KR101433473B1 - 산화환원 순환을 이용한 바이오센서 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 효소에 의한 신호 증폭과 산화환원 순환에 의한 신호 증폭을 결합한 이중 중폭을 이용하는 바이오센서에 있어서, 산화환원 효소들을 사용하지 않고도 산화제와 환원제 사이의 반응이 느린 상태를 유지하면서 빠른 화학적-화학적 산화환원 순환을 일으킬 수 있는 기술을 이용하는 것에 관한 것이다. 이에 추가하여 본 발명은 효소에 의한 신호 증폭, 화학적-화학적 산화환원 순환에 의한 신호 증폭에 더해서 전기화학적-화학적-화학적 산화환원 순환이 일어나게 함으로써 삼중 증폭을 얻는 바이오센서에 관한 것이다.
Description
본 발명은 생체분자(biomolecule)의 존재 또는 농도를 고감도로 측정하는 바이오센서(biosensor)에 관한 것으로, 특히 산화환원 순환(redox cycling)을 이용하여 신호(signal)을 증폭(amplification)하는 바이오센서에 관한 것이다.
고감도의 빠른 측정을 위해 필수적인 신호 증폭은 화학적인 증폭(chemical amplification) 혹은 물리적인 증폭(physical amplification)에 의해 이루어진다. 화학적인 증폭은 측정하고자 하는 물질을 증폭하거나 측정하고자 하는 물질 당 많은 신호를 내는 물질을 증폭하는 것을 말하고, 물리적인 증폭은 신호 변환기(transducer)의 감도를 증가시키는 것을 말한다. 일반적으로 화학적인 증폭이 배경 수준(background level)을 높이지 않으면서 신호 수준(signal level)을 높일 수 있기 때문에 큰 신호-대-배경 비(signal-to-background ratio)를 제공한다. 따라서, 고감도 검출을 위해서는 높고, 선택적이고, 재현성이 우수한 화학적인 증폭을 이용하는 것이 바람직하다.
일반적으로 높은 화학적인 증폭을 얻기 위해서, 촉매 반응(catalytic reaction)을 이용한 단일 증폭(single amplification)(Porstmann, T.; Kiessig, S. T. J. Immunol. Methods 1992, 150, 5-21)과 촉매 반응과 산화환원 순환(redox cycling)을 동시에 이용하는 이중 증폭(double amplification)(Stanley, C. J.; Cox, R. B.; Cardosi, M. F.; Turner, A. P. F. J. Immunol. Methods 1988, 112, 153-161. Niwa, O. Electroanalysis 1995, 7, 606-613. Limoges, B.; Marchal, D.; Mavre F.; Saveant, J. J. Am. Chem. Soc. 2008, 130, 7276-7285)을 이용한다. 촉매 반응은 주로 효소(enzyme) 에 의해 이루어지고, 효소는 측정 대상 생체분자일 수도 있고 생체분자 측정 시 사용하는 표지(label)일 수도 있다. 산화환원 순환은 두 전극에서 산화, 환원이 일어나는 전기화학적-전기화학적 산화환원 순환(electrochemical-electrochemical redox cycling)(Niwa, O. Electroanalysis 1995, 7, 606-613)과 하나의 전극과 하나의 환원제(reductant)(혹은 산화제(oxidant))를 이용하는 전기화학적-화학적 산화환원 순환(electrochemical-chemical redox cycling)(Das, J.; Jo, K.; Lee, J. W.; Yang, H. Anal. Chem. 2007, 79, 2790-2796. Akanda, M. R.; Aziz, M. A.; Jo, K.; Tamilavan, V.; Hyun, M. H.; Kim, S.; Yang, H. Anal. Chem. 2011, 83, 3926-3933, 대한민국 특허 등록번호 10-0812573)이 있다. 또 다른 산화환원 순환의 방법은 하나의 환원제와 하나의 산화제를 이용한 효소적-효소적 산화환원 순환(enzymatic-enzymatic redox cycling)(Stanley, C. J.; Cox, R. B.; Cardosi, M. F.; Turner, A. P. F. J. Immunol. Methods 1988, 112, 153-161. Lovgren, U.; Kronkvist, K.; Johansson, G.; Edholm, L.-E. Anal. Chim. Acta 1994, 288, 227-235; 미국 특허 등록번호 4,318,980; 미국 특허 등록번호 4,446,231; 미국 특허 등록번호 4,595,655)이 있다. 이 경우 산화환원 순환에 필요한 물질이 효소의 촉매 반응 등에 의해 만들어지면, 산화제(혹은 환원제)에 의해 (효소의 도움을 받아) 산화(혹은 환원)된 뒤 환원제(혹은 산화제)에 의해 (효소의 도움을 받아) 환원(혹은 산화)되어 원래 물질로 돌아가는 산화환원 순환이 계속적으로 일어난다. 이 산화환원 순환을 통해 산화제가 환원된 물질(혹은 환원제가 산화된 물질)의 증폭이 일어나고, 이 물질로 신호를 얻으면 큰 신호 증폭을 얻을 수가 있다. 산화환원 순환에 사용할 산화제와 환원제 사이의 표준환원 전위(standard reduction potential) 차이가 크면 빠른 산화환원 순환을 얻을 수 있지만, 산화환원 순환을 일으키는 물질이 없는 상황에서도 산화제와 환원제 사이의 반응이 일어나서 산화제가 환원된 물질과 환원제가 산화된 물질이 많이 생기게 되는 문제점이 있다. 이 경우 낮은 배경 수준을 얻는 것이 불가능해진다. 이러한 문제점 때문에 효소적-효소적 산화환원 순환을 이용한 바이오센서에서는 산화제와 환원제의 반응이 매우 느린 것을 선택한 뒤 반응 선택적인 산화환원 효소(redox enzyme)가 존재하는 상황에서 산화제에 의해 산화가 일어나도록 하고, 또 다른 반응 선택적인 산화환원 효소가 존재하는 상황에서 환원제에 의해 환원이 일어나도록 하는 방법을 사용한다(필요로 하는 두 산화환원 효소 중 적어도 하나는 존재하는 상황에서 산화환원 순환을 얻고 있다.)(Stanley, C. J.; Cox, R. B.; Cardosi, M. F.; Turner, A. P. F. J. Immunol. Methods 1988, 112, 153-161. Lovgren, U.; Kronkvist, K.; Johansson, G.; Edholm, L.-E. Anal. Chim. Acta 1994, 288, 227-235; 미국 특허 등록번호 4,318,980; 미국 특허 등록번호 4,446,231; 미국 특허 등록번호 4,595,655). 즉, 열역학적으로는(thermodynamically) 가능하지만 반응속도론적으로(kinetically) 잘 일어나지 않는 산화제의 산화 반응 및 환원제의 환원 반응을 선택적인 산화환원 효소들에 의해 반응속도론적으로 잘 일어나게 하는 방법을 사용한다. 이 경우 산화제와 환원제 사이의 반응을 빠르게 하는 제 3의 산화환원 효소는 존재하지 않기 때문에 둘 사이의 반응은 거의 일어나지 않는다.
이와 같이 효소적-효소적 산화환원 순환을 이용하는 바이오센서에서는 산화환원 순환에 필요한 산화 및 환원 반응들의 반응속도가 산화환원 효소들에 의해 제어된다. 따라서, 좀 더 간단하게 산화환원 효소들을 사용하지 않고도 (산화제와 환원제 사이의 반응이 느린 상태에서) 빠른 산화환원 순환이 일어날 수 있는 신호 증폭 기술의 개발이 요구된다.
한편, 효소 및 산화환원 순환에 의해 증폭된 물질은 전기화학적으로 전극에서 산화되거나 환원되어 전기화학 신호를 얻을 수 있다. 하지만, 이 신호 측정 중에 효소 반응에 사용된 기질(substrate), 산화환원에 사용된 산화제와 환원제, 용액 중에 존재하는 산소가 전기화학 반응에 참여함으로써 배경 전류(background current)가 커지는 문제점이 있다. 이러한 문제점을 해결하기 위해 전기촉매 특성이 나쁜 전극을 사용하여 이러한 전극 반응을 최소화하는 방법을 사용한다(Das, J.; Jo, K.; Lee, J. W.; Yang, H. Anal. Chem. 2007, 79, 2790-2796).
일반적으로 전기촉매 특성이 나쁜 전극으로 다이아몬드(diamond) 전극과 ITO(indium tin oxide)와 같은 주석산화물(tin oxide) 전극이 많이 사용되고 있다. 이 전극들은 매우 작고 재현성 있는 배경 전류를 제공해 준다. 하지만, 이 전극들의 전기촉매 특성이 좋지 않기 때문에, 증폭된 신호 물질도 쉽게 전기화학적으로 산화(혹은 환원)되지 않는 문제점이 있다. 전기촉매 특성을 조금 높이기 위해서 전기촉매 특성이 우수한 물질(금속촉매 혹은 전자전달 매개체)로 전극 표면을 변화시키는 방법이 사용되고 있다.
이와 같이 전기촉매 특성이 나쁜 전극에 전기촉매 특성이 우수한 물질을 입히는 것은 추가적인 작업이 필요하므로, 전극에 전기촉매 특성이 우수한 물질을 입혀서 사용할 필요가 없는 간단한 바이오센서의 개발이 필요하다.
