지 기능적 설명을 위한 실시예에 불과하므로, 본 발명의 권리범위는 본문에 설명된 실시예에 의하여 제한되는 것으로 해석되어서는 아니 된다. 즉, 실시예는 다양한 변경이 가능하고 여러 가지 형태를 가질 수 있으므로 본 발명의 권리범위는 기술적 사상을 실현할 수 있는 균등물들을 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 또한, 본 발명에서 제시된 목적 또는 효과는 특정 실시예가 이를 전부 포함하여야 한다거나 그러한 효과만을 포함하여야 한다는 의미는 아니므로, 본 발명의 권리범위는 이에 의하여 제한되는 것으로 이해되어서는 아니 될 것이다.
본 발명에서 서술되는 용어의 의미는 다음과 같이 이해되어야 할 것이다.
"제1", "제2" 등의 용어는 하나의 구성요소를 다른 구성요소로부터 구별하기 위한 것으로, 이들 용어들에 의해 권리범위가 한정되어서는 아니 된다. 예를 들어, 제1 구성요소는 제2 구성요소로 명명될 수 있고, 유사하게 제2 구성요소도 제1 구성요소로 명명될 수 있다. 어떤 구성요소가 다른 구성요소에 "연결되어" 있다고 언급된 때에는, 그 다른 구성요소에 직접적으로 연결될 수도 있지만, 중간에 다른 구성요소가 존재할 수도 있다고 이해되어야 할 것이다. 반면에, 어떤 구성요소가 다른 구성요소에 "직접 연결되어" 있다고 언급된 때에는 중간에 다른 구성요소가 존재하지 않는 것으로 이해되어야 할 것이다. 한편, 구성요소들 간의 관계를 설명하는 다른 표현들, 즉 "~사이에"와 "바로 ~사이에" 또는 "~에 이웃하는"과 "~에 직접 이웃하는" 등도 마찬가지로 해석되어야 한다.
단수의 표현은 문맥상 명백하게 다르게 뜻하지 않는 한 복수의 표현을 포함하는 것으로 이해되어야 하고, "포함하다" 또는 "가지다" 등의 용어는 설시된 특징, 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부분품 또는 이들을 조합한 것이 존재함을 지정하려는 것이며, 하나 또는 그 이상의 다른 특징이나 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부분품 또는 이들을 조합한 것들의 존재 또는 부가 가능성을 미리 배제하지 않는 것으로 이해되어야 한다.
여기서 사용되는 모든 용어들은 다르게 정의되지 않는 한, 본 발명이 속하는 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가진다. 일반적으로 사용되는 사전에 정의되어 있는 용어들은 관련 기술의 문맥상 가지는 의미와 일치하는 것으로 해석되어야 하며, 본 발명에서 명백하게 정의하지 않는 한 이상적이거나 과도하게 형식적인 의미를 지니는 것으로 해석될 수 없다.
제 1 실시예
도 1은 핵산 증폭과정에서 교정(Proofreading) 반응에 대한 반응도이고, 그리고 도 4는 본 발명의 제 1 실시예에 따른 핵산 증폭 기술에서 신호전달물질을 이용한 핵산의 전기화학적 검출방법의 개략적인 흐름도이다.
도 1, 4에 도시된 바와 같이, 먼저, 검체로부터 분석 대상이 되는 핵산을 추출하여 농축한다(S100). 구체적으로는 추출 키트(extraction kit)로 핵산을 정제하여 추출함으로써 검체 내에서 직접 RNA를 정제하여 준비한다.
그 다음, 핵산이 용출된 용액에 중합효소(polymerase), 프라이머(primer) 및 dNTPs(deoxynucleotide triphosphate)를 첨가하여 혼합물을 생성한다(S110);
그 다음, 혼합물에 신호전달물질(16)이 결합된 시그널 프로브를 첨가한다(S120). 도 1에 도시된 바와 같이, 시그널 프로브는 증폭하고자 하는 핵산의 특정 부위와 상보적 서열을 갖는 올리고뉴클레오타이드의 5'말단과 3'말단을 포함하는데 3'말단 부분은 프라이머 역할을 할 수 없도록 -OH기를 변형시켜 준비한다. 또한, 핵산과 올리고뉴클레오타이드는 정전기적으로 음전하를 띈다. 핵산과 올리고뉴클레오타이드는 음전하로 도포된 필터 또는 전극 표면이 음전하로 코팅되어 있는 상태에서는 전극표면에 전자전달을 수행하지 못하다가 핵산증폭과정에서 신호전달물질이 올리고뉴틀레오타이드와 분리되어 정전기적 변화가 발생하면 비로서 전극표면으로 이동가능하여 전기화학적인 신호를 측정하는 원리이다.
