CN110646486B - 基于杂交链反应及TdT调控的铅离子传感器及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了基于杂交链反应及TdT调控双重信号放大的铅离子交流阻抗传感器研究，具体步骤如下：处理Au，用HP修饰，发夹探针H1和发夹探针H2混合均匀滴到电极表面，HCR反应发生，然后TdT缓冲液、dATP、dGTP、TdT，混合均匀，滴于电极表面，TdT扩增反应发生，再依次滴加Pb2+、hemin、DAB、H2O2标记为IP/G4/HCR/Au，用于EIS检测。在传感器制备过程中，改变Pb2+浓度探究所制备的一系列传感器对电化学阻抗信号的影响。优点是灵敏度高、检测速度快、结果准确可靠、成本低。

Description

基于杂交链反应及TdT调控的铅离子传感器及应用
技术领域
本发明涉及一种电化学阻抗传感器及其检测方法，尤其是涉及基于杂交链反应及TdT调控双重信号放大的铅离子交流阻抗传感器的制备及应用，属于功能生物材料和生物传感技术领域。
背景技术
铅(Pb2+)是最毒的重金属污染物之一，在人体的重要器官和组织中积累会导致神经、生殖、心血管和发育障碍。环境保护局设定的饮用水安全限值为15ppb(0.07μM)，而国际癌症研究机构设定阈值则低于10ppb(48.26nM)。传统铅离子分析检测技术，如原子吸收光谱法、原子发射光谱法、电感耦合等离子体、质谱和X射线荧光分光光度法等，已被用于Pb2+分析。然而，这些技术大多数需要复杂的仪器、操作和样品制备程序，而且昂贵且耗时。因此，亟待开发高灵敏、高选择性的铅离子检测方法。
电化学阻抗谱(EIS)即通过测量阻抗随正弦波频率的变化，进而分析电极过程动力学、双电层和扩散等，由于采用小幅度的正弦电势信号对系统进行微扰，电极上交替出现阳极和阴极过程(也就是氧化和还原过程)，二者作用相反，即使扰动信号长时间作用于电极，也不会导致极化现象的积累性发展和电极表面状态的积累性变化。因此，EIS 法是一种″准稳态方法″。Xiang报道了使用发夹DNA和石墨烯/Au进行无标记的免疫测定基因传感。此外，基于单壁碳纳米角作为标记和生物催化沉淀作为信号增强剂，开发了夹心型阻抗免疫传感器用于检测α-胎蛋白。可见，EIS方法是一种功能强大，信息量大且非破坏性的分析方法。因此，EIS传感器吸引了众多科研工作者的目光。
在生物传感器的设计过程中，为了进一步改善检测方法灵敏度，引入了一些循环放大技术，譬如：滚环复制放大反应、聚合酶链式反应、杂交链式反应、聚合酶链置换反应、链取代反应等。其中，杂交链式反应(HCR)技术是基于一种亚稳态发夹DNA，利用一种单链DNA启动分子。当单链分子与亚稳态发夹DNA结合时使得发夹结构打开，DNA发夹构象由此发生改变暴露出发夹环，进而不断结合和打开新的DNA发夹，驱动形成条长的双链聚合体。很少有人将这种DNA循环放大技术引入铅离子检测方法中，具有较大的发展空间和意义。
利用这些性质，我们利用杂交链反应及脱氧核苷酸末端转移酶(TdT)扩增反应开发了一种信号双重放大的高灵敏、高选择性的Pb2+检测方法。我们设计了三种DNA探针，包括一个含有巯基并可引发HCR序列的辅助探针(HR)，以及可以产生HCR放大反应的发夹DNA1(H1)和发夹DNA2(H2)探针。HCR扩增后，引入底物dNTP(采用dATP∶dGTP＝4∶6)，通过TdT特异性催化H1和H2链的3’-OH末端，生成随机排布富G的长链DNA。在Pb2+作用下，这种富G的DNA链会从无规则的卷曲结构变成规则的G4结构。G4与血红素(hemin)作用能够形成一种有辣根过氧化物酶活性的DNA 模拟酶，并将3，3-二氨基联苯胺(DAB)被氧化形成不导电的不溶性沉淀物(IP)。使得电极界面和氧化还原探针之间的电子转移受到很大阻碍，导致电化学阻抗信号的显著放大。目前国内外尚未发现联合杂交链反应和TdT扩增反应用于铅离子电化学阻抗型传感器的构建的报道。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种特异性好、灵敏度高、检测速度快、结果准确可靠、成本低的基于杂交链反应及TdT调控双重信号放大的铅离子交流阻抗传感器研究。
本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：基于杂交链反应及TdT调控双重信号放大的铅离子交流阻抗传感器研究，具体步骤如下：
(1)Au：首先在含有粒径为0.05μm的Al2O3悬浮液的抛光布上抛光，然后在水中超声1～6min处理，再用蒸馏水缓缓冲洗三次，获得干净的金电极(Au)。
(2)HCR/Au：a.Au用氮气吹干后置于HP(1～6μL，0.01～0.6μM)溶液中组装3～12h，蒸馏水缓缓冲洗；接着把电极浸泡在巯基己醇(MCH)(0.5～5mM)水溶液中 10～30min，蒸馏水缓缓冲洗；b.将0.2～3μL 10×Tris反应缓冲液、发夹探针H1(0.1～2.5 μL，0.02～1μM)、发夹探针H2(0.1～2.5μL，0.02～1μM)混合均匀并滴到a中电极表面，在25～39℃下反应0.5～1.2h，蒸馏水缓缓冲洗，标记为HCR/Au。