POCT(point of care testing)용 바이오센서에서는 시료를 떨어뜨린 후 자동으로 모든 측정 과정이 이루어져야 한다. 측정 과정 중에 필요한 세척 등의 유체 제어를 간단하게 하기 위해서는 시료 외에 다른 용액을 추가로 사용하지 않고 시료만을 이용하여 측정이 이루어지는 것이 필요하다. 전혈(whole blood)이나 혈청(serum) 같은 시료 속에는 아스코르브산(ascorbic acid) 등의 전기화학적 활성을 띄는 방해물질(interferent)이 많이 존재하기 때문에 효소에 의해 생성된 생성물을 전기화학적으로 측정하는 일반적인 바이오센서에서는 큰 신호-대-배경 비를 얻을 수 없다. 전기화학적 활성을 띄는 방해물질의 전기화학 신호는 최소화하면서 생성물의 전기화학 신호를 증폭시키는 기술의 개발이 요구된다.
본 발명은 효소에 의한 신호 증폭과 산화환원 순환에 의한 신호 증폭을 결합한 이중 중폭을 이용하는 바이오센서에 있어서, 산화환원 순환을 위한 산화환원 효소들을 사용하지 않고도 산화제와 환원제 사이의 반응이 느린 상태를 유지하면서 빠른 화학적-화학적 산화환원 순환(chemical-chemical redox cycling)을 일으킬 수 있는 기술을 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한 본 발명은 효소 표지에 의한 신호 증폭, 화학적-화학적 산화환원 순환에 의한 신호 증폭에 더해서 전기화학적으로 또 다른 산화환원 순환(전기화학적-화학적-화학적 산화환원 순환(electrochemical-chemical-chemical redox cycling)이 일어나게 함으로써 삼중 증폭(triple amplification)을 얻는 바이오센서를 제공하는 것을 목적으로 한다.
이에 더하여 상기 이중 증폭 및 상기 삼중 증폭을 이용할 때, 큰 신호-대-배경 비를 얻기 위해서 증폭에 참여하는 물질들의 선호되는 전자전달 형태를 서로 다르게 하는 기술을 제공하는 것을 목적으로 한다.
상기 이중 증폭 및 상기 삼중 증폭에서 사용될 효소, 전극의 특징을 제공하는 것을 추가적인 목적으로 한다. 구체적으로 산화제, 환원제에 의해 영향을 받지 않는 효소의 특징을 제공하고, 전기촉매 특성이 우수한 물질을 입힐 필요가 없이 전기촉매 특성이 나쁜 상태를 그대로 이용하는 전극의 특징을 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한 전기화학 신호 측정 시 전극촉매 특성이 나쁜 전극을 사용함으로써 방해물질의 전기화학 신호는 크지 않은 상황에서 방해물질이 참여하는 전기화학적-화학적-화학적 산화환원 순환은 느리게 일어나게 하고 신호를 내는 생성물이 참여하는 전기화학적-화학적-화학적 산화환원 순환은 빨리 일어나게 하여 큰 신호-대-배경 비를 얻는 기술을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명의 목적과 여러 가지 장점은 이 기술 분야의 숙련된 사람들에 의해 첨부된 도면을 참조하여 다음 설명에 의해 더욱 명확하게 될 것이다.
산화환원 반응의 반응속도는 반응에 참여하는 물질과 전자전달의 종류에 의존한다. 무기 배위 착물(inorganic coordination complex) 사이의 전자전달은 내부권 전자전달(inner-sphere electron transfer) 혹은 외부권 전자전달(outer-sphere electron transfer)을 통해서 이루어진다고 알려져 있다(Taube, H. Angew. Chem. Int. Ed. 1984, 23, 329-339). 또한, 유기 물질 사이의 전자전달도 내부권 전자전달 및 외부권 전자전달을 이용해서 설명할 수 있다고 알려져 있다(Rosokha, S. V.; Kochi, J. K. Acc. Chem. Res. 2008, 41, 641-653). 전자전달이 일어나는 두 물질 사이의 전자 연결(electronic coupling) 혹은 궤도함수 중첩(orbital overlap)의 정도가 매우 작은 상태에서 전자전달이 일어나면 외부권 전자전달이라고 할 수 있고, 매우 큰 상태에서 일어나면 내부권 전자전달이라고 할 수 있다. 전극 반응에서도 산화(혹은 환원)되는 물질이 전극하고 약한 전자 연결을 통해서 전자전달이 일어나면 외부권 전자전달이라고 하고, 강한 전자 연결을 통해서 일어나면 내부권 전자전달이라고 한다. 외부권 전자전달에 의해서 산화환원이 일어나는 물질을 외부권 전자전달을 좋아하는 "외부권 전자전달 물질"이라고 하고 내부권 전자전달에 의해서 산화환원이 일어나는 물질을 내부권 전자전달을 좋아하는 "내부권 전자전달 물질"이라고 한다면, 강한 외부권 전자전달 물질의 전자전달은 주로 외부권 전자전달에 의해서만 일어나고 강한 내부권 전자전달 물질의 전자전달은 주로 내부권 전자전달에 의해서만 일어난다. 따라서, 강한 외부권 전자전달 물질과 강한 내부권 전자전달 물질 사이의 전자전달은 잘 일어나지 않는다. 많은 유기화합물의 산화환원 반응은 내부권 전자전달 및 외부권 전자전달에 의해서 일어날 수 있다. 이러한 물질은 강한 내부권 전자전달 물질과도 반응을 하고, 강한 외부권 전자전달 물질과도 반응을 한다.
따라서 본 발명은, 강한 외부권 전자전달 물질과 강한 내부권 전자전달 물질을 각각 산화제(혹은 환원제) 또는 환원제(혹은 산화제)로 사용하고, 즉 산화제와 환원제 각각의 산화환원 반응의 전자전달 형태를 다르게 선택하고, 내부권 전자전달뿐만 아니라 외부권 전자전달이 잘 일어나는 물질을 산화환원 순환을 일으키는 매개 물질로 사용하여, 산화환원 효소를 사용하지 않으면서 상기 산화제와 환원제 사이의 산화환원 반응은 느린 상태를 유지하면서, 산화제, 환원제 및 상기 매개 물질간의 빠른 산화환원 반응에 의한 빠른 산화환원 순환을 일으키는 것을 특징으로 한다. 상기 빠른 산화환원 순환에 의해 본 발명에서는 이중 증폭(효소 표지에 의한 신호 증폭과 화학적-화학적 산화환원 순환에 의한 신호 증폭)를 통한 큰 신호의 증폭을 얻을 수 있다.
이를 위해 본 발명은 기질을 활성화 시키는 효소, 상기 효소에 의해 활성화됨으로써 산화환원 반응하는 생성물로 되는 기질, 상기 생성물의 산화환원 반응에 의해 산화환원 순환을 이루는 환원제 및 산화제를 포함하고;
상기 산화제와 환원제 각각은 산화환원 반응에서의 전자전달 형태를 서로 달리하여 반응속도론적으로 산화제와 환원제 간의 직접적인 산화환원 반응은 잘 일어나지 않고, 상기 생성물은 산화환원 반응에서의 전자전달 형태가 상기 산화제 및 환원제 양자와 동일하여 상기 생성물을 매개로 상기 산화제 및 환원제의 산화환원 반응 및 상기 산화환원 순환이 이루어지며;
상기 산화환원 순환의 반복에 의해 증폭 생성된 환원제의 산화물 또는 산화제의 환원물의 전기화학적, 색깔적 또는 형광적인 변화로부터 신호를 감지함으로써 생체분자의 존재 및 농도를 측정하는 바이오센서를 제공한다.
도 1은 본 발명에서 제시하는 효소에 의한 증폭과 화학적-화학적 산화환원 순환에 의한 증폭을 이용한 이중 증폭에 대한 개념도이다. 효소는 검출 대상인 생체분자일 수도 있고, 생체분자 검출에 사용하는 표지(label)일 수도 있다. 가장 먼저 효소(11)에 의해 기질(12)은 생성물(13)로 변한다. 효소가 검출 대상인 생체분자인 경우와 효소가 표지로 사용되는 경우 모두 효소의 반응에 의해서만 생성물(13)이 선택적으로 형성된다. 이렇게 형성된 생성물(13)은 산화제(혹은 환원제)(15)와 반응한 뒤 산화된 생성물(혹은 환원된 생성물)(14)이 되고, 이 산화된 생성물(혹은 환원된 생성물)(14)은 환원제(혹은 산화제)(17)와 반응하여 다시 생성물(13)로 된다. 이 산화환원 순환이 반복적으로 일어남으로써 많은 산화제(혹은 환원제)(15)가 산화제의 환원된 물질(혹은 환원제의 산화된 물질)(16)로 변하게 되고, 많은 환원제(혹은 산화제)(17)는 환원제의 산화된 물질(혹은 산화제의 환원된 물질)(18)로 변하게 된다. 효소(11) 하나 당 많은 양의 산화제의 환원된 물질(혹은 환원제의 산화된 물질)(16) 혹은 환원제의 산화된 물질(혹은 산화제의 환원된 물질)(18)를 만들 수 있으므로, 큰 물질의 증폭을 얻을 수 있다. 산화제(혹은 환원제)(15)가 산화제의 환원된 물질(혹은 환원제의 산화된 물질)(16) 혹은 환원제(혹은 산화제)(17)가 환원제의 산화된 물질(혹은 산화제의 환원된 물질)(18)은 전기화학적 활성, 흡광도, 혹은 형광 세기의 변화를 이용하여 측정한다. 이렇게 얻은 신호는 생체지표물질의 농도를 측정하는 바이오센서에 이용한다.