그리고, 신호전달물질은 도파민, 니코틴아마이드 아데닌 다이뉴클레오타이드(NAD), 메틸렌블루(Methylene Blue), 철, 퀴논(quinones), 페로세인(ferrocene), 페로시아니드(ferrocyanide), 오스뮴, 유로퓸 또는 루테늄 함유 유무기 복합체 중 하나가 될 수 있다. 특히, 유무기 복합체는 전기 전달 관련 신호발생부로 기능하는 유기 또는 금속 부분 이외에 핵산과의 공유 결합(17)을 위한 유기물 작용기 부분을 포함한다.
이러한 신호전달물질은 기질 또는 대사 초기물질에 대한 접근성이나 운동학적인 물리적 특성에 변화를 최소화하기 위하여 1 ~ 1000 Dalton 범위의 저분자가 되도록 한다.
또한, 신호전달물질은 또 다른 효소와 기질에 의하여 연속적인 신호전달을 수행하여 신호 증폭을 진행할 수 있다.
또한, 시그널 프로브에 표지되는 전기화학적 물질(예 : 금속)은, 구리(Cu), 아연(Zn), 갈륨(Ga), 제마늄 (Ge), 인듐(In), 카드뮴(Cd), 니켈(Ni), 납(Pb), 안티몬(Sb), 비스무트(Bi), 주석(Sn), 탈륨(Tl), 수은(Hg), 금(Au), 은(Ag), 백금(Pt), 철(Fe), 오스뮴(Os), 유로퓸(Eu) 및 루테늄(Ru) 중 하나이다.
또한, 전기화학적 물질은 표지를 용이하게 하기 위해 이온(ion), 나노입자 (nanoparticle), 양자점(quantum dot), 및 그래핀(graphene) 형태로 사용가능하다. 또한, 전기화학적 물질은, 다중표적 핵산을 검출하는 경우 각각 서로 다른 산화/환원의 전위를 가진 신호전달물질을 각각의 프로부에 결합시켜야 하며, 신호의 민감도를 향상시키기 위해 수은(Hg) 또는 비스무트(Bi)를 첨가제로 사용할 수 있다. 그 다음, 생성된 혼합물에 PCR과정(Annealing, Extension)을 수행한다(S130).
그 다음, 핵산외부가수분해효소(엑소뉴클리아제, exonuclease) 활성에 의해 올리고뉴클레오타이드와 신호전달물질이 분해(Hydrolysis)되도록 한다(S140).
그 다음, 분해되어 생성된 신호전달물질이 전극 표면의 극성 필터를 반응 전후로 통과한다(S150). 즉, 시그널 프로브에 전기화학적 신호전달물질을 직접 붙이고 교정 과정에 분리됨으로써 정전기적 신호가 바뀐 신호전달물질이 생성되고 반대의 정전기적 성질을 띠고 있는 필터를 이용하여 핵산증폭 반응 전후의 신호전달물질의 이동을 조절하는 것이다.
그 다음, 전극 주위에 효소-기질 반응에 의해 전자가 축적되어 있어(S160) 전극으로부터 신호전달물질의 산화 및/또는 환원 전위에 기초하여 직접과 별도의 효소-기질 반응에 의해 축적된 전자를 연속적으로 순환하면서 전달하여 전기신호를 측정한다(S170). 이때, 전극 표면을 음전하로 직접 코팅을 하거나 음전하 필터 형태로 하여, 전극으로의 물질 이동을 조절함으로서 전기신호를 정성 또는 정량적으로 측정할 수 있다(S180).
또한, 상기의 용액내 별도의 효소-기질 반응에 의해 전자를 전극 주위에 축적해 놓을 수 있는 반응은, 글루코스 산화효소(glucose oxidase, GOx)-글루코스, 글루코스 탈수소화효소(glucose dehydrogenase, GDH)-글루코스, 겨자물과산화효소(Horseradish peroxidase, HRP)-과산화수소(H2O2) 등이 한세트로 존재하여 전자를 생성하여 전극 주위에 전자를 축적해 놓을 수 있다.