(3)G4/HCR/Au：a.控制TdT反应液总体积为2.5μL：加入TdT缓冲液，dATP (0.2～0.8μL，0.5～10mM)，dGTP(0.1～1.3μL，0.8～12mM)，TdT(0.2～1.5μL，0.5～12 U/mL)，混合均匀，滴于HCR/Au表面，在25～39℃下放置0.3～1.3h，蒸馏水缓缓冲洗电极；b.再滴加Pb2+(0.6～6μL，0～5000nM)和hemin(0.8～8μL，0.5～2μM)，室温下静置15～50min，蒸馏水缓缓冲洗。
(4)IP/G4/HCR/Au：滴加DAB(2～10μL，1～20mM)和H2O2(2～10μL，1～20 mM)，静置10～60min，标记为IP/G4/HCR/Au，用于EIS检测。
所述的10×Tris反应缓冲液由以下溶液配制：50mM三羟甲基氨基甲烷-盐酸(Tris- HCl)，500mM氯化镁(MgCl2)，pH 8.0。
发明原理：我们利用杂交链反应和TdT扩增反应开发了一种信号双重放大的高灵敏、高选择性的Pb2+检测方法。我们设计了三种DNA探针，包括一个含有巯基并可引发HCR序列的辅助探针，以及可以产生HCR放大反应的发夹1和发夹2探针。HCR 反应后，在dNTP(dATP∶dGTP＝4∶6)存在下，通过脱氧核苷酸末端转移酶的特异性催化，使得dNTP不断地结合在H1和H2链的3’-OH末端，生成随机排布富G的长链 DNA。在Pb2+作用下，这种富G的DNA链会从无规则的卷曲结构变成规则的G4结构。 G4与血红素(hemin)作用能够形成一种有辣根过氧化物酶活性的DNA模拟酶。在 G4/hemin的生物催化作用下，3，3-二氨基联苯胺(DAB)被氧化形成不导电的IP，使得电极界面和氧化还原探针之间的电子转移受到很大阻碍，导致电化学阻抗信号的显着放大。显然，在浓度一定范围内，目标物浓度越大，电化学阻抗响应越明显。实验结果表明，电化学阻抗大小与目标物浓度在一定范围内呈线性关系，实现对目标物的检测。其优点在于：
(1)高灵敏度。实验得出传感器的电化学响应对Pb2+浓度对数值的线性相关方程为y＝89481gCPb2++38863，R2＝0.9937，线性范围为0.0001～1nM，检测限为0.03pM，由此说明传感器对Pb2+可实现高灵敏检测。
(2)结果准确。回收率均在90％～110％之间。
(3)制备与检测方法试剂用量少、检测速度快、成本低。
(4)特异性好。其他常见的金属离子对本体系基本无干扰。
综上所述，本发明制备基于杂交链反应及TdT调控双重信号放大的铅离子交流阻抗传感器的构建，具有灵敏度高、选择性好、操作简单、分析快速、易于操作等优点，可以实现检测低浓度Pb2+，具有良好的应用前景。
附图说明
图1为本发明传感器的制备过程的交流阻抗对比实验图；
图2为本发明传感器对有无Pb2+的电化学交流阻抗响应；
图3为本发明传感器对不同浓度Pb2+电化学交流阻抗响应对Pb2+浓度对数校准曲线图；
图4为本发明传感器的选择性实验图；
图5为本发明传感器的抗干扰实验图。
具体实施方式
以下结合附图实施例对本发明作进一步详细描述。
实施例1传感器的制备
(1)Au：首先在含有粒径为0.05μm的Al2O3悬浮液的抛光布上抛光，然后在水中超声3min处理，再用蒸馏水缓缓冲洗三次，获得干净的金电极(Au)。
(2)HCR/Au：a.Au用氮气吹干后置于HP(3μL，0.2μM)溶液中组装6h，蒸馏水缓缓冲洗；接着把电极浸泡在巯基己醇(MCH)(2mM)水溶液中24min，蒸馏水缓缓冲洗；b.将2μL 10×Tris反应缓冲液、发夹探针H1(1μL，0.5μM)、发夹探针H2 (1μL，0.5μM)混合均匀并滴到a中电极表面，在35℃下反应1h，蒸馏水缓缓冲洗，标记为HCR/Au。
(3)G4/HCR/Au：a.控制TdT反应液总体积为2.5μL：加入TdT缓冲液，dATP (0.4μL，10mM)，dGTP(0.6μL，10mM)，TdT(1μL，10U/mL)，混合均匀，滴于 HCR/Au表面，在36℃下放置1h，蒸馏水缓缓冲洗电极；b.再滴加Pb2+(3μL，10 nM)和hemin(3μL，1μM)，室温下静置30min，蒸馏水缓缓冲洗。
(4)IP/G4/HCR/Au：滴加DAB(3μL，2mM)和H2O2(3μL，2mM)，静置30 min，标记为IP/G4/HCR/Au，用于EIS检测。
检测制备的四种电极对溶液(0.1M KCl+5mM[Fe(CN)6]3-/4-)的电化学交流阻抗响应，见图1。可看出制备的传感器相比较于其他三种电极，电化学阻抗响应很明显。
实施例2有无Pb2+的电化学响应
基于杂交链反应及TdT调控双重信号放大的铅离子交流阻抗传感器研究，基于实施例1制备的生物传感器。见图2，无Pb2+时，传感器在溶液(0.1M KCl+5mM[Fe(CN)6]3-/4-)中的电化学阻抗响应很小，而在1nM Pb2+存在时，交流阻抗响应明显增强，证明该传感器可用于Pb2+检测。
实施例3 Pb2+检测