도 2는 생체특이적인 결합을 이용하여 생체지표물질의 농도를 측정하는 바이오센서에서 효소 표지가 어떻게 이용되는가를 나타내는 개념도이다. 고체 표면(21)에 생체지표물질(23)과 생체특이적인 결합을 하는 항체 또는 생체분자(22)가 고정되어 있고, 여기에 생체지표물질(23)이 결합한다. 이 생체지표물질(23)에 생체특이적인 결합을 하는 항체 또는 생체분자(24)가 한번 더 붙게 된다. 이 항체 또는 생체분자(24)에는 표지로 효소(11)가 붙어 있다. 생체지표물질(23)이 표면에 존재할 때만 표지가 붙어 있는 항체 또는 생체분자(24)가 결합하고, 시료 속에 있는 생체지표물질(23)의 양에 따라 표지가 붙어 있는 항체 또는 생체분자(24)의 붙는 양이 달라진다. 따라서, 표면에 존재하는 효소(11)의 양이 달라짐에 따라 효소 반응에 의해서 생성되는 생성물의 양도 달라진다. 이 생성물의 양을 측정함으로써 간접적으로 생체지표물질(23)의 양을 알 수 있게 된다. 본 발명은 이와 같이 샌드위치 형태의 바이오센서에 응용될 수 있다.
경쟁 반응(competitive reaction)과 치환 반응(displacement) 등을 이용한 바이오센서에서도 본 발명은 응용될 수 있다. 생체지표물질(25)과 표지로 효소(11)가 붙어 있는 생체지표물질(26)이 경쟁 또는 치환 반응을 통해 생체특이적인 결합을 하는 항체 또는 생체분자(22)에 결합하게 된다. 표면에 존재하는 효소(11)의 양이 많을수록 생체지표물질(25)이 적게 존재함을 의미한다. 따라서, 효소 반응에 의해서 생성되는 생성물의 양은 생체지표물질(25)이 많을수록 적어진다. 이와 같은 원리를 통해 생체지표물질(25)의 양을 측정할 수 있다. 생체지표물질(23, 25)은 DNA, RNA, 단백질, 유기물질 등이 될 수 있다.
도 3는 효과적인 산화환원 순환을 얻기 위한 조건을 나타내는 개념도이다. 효소(11)에 의해 생성물(13)이 만들어질 때만 산화환원 순환이 일어나게 하기 위해서는, 도 3a에서 보는 것처럼 산화제(혹은 환원제)(15)와 환원제(혹은 산화제)(17)의 반응은 매우 느려야 한다. 그런데 산화제(혹은 환원제)(15)와 환원제(혹은 산화제)(17) 반응은 열역학적으로 선호되므로 이 반응이 반응속도론적으로 느리게 일어나게 해야 한다. 이를 위해 본 발명에서는 산화제(혹은 환원제)(15)의 산화환원 반응 시 잘 일어나는 전자전달 형태와 환원제(혹은 산화제)(17)의 산화환원 반응 시 잘 일어나는 전자전달 형태가 서로 다르게 하는 방법을 사용하는 것을 특징으로 한다. 즉 내부권 전자전달을 통해 산화환원 반응이 주로 진행되는 물질을 산화제(혹은 환원제)(15)로 선택하면, 외부권 전자전달을 통해 산화환원 반응이 주로 진행되는 물질을 환원제(혹은 산화제)(17)로 선택한다. 반대로 외부권 전자전달을 통해 산화환원 반응이 주로 진행되는 물질을 산화제(혹은 환원제)(15)로 선택하면, 내부권 전자전달을 통해 산화환원 반응이 주로 진행되는 물질을 환원제(혹은 산화제)(17)로 선택한다. 이와 같이 산화제와 환원제 각각에서의 산화환원 반응으로 서로 다른 전자전달 형태를 선택함으로써 본 발명의 센서에서는 산화제와 환원제 간의 직접적인 산화환원 반응이 일어나는 것을 느리게 할 수 있다.
도 3b와 도 3c는 산화환원 순환 시 일어나는 두 개의 산화환원 반응이 가져야 하는 전자전달 형태를 나타낸 것이다. 도 3b에서 보는 것처럼 산화제(혹은 환원제)(15)와 생성물(13) 사이의 전자전달이 내부권 전자전달에 가까우면, 환원제(혹은 산화제)(17)와 산화된 생성물(혹은 환원된 생성물)(14) 사이의 전자전달은 외부권 전자전달에 가까워야 한다. 또한, 도 3c에서 보는 것처럼 산화제(혹은 환원제)(15)와 생성물(13) 사이의 전자전달이 외부권 전자전달에 가까우면, 환원제(혹은 산화제)(17)와 산화된 생성물(혹은 환원된 생성물)(14) 사이의 전자전달은 내부권 전자전달에 가까워야 한다.
즉 본 발명에서는 상술한 바와 같이 반응속도론적으로 서로 직접적으로 산화환원 반응하지 않는 산화제 및 환원제를, 산화환원 효소를 사용하지 않으면서 빠르게 산화환원 반응시키고 이로부터 산화환원 순환을 형성하기 위해, 상기 생성물(13)은 산화제 및 환원제 양자와 빠른 산화환원 반응할 수 있는 것을 선택하여 사용한다. 빠른 외부권 전자전달 반응과 빠른 내부권 전자전달 반응이 동시에 이루어지게 하기 위해, 상기 생성물(13)과 산화된 생성물(혹은 환원된 생성물)(14)은 외부권 전자전달 반응뿐만 아니라 내부권 전자전달 반응에도 참여할 수 있는 물질이어야 한다. 외부권 전자전달을 통해 반응이 잘 일어나는 물질로는 Ru(NH3)6 3+, Ru(NH3)6 2+, 페로세니움 이온(ferrocenium ion), 페로센(ferrocene), Fe(CN)6 3-, Fe(CN)6 4-, Ru(NH3)5(pyridine)3+ 및 그 유도체, Ru(NH3)5(pyridine)2+ 및 그 유도체, Ru(NH3)4(bipyridyl)3+를 포함하는 Ru(NH3)4(diimine)3+ 유도체, Ru(NH3)4(bipyridyl)2+를 포함하는 Ru(NH3)4(diimine)2+ 유도체와 같은 배위화합물을 들 수 있고, 내부권 전자전달을 통해 반응이 잘 일어나는 물질로는 트리스(2-카복시에틸)포스핀(tris(2-carboxyethyl)phosphine)을 포함하는 포스핀 유도체(phosphine derivative), 하이드라진(hydrazine) 및 그 유도체(derivative), 니코틴아마이드 아데닌 다이뉴클레오티드 환원 형태(nicotineamide adenine dinucleotide; NADH)를 포함하는 니코틴아마이드 환원 형태의 유도체 등과 같은 환원제와 H2O2, O2 등과 같은 산화제를 들 수 있다.
외부권 전자전달 반응뿐만 아니라 내부권 전자전달 반응으로 전자전달 반응이 잘 일어나는 물질로는 도 3d에서 보는 것처럼 벤젠 고리를 갖는 기질(27) 중에 두 개 이상의 알코올 혹은 아민 작용기(혹은 한 개 이상의 알코올 작용기와 한 개 이상의 아민 작용기)를 갖는 하이드로퀴논(hydroquinone), 아미노페놀(aminophenol), 다이아미노벤젠(diaminobenzene)과 같은 환원된 형태와 이 것들의 산화된 상태인 벤조퀴논(benzoquinone), 퀴논 이민(quinone imine)과 같은 산화된 형태를 들 수 있다. 그리고, 이 것들의 유도체(derivative)도 같은 역할을 할 수 있다. 또한 도 3e에서 보는 것처럼 나프탈렌 고리를 갖는 기질(28) 중에 두 개 이상의 알코올 혹은 아민 작용기(혹은 한 개 이상의 알코올 작용기와 한 개 이상의 아민 작용기)를 갖는 다이하이드록시나프탈렌(dihydroxynaphthalene), 아미노나프톨(aminonaphthol), 다이아미노나프탈렌(diaminonaphthalene)과 같은 환원된 형태와 이 것들의 산화된 상태인 나프토퀴논(naphthoquinone), 나프토퀴논 이민(naphthoquinone imine)과 같은 산화된 형태를 들 수 있다. 특히, 하이드로퀴논, 벤조퀴논의 두 환원 및 산화된 형태와 아미노페놀, 퀴논 이민의 두 환원 및 산화된 형태는 빠른 외부적 및 내부적 전자전달 반응에 참여할 수 있고, 비교적 수용액에서 안정적으로 존재하므로 안정적인 산화환원 순환을 일으킬 수 있다.
효소에 의한 신호의 증폭과 산화환원 순환에 의한 신호의 증폭을 통해 이중 중폭을 얻고자 하는 상황에서 효소가 산화제, 환원제, 산소에 의해 영향을 받으면 안되기 때문에 산화제, 환원제, 산소에 의해 크게 영향을 받지 않는 효소를 사용한다. 이와 같은 요구 조건을 만족하는 효소로 알칼라인 포스파테이즈(alkaline phosphatase)와 같은 포스파테이즈, 갈락토시데이즈(galactosidase), 그리고 트립신(tripsin)과 트롬빈(thrombin)과 같은 단백질 분해효소(protease)가 이용될 수 있다. 포스파테이즈의 효소 반응에 의해 산화(혹은 환원)가 용이하지 않은 기질(12)이 산화(혹은 환원)가 용이한 생성물(13)로 바뀌게 할 수 있다.
