JP2013013375A - 電極上における核酸の増幅反応を伴う電気化学的検出方法 - Google Patents

Abstract

【課題】蛍光物質を利用することなく、増幅された核酸を電気化学的に定量・検出する方法を提供すること。
【解決手段】検出対象となる標的核酸の相補鎖の部分配列を電極上に固定し、電極上で増幅反応を行わせ、酸化還元活性を有する物質の存在のもと増副核酸を電気化学的に検出する。
【選択図】なし

Description

本発明は、電極上における核酸の増幅反応およびそれの電気化学的検出方法に関する。

ガンや感染症等の診断において、従来の生化学検査や病理検査に加えて遺伝子を解析する遺伝子検査が行われている。例えば、外科手術においてガン病巣の切除範囲を決定するためには、病巣周辺の組織を切除し、組織中のガン特有遺伝子を定量した上で病巣を取り除いている。

臨床結果を待つまでもなく、遺伝子レベルでの診断の有用性は広く認識されており、多数の研究例が報告されている。何れの研究例においても、検体である組織や細胞中に含まれる遺伝子（核酸）が微量なことから、ＰＣＲ等により標的核酸を増幅して解析する方法が用いられている。増幅工程の後の核酸の検出には、ハイブリダイゼーション法等が、簡便であることから利用されている。

ハイブリダイゼーション法とは、ガラスや合成樹脂などの固体基板上に標的核酸に対して相補的なプローブとなる核酸を固定化し、そこに増幅核酸を添加・作用させることにより二本鎖を形成（ハイブリダイゼーション）させ、所定時間後、ハイブリダイゼーションの有無あるいは形成割合を検出する方法である。核酸のハイブリダイゼーションは、核酸の塩基配列に基づく高い特異性のもとで生じるため、高度な選択性を有する核酸の検出のために広く用いられている。

ハイブリダイゼーションした核酸の検出法としては、蛍光物質を用いる方法が利用されている。蛍光検出法では、蛍光物質により標識した標的核酸とプローブ核酸との間でのハイブリダイゼーションを起こさせ、ハイブリダイゼーションの割合を蛍光強度により定量することが行われている（特許文献１、特許文献２）。

しかしながら、蛍光検出法においては、蛍光物質の退色性や非特異的に発生するバックグラウンド蛍光の存在による感度の低下が、常に技術問題として挙げられている。

特許第２６５０１５９号 特表平４−５００７５９号公報

本発明の課題は、蛍光物質を利用することなく、増幅された核酸を電気化学的に定量・検出する方法を提供することにある。

本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討した結果、検出対象となる標的核酸の相補鎖の部分配列を電極上に固定し、電極上で増幅反応を行わせ、酸化還元活性を有する物質の存在のもと増副核酸を電気化学的に検出できることを見出し、本願発明を完成させるに至った。
すなわち、本願は以下の（１）から（７）に記載の態様を包含する：
（１）試料中の核酸を定量しおよび／または解析するための方法であって、（ａ）試料中の核酸あるいはその相補鎖にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸を電極上に固定し、（ｂ）固定化した核酸をプライマーとして利用した増幅反応を行うことにより、電極上で検出対象とする核酸の一部、もしくは全部を増幅させ、二本鎖核酸として電極上に配置し、（ｃ）電気化学応答の測定を行う、工程を含んでなる方法。
（２）（１）の工程（ｂ）で電極上に配置した二本鎖核酸に、酸化還元活性を有する物質を結合させる工程を含む（１）に記載の方法。
（３）酸化還元活性を有する物質がフェロセン化ナフタレンジイミド（ＦＮＤ）であることを特徴とする（２）に記載の方法。
（４）酸化還元活性を有する物質がルテニウム錯体であることを特徴とする（２）に記載の方法。
（５）試料中の検出対象とする核酸がＲＮＡであることを特徴とする（１）から（４）のいずれかに記載の方法。
（６）増幅反応に逆転写酵素を用いることを特徴とする（５）に記載の方法。
（７）試料中の核酸あるいはその相補鎖にストリンジェントな条件下でにハイブリダイズする核酸を固定した電極と、（１）に記載の工程（ｂ）における増幅反応に必要な試薬を含む（１）から（６）のいずれかに記載の方法による核酸検出用キット。

