JP6559838B2 - 核酸検出方法及びアッセイキット - Google Patents
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Description
<例1>
LAMP増幅反応におけるRuHexからの電気的信号の挙動を評価した。
パイレックス(登録商標)(d=0.8mm)ガラス表面にチタン(500nm)及び金(2000nm)の薄膜をスパッタリングにより形成した。その後、レジストAZP4620を用いて金の電極(φ=200μm)を形成した。その上にメルカプトヘキサノールで被覆した。
増幅産物としてパルボウイルスの人工配列(105コピー、1μL)(表1に配列番号1として示す)、表2に示すLAMPプライマーとしてのF3プライマー(配列番号2)、B3プライマー(配列番号3)、FIPプライマー(配列番号4)、BIPプライマー(配列番号5)及びLbプライマー(配列番号6)、レドックスプローブとしてのRuHex(25μM)、KCl(60mM)、マグネシウムイオン(8mM)、アンモニウムイオン(10mM)、ベタイン(0.8M)、dNTPs(各1.4mM)並びにポリメラーゼ(GspSSD)(8unit)を含む反応液を調製した。
異なるコピー数の増幅産物を含む反応液において、LAMP増幅におけるRuHexからの電気的信号の挙動を評価した。
レドックスプローブの量と電流及び電位立ち上がり時間の関係を調査した。
アレイ状の電極を用いて、異なるコピー数の増幅産物を含む反応液における電流及び電位立ち上がり時間の経時的変化を調査した。
パイレックス(登録商標)(d=0.8mm)ガラス表面にチタン(500nm)及び金(2000nm)の薄膜をスパッタリングにより形成した。その後、レジストAZP4620を用いてアレイ状の60個の金電極(φ=200μm)(作用極)を形成した。作用極2つごとにそれらに対応する参照極と対極とを形成した。電極の表面をメルカプトヘキサノールで被覆した。
0コピー、102コピー、103コピー、104コピー、105コピーのパルボウイルスの人工配列(配列番号1)をそれぞれ含む例1と同じ反応液を5つ用意した。上述した基板の電極を有する面上に反応液を持ち込み、これらの反応液をそれぞれ67℃の等温で加温し、増幅反応を開始した。増幅反応と並行して、電気的信号をLSV法で測定した(掃引速度:0.5V/s)。
異なる濃度のマグネシウムイオンを含む反応液におけるピーク電流値の経時的変化を調査した。
異なる濃度のマグネシウムイオンを含む反応液におけるLAMP増幅反応を調査した。
5…レドックスプローブ 6a…マグネシウムイオン 6b…ピロリン酸
6…ピロリン酸マグネシウム 7…増幅産物 8…複合体 9…パット
10…反応場
Claims (21)
- 試料中の標的核酸を検出する方法であって、
前記方法は、
(A)前記試料、
前記標的核酸を増幅するためのプライマーセット、
増幅酵素、
4mM以上の濃度で含まれるマグネシウムイオン、及び
電気的信号を生じるルテニウム錯体であるレドックスプローブ
を含む反応液を、核酸プローブが固定されていない電極上に存在させて、反応場を形成すること、
(B)形成された前記反応場を、増幅反応条件下に維持すること、
(C)前記増幅反応条件下での維持中に、前記レドックスプローブからの前記電気的信号を前記電極によって経時的に検出すること、並びに
(D)前記(C)で得られた前記電気的信号の大きさの経時的な変化に基づいて、前記標的核酸の有無又は量を決定することを含み、
前記工程(B)の維持により、増幅産物の生成に伴い生成されるピロリン酸マグネシウムが、前記電極上に前記レドックスプローブとともに沈殿し、
前記工程(C)において、検出される前記電気的信号の大きさは、前記反応場における増幅産物の存在量の増加に伴って増加する
核酸検出方法。 - 前記ルテニウム錯体が、アミン錯体、シアノ錯体、ハロゲン錯体、ヒドロキシ錯体、シクロペンタジエニル錯体、フェナントロリン錯体及びビピリジン錯体からなる群より選択される請求項1に記載の方法。
- 前記ルテニウム錯体が、ルテニウムヘキサアミンである請求項1に記載の方法。