또한, 전기화학적 신호 측정모듈은 임피던스계(impedance), 양극 벗김 전압전류계(anodic stripping voltammetry, ASV), 대시간 전류계 (chronoamperometry, CA), 순환 전압전류계(cyclic voltammetry), 네모파 전압전류계(square wave voltammetry, SWV), 및 펄스 전압전류계(differential pulse voltammetry, DPV)로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다.
도 2는 핵산 증폭 과정의 생성물인 신호전달물질의 전극 전달 모식도이다. 도 2에 도시된 바와 같이, 전극 표면에 음전하를 띤 고분자를 필터형태로 전극 표면 앞에 위치시키거나 직접 결합시키면 음전하를 띈 신호전달물질을 포함한 핵산중합체, 올리고뉴클레오타이드중합체 분자는 통과가 되지 않는다. 그러나, 핵산증폭 과정의 산물로 각각의 중합체에서 분리된 신호전달물질은 양전하 또는 중성전하를 띄게 되어 전극 표면으로 이동이 가능하여 전기적인 신호를 발생시킨다.
그 다음, 측정된 전기신호에 기초하여 별도의 계측장비를 통해 핵산을 정성 또는 정량적으로 산출한다(S180).
제 2 실시예
도 5는 본 발명의 제 2 실시예에 따른 핵산 증폭 기술에서 신호전달물질을 이용한 핵산의 전기화학적 검출방법의 개략적인 흐름도이다. 제 2 실시예의 각 단계는 핵산 용출단계(S200)를 제외하고 제 1 실시예의 각 단계와 대응적으로 동일하다. 따라서, 제 2 실시예에 대해서는 S200 단계를 설명하며 첨가단계(S210 단계) 내지 산출단계(S280)는 제 1 실시예의 첨가단계(S110 단계) 내지 산출단계(S180)로 갈음한다.
핵산 용출단계(S200)는 검체를 일정온도(예 : 85℃)로 상승시킨 후 수분간(1분 ~ 10분) 유지하면서 반응시킴으로서 검체 내에서 직접 핵산(DNA, RNA)이 용출되도록 한다. 핵산 용출단계(S200) 이후의 단계는 제 1 실시예와 동일하다.
제 3 실시예
도 6은 본 발명의 제 3 실시예에 따른 핵산 증폭 기술에서 신호전달물질을 이용한 핵산의 전기화학적 검출방법의 개략적인 흐름도이다. 제 3 실시예의 각 단계는 핵산 용출단계(S300)를 제외하고 제 1 실시예의 각 단계와 대응적으로 동일하다. 따라서, 제 3 실시예에 대해서는 S300 단계를 설명하며 첨가단계(S310 단계) 내지 산출단계(S380)는 제 1 실시예의 첨가단계(S110 단계) 내지 산출단계(S180)로 갈음한다.
핵산 용출단계(S300)는 검체의 핵산(DNA, RNA)에 세제(Detergent)를 이용함으로서 검체 내에서 직접 핵산(DNA, RNA)이 용출되도록 한다. 핵산 용출단계(S300) 이후의 단계는 제 1, 2 실시예와 동일하다.
바이오센서
도 3a는 바이오센서 중 한쌍의 3차원 전극(60a, 60b)의 사시도이다. 도 3a에 도시된 바와 같이, 한쌍의 3차원 전극(60a, 60b)은 기판(80)으로부터 돌출된 채 상호 만곡된 채로 이격되어 있다. 이러한 한쌍의 3차원 전극(60a, 60b)은 본 발명의 생성물인 신호전달물질이 전극표면에서 확산되는 것을 용이하게 하여 기존의 신호측정 전극보다 민감도를 높이는 기능을 한다.
한쌍의 3차원 전극(60a, 60b)이 돌출됨으로써 전극(60a, 60b)만 분석물의 액체에 담그거나 전극(60a, 60b)에만 마이크로 액적을 떨어뜨릴 수 있다. 이격거리는 1mm ~ 10mm 범위에서 적절히 선택될 수 있다. 너무 가까우면 단선될 수 있고, 너무 멀면 전류가 미약할 수 있기 때문이다. 한쌍의 3차원 전극(60a, 60b)은 제어부(미도시)에 의해 일정한 정전압(예 : 0.2V, 0.5V, 1.0V, 1.2V, 1.4V, ... ,3V)이 인가된다. 서로 다른 정전압에 의해 서로 다른 성분을 검출할 수 있다. 예를 들어, 분석물이 소변인 경우 비타민C가 많으므로 0.1V를 인가하여 오스뮴만을 검출할 수 있다.