본 발명에서는 효소로 산화환원 순환에 의해 영향을 받지 않는 것을 사용하고, 기질로 산화환원 순환에 거의 참여하지 않는 물질을 사용하고자 한다. 또한 효소 반응에 의해 기질로부터 생성되는 생성물로는 산화환원 순환에 잘 참여하는 물질을 사용하고자 한다.
도 4는 화학적-화학적 산화환원 순환에 적합한 효소 반응에 대한 개념도이다. 생성물(13)이 산화환원 순환에 참여하지만 기질(12)은 산화환원 순환에 참여하지 않기 때문에, 기질(12)은 산화제(혹은 환원제)(15)에 의해서 쉽게 산화(혹은 환원)되지 않고 환원제(혹은 산화제)(16)에 의해서 쉽게 환원(혹은 산화)되지 않아야 한다. 이를 위해 기질(12)은 도 4a에서 보는 것처럼 산화환원이 잘 일어나지 않는 형태(31)로 존재하다가 효소 반응에 의해 산화환원이 잘 일어나는 생성물(13)로 바뀌는 것을 이용한다. 여기서 효소(11)는 산화제(혹은 환원제)(15)와 환원제(혹은 산화제)(17)에 의해 영향을 받지 않는 것을 사용한다. 예로 도 4b에서 보는 것처럼 효소 반응에 의해 기질(32)의 일부가 떨어져 나감에 의해 산화환원이 잘 일어나는 생성물(13)이 생성되는 것이 있다. 좀 더 구체적으로는 도 4c와 같이 포스페이트가 붙어 있는 기질(33)이 포스파테이즈와 같은 효소(11)에 의해 포스페이트가 떨어져 나간 생성물(34)이 되는 것, 도 4d와 같이 갈락토우즈(galactose)가 붙어 있는 기질(35)이 갈락토시데이즈와 같은 효소(11)에 의해 갈락토우즈가 떨어져 나간 생성물(34)이 되는 것, 도 4e와 같이 두 개의 포스페이트가 붙어 있는 기질(36)이 포스파테이즈와 같은 효소(11)에 의해 포스페이트가 떨어져 나간 생성물(37)이 되는 것, 도 4f와 같이 두 개의 갈락토우즈가 붙어 있는 기질(38)이 갈락토시데이즈와 같은 효소(11)에 의해 갈락토우즈가 떨어져 나간 생성물(37)이 되는 것 등이 있다. 또한 도 4g와 같이 펩타이드소중합체(oligopeptide)가 붙어 있는 기질(41)이 단백질 분해효소와 같은 효소(11)에 의해 펩타이드소중합체가 떨어져 나간 생성물(42)이 되는 것, 도 4h와 같이 두 개의 펩타이드소중합체가 붙어 있는 기질(43)이 단백질 분해효소와 같은 효소(11)에 의해 펩타이드소중합체가 떨어져 나간 생성물(44)이 되는 것 등이 있다. 포스페이트가 붙어 있는 기질(33)인 아미노페닐 포스페이트(aminophenyl phosphate), 하이드로퀴논 포스페이트(hydroquinone phosphate), 아미노나프틸 포스페이트(aminonaphthyl phosphate), 나프토하이드로퀴논 포스페이트(naphthohydroquinone phosphate), 두 개의 포스페이트가 붙어 있는 기질(36)인 하이드로퀴논 다이포스페이트(hydroquinone diphosphate)와 나프토하이드로퀴논 다이포스페이트(naphthohydroquinone diphosphate)가 상술한 바와 같이 빠른 외부적 및 내부적 전자전달 반응에 참여할 수 있는 아미노페놀, 하이드로퀴논, 아미노나프톨(aminonaphthol), 나프토하이드로퀴논(naphthohydroquinone)을 생성할 수 있어 특히 유리하다. 또한 갈락토우즈가 붙어 있는 기질(33)인 아미노페닐 갈락토우즈(aminophenyl galactose), 하이드로퀴논 갈락토우즈(hydroquinone galactose), 아미노나프틸 갈락토우즈(aminonaphthyl galactose), 나프토하이드로퀴논 갈락토우즈(naphthohydroquinone galactose), 두 개의 갈락토우즈가 붙어 있는 기질(38)인 하이드로퀴논 다이갈락토우즈(hydroquinone digalactose)와 나프토하이드로퀴논 다이갈락토우즈(naphthohydroquinone digalactose)가 상술한 바와 같이 빠른 외부적 및 내부적 전자전달 반응에 참여할 수 있는 아미노페놀, 하이드로퀴논, 아미노나프톨, 나프토하이드로퀴논을 생성할 수 있어 특히 유리하다. 상기 펩타이드소중합체가 붙어 있는 기질(42)인 아미노페닐 펩타이드소중합체(aminophenyl oligopeptide), 아미노나프틸 펩타이드소중합체(aminonaphthyl oligopeptide), 상기 두 개의 펩타이드소중합체가 붙어 있는 기질(43)인 다이아미노벤젠 다이펩타이드소중합체(diaminobenzene dioligopeptide), 다이아미노나프탈렌 다이펩타이드소중합체(diaminonaphthalene dioligopeptide)가 상술한 바와 같이 빠른 외부적 및 내부적 전자전달 반응에 참여할 수 있는 아미노페놀, 다이아미노벤젠, 아미노나프톨, 다이아미노나프탈렌을 생성할 수 있어 특히 유리하다.
도 1의 이중 증폭이 어느 시간 동안 진행되면 산화제의 환원된 물질(혹은 환원제의 산화된 물질)(16) 혹은 환원제의 산화된 물질(혹은 산화제의 환원된 물질)(18)이 많이 생기고, 이 두 물질(16, 18) 중의 하나를 전기화학적으로 산화 혹은 환원시키면 큰 전기화학 신호를 얻을 수 있다. 이 전기화학적 측정 중에 또 다른 형태의 산화환원 순환이 일어나기 때문에, 결과적으로 삼중 증폭(효소 표지에 의한 증폭, 화학적-화학적 산화환원 순환에 의한 증폭, 전기화학적-화학적-화학적 산화환원 순환에 의한 증폭)을 얻어 매우 큰 신호 증폭을 얻을 수 있다.
도 5는 삼중 증폭을 이용할 때 전기화학 측정 중에 생기는 전기화학적-화학적-화학적 산화환원 순환의 개념도이다. 도 5a와 도 5b에서 보는 것처럼 산화환원 순환에 의해 생성된 산화제의 환원된 물질(혹은 환원제의 산화된 물질)(16)은 전극(51)에서 산화되어(혹은 환원되어) 전자(52)를 잃게 된다(혹은 얻게 된다). 이렇게 전기화학적으로 산화되어(혹은 환원되어) 산화제(혹은 환원제)(15)로 되돌아 가고, 다시 생성물(13)과 반응하여 산화제의 환원된 물질(혹은 환원제의 산화된 물질)(16)로 된다. 이 물질은 다시 전극(51)에서 산화되거나 환원됨으로써 또 다른 형태의 전기화학적-화학적-화학적 산화환원 순환이 일어나게 되고 이 산화환원 순환을 통해 더 큰 전류를 얻을 수 있게 된다. 생성물(13)이 환원된 형태이면 도 5a에서 보는 것처럼 전극(51)에서 산화가 일어나고, 생성물(13)이 산화된 형태이면 도 5b에서 보는 것처럼 전극(51)에서 환원이 일어난다. 열역학적으로 환원제(혹은 산화제)(17)는 전극(51)에서 쉽게 산화(혹은 환원)될 수 있으므로 반응속도론적으로 전극(51)에서 반응이 잘 일어나지 않도록 해야 한다. 이를 위해 전극(51)에서 산화제의 환원된 물질(혹은 환원제의 산화된 물질)(16)이 산화환원 반응 시 잘 일어나는 전자전달 형태와 환원제(혹은 산화제)(17)의 산화환원 반응 시 잘 일어나는 전자전달 형태를 서로 다르게 한다. 특히 전극(51)에서의 반응은 외부권 전자전달을 통해 주로 진행되도록 하고, 환원제(혹은 산화제)(17)의 반응은 내부권 전자전달을 통해 주로 진행되도록 한다. 따라서, 본 발명의 전극(51)에서는 산화제의 환원된 물질(혹은 환원제의 산화된 물질)(16)의 전기화학적 산화환원 반응이 일어나고, 환원제(혹은 산화제)(17)의 전기화학적 산화환원 반응은 잘 일어나지 않는 것을 특징으로 한다.