標的核酸にハイブリダイズする電極上に固定化した一本鎖プライマーを利用して増幅反応を行うことにより、標的となる核酸の増幅とその増幅産物を電気化学的に検出することができ、遺伝子検査への利用性を高めることができる。

本発明は、試料中の核酸を定量しおよび／または解析するための方法であって、（ａ）試料中の核酸あるいはその相補鎖にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸を電極上に固定し、（ｂ）固定化した核酸をプライマーとして利用した増幅反応を行うことにより、電極上で検出対象とする核酸の一部、もしくは全部を増幅させ、二本鎖核酸として電極上に配置し、（ｃ）電気化学応答の測定を行う、工程を含んでなる方法を提供する。

本発明における検出すべき「試料中の核酸」は、ＤＮＡもしくはＲＮＡ、あるいはそのハイブリッドであっても良く、増幅可能な人工核酸を含んでいても良い。また、その形状は一本鎖もしくは二本鎖以上であっても良い。

「検出対象とする核酸」（標的核酸）の塩基配列の長さは、プライマーが標的核酸にハイブリダイズして増幅できる長さであれば良く、好ましくは１０から１，０００ｍｅｒ、より好ましくは２０から１００ｍｅｒである。

核酸を含む「試料」としては、ヒト組織、ヒト臓器、血清、血漿等を例示することができ、検査診断の方法に応じて適宜選択され利用される。試料からの核酸抽出は、必要な量の標的核酸が得られる方法であれば良く、好ましくは試料中に存在する夾雑物質を排して選択的に（従って、高純度で）核酸を抽出できる方法である。

「ストリンジェントな条件」とは、任意の核酸が、他の核酸を含む混合物中で、その標的核酸にはハイブリダイズするが、他の核酸にはハイブリダイズしない条件を意味する。ハイブリダイズする核酸の配列がより長い場合には、より特異的に、より高温でハイブリダイズすることができる。一般に、高ストリンジェントな条件は、既定のイオン強度およびｐＨで特異的配列の融解温度より約５から１０℃低くなるように選択される。これに対して低ストリンジェントな条件は、一般的には融解温度より約１５〜３０℃低くなるように選択される。融解温度とは、既定のイオン強度、ｐＨ、核酸配列で標的核酸に対して相補的な核酸において５０％が平衡状態で占める温度である。

電極に固定する「核酸」は、ＤＮＡもしくはＲＮＡ、あるいはそのハイブリッドであっても良く、増幅可能な人工核酸を含んでいても良い。また、その塩基配列の長さは特異的なハイブリダイズに適した長さであれば任意の長さで良く、好ましくは５から１，０００ｍｅｒ、より好ましくは１０から１００ｍｅｒである。

電極に核酸を固定する際には、核酸溶液を調製し電極に添加することで、核酸と非特異な電極表面の反応により固定することもできるが、核酸の固定化量を制御できる点や所定の強度のもとに核酸を電極に固定化できる点で、核酸に化学修飾を施すことが好ましい。核酸の化学修飾は、核酸の５‘末端あるいは３’末端でも良く、核酸配列の物理的特性に応じて適宜選択すれば良い。核酸に導入する官能基としては、アミノ基、アルデヒド基、チオール基、リン酸基、−ＳＨ基（チオール基）、ビオチン等が挙げられるが、この中でも、アミノ基、チオール基が特に好ましく用いることができる。官能基の導入法は、当業者では周知であり、導入する官能基は適宜選択して、既知の化学合成法により核酸に導入することができる。

核酸溶液を調製する際には、ｐＨを制御できる緩衝液を用いることが好ましく、緩衝液としては、酢酸緩衝液、リン酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、グリシン緩衝液等の無機塩からなる緩衝液、あるいはＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液等を例示することができる。