도 3b는 도 3a에 도시된 3차원 전극(60a, 60b)의 표면에 필터(50)로 코팅된 3차원 전극(70a, 70b)을 나타내는 사시도이다. 도 3b에 도시된 바와 같이, 코팅된 3차원 전극(70a, 70b)은 미세한 세공을 갖는 필터(50)로 표면이 코팅되며, 필터(50)는 음극(-)으로 여기된다. 필터(50)는 도포되거나 씌워질 수 있다. 필터(50)는 멤브레인 막 또는 고분자막이 될 수 있고, 전도성 촉매로 이루어질 수 있다.
도 3c는 또 다른 실시예로서 바이오센서 중 한쌍의 2차원 전극(75a, 75b)의 사시도이다. 한쌍의 2차원 전극(75a, 75b)은 기판(80)과 같은 평면이거나 살짝 돌출된 형상일 수 있다.
변형 실시예
본 발명에서 핵산 증폭 과정은 PCR과정을 설명하였으나 그 외에도 end-point PCR, Reverse transcription PCR 과정 또는 핵산외부가수분해효소(exonuclase) 기능이 포함된 LAMP(Loop-mediated isothermal amplification) 과정으로 대체할 수 있다.
만약, 서로 상이한 복수개의 핵산에 대해 측정하고자 할 경우, 시그널 프로브를 산화 및/또는 환원 전위가 다른 신호전달물질과 결합시켜 핵산의 프라이머와 같이 PCR과정을 수행함으로써 전기신호의 측정단계에서 각각의 핵산들을 정성 및 정량적 측정할 수도 있다. 즉, 2개 이상의 타켓 핵산을 이용하여 각각의 시그널 프로브에 결합시킨 산화/환원 전위가 다른 신호전달물질을 이용하여 동시 진단을 수행할 수 있다.
다중표적 핵산을 검출하는 경우 전기화학적 물질인 전자전달매개체들은 각각 서로 다른 산화/환원 전위를 가지고 있어야 하며, 신호의 민감도를 향상시키기 위해 수은(Hg) 또는 비스무트(Bi) 등의 첨가제를 사용할 수 있다.
그 밖에도, 최종 반응물인 신호전달물질이 용액 내에서 글루코스 산화효소(glucose oxidase)와 글루코스가 존재하여 생성된 전자를 전극에 전달하여 신호를 증폭할 수 있다.
선택적으로, 최종 반응물인 신호전달물질이 용액 내에서 글루코스 탈수소효소(dehydrogenase)와 글루코스가 존재하여 생성된 전자를 전극에 전달하여 신호를 증폭할 수도 있다.
본 발명에서는 3차원 전극을 사용함으로 기존 2차원 전극에서 용액과 전극의 접촉되는 접촉면에 한하여 신호 전달이 되는 단점을 입체적으로 제작할 수 있다. 2차원의 경우에도 여러 부위에 신호 발생원의 결과를 별도로 인식하게 디자인함으로 다중 검사는 물론 높은 효율의 신호 검출이 가능한 시스템을 만들 수 있는 장점도 있다.
상술한 바와 같이 개시된 본 발명의 바람직한 실시예들에 대한 상세한 설명은 당업자가 본 발명을 구현하고 실시할 수 있도록 제공되었다. 상기에서는 본 발명의 바람직한 실시예들을 참조하여 설명하였지만, 해당 기술 분야의 숙련된 당업자는 본 발명의 영역으로부터 벗어나지 않는 범위 내에서 본 발명을 다양하게 수정 및 변경시킬 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 예를 들어, 당업자는 상술한 실시예들에 기재된 각 구성을 서로 조합하는 방식으로 이용할 수 있다. 따라서, 본 발명은 여기에 나타난 실시형태들에 제한되려는 것이 아니라, 여기서 개시된 원리들 및 신규한 특징들과 일치하는 최광의 범위를 부여하려는 것이다.