또한, 도 5c와 도 5d에서 보는 것처럼 산화환원 순환에 의해 생성된 환원제의 산화된 물질(혹은 산화제의 환원된 물질)(18)은 전극(51)에서 환원되어(혹은 산화되어) 전자(52)를 얻게 된다(혹은 잃게 된다). 이렇게 전기화학적으로 환원되어(혹은 산화되어) 환원제(혹은 산화제)(17)로 되고, 다시 산화된 생성물(혹은 환원된 생성물)(14)과 반응하여 환원제의 산화된 물질(혹은 산화제의 환원된 물질)(18)로 된다. 이 물질은 다시 전극(51)에서 환원(혹은 산화)됨으로써 또 다른 형태의 산화환원 순환이 일어나게 되고 이 산화환원 순환을 통해 더 큰 전류를 얻을 수 있게 된다. 생성물(13)이 산화된 형태이면 도 5c에서 보는 것처럼 전극(51)에서 산화가 일어나고, 생성물(13)이 환원된 형태이면 도 5d에서 보는 것처럼 전극(51)에서 환원이 일어난다. 열역학적으로 산화제(혹은 환원제)(15)는 전극(51)에서 쉽게 환원(혹은 산화)될 수 있으므로 반응속도론적으로 전극(51)에서 반응이 잘 일어나지 않도록 해야 한다. 이를 위해 전극(51)에서 환원제의 산화된 물질(혹은 산화제의 환원된 물질)(18)이 산화환원 반응 시 잘 일어나는 전자전달 형태와 산화제(혹은 환원제)(15)의 산화환원 반응 시 잘 일어나는 전자전달 형태를 서로 다르게 한다. 특히 전극(51)에서의 반응은 외부권 전자전달을 통해 주로 진행되도록 하고, 산화제(혹은 환원제)(15)의 반응은 내부권 전자전달을 통해 주로 진행되도록 한다.
도 5e에서 전기화학적-화학적-화학적 산화환원 순환에 참여하는 각 반응은 매우 빠르게 일어나 빠른 산화환원 순환이 일어나게 하지만, 방해 물질(19)이 참여하는 산화환원 순환에서는 두 개의 반응 중의 하나가 느리게 일어나 방해물질(19)에 대한 산화환원 순환은 느리게 일어나게 한다. 이를 통해 방해물질(19)에 의한 배경의 증가를 최소화할 수 있다. 또한, 전극촉매 특성이 나쁜 전극을 사용함으로써 방해물질(19)의 전극(51)에 직접 전기화학 반응이 최소화하여 방해물질(19)에 의한 배경의 증가를 최소화할 수 있다.
전극(51)에서 외부권 전자전달은 잘 일어나지만, 내부권 전자전달이 잘 일어나지 않게 하기 위해서는 전기촉매 특성이 좋지 않은 전극을 사용해야 한다. 이러한 목적을 위해 ITO 전극, FTO(fluorinated tin oxide) 전극을 포함하는 주석 산화물 전극, 붕소가 도핑된 다이아몬드(boron-doped diamond) 전극, 유사다이아몬드 탄소(diamond-like carbon) 전극을 포함하는 다이아몬드 전극 등을 사용할 수 있다.
Ru(NH3)6 3+와 Ru(NH3)6 2+와 같은 강한 외부권 전자전달 물질은 전극에 상관 없이 매우 큰 전자전달 속도를 가지므로 전기촉매 특성이 나쁜 외부권 전자전달을 좋아하는 전극에서도 큰 전기화학 신호를 얻을 수 있다.
외부권 전자전달 및 내부권 전자전달을 통해 산화환원이 일어날 수 있는 생성물(13) 혹은 산화된 생성물(혹은 환원된 생성물)(14)은 전기촉매 특성이 나쁜 전극에서 산화환원이 잘 일어나지 않을 수 있으므로, 매우 높거나 매우 낮은 전위를 걸어 주지 않고서는 생성물(13) 혹은 산화된 생성물(혹은 환원된 생성물)(14)을 전기화학 신호를 크게 얻기가 어렵다. 도 5a, 5b에서는 산화제(혹은 환원제)(15)의 도움으로 산화환원이 일어나고, 도 5c, 5d에서는 환원제(혹은 산화제)(17)의 도움으로 산화환원이 일어나, Ag/AgCl 기준 전극 대비 0 V 근처의 전위에서 쉽게 생성물(13) 혹은 산화된 생성물(혹은 환원된 생성물)(14)의 산화환원을 얻을 수 있게 된다. 따라서, 전극에 전기촉매 특성이 우수한 물질을 입힐 필요가 없게 된다.
단 본 발명에서는 상기 전기촉매 특성이 나쁜 전극에서도 전기화학적 산화환원 반응을 일으키는 기질의 생성물 또는 그것의 산화된 물질 또는 환원된 물질을 사용함으로써 삼중 증폭의 효과를 얻을 수 있다.
도 6은 삼중 증폭 중에 생길 수 있는 전기화학적-화학적 산화환원 순환의 개념도이다. 즉 도 5에서 보는 것과 같은 전기화학적-화학적-화학적 산화환원 순환이 전기화학 측정 중에 생기는 것뿐만 아니라 도 6에서 보는 것과 같은 (일반적으로 알려진) 전기화학적-화학적 산화환원 순환이 일어날 수 있다. 이것에 의해 더 큰 신호의 증폭을 얻을 수 있다. 도 6a는 생성물(13)이 전극(51)에서 직접 산화되는 것을 나타낸 것이고, 도 6b는 직접 환원되는 것을 나타낸 것이다. 또한 도 6c는 환원된 생성물(14)이 전극(51)에서 직접 산화되는 것을 나타낸 것이고, 도 6d는 직접 환원되는 것을 나타낸 것이다.
하지만, 전기화학적 촉매 특성이 나쁜 전극을 이용할 경우 상기 생성물(13) 또는 환원된 생성물(14)의 산화환원 반응이 전극에서 느리게 일어날 수 있으므로, 이럴 경우 상기 생성물(13) 또는 환원된 생성물(14)의 산화환원 순환에 의한 전기화학 신호는 도 5에서 나타나는 산화제의 환원된 물질(16) 또는 환원제의 산화된 물질(18)의 산화환원 순환에 의한 전기화학 신호에 비해 작게 나타난다.
본 발명에 의한 바이오센서에서는 효소를 이용한 기존 바이오센서에 추가적으로 효소를 사용함이 없이 산화제와 환원제만을 첨가하여 이중 증폭이 일어나게 함으로써 짧은 측정 시간에 큰 신호-대-배경 비를 얻게 해 준다. 이를 통해 매우 낮은 검출한계를 얻을 수 있게 된다.
특히, 전기화학 측정 중에 전기화학적-화학적-화학적 산화환원 순환이 추가됨으로써 삼중 증폭을 얻을 수 있게 되어, 초고감도의 검출이 가능해 진다. 또한, 전기촉매 특성이 나쁜 전극을 전기촉매 특성이 우수한 물질을 처리할 필요가 없이 사용하는 것이 가능하게 해 준다. 따라서, 저가격이면서 간단하고 고감도인 바이오센서의 개발이 가능해 진다.
따라서, 본 발명은 항원 또는 항체를 분석하는 면역분석법(immunoassay), DNA를 분석하는 DNA 센서(DNA sensor), 효소의 농도를 분석하는 바이오센서 등의 핵심 기술로 활용될 수 있다.
도 1은 본 발명에서 제시하는 효소에 의한 증폭과 화학적-화학적 산화환원 순환에 의한 증폭을 이용한 이중 증폭에 대한 개념도.
도 2는 생체특이적인 결합을 이용하여 생체지표물질의 농도를 측정하는 바이오센서에서 효소 표지가 어떻게 이용되는가를 나타내는 개념도.
도 3은 효과적인 산화환원 순환을 얻기 위한 조건을 나타내는 개념도.
도 4는 화학적-화학적 산화환원 순환에 적합한 효소 반응에 대한 개념도.
도 5는 삼중 증폭을 이용할 때 전기화학 측정 중에 생기는 전기화학적-화학적-화학적 산화환원 순환의 개념도.
도 6은 삼중 증폭 증에 생길 수 있는 전기화학적-화학적 산화환원 순환의 개념도.
도 7은 아미노페닐 포스페이트를 기질로 이용하여 트로포닌 아이를 검출하는 샌드위치 형태의 전기화학 바이오센서의 개념도.
도 8은 Ru(NH3)6 3+와 트리스(2-카복시에틸)포스핀이 들어 있는 용액에서 아미노페놀이 있을 때와 없을 때에 Ru(NH3)6 2+의 산화가 일어나는 전위에서 얻은 시간대전류도.
도 9는 용액을 섞은 후 바로 얻은 시간대전하도와 10분 후에 얻은 시간대전하도.
도 10은 도 7의 바이오센서로 얻은 트로포닌 아이 농도에 따른 시간대전하도.
도 11은 도 10의 시간대전하도에서 100초일 때 트로포닌 아이 농도에 따른 보정된 전하.
도 12은 하이드로퀴논 다이포스페이트를 기질로 이용하여 생쥐 항체를 검출하는 샌드위치 형태의 전기화학 바이오센서의 개념도.
도 13는 도 12의 바이오센서에 대한 시간대전하도에서 100초일 때 얻은 생쥐 항체 농도에 따른 보정된 전하.
도 14은 아미노나프틸 갈락토우즈를 기질로 이용하여 생쥐 항체를 검출하는 샌드위치 형태의 전기화학 바이오센서의 개념도.
도 15은 아스코르브산 방해물질이 존재할 때와 존재하지 않을 때의 배경 및 신호의 시간대전하도.
도 16는 도 14의 바이오센서에 대한 시간대전하도에서 100초일 때 얻은 생쥐 항체 농도에 따른 보정된 전하.
도 2는 생체특이적인 결합을 이용하여 생체지표물질의 농도를 측정하는 바이오센서에서 효소 표지가 어떻게 이용되는가를 나타내는 개념도.