基于杂交链反应及TdT调控双重信号放大的铅离子交流阻抗传感器研究，传感器的制备步骤同具体实施例1，在传感器制备过程(3)中，依次改变Pb2+的浓度，Pb2+的浓度为：0、0.0001、0.0004、0.001、0.004、0.01、0.04、0.1、0.4、1、4、10nM，随后用于制备传感器。记录传感器在溶液(0.1M KCl+5mM[Fe(CN)6]3-/4-)中的电化学交流阻抗响应，根据实验结果，获得一系列不同浓度Pb2+对应的电化学阻抗响应曲线，建立电化学交流阻抗响应大小与Pb2 +浓度之间的定量关系，根据两者之间的定量关系，确定待测样品中Pb2+的浓度。实验结果如图3所示，说明随着Pb2+浓度增大，传感器的交流阻抗响应越明显，线性相关方程为y＝8948lgCPb2++38863，R2＝0.9937，线性范围为0.0001～1 nM，检测限为0.03pM，说明传感器对Pb2+可实现高灵敏检测。
实施例4特异性检测
选择性和抗干扰性实验中Pb2+及其他金属离子的浓度均为1nM，所用到的其他金属离子的缩写如下：Ag+(银离子)、Cu2+(铜离子)、Fe3+(铁离子)、Mg2+(镁离子)、 Cd+(镉离子)。
按上述实施例1的传感器制备步骤，用其他相同浓度的金属离子代替Pb2+，制备得到传感器。结果如图4所示，与Pb2+对比，传感器对其他金属离子的电化学响应非常小，基本接近空白信号，说明传感器对于Pb2+的检测有很好的选择性。
按上述实施例1的传感器制备步骤，其他相同浓度的金属离子与Pb2+同时存在，制备得到传感器。结果如图5所示，其他金属离子的加入基本没有影响传感器的电化学阻抗响应，说明传感器对于Pb2+的检测有很好的抗干扰性。
当然，上述说明并非对本发明的限制，本发明也并不限于上述举例。本技术领域的普通技术人员在本发明的实质范围内做出的变化、改型、添加或替换，也应属于本发明保护范围。

Claims (5)

1.一种基于杂交链反应及TdT调控双重信号放大的铅离子Pb2+交流阻抗传感器，其特征在于，制备步骤如下：
(1)金电极Au：首先在含有粒径为0.05μm的Al2O3悬浮液的抛光布上抛光，然后在水中超声1～6min处理，再用蒸馏水缓缓冲洗三次，获得干净的金电极Au；
(2)HCR/Au：a.金电极Au用氮气吹干后置于HP溶液中组装3～12h，蒸馏水缓缓冲洗；接着把电极浸泡在0.5～5mM的巯基己醇MCH水溶液中10～30min，蒸馏水缓缓冲洗；b.将0.2～3μL 10×Tris反应缓冲液、发夹探针H1、发夹探针H2混合均匀并滴到步骤a中电极表面，在25～39℃下反应0.5～1.2h，蒸馏水缓缓冲洗，标记为HCR/Au；
其中所述HP为含有巯基并可引发杂交链反应HCR序列的DNA辅助探针，用量为1～6μL，浓度为0.01～0.6μM；
发夹探针H1用量为0.1～2.5μL，浓度为0.02～1μM；
发夹探针H2用量为0.1～2.5μL，浓度为0.02～1μM；
(3)G4/HCR/Au：a.控制TdT反应液总体积为2.5μL：加入TdT缓冲液，dATP，dGTP，TdT，混合均匀，滴于HCR/Au表面，在25～39℃下放置0.3～1.3h，蒸馏水缓缓冲洗电极；b.再滴加Pb2+和血红素hemin，室温下静置15～50min，蒸馏水缓缓冲洗；
其中dATP用量为0.2～0.8μL，浓度为0.5～10mM；
dGTP用量为0.1～1.3μL，浓度为0.8～12mM；
TdT用量为0.2～1.5μL，浓度为0.5～12U/mL；
Pb2+用量为0.6～6μL，浓度为0～5000nM；
血红素hemin用量为0.8～8μL，浓度为0.5～2μM；
(4)IP/G4/HCR/Au：滴加3，3-二氨基联苯胺和H2O2，静置10～60min，标记为IP/G4/HCR/Au，用于EIS检测；
其中3，3-二氨基联苯胺用量为2～10μL，浓度为1～20mM；
H2O2用量为2～10μL，浓度为1～20mM；
所述IP/G4/HCR/Au中IP表示3，3-二氨基联苯胺被氧化形成不导电的不溶性沉淀物。
2.根据权利要求1所述的铅离子Pb2+交流阻抗传感器，其特征在于，步骤(1)中所述的10×Tris反应缓冲液由以下溶液配制：50mM三羟甲基氨基甲烷-盐酸ris-HCl，500mM氯化镁，pH 8.0。
3.根据权利要求1或2所述的铅离子Pb2+交流阻抗传感器的应用，其特征在于，应用于不同浓度铅离子Pb2+的检测。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，应用方法如下：根据权利要求1或2中所述铅离子Pb2+交流阻抗传感器的制备步骤 ，在步骤(3)中依次改变铅离子Pb2+浓度，获得一系列不同浓度Pb2+对应的电化学阻抗响应曲线，建立电化学交流阻抗响应大小与Pb2+浓度之间的定量关系，根据两者之间的定量关系，确定待测样品中Pb2+的浓度。
5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，Pb2+浓度线性范围为0.0001～1nM，检测限为0.03pM。
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Miao et al. Application of iridium (III) complex in label-free and non-enzymatic electrochemical detection of hydrogen peroxide based on a novel “on-off-on” switch platform
