CN107589162B

CN107589162B - 一种基于铱配合物光电化学生物传感器的制备方法及应用

Info

Publication number: CN107589162B
Application number: CN201710760878.9A
Authority: CN
Inventors: 李春香; 卢维森; 庞萌萌; 周晓明; 朱明�
Original assignee: Qingdao University of Science and Technology
Current assignee: Deming Shenzhou Bioengineering Beijing Co ltd
Priority date: 2017-08-30
Filing date: 2017-08-30
Publication date: 2019-07-23
Anticipated expiration: 2037-08-30
Also published as: CN107589162A

Abstract

本发明公开了一种基于环金属铱配合物光电化学生物传感器的制备方法及在凝血酶检测中的应用。该传感器以可见光激发的铱配合物作为光电活性材料，将其负载于胶体金上制备了金纳米信号探针。将捕获发夹DNA固定在修饰好的ITO电极上制得本传感器的工作电极。凝血酶识别体系包括特异性识别发夹HP1及辅助发夹HP2，当存在凝血酶时，在外切酶ExoIII的作用下释放大量二级靶T‑DNA，与工作电极上的捕获发夹DNA杂交进而捕获金纳米信号探针，实现光电流信号的响应。不同浓度的凝血酶使得连接到工作电极的信号探针的量不同，从而导致光电流强度的不同，实现对凝血酶的定量检测。该方法具有灵敏度高、选择性好的优势。

Description

一种基于铱配合物光电化学生物传感器的制备方法及应用

技术领域

本发明涉及基于环金属铱配合物光电化学生物传感器的制备方法及其在凝血酶检测中的应用，属于光电功能材料和生物分析技术领域。

背景技术

生物标志物(Biomarker)，如microRNA，蛋白质，酶等，是近年来随着免疫学、分子生物学和基因组学技术的发展而提出的一类与细胞生长、增殖、疾病发生等有关的标志物，在疾病早期诊断、预防、药物靶点确定、药物反应以及其他方面发挥重要的作用，尤其在肿瘤、心血管疾病、糖尿病等慢性疾病与复杂疾病的防控上具有重要的价值。凝血酶作为一种重要的生物标志物，可以调控炎症、贫血和伤口愈合速度等生理及病理过程，其浓度水平与许多疾病如白血病、动脉血栓症等有紧密联系。但在疾病初期，凝血酶的浓度水平变化往往很小，给检测带来一定的难度，亟需发展高灵敏的生物检测方法实现标志物的痕量检测以满足临床诊断的需要。

光电化学(Photoelectrochemical,PEC)生物传感器是近年来基于光电转换过程而建立起来的一种新型分析技术。由于光激发过程与电流检测分步进行，激发与检测信号属于不同的能量模式，可降低背景信号，灵敏度比传统的电化学方法高；同时具有设备简单、成本低廉、易于微型化和集成化等特点。PEC生物传感器的灵敏度最终取决于所采用光电材料的转换效率；稳定性、重现性也与所采用材料的理化性质息息相关。目前用于PEC生物分析的光电材料根据结构主要分为两大类(W.W.Zhao et al.,Chem.Rev.,2014,114,7421-7441)：一类为无机半导体纳米材料及其复合物，主要包括TiO₂及CdS、CdTe等量子点。其中TiO₂禁带宽度大，只能被紫外光激发，易使生物体系受到干扰或破坏，需通过使用有机染料或量子点对其进行敏化；CdS、CdTe等量子点是目前应用最广泛的光电材料，具有较好的光电性能，但该类材料电子-空穴复合率高、光稳定性差，另外镉离子的毒性，限制了其在生物体系中的应用；另一类为有机金属配合物，目前这方面的研究还仅限于Ru(bpy)₃ ²⁺及其衍生物。

与Ru配合物相比，一方面，环金属铱配合物的光物理性质和电化学性质具有更宽的调控范围；另一方面金属铱原子序数比Ru大，增强了配位场的分裂能，使得铱配合物具有更高的化学稳定性。尽管环金属铱配合物具有优异的光电性能，但将其用作光电材料用于光电化学生物传感还是一个崭新的领域，Cosnier等曾验证了铱配合物与传统Ru配合物具有类似的光电活性(A.L.Goff et al.,J.Mater.Chem.,2011,21,3910-3915)。最近，本课题组基于dppz与DNA的高亲和作用，设计合成了新型的光电材料[(ppy)₂Ir(dppz)]⁺PF₆ ^-，并用于高灵敏检测DNA(C.X.Li et al.,Anal.Chem.,2015,87,4283-4291)。目前制约铱配合物在PEC领域进一步应用的瓶颈在于其在可见光区的吸收弱，最大激发波长只限于紫外区域，容易造成生物体系的光损伤。因此，增强铱配合物在可见光长波方向的光吸收能力，进一步提高光电转换效率是该类材料在光电化学生物传感器领域进行应用的关键。

综上所述，结合PEC生物传感器的优点，设计合成可见光激发的高效铱配合物光电活性材料，基于信号放大技术，实现复杂生物体系中生物标志物的高灵敏、高特异性分析检测，为相关疾病的早期诊断提供新方法和新技术。

发明内容：

本发明旨在提供一种基于环金属铱配合物可见光激发的光电化学生物传感器的制备方法，用于凝血酶的检测，具有灵敏度高、检测限低的特点。

基于上述目的，本发明所涉及的技术方案如下：

(1)本发明所述的光电材料为离子型双配体环金属铱配合物，环金属化配体为香豆素-6，辅助配体为4,4'-二羧酸-2,2'-联吡啶，用作光电化学生物传感器的活性材料，其结构式如下所示：