標的核酸の塩基配列は、学術情報や公的データベース（ｈｔｔｐ://ｗｗｗ.ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｇｅｎｂａｎｋ／）などの塩基配列情報を参考にして配列の解析を行うことにより決定することができる。

「電極」として、好ましく用いられるのは、金、銀、白金に代表される金属や、カーボン、ＩＴＯなどが挙げられ、より好ましくは核酸に導入する一例として挙げたチオール基との配位結合に優れた金である。

本発明において「プライマー」とは、ポリメラーゼが核酸を伸長合成する際に３’水酸基を供給する役割をもつ短い核酸断片であり、一本鎖のＤＮＡもしくはＲＮＡ、あるいはそのハイブリッドであり、その塩基配列の長さは５から１００ｍｅｒ、より好ましくは１５から３０ｍｅｒである。本発明においては、プライマーは試料中の核酸もしくはその相補鎖とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする性能を有しており、試料中の核酸もしくはその相補鎖と部分的な二本鎖を形成することで核酸の伸長合成の出発点として機能する。プライマーとしては、例えば、ＴＲＣ法（Ｉｓｈｉｇｕｒｏ Ｔ ｅｔ ａｌ. Ａｎａｌ. Ｂｉｏｃｈｅｍ． ３１４：:７７−８６， ２００３）におけるフォワードプライマー（Ｆｏｗａｒｄ Ｐｒｉｍｅｒ）あるいはリバースプライマー（Ｒｅｖｅｒｓｅ
Ｐｒｉｍｅｒ）を例示することができる。

「増幅反応」とは、電極上に固定化した核酸（プライマー）がハイブリダイズする試料中の検出対象とする核酸（鋳型核酸）からその複製を合成する反応である。増幅反応としては、試料中の検出対象とする核酸がＲＮＡである場合、例えば、ＴＲＣ法、ＮＡＳＢＡ法、ＴＭＡ法、ＲＴ−ＰＣＲ法などが例示でき、試料中の検出対象とする核酸がＤＮＡである場合、例えば、ＰＣＲ法などが例示できる。また、これら方法に限らず、その他、鋳型依存性ＤＮＡポリメラーゼを用いた方法、逆転写酵素を含む鋳型依存型ＲＮＡポリメラーゼを用いた方法、もしくはその組み合わせを用いた方法を例示することができる。

用いる増幅反応がＴＲＣ反応の場合、反応液中では通常のＴＲＣ反応と同様に、陽性標準液中の鋳型ＲＮＡがシザープローブによりトリミングされた後、リバースプライマーとハイブリダイズし、酵素によりリバースプライマーが伸長し、さらにＲＮＡ鎖が加水分解される。合成された一本鎖ＤＮＡはフォワードプライマーとハイブリダイズし、酵素によりフォワードプライマーが伸長し二本鎖ＤＮＡが合成される。二本鎖ＤＮＡを鋳型として、トリミングされた鋳型ＲＮＡの複製が合成される。一方、電極上でも同様の反応が進行し、電極上に固定化されたリバースプライマーにトリミングされた鋳型ＲＮＡがハイブリダイズし、酵素によりリバースプライマーが伸長し、さらにＲＮＡ鎖が加水分解される。合成された一本鎖ＤＮＡは電極上に固定されており、さらにフォワードプライマーとハイブリダイズし、酵素によりフォワードプライマーが伸長し、電極上に固定された二本鎖ＤＮＡが合成される（Ｉｓｈｉｇｕｒｏ Ｔ ｅｔ ａｌ. Ａｎａｌ. Ｂｉｏｃｈｅｍ． ３１４：:７７−８６， ２００３）。

「電気化学応答の測定」とは、物質の濃度や種類を電気的に計測する方法であり、電位差滴定法、クロノクーロメトリー法、交流インピーダンス法、ボルタンメトリー（ｖｏｌｔａｍｍｅｔｒｙ）法などを例示できる。特に測定装置が小型にでき、電位を変化させ、それに応答して変化する電流を計測するボルタンメトリー法が好ましい。ボルタンメトリー法の中でも、特に、高感度と迅速性に優れた矩形波ボルタンメトリー法が好ましい。