Zhang et al. A Pb2+-ion electrochemical biosensor based on single-stranded DNAzyme catalytic beacon
Lei et al. An enzyme-free and label-free signal-on aptasensor based on DNAzyme-driven DNA walker strategy
Kim et al. Rapid and label-free, electrochemical DNA detection utilizing the oxidase-mimicking activity of cerium oxide nanoparticles
Zhao et al. Electrochemical aptasensor based on Au@ HS-rGO and thymine-Hg2+-thymine structure for sensitive detection of mercury ion
Dong et al. A sensitive electrochemical sensor based on PtNPs@ Cu-MOF signal probe and DNA walker signal amplification for Pb2+ detection
Yuan et al. Sensitive pseudobienzyme electrocatalytic DNA biosensor for mercury (II) ion by using the autonomously assembled hemin/G-quadruplex DNAzyme nanowires for signal amplification
Liu et al. An electrochemical aptasensor for sensitive and selective detection of dopamine based on signal amplification of electrochemical-chemical redox cycling
Chen et al. A facile electrochemical aptasensor for lysozyme detection based on target-induced turn-off of photosensitization
Sawan et al. Aptamers functionalized metal and metal oxide nanoparticles: Recent advances in heavy metal monitoring
Huang et al. A protease-free and signal-on electrochemical biosensor for ultrasensitive detection of lead ion based on GR-5 DNAzyme and catalytic hairpin assembly
Lei et al. A “signal-on” electrochemical biosensor based on DNAzyme-driven bipedal DNA walkers and TdT-mediated cascade signal amplification strategy
Huang et al. A label-free electrochemical sensor for detection of mercury (II) ions based on the direct growth of guanine nanowire
quan Zhong et al. An electrochemical Hg2+ sensor based on signal amplification strategy of target recycling
Li et al. A Sensitive Fluorescence Biosensor for Silver Ions (Ag+) Detection Based on C‐Ag+‐C Structure and Exonuclease III‐Assisted Dual‐Recycling Amplification
Li et al. Zettomole electrochemical HIV DNA detection using 2D DNA-Au nanowire structure, hemin/G-quadruplex and polymerase chain reaction multi-signal synergistic amplification
Niu et al. Sensitive DNA biosensor improved by Luteolin copper (II) as indicator based on silver nanoparticles and carbon nanotubes modified electrode

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