铱配合物的合成采用两步反应进行。首先IrCl₃·3H₂O与过量的环金属化配体在2-乙氧基乙醇中回流24h，得到氯桥联的二聚中间体，然后中间体与辅助配体在Na₂CO₃存在下，在2-乙氧基乙醇中回流，柱层析提纯得到铱配合物。

(2)本发明提供一种基于环金属铱配合物金纳米探针的制备方法，具体步骤如下：

向柠檬酸根保护的胶体金(AuNPs)溶液中加入经三(2-羧基乙基)膦盐酸盐(TCEP)活化的双功能连接剂β-巯基乙胺和末端巯基化的信号DNA，室温条件下孵化6h。然后加入活化羧基的铱配合物溶液，置于37℃摇床上震荡12h。离心分离进行洗涤，如此重复三次，得到用于制备光电化学生物传感器的铱配合物金纳米探针，其结构示意图如下：

其中为信号DNA；为铱配合物；为胶体金。

(3)本发明同时提供一种基于环金属铱配合物金纳米探针制备光电化学生物传感器的方法，用于凝血酶的检测，具体步骤主要包括如下四部分：

ITO电极的修饰：将清洗干净、面积固定的ITO电极浸入3-氨基丙基三乙氧基硅烷溶液中在电极表面形成氨基化的单分子层。然后将其浸泡在胶体金溶液中得到胶体金修饰的ITO电极，最后通过Au-S键将捕获发夹DNA固定在电极上得到ITO工作电极。

凝血酶的识别：特异性识别发夹HP1含有凝血酶适体，当存在凝血酶时，凝血酶与适体的特异性结合导致能发夹的变形使得已杂交发夹的颈部分释放出来，与辅助发夹HP2杂交，为外切酶Exo III提供了酶切反应的位点，引发Exo III的酶切反应，继而释放出二级靶T-DNA，如此循环往复，得到大量T-DNA，实现光电信号的放大。

铱配合物金纳米探针的捕获：将凝血酶识别后释放的T-DNA溶液滴加到工作电极上，由于T-DNA与捕获发夹DNA的杂交而释放捕获发夹的颈部分，进而与铱配合物金纳米探针的信号DNA杂交将金纳米探针捕获在工作电极上，制得光电传感器。

光电信号检测：将制备好的光电传感器浸入0.1M PBS缓冲溶液中(pH＝7.4)，采用480nm可见光进行激发，以0.1M抗坏血酸为电子供体，对光电流进行检测，实现对不同浓度凝血酶的信号响应。

本发明的有益效果：

(1)本发明首次采用可见光激发的环金属铱配合物作为光电材料用于生物传感器的制备，拓展了一类高效、稳定的新型光电材料。

(2)结合核酸适体的特异性识别作用以及纳米、DNA信号放大技术，实现生物标志物的高灵敏、高特异性分析检测，对于靶凝血酶，检测限低至20fM。

附图说明：

图1铱配合物金纳米探针紫外光谱图

图2光电化学生物传感器制备示意图

图3传感器对凝血酶浓度的光电流响应示意图，凝血酶的浓度分别为(a)0,(b)20fM,(c)50fM,(d)100fM,(e)500fM,(f)1pM,(g)5pM,(h)10pM。

图4传感器对凝血酶浓度的线性关系图

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明，但本发明的保护范围并不限于此。

实施例1

铱配合物的制备

称取IrCl₃·3H₂O固体(0.35g,1mmol)溶于水(3mL)，搅拌使其充分溶解，加入香豆素-6(0.88g,2.5mmol)和乙二醇乙醚(10mL)，反应混合液在氮气氛围下于120℃下反应27h，停止反应冷却至室温。过滤，用无水乙醇洗涤，减压蒸发除去溶剂，进行硅胶柱色谱(100-200目，洗脱剂：二氯甲烷/甲醇＝10:1)提纯，然后真空干燥至恒重，得橘黄色固体氯桥联中间体(0.58g,0.3mmol)，产率60％。称取制得的氯桥联中间体(0.185g,0.1mmol)，2,2'-联吡啶-4,4'-二羧酸(0.06g,0.25mmol)，过量Na₂CO₃，加入到乙二醇乙醚(15mL)中。氮气保护下加热回流24h，冷却至室温。减压蒸发去除溶剂，加入盐酸(1M,10mL)搅拌10分钟，以中和过量的Na₂CO₃。过滤，用去离子水洗涤，沉淀用甲醇和二氯甲烷溶解。加入饱和六氟磷酸胺的甲醇溶液(2mL)，室温继续搅拌30min。减压除去溶剂，进行柱色谱提纯(200-300目，洗脱剂：二氯甲烷/甲醇＝5/1)，得橘红色固体(0.086g,0.075mmol)。¹H NMR(500MHz,DMSO)δ8.71(d,J＝10.0,2H)；8.59(s,2H)；8.08(d,J＝5.0,2H)；7.95(d,J＝10.0,2H)；7.24(t,J＝7.5,2H)；7.00(t,J＝7.5,2H)；6.46(s,2H)；6.03(s,4H)；5.88(d,J＝10.0,2H)；3.40(q,J＝6.5,8H)；0.96(t,J＝6.5,12H).

实施例2

铱配合物胶体金纳米探针的制备

(1)纳米金的制备：将制备过程中所需的玻璃仪器、磁子及存放金纳米粒子的广口瓶均用二次水洗净，用王水浸泡过夜，之后用大量超纯水冲洗至pH值为中性，烘干备用。氯金酸HAuCl₄(1.0mmol/L,100mL)于洗净的单口烧瓶中边搅拌加热