도 3은 효과적인 산화환원 순환을 얻기 위한 조건을 나타내는 개념도.
도 4는 화학적-화학적 산화환원 순환에 적합한 효소 반응에 대한 개념도.
도 5는 삼중 증폭을 이용할 때 전기화학 측정 중에 생기는 전기화학적-화학적-화학적 산화환원 순환의 개념도.
도 6은 삼중 증폭 증에 생길 수 있는 전기화학적-화학적 산화환원 순환의 개념도.
도 7은 아미노페닐 포스페이트를 기질로 이용하여 트로포닌 아이를 검출하는 샌드위치 형태의 전기화학 바이오센서의 개념도.
도 8은 Ru(NH3)6 3+와 트리스(2-카복시에틸)포스핀이 들어 있는 용액에서 아미노페놀이 있을 때와 없을 때에 Ru(NH3)6 2+의 산화가 일어나는 전위에서 얻은 시간대전류도.
도 9는 용액을 섞은 후 바로 얻은 시간대전하도와 10분 후에 얻은 시간대전하도.
도 10은 도 7의 바이오센서로 얻은 트로포닌 아이 농도에 따른 시간대전하도.
도 11은 도 10의 시간대전하도에서 100초일 때 트로포닌 아이 농도에 따른 보정된 전하.
도 12은 하이드로퀴논 다이포스페이트를 기질로 이용하여 생쥐 항체를 검출하는 샌드위치 형태의 전기화학 바이오센서의 개념도.
도 13는 도 12의 바이오센서에 대한 시간대전하도에서 100초일 때 얻은 생쥐 항체 농도에 따른 보정된 전하.
도 14은 아미노나프틸 갈락토우즈를 기질로 이용하여 생쥐 항체를 검출하는 샌드위치 형태의 전기화학 바이오센서의 개념도.
도 15은 아스코르브산 방해물질이 존재할 때와 존재하지 않을 때의 배경 및 신호의 시간대전하도.
도 16는 도 14의 바이오센서에 대한 시간대전하도에서 100초일 때 얻은 생쥐 항체 농도에 따른 보정된 전하.
이하, 첨부된 도면을 참조하여 구체적 실시 예를 설명한다.
도 7은 본 발명에서 제시하는 바이오센서의 한 가지 예이다. 트로포닌 아이(troponin I)를 검출하는 샌드위치 형태의 전기화학 바이오센서의 개념도를 나타내고 있다. ITO 전극 위에 아비딘(avidin)이 입혀서 있고 바이오틴(biotin)-아비딘 결합에 의해 트로포닌 아이를 잡을 수 있는 항체가 고정되어 있다. 측정하고자 하는 트로포닌 아이가 표면에 잡힌 후 포스파테이즈가 연결된 항체가 트로포닌 아이에 결합하게 된다. 이 전극을 아미노페닐 포스페이트가 들어 있는 용액에 담그면 포스파테이즈에 의해 아미노페닐 포스페이트는 아미노페놀로 바뀌게 된다. 이 효소 반응이 어느 정도 시간 동안 일어나게 되면 많은 양의 아미노페놀이 생성된다. 아미노페놀이 생기면 Ru(NH3)6 3+와 트리스(2-카복시에틸)포스핀에 의해 산화환원 순환이 일어나서 많은 양의 Ru(NH3)6 2+가 생긴다. 어느 정도 시간 후에 Ru(NH3)6 2+를 ITO 전극에서 산화시키면 Ru(NH3)6 3+가 생기면서 (외부권 전자전달에서 내부권 전자전달으로의) 산화환원 순환이 진행된다. 이를 통해 큰 전기화학 신호를 얻게 된다.
도 7의 바이오센서는 다음과 같은 과정을 거쳐서 제작된다. 1cm×2cm 크기의 ITO 전극을 세척한 후 100㎍/mL의 아비딘이 들어 있는 카보네이트 버퍼(carbonate buffer)(pH 9.6) 용액 70mL를 ITO 전극 위에 떨어뜨린 후 섭씨 20도에서 2시간 유지한 뒤 세척한다. 다시 이 전극 위에 PBSB(phosphate-buffered saline with bovine serum albumin) 용액 70mL를 떨어뜨린 후 섭씨 4도에서 30분 유지한 뒤 세척한다. 바이오틴-아비딘 결합에 의해 트로포닌 아이 항체를 고정하기 위해 10㎍/mL의 "바이오틴이 연결된 트로포닌 아이 항체(biotinylated anti-troponin-I IgG)"가 들어 있는 TBS(tris-buffered saline) 용액 70mL를 떨어뜨린 후 섭씨 4도에서 30분 유지한 뒤 세척한다. 그리고 나서, 서로 다른 농도의 트로포닌 아이가 들어 있는 사람 혈청(human serum) 70mL를 떨어뜨린 후 섭씨 4도에서 30분 유지한 뒤 세척한다. 마지막으로 10㎍/mL의 "알칼라인 포스파테이즈가 연결된 트로포닌 아이 항체(alkaline phosphatase-conjugated anti-troponin-I IgG)"가 들어 있는 TBS 용액 70mL를 떨어뜨린 후 섭씨 4도에서 30분 유지한 뒤 세척한다. 전기화학 신호를 얻기 위해서는 테플론(Teflon)으로 만들어진 전기화학 셀에 Ag/AgCl (3M NaCl)를 기준전극(reference electrode)으로 하고, 백금을 반대전극(counter electrode)로 하며, ITO 전극을 작업전극(working electrode)로 하여 전기화학 신호를 측정한다. 용액에 노출된 ITO 전극의 크기는 0.28cm2이다. 1mM 아미노페닐 포스페이트, 1mM Ru(NH3)6 3+, 2mM 트리스(2-카복시에틸)포스핀이 들어 있는 트리스 버퍼(tris buffer)(pH 8.9) 용액을 전기화학 셀에 넣고 섭씨 30도에서 10분 동안 알칼라인 포스파테이즈에 의한 증폭과 화학적-화학적 산화환원 순환에 의한 증폭이 일어나게 한 뒤 전기화학적-화학적-화학적 산화환원 순환에 의해 전기화학 신호를 측정한다.
도 8은 Ru(NH3)6 3+와 트리스(2-카복시에틸)포스핀이 들어 있는 용액에서 아미노페놀이 있을 때와 없을 때에 Ru(NH3)6 2+의 산화가 일어나는 전위에서 얻은 시간대전류도(chronoamperogram)를 나타낸 것이다. 1mM Ru(NH3)6 3+와 2mM 트리스(2-카복시에틸)포스핀이 들어있는 트리스 버퍼 용액(pH 8.9) 혹은 1mM Ru(NH3)6 3+, 0.1mM 아미노페놀, 2mM 트리스(2-카복시에틸)포스핀이 들어있는 트리스 버퍼 용액(pH 8.9)을 사용하였다. 시간대전류도는 Ag/AgCl 기준전극 대비 0.05V에서 ITO전극으로 얻었다. 아미노페놀이 존재할 때 산화환원 순환에 의해 전류가 크게 증가함을 보여 준다. 그리고, 아미노페놀이 존재할 때 전류는 초기에 감소 후 정상 상태(steady state)를 유지함을 보여 준다. 이것은 계속해서 안정적으로 산화환원 순환이 일어남을 나타낸다.
도 9는 용액을 섞은 후 바로 얻은 시간대전하도(chronocoulogram)와 10분 후에 얻은 시간대전하도를 나타낸 것이다. 1mM Ru(NH3)6 3+, 0.01mM 아미노페놀, 2mM 트리스(2-카복시에틸)포스핀이 들어있는 트리스 버퍼 용액(pH 8.9)을 사용하였고, 시간대전하도는 Ag/AgCl 기준전극 대비 0.05V에서 ITO 전극으로 얻었다. 용액을 섞고 10분 동안 있은 후 얻은 시간대전하도의 전하 값이 용액을 섞은 후 바로 얻은 시간대전하도의 전하 값보다 더 크게 나타난다. 이것은 용액을 섞은 후 10분 동안 Ru(NH3)6 3+, 아미노페놀, 트리스(2-카복시에틸)포스핀에 의해 도 3b처럼 화학적-화학적 산화환원 순환이 일어났기 때문이다. 두 시간대전하도의 전하 값 차이는 초기에 증가하다가 계속 일정한 값을 유지한다. 이것은 도 7의 전기화학적-화학적-화학적 산화환원 순환이 두 경우 모두 비슷하게 일어남을 의미한다. 즉, 전기화학 측정 초기에는 화학적-화학적 산화환원 순환의 영향이 크게 나타나지만, 어느 정도 시간이 지나면 전기화학적-화학적-화학적 산화환원 순환의 영향이 주로 일어남을 의미한다.
도 10은 도 7의 바이오센서로 얻은 트로포닌 아이 농도에 따른 시간대전하도를 나타낸 것이다. 1mM Ru(NH3)6 3+, 1mM 아미노페닐 포스페이트, 2mM 트리스(2-카복시에틸)포스핀이 들어있는 트리스 버퍼 용액(pH 8.9)을 사용하였고, 시간대전하도는 Ag/AgCl 기준전극 대비 0.05V에서 바이오 센싱이 일어난 ITO 전극으로 얻었다. 트로포닌 아이 농도가 클수록 같은 시간에서 더 큰 전하 값을 가짐을 보인다.