電気化学的応答をより精度高く測定するためには、反応液中に「酸化還元活性を有する物質」を添加することが好ましい。酸化還元活性を有する物質には、ヘキスト３３２５８、メチレンブルー、ＦＮＤ（フェロセン化ナフタレンジイミド）、ルテニウム錯体などを例示することができる。電気化学的に反応しやすく、小さい電位の変化により酸化還元反応が進行する点で、ＦＮＤがより好ましい。

酸化還元活性を有する物質を結合させる工程とは、当該物質を電極上で増幅し配置させた二本鎖核酸に特異的に結合させる工程である。この工程は、例えば、ヘキスト３３２５８、メチレンブルー、ＦＮＤなどが有する二本鎖核酸への特異的結合性を利用し、両者を接触させる工程、もしくは増幅反応に用いるプライマーあるいは基質にこれら物質を予め結合させておくことで、増幅反応によりこれら物質が二本鎖核酸に特異的に取り込まれる工程である。前者の工程では、例えば、増幅した二本鎖核酸に対して過剰量（好ましくは１から１，０００μＭ、より好ましくは１０から５０μＭ）のＦＮＤを含む溶液に電極を浸せば良い。後者の工程では、例えば、フォワードプライマーの５’末端に既知の化学合成方法を利用しルテニウム錯体を結合させ、増幅反応に用いれば良い。

また、本発明は、試料中の核酸あるいはその相補鎖にストリンジェントな条件下でにハイブリダイズする核酸を固定した電極と、上記本発明の方法における工程（ｂ）における増幅反応に必要な試薬を含む、上記本発明の方法による核酸検出用キットを提供する。

「増幅反応に必要な試薬」としては、例えば、ポリメラーゼ、逆転写酵素、基質などが挙げられる。

「核酸を固定した電極」は、例えば、電極マットや導電板とともに基板上に配置し、測定ウェルとして組み立てることができる。基板においては、当該電極に上記増幅反応に必要な試薬を添加した場合でも、液体が拡散しないように、当該電極を配置する領域の周囲には区画が設けられていることが好ましい。こうして組み立てた測定ウェルは、電気化学アナライザーなどの装置に適用して、試料中の核酸を定量しおよび／または解析することができる。

さらに、本発明のキットには、洗浄液、対照（陰性対照、陽性対照）となる溶液、当該キットの説明書が含まれていてもよい。

以下に本発明を更に詳細に説明するために実施例を示すが、これら実施例は本発明の一例を示すものであり、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。

[実施例１] 電極への核酸の固定化
電極ホルダーに金電極、電極マット、導電板をセットし測定ウェルを組み立てた（羽野製作所製）。ＣＵＴＥ １ＭＰＲ（フェムトサイエンス社製）を用いて０．５Ｔｏｒｒ、３０ｓｃｃｍ Ａｉｒ、出力７０％で３０秒のプラズマ照射を行った。５、５０、１００、２００ｎＭに調製した配列番号１に記載した合成ＤＮＡ（Ｇｅｎｅｔ社製）を１００ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ６−メルカプトヘキサノールになるように調整した溶液３００μＬをそれぞれ測定ウェルに加えて密閉し、３７℃で２時間インキュベートし上述のＤＮＡを固定化しプローブとした。なお、プローブ（配列番号１）の５’端の−ＳＳ−は、プローブを電極に固定するために付加したチオール結合を示すものであり、またプローブ（配列番号１）の５’端側に存在する８個の「ｔ」は、プローブ中に含まれ、後述するＴＲＣ法に基づく増幅においてリバースプライマーとして機能する３’端の１８塩基部分を電極から一定程度離間させるためのものである。このように、プローブは電極から一定程度離間させた方が好ましく、そのためには適当な塩基をプローブの、リバースプライマーとして機能する部分の５’側に付加すれば良いが、当該付加部分による非特異的な結合を抑制するためには、測定対象に含まれていない塩基（又は塩基配列）を選択することが好ましく、またその塩基数は５から１５ｍｅｒ程度、好ましくは８から１０ｍｅｒ程度である。