본 발명은 본 발명의 정신 및 필수적 특징을 벗어나지 않는 범위에서 다른 특정한 형태로 구체화될 수 있다. 따라서, 상기의 상세한 설명은 모든 면에서 제한적으로 해석되어서는 아니 되고 예시적인 것으로 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 첨부된 청구항의 합리적 해석에 의해 결정되어야 하고, 본 발명의 등가적 범위 내에서의 모든 변경은 본 발명의 범위에 포함된다. 본 발명은 여기에 나타난 실시형태들에 제한되려는 것이 아니라, 여기서 개시된 원리들 및 신규한 특징들과 일치하는 최광의 범위를 부여하려는 것이다. 또한, 특허청구범위에서 명시적인 인용 관계가 있지 않은 청구항들을 결합하여 실시예를 구성하거나 출원 후의 보정에 의해 새로운 청구항으로 포함할 수 있다.
10 : 제 1 DNA 가닥,
12 : 제 2 DNA 가닥,
14 : 프라이머(Primer),
16 : 신호전달물질(전자전달매개체),
16a : 필터를 통과할 수 있는 신호전달물질,
17 : 공유결합,
18 : 프로브(Probe),
50 : 필터,
60, 60a, 60b : (미코팅된) 3차원 전극,
70, 70a, 70b : 코팅된 3차원 전극,
75a, 75b : 코팅된 2차원 전극,
80 : 기판.

Claims (13)

  1. 검체로부터 분석 대상이 되는 핵산을 추출하여 농축하는 단계;
    상기 핵산이 용출된 용액에 중합효소, 프라이머 및 dNTPs를 첨가하는 단계;
    하나 이상의 뉴클레오타이드에 신호전달물질이 결합된 시그널 프로브를 첨가하는 단계;
    생성된 혼합물에 PCR과정을 수행하는 단계;
    핵산외부가수분해효소(엑소뉴클리아제, exonuclease) 활성에 의해 올리고뉴클레오타이드와 상기 신호전달물질이 분해되는 단계;
    분해되어 생성된 상기 신호전달물질이 전극 표면의 극성 필터를 반응 전후로 통과하는 단계;
    상기 전극 주위의 효소-기질 반응에 의해 전자가 축적되는 단계;
    상기 전극으로부터 상기 신호전달물질의 산화 및/또는 환원 전위에 기초하여 축적된 전자의 전기신호를 측정하는 단계; 및
    상기 전기신호에 기초하여 상기 핵산을 정성 또는 정량적으로 산출하는 단계;를 포함하고,
    상기 전기신호의 측정단계는 상기 전극 표면을 음전하로 직접 코팅을 하거나 음전하 필터 형태로 하여, 상기 전극으로의 물질 이동을 조절함으로서 상기 전기신호를 정성 또는 정량적으로 측정하며, 그리고
    상기 신호전달물질은 1 ~ 1000 Dalton 범위의 저분자인 것을 특징으로 하는 핵산 증폭 기술에서 신호전달물질을 이용한 핵산의 전기화학적 검출방법.
  2. 검체로부터 분석 대상이 되는 핵산을 추출하여 농축하는 단계;
    상기 핵산이 용출된 용액에 중합효소, 하나 이상의 뉴클레오타이드에 신호전달물질이 결합된 프라이머 및 dNTPs를 첨가하는 단계;
    생성된 혼합물에 대해 PCR과정을 수행하는 단계;
    핵산외부가수분해효소(엑소뉴클리아제, exonuclease) 활성에 의해 올리고뉴클레오타이드와 상기 신호전달물질이 분해되는 단계;
    분해되어 생성된 상기 신호전달물질이 전극 표면의 극성 필터를 반응 전후로 통과하는 단계;
    상기 전극 주위의 효소-기질 반응에 의해 전자가 축적되는 단계;
    상기 전극으로부터 상기 신호전달물질의 산화 및/또는 환원 전위에 기초하여 축적된 전자의 전기신호를 측정하는 단계; 및
    상기 전기신호에 기초하여 상기 핵산을 정성 또는 정량적으로 산출하는 단계;를 포함하고,
    상기 전기신호의 측정단계는 상기 전극 표면을 음전하로 직접 코팅을 하거나 음전하 필터 형태로 하여, 상기 전극으로의 물질 이동을 조절함으로서 상기 전기신호를 정성 또는 정량적으로 측정하며, 그리고
    상기 신호전달물질은 1 ~ 1000 Dalton 범위의 저분자인 것을 특징으로 하로 하는 핵산 증폭 기술에서 신호전달물질을 이용한 핵산의 전기화학적 검출방법.