도 11은 도 10의 시간대전하도에서 100초일 때 트로포닌 아이 농도에 따른 보정된 전하를 나타낸 것이다. 모든 데이터는 농도 0에서 얻는 평균값으로 빼주었고, 모든 농도 결과는 3번의 반복 실험을 통하여 얻었다. 에러 바(error bar)는 표준 편차를 나타낸다. 이 그래프로부터 계산된 트로포닌 아이에 대한 검출한계는 10fg/mL 이다. 새로운 화학적-화학적 산화환원 순환 및 전기화학적-화학적-화학적 산화환원을 포함하는 삼중 증폭을 이용하여 매우 낮은 검출한계를 얻을 수 있음을 보여준다.
도 12은 본 발명에서 제시하는 또 다른 바이오센서의 예이다. 생쥐 항체를 검출하는 샌드위치 형태의 전기화학 바이오센서의 개념도를 나타내고 있다. 도 12은 도 7에서 제시하는 바이오센서와 같은 방식으로 센서를 제작하고 측정하였다. 단, 도 7의 트로포닌 아이, 아미노페놀 포스페이트 대신에 각각 생쥐 항체, 하이드로퀴논 다이포스페이트를 사용하였다.
도 13은 도 12의 바이오센서에 대한 시간대전하도에서 100초일 때 얻은 생쥐 항체 농도에 따른 보정된 전하를 나타낸 것이다. 1mM Ru(NH3)6 3+, 1mM 하이드로퀴논 다이포스페이트, 2mM 트리스(2-카복시에틸)포스핀이 들어있는 트리스 버퍼 용액(pH 8.9)을 사용하였고, 시간대전하도는 Ag/AgCl 기준전극 대비 0.05V에서 바이오 센싱이 일어난 ITO 전극으로 얻었다. 모든 데이터는 농도 0에서 얻는 평균값으로 빼주었고, 모든 농도 결과는 3번의 반복 실험을 통하여 얻었다. 에러 바(error bar)는 표준 편차를 나타낸다. 이 그래프로부터 계산된 생쥐 항체에 대한 검출한계는 1fg/mL 이다. 하이드로퀴논 다이포스페이트를 이용한 바이어 센서에서도 새로운 화학적-화학적 산화환원 순환 및 전기화학적-화학적-화학적 산화환원을 포함하는 삼중 증폭을 이용하여 매우 낮은 검출한계를 얻을 수 있었다.
하이드로퀴논 다이포스페이트는 두 개의 포스페이트를 가지므로 전기화학적 활성을 띄는 하이드로퀴논이 되기 위해서는 두 번의 효소 반응이 일어나야 한다. 하지만, 하이드로퀴논 다이포스페이트는 산화제 혹은 환원제와 반응이 잘 일어나지 않아서 낮은 배경 신호를 얻게 해 주고, 하이드로퀴논에 의한 산화환원이 빠르게 안정적으로 일어남으로써 큰 신호를 얻게 해 준다.
도 14는 본 발명에서 제시하는 또 다른 바이오센서의 예이다. 생쥐 항체를 검출하는 샌드위치 형태의 전기화학 바이오센서의 개념도를 나타내고 있다. 도 14은 도 7에서 제시하는 바이오센서와 같은 방식으로 센서를 제작하고 측정하였다. 단, 도 7의 트로포닌 아이, 아미노페놀 포스페이트, "알칼라인 포스파테이즈가 연결된 트로포닌 아이 항체" 대신에 각각 생쥐 항체, 아미노나프틸 갈락토우즈, "갈락토우즈가 연결된 생쥐 항체"를 사용하였다.
도 7과 도 12의 바이오센서에서는 전기화학 신호의 측정이 pH 8.9에 이루어졌다. Ru(NH3)6 3+의 형식전위가 pH에 의존하지 않지만 아미노페놀과 하이드로퀴논의 형식전위는 pH에 의존한다. pH가 낮아지면 Ru(NH3)6 3+과 아미노페놀(혹은 하이드로퀴논)의 형식전위 차이는 커지게 되고 전기화학적-화학적-화학적 산화환원 순환이 느려지게 된다. 따라서 pH 7.4에서는 아미노페놀(혹은 하이드로퀴논)에 대한 전기화학적-화학적-화학적 산화환원 순환이 매우 느려지게 되어 큰 신호 증폭을 얻을 수 없었다. 이에 반해 아미노나프톨은 아미노페놀과 하이드로퀴논 보다 훨씬 낮은 형식전위를 가지기 때문에 pH 7.4에서도 빠른 전기화학적-화학적-화학적 산화환원 순환을 얻을 수 있었다.
도 15는 전혈이나 혈청 속의 방해물질인 아스코르브산이 존재할 때와 존재하지 않을 때의 배경 전하와 신호 전하의 변화를 나타낸 것이다. 아르코르브산이 존재할 때 배경 전하와 신호 전하에 큰 증가가 일어나지 않았다. 이 것은 아스코르브산이 전기촉매 특성이 나쁜 ITO전극에서 0.05 V에서 전기화학 반응이 느리게 일어나고, 아스코르브산의 전기화학적-화학적-화학적 산화환원 순환이 느리게 일어나기 때문이다. 반면에 아미노나프톨의 전기화학적-화학적-화학적 산화환원 순환은 빠르게 일어나므로 아스코르브산의 방해 작용을 최소화하면서 신호 전하를 측정할 수 있었다.
도 16은 도 14의 바이오센서에 대한 시간대전하도에서 100초일 때 얻은 생쥐 항체 농도에 따른 보정된 전하를 나타낸 것이다. 1mM Ru(NH3)6 3+, 1mM 하이드로퀴논 다이포스페이트, 2mM 트리스(2-카복시에틸)포스핀이 들어있는 PBS(phosphate-buffered saline) 버퍼 용액(pH 7.4)을 사용하였고, 시간대전하도는 Ag/AgCl 기준전극 대비 0.05V에서 바이오 센싱이 일어난 ITO 전극으로 얻었다. 모든 데이터는 농도 0에서 얻는 평균값으로 빼주었고, 모든 농도 결과는 3번의 반복 실험을 통하여 얻었다. 에러 바(error bar)는 표준 편차를 나타낸다. 이 그래프로부터 계산된 생쥐 항체에 대한 검출한계는 100fg/mL 이다. pH 7.4에서 아미노나프틸 갈락토우즈를 이용한 바이오 센서에서도 새로운 화학적-화학적 산화환원 순환 및 전기화학적-화학적-화학적 산화환원을 포함하는 삼중 증폭을 이용하여 매우 낮은 검출한계를 얻을 수 있었다.
효소 반응의 생성물이 아미노페놀 혹은 하이드로퀴논일 경우에 pH 7.4에서 느린 산화환원 순환때문에 낮은 검출한계를 얻을 수 없었지만, 생성물이 아미노페놀 및 하이드로퀴논보다 형식 전위가 낮은 아미노나프톨일 경우에는 빠른 산화환원 순환때문에 낮은 검출한계를 얻을 수 있었다.
이상에서 설명한 본 발명은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 있어 본 발명의 기술적 사상을 벗어나지 않는 범위 내에서 여러 가지 치환, 변형 및 변경이 가능함으로 전술한 실시 예 및 첨부된 도면에 한정되는 것이 아니다.