[実施例２] 増幅反応前の矩形波ボルタンメトリー測定
アスピレータで溶液を除去後、測定ウェルをＲＮａｓｅ
Ｆｒｅｅ水３００μＬで２回洗浄した。次いで、３００μＬの０．１Ｍ 酢酸カリウム緩衝液（ｐＨ５．５）で洗浄した後、２０μＭのＦＮＤを含む０．１Ｍの酢酸カリウム緩衝液（Ｓａｔｏ等，Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，１４，６９３−７０７（２００５））を添加し、室温で１０分間静置し電気化学測定を行った。電気化学測定には参照電極としてＡｇ／ＡｇＣｌ、対極にＰｔ電極を用いて、Ｉｎｉｔ Ｅ（Ｖ）=０、Ｆｉｎａｌ Ｅ（Ｖ）＝０．６、Ｉｎｃｒ Ｅ（Ｖ）＝０．０１、Ａｍｐｌｉｔｕｄｅ（Ｖ）＝０．０５、Ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ（ＨＺ）＝１００、Ｑｕｉｔ Ｔｉｍｅ（Ｓ）＝３、Ｓｅｎｓｉｖｉｔｙ（Ａ／Ｖ）＝１ｅ−５のパラメータでＡＬＳ Ｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ａｎａｌｙｚｅｒ（ＣＨ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ Ｉｎｃ．社製）を用いて矩形波ボルタンメトリー測定を行った。

[実施例３] 核酸増幅反応
核酸増幅反応は、ＴＲＣ法（Ｉｓｈｉｇｕｒｏ Ｔ ｅｔ ａｌ. Ａｎａｌ. Ｂｉｏｃｈｅｍ． ３１４：:７７−８６， ２００３）により実施した。また、核酸増幅反応には、市販の結核菌群検出試薬（東ソー社製）を用いた。すなわち、陽性酵素反応液として結核菌群ｒＲＮＡ検出試薬の基質試薬１５μＬ、陰性標準液６μＬ、陽性標準液１．５μＬ（陰性酵素反応液の場合は陰性標準液に変更）に、別途調製したプライマー試薬１５μＬ（３００ｍＭ ＫＣｌ、３９％ Ｄｉｍｅｔｈｙｌ ｓｕｌｏｘｉｄｅ、３μＭ リバースプライマー（配列番号２）、３μＭ フォワードプライマー（配列番号３）、０．４８μＭ シザープローブ（配列番号４））を混合し、実施例１にて調製した、プローブが固定された電極を有する測定ウェルに添加した後４２℃に加温し、さらに４２℃に加温しておいた酵素試薬７．５μＬを素早く混和し以下の操作に用いた。

測定ウェルの溶液をアスピレータで除去し、０．０２Ｕ／μＬ ＲＮａｓｅ
ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）を加えたＲＮａｓｅ Ｆｒｅｅ水３００μｌで２回洗浄した。アスピレータで溶液を除去した後、調製した陽性酵素反応溶液あるいは対照となる陰性酵素反応溶を１０μＬずつ加え、４２℃で２０分間インキュベートしＴＲＣ反応を進行させた。

この操作において、電極に固定されたプローブと、別途調製したプライマー試薬に含まれるリバースプライマーは同一の塩基配列部分を有する。これにより、結核菌群のｒＲＮＡが電極に固定されたプローブ及び／又はプライマー試薬に含まれるリバースプライマーと結合することによってＴＲＣ法に基づく増幅が開始され、前記ＲＮＡと同一の配列を有する増幅産物（ＲＮＡ）を転写可能な二重鎖ＤＮＡが液中及び／又は電極上に作られる（電極上につくられる二重鎖ＤＮＡの一方は、ＴＲＣ法に基づく増幅によって伸張された、実施例１において電極に固定されたプローブである）。そして、この二重鎖ＤＮＡから転写されたＲＮＡに基づいて、更なる増幅が開始され、その結果、電極上には前記二重鎖ＤＮＡが蓄積される。