- 前記反応液中のレドックスプローブの濃度が25μM以上、3mM以下である請求項1〜3の何れか1項に記載の方法。
- 前記電気的信号が、酸化還元電位である請求項1〜4の何れか1項に記載の方法。
- 前記電気的信号が、酸化還元電流である請求項1〜4の何れか1項に記載の方法。
- 前記増幅反応条件が、等温増幅反応条件である請求項1〜6の何れか1項に記載の方法。
- 前記等温増幅反応条件が、LAMP増幅反応条件である請求項7に記載の方法。
- 前記増幅酵素が、Bst、GspSSD又はTinポリメラーゼである請求項1〜8の何れか1項に記載の方法。
- 前記電極が金である請求項1〜9の何れか1項に記載の方法。
- 請求項1に記載の方法に用いるための、標的核酸を検出するためのアッセイキットであって、
前記アッセイキットは、
前記反応液の構成成分である
前記標的核酸を増幅するためのプライマーセット、
増幅酵素、
前記反応液に含まれる最終濃度が、前記工程(B)の維持により生成したピロリン酸マグネシウムが沈殿を生成する量であり、4mM以上であるマグネシウムイオン、及び
ルテニウム錯体であって、電気的信号を生じるレドックスプローブ、
を含むアッセイキット。 - さらに基体を含み、前記基体は、前記反応場を支持するための基体であって、表面に前記電気的信号を検出するための電極を備え、当該電極は、その上に前記反応場が形成されるように配置されている請求項11に記載のアッセイキット。
- 前記ルテニウム錯体が、アミン錯体、シアノ錯体、ハロゲン錯体、ヒドロキシ錯体、シクロペンタジエニル錯体、フェナントロリン錯体及びビピリジン錯体からなる群より選択される請求項11又は12に記載のアッセイキット。
- 前記ルテニウム錯体が、ルテニウムヘキサアミンである請求項11又は12に記載のアッセイキット。
- 前記レドックスプローブの量が、前記反応液中におけるその濃度が25μM以上、3mM以下となる量である請求項11〜14の何れか1項に記載のアッセイキット。
- 請求項1に記載の方法に使用するための前記反応場を支持する基体であって、
前記基体は、少なくとも1つの表面が前記反応場に接する固相であり、前記固相の前記表面に前記電気的信号を検出するための前記電極が設けられ、当該電極は、前記反応場の底面に接するように配置されている基体。 - 前記プライマーセットが前記固相の前記表面に遊離可能に固定されている請求項16に記載の基体。
- 前記電極が複数設けられている請求項16又は17記載の基体。
- 試料中の標的核酸を検出する方法であって
当該標的核酸は、第1の配列を含み、
前記方法は、
(A)前記試料、
前記第1の配列の一端部に相補的な第1のプライマーと、前記第1の配列の他端部に相同な第2のプライマーとを少なくとも含むプライマーセット、
増幅酵素、
4mM〜30mMの濃度のマグネシウムイオン、及び
検出可能な電気的信号を生じるレドックスプローブであって、前記電気的信号の大きさが、反応場における増幅産物の存在量の増加に伴って増加する、ルテニウム錯体である前記レドックスプローブ
を含む反応液を、電極上に存在させて、核酸プローブが固定されていない反応場を形成すること、
(B)形成された前記反応場を増幅反応条件下に維持すること、
(C)前記増幅反応条件下での維持中に、前記レドックスプローブからの前記電気的信号を前記電極によって経時的に検出すること、並びに
(D)前記(C)で得られた前記電気的信号の大きさの経時的な変化に基づいて、前記標的核酸の有無又は量を決定すること
を含む核酸検出方法に使用するための前記反応場を支持する基体であって、
前記基体は、少なくとも1つの表面が前記反応場に接する固相であり、前記固相の前記表面に前記電気的信号を検出するための前記電極が設けられ、当該電極は、前記反応場の底面に接するように配置されている基体。 - 前記プライマーセットが前記固相の前記表面に遊離可能に固定されている請求項19に記載の基体。
- 前記電極が複数設けられている請求項19又は20に記載の基体。
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