11: 효소
12: 기질
13: 생성물
14: 산화된 생성물(혹은 환원된 생성물)
15: 산화제(혹은 환원제)
16: 산화제의 환원된 물질(혹은 환원제의 산화된 물질)
17: 환원제(혹은 산화제)
18: 환원제의 산화된 물질(혹은 산화제의 환원된 물질)
19: 방해물질
20: 방해물질이 산화된 물질(혹은 환원된 물질)
21: 고체 표면
22: 항체 또는 생체분자
23: 생체지표물질
24: 표지가 붙어 있는 항체 또는 생체분자
25: 생체지표물질
26: 표지가 붙어 있는 생체지표물질
27: 벤젠 고리를 갖는 기질
28: 나프탈렌 고리를 갖는 기질
31, 32: 산화환원이 잘 일어나지 않는 기질
33: 포스페이트가 붙어 있는 기질
34: 포스페이트(혹은 갈락토우즈)가 떨어져 나간 생성물
35: 갈락토우즈가 붙어 있는 기질
36: 두 개의 포스페이트가 붙어 있는 기질
37: 두 개의 포스페이트(혹은 두 개의 갈락토우즈)가 떨어져 나간 생성물
38: 두 개의 갈락토우즈가 붙어 있는 기질
41: 펩타이드소중합체가 붙어 있는 기질
42: 펩타이드소중합체가 떨어져 나간 생성물
43: 두 개의 펩타이드소중합체가 붙어 있는 기질
44: 두 개의 펩타이드소중합체가 떨어져 나간 생성물
51: 전극
52: 전자
12: 기질
13: 생성물
14: 산화된 생성물(혹은 환원된 생성물)
15: 산화제(혹은 환원제)
16: 산화제의 환원된 물질(혹은 환원제의 산화된 물질)
17: 환원제(혹은 산화제)
18: 환원제의 산화된 물질(혹은 산화제의 환원된 물질)
19: 방해물질
20: 방해물질이 산화된 물질(혹은 환원된 물질)
21: 고체 표면
22: 항체 또는 생체분자
23: 생체지표물질
24: 표지가 붙어 있는 항체 또는 생체분자
25: 생체지표물질
26: 표지가 붙어 있는 생체지표물질
27: 벤젠 고리를 갖는 기질
28: 나프탈렌 고리를 갖는 기질
31, 32: 산화환원이 잘 일어나지 않는 기질
33: 포스페이트가 붙어 있는 기질
34: 포스페이트(혹은 갈락토우즈)가 떨어져 나간 생성물
35: 갈락토우즈가 붙어 있는 기질
36: 두 개의 포스페이트가 붙어 있는 기질
37: 두 개의 포스페이트(혹은 두 개의 갈락토우즈)가 떨어져 나간 생성물
38: 두 개의 갈락토우즈가 붙어 있는 기질
41: 펩타이드소중합체가 붙어 있는 기질
42: 펩타이드소중합체가 떨어져 나간 생성물
43: 두 개의 펩타이드소중합체가 붙어 있는 기질
44: 두 개의 펩타이드소중합체가 떨어져 나간 생성물
51: 전극
52: 전자
Claims (13)
- 기질을 활성화 시키는 효소, 상기 효소에 의해 활성화됨으로써 산화환원 반응하는 생성물로 되는 기질, 상기 생성물의 산화환원 반응에 의해 산화환원 순환을 이루는 환원제 및 산화제를 포함하고;
상기 산화제 및 환원제는 용액에 존재하면서, 상기 산화제 및 환원제 사이에서는 반응속도론적으로 직접적인 산화환원 반응은 잘 일어나지 않고, 상기 생성물과 산화제 및 환원제 사이에서는 전자전달이 일어나 상기 생성물을 매개로 상기 산화제 및 환원제의 산화환원 반응 및 상기 산화환원 순환이 이루어지며;
상기 산화제의 환원물 또는 환원제의 산화물을 전기화학적으로 빠르게 산화 또는 환원시켜 산화제 또는 환원제가 되도록 하면서, 상기 환원제 또는 산화제를 전기화학적으로 느리게 산화 또는 환원시키는 전극을 포함하며;
상기 전극에서의 전기화학 반응에 의해 생성된 산화제 또는 환원제는 상기 산화환원 순환에 의해 환원 또는 산화되어 산화제의 환원물 또는 환원제의 산화물이 생성되며, 상기 산화제의 환원물 또는 환원제의 산화물의 전기화학 반응에 의해 다시 산화제 또는 환원제가 되는 것을 반복함으로써 신호가 증폭되며;
상기 산화환원 순환의 반복에 의해 증폭 생성된 환원제의 산화물 또는 산화제의 환원물의 전기화학적, 색깔적 또는 형광적인 변화로부터 신호를 감지함으로써 생체분자의 존재 및 농도를 측정하는 바이오센서. - 제 1 항에 있어서,
상기 효소는 상기 산화제 및 환원제에 의해 크게 영향을 받지 않는 효소인 것을 특징으로 하는 바이오 센서. - 제 1 항에 있어서,
상기 생성물은 하이드로퀴논, 아미노페놀, 다이아미노벤, 다이하이드록시나프탈렌, 아미노나프톨, 다이아미노나프탈렌, 벤조퀴논, 퀴논 이민, 나프토퀴논, 나프토퀴논 이민으로 이루어진 그룹에서 선택되는 것을 특징으로 하는 바이오센서. - 제 1 항에 있어서,
상기 환원제는 하이드라진, 트리스(2-카복시에틸)포스핀 및 니코틴아마이드 아데닌 다이뉴클레오티드 환원 형태로 이루어진 그룹에서 선택되는 것을 특징으로 하는 바이오센서. - 제 1 항에 있어서,
상기 산화제는 Ru(NH3)6 3+, Ru(NH3)5(pyridine)3+, Ru(NH3)4(bipyridyl)3+, 페로세니움 이온 및 Fe(CN)6 3-로 이루어진 그룹에서 선택되는 것을 특징으로 하는 바이오센서. - 삭제
- 제 2 항에 있어서,
상기 효소는 포스파테이즈, 갈락토시데이즈, 또는 단백질 분해효소인 것을 특징으로 하는 바이오 센서. - 삭제
- 삭제
- 제 1 항에 있어서,
상기 전극은 상기 생성물 또는 상기 산화환원 순환에 의해 생성되는 생성물의 산화물 또는 환원물을 전기화학적으로 환원 또는 산화시키며, 상기 전기화학적 반응에 의해 신호가 증폭되는 것을 특징으로 하는 바이오센서. - 제 7 항에 있어서,
상기 효소의 기질은 아미노페닐 포스페이트, 하이드로퀴논 포스페이트, 하이드로퀴논 다이포스페이트, 아미노나프틸 포스페이트, 나프토하이드로퀴논 포스페이트, 나프토하이드로퀴논 다이포스페이트, 아미노페닐 갈락토우즈, 하이드로퀴논 갈락토우즈, 하이드로퀴논 다이갈락토우즈, 아미노나프틸 갈락토우즈, 나프토하이드로퀴논 갈락토우즈, 나프토하이드로퀴논 다이갈락토우즈, 아미노페닐 펩타이드소중합체, 아미노나프틸 펩타이드소중합체 및 다이아미노나프탈렌 다이펩타이드소중합체로 이루어진 그룹에서 선택되는 것을 특징으로 하는 바이오센서. - 제 1 항에 있어서,
상기 전극은 ITO 전극, FTO(fluorinated tin oxide) 전극을 포함하는 주석 산화물 전극, 붕소가 도핑된 다이아몬드(boron-doped diamond) 전극 또는 유사다이아몬드 탄소(diamond-like carbon) 전극인 것을 특징으로 하는 바이오센서. - 제 1 항에 있어서,
상기 산화제 또는 환원제와 방해물질 사이의 전자전달이 느리게 일어나, 상기 산화제, 상기 환원제 및 상기 방해물질이 참여하는 산화환원 순환은 느리게 일어나는 것을 특징으로 하는 바이오센서.
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Cited By (1)
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Families Citing this family (8)
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WO2016154627A1 (en) * | 2015-03-26 | 2016-09-29 | Xagenic Inc. | Ultrasensitive diagnostic device using electrocatalytic fluid displacement (efd) for visual readout |
US10670595B2 (en) * | 2015-05-26 | 2020-06-02 | Oncogenesis, Inc. | System, method and kit for detection of analytes by production of electrochemical species |
US11104933B1 (en) | 2016-03-22 | 2021-08-31 | Cleu Diagnostics, Llc | Compositions and methods for determining the presence of active leukocyte cells using an electrochemical assay |
US20190064165A1 (en) * | 2016-03-22 | 2019-02-28 | Parvizi Surgical Innovation, Llc | Compositions and methods for determining the presence of active leukocyte cells using an electrochemical assay |
KR101871895B1 (ko) * | 2016-04-20 | 2018-06-28 | 한국과학기술연구원 | 응집 단백질의 고감도 광 산화 증폭 면역 분석을 통한 체액기반의 퇴행성 신경질환 진단 방법 |
KR102009455B1 (ko) * | 2017-07-10 | 2019-08-09 | 부산대학교 산학협력단 | 산화환원 효소를 이용한 바이오센서 |
KR102094871B1 (ko) * | 2018-04-18 | 2020-03-31 | 부산대학교 산학협력단 | 공액 고분자 전해질을 이용하는 바이오 센서 및 이를 이용한 분석물질 검출방법 |
KR102497547B1 (ko) * | 2020-08-31 | 2023-02-09 | 부산대학교 산학협력단 | 거리에 따른 빛의 세기 차이를 이용한 바이오 센서 |
Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20060160100A1 (en) | 2005-01-19 | 2006-07-20 | Agency For Science, Technology And Research | Enzymatic electrochemical detection assay using protective monolayer and device therefor |
KR100812573B1 (ko) | 2006-10-26 | 2008-03-13 | 부산대학교 산학협력단 | 피드백을 이용한 바이오센서 |
KR20100122997A (ko) * | 2009-05-14 | 2010-11-24 | 부산대학교 산학협력단 | 포스파테이즈 및 주석산화물 전극을 이용한 전기화학 바이오센서 |
Family Cites Families (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
GB8432069D0 (en) * | 1984-12-19 | 1985-01-30 | Iq Bio Ltd | Apparatus for immunoassay |
-
2012
- 2012-11-28 KR KR1020120136254A patent/KR101433473B1/ko active IP Right Grant
- 2012-12-13 US US14/365,313 patent/US20140329254A1/en not_active Abandoned
Patent Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20060160100A1 (en) | 2005-01-19 | 2006-07-20 | Agency For Science, Technology And Research | Enzymatic electrochemical detection assay using protective monolayer and device therefor |
KR100812573B1 (ko) | 2006-10-26 | 2008-03-13 | 부산대학교 산학협력단 | 피드백을 이용한 바이오센서 |
KR20100122997A (ko) * | 2009-05-14 | 2010-11-24 | 부산대학교 산학협력단 | 포스파테이즈 및 주석산화물 전극을 이용한 전기화학 바이오센서 |
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
Analytical Chemistry. 1 April 2007, Vol. 79, No. 7, pp. 2790-2796 * |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
KR102625649B1 (ko) * | 2022-12-13 | 2024-01-17 | 주식회사 다이아슈어바이오 | 핵산 증폭 기술에서 신호전달물질을 이용한 핵산의 전기화학적 검출방법 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
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US20140329254A1 (en) | 2014-11-06 |
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