  3. 제 1 항에 있어서,
    상기 시그널 프로브는 올리고뉴클레오타이드의 3'말단의 -OH기가 -NH2기로 변형되어 신장(extension)을 못하게 하는 것을 특징으로 하는 핵산 증폭 기술에서 신호전달물질을 이용한 핵산의 전기화학적 검출방법.
  4. 삭제
  5. 제 1 항에 있어서,
    서로 상이한 복수개의 상기 핵산에 대해 상기 시그널 프로브를 산화 및/또는 환원 전위가 다른 신호전달물질과 결합시켜 상기 핵산의 프라이머와 같이 상기 PCR과정을 수행함으로써
    상기 전기신호의 측정단계에서 각각의 핵산들을 정성 및 정량적 측정할 수 있는 것을 특징으로 하는 핵산 증폭 기술에서 신호전달물질을 이용한 핵산의 전기화학적 검출방법.
  6. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    상기 신호전달물질은 도파민, 철, 니코틴아마이드 아데닌 다이뉴클레오타이드(NAD), 메틸렌블루(Methylene Blue), 퀴논(quinones), 페로세인(ferrocene), 페로시아니드 (ferrocyanide), 오스뮴, 유로퓸 또는 루테늄 함유 유무기 복합체 중 하나인 것을 특징으로 하는 핵산 증폭 기술에서 신호전달물질을 이용한 핵산의 전기화학적 검출방법.
  7. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    상기 신호전달물질은 또 다른 효소와 기질에 의하여 연속적인 신호전달을 수행하여 신호 증폭을 진행하는 것을 특징으로 하는 핵산 증폭 기술에서 신호전달물질을 이용한 핵산의 전기화학적 검출방법.
  8. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    상기 전기신호의 측정단계에서, 전기화학적 신호 측정모듈은 임피던스계(impedance), 양극 벗김 전압전류계(anodic stripping voltammetry, ASV), 대시간 전류계 (chronoamperometry, CA), 순환 전압전류계(cyclic voltammetry), 네모파 전압전류계(square wave voltammetry, SWV), 및 펄스 전압전류계(differential pulse voltammetry, DPV)로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 핵산 증폭 기술에서 신호전달물질을 이용한 핵산의 전기화학적 검출방법.
  9. 삭제
  10. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    상기 시그널 프로브에 표지되는 전기화학적 물질은, 구리(Cu), 아연(Zn), 갈륨(Ga), 제마늄 (Ge), 인듐(In), 카드뮴(Cd), 니켈(Ni), 납(Pb), 안티몬(Sb), 비스무트(Bi), 주석(Sn), 탈륨(Tl), 수은(Hg), 금(Au), 은(Ag), 백금(Pt), 철(Fe), 오스뮴(Os), 유로퓸(Eu) 및 루테늄(Ru) 중 하나인 것을 특징으로 하는 핵산 증폭 기술에서 신호전달물질을 이용한 핵산의 전기화학적 검출방법.
  11. 제 10 항에 있어서,
    상기 전기화학적 물질은 표지를 용이하게 하기 위해 이온(ion), 나노입자 (nanoparticle), 양자점(quantum dot), 및 그래핀(graphene) 형태로 사용가능한 것을 특징으로 하는 핵산 증폭 기술에서 신호전달물질을 이용한 핵산의 전기화학적 검출방법.
  12. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    상기 핵산과 상기 올리고뉴클레오타이드는 정전기적으로 음전하를 띠는 것을 특징으로 하는 핵산 증폭 기술에서 신호전달물질을 이용한 핵산의 전기화학적 검출방법.
  13. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    상기 PCR과정의 수행단계는 Reverse transcription PCR 과정 또는 핵산외부가수분해효소(exonuclase) 기능이 포함된 LAMP(Loop-mediated isothermal amplification) 과정으로 대체될 수 있는 것을 특징으로 하는 핵산 증폭 기술에서 신호전달물질을 이용한 핵산의 전기화학적 검출방법.
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