[実施例４] 増幅反応後の矩形波ボルタンメトリー測定
反応終了後、反応液をアスピレータで除去した後、測定ウェルをＰＢＳ溶液３００μＬで２回洗浄した。次いで、実施例２と同様に、０．１Ｍ 酢酸カリウム緩衝液（ｐＨ５．５）３００μＬで洗浄した後、２０μＭ ＦＮＤ溶液を含む酢酸カリウム緩衝液（ｐＨ５．５）３００μＬを加え、室温で１０分間静置し電気化学測定を行った。電気化学測定には参照電極としてＡｇ／ＡｇＣｌ、対極にＰｔ電極を用いて、Ｉｎｉｔ Ｅ（Ｖ）=０、Ｆｉｎａｌ Ｅ（Ｖ）＝０．６、Ｉｎｃｒ Ｅ（Ｖ）＝０．０１、Ａｍｐｌｉｔｕｄｅ（Ｖ）＝０．０５、Ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ（ＨＺ）＝１００、Ｑｕｉｔ Ｔｉｍｅ（Ｓ）＝３、Ｓｅｎｓｉｖｉｔｙ（Ａ／Ｖ）＝１ｅ−５パラメータでＡＬＳ Ｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ａｎａｌｙｚｅｒ（ＣＨ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ Ｉｎｃ．製）を用いて矩形波ボルタンメトリー測定を行った。得られた電流値と実施例２の電流値を比較し、電流増加率を比較した。電極への固定化に用いるＤＮＡ濃度を５ｎＭ、５０ｎＭ、１００ｎＭ、２００ｎＭに設定し、それぞれ３ないし４回試験を行った。陽性酵素反応および陰性酵素反応における電流増加の結果を表１に示した。表１の通り、固定化時に用いたＤＮＡ濃度５０から２００ｎＭの各試験区において、陽性反応のみ電流が増加した。以上の結果から、電極上に固定化した核酸をプライマーとして利用することで、標的となる核酸が増幅され、さらに、電気化学的に検出できることが示された。

以上説明したように、本発明によれば、標的核酸にハイブリダイズする電極上に固定化した一本鎖プライマーを利用して増幅反応を行うことにより、標的となる核酸の増幅とその増幅産物を電気化学的に検出することができる。本発明の検出法では、従来の蛍光検出法におけるバックグラウンド蛍光の存在による感度の低下の問題を回避することができ、効率的な標的核酸の検出が可能となるため、例えば、遺伝子検査など分野に大きく貢献し得るものである。

Claims (7)

1. 試料中の核酸を定量しおよび／または解析するための方法であって、（ａ）試料中の核酸あるいはその相補鎖にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸を電極上に固定し、（ｂ）固定化した核酸をプライマーとして利用した増幅反応を行うことにより、電極上で検出対象とする核酸の一部、もしくは全部を増幅させ、二本鎖核酸として電極上に配置し、（ｃ）電気化学応答の測定を行う、工程を含んでなる方法。
2. 請求項１の工程（ｂ）で電極上に配置した二本鎖核酸に、酸化還元活性を有する物質を結合させる工程を含む請求項１に記載の方法。
3. 酸化還元活性を有する物質がフェロセン化ナフタレンジイミド（ＦＮＤ）であることを特徴とする請求項２に記載の方法。
4. 酸化還元活性を有する物質がルテニウム錯体であることを特徴とする請求項２に記載の方法。
5. 試料中の検出対象する核酸がＲＮＡであることを特徴とする請求項１から４のいずれかに記載の方法。
6. 増幅反応に逆転写酵素を用いることを特徴とする請求項５に記載の方法。
7. 試料中の核酸あるいはその相補鎖にストリンジェントな条件下でにハイブリダイズする核酸を固定した電極と、請求項１に記載の工程（ｂ）における増幅反応に必要な試薬を含む請求項１から６のいずれかに記載の方法による核酸検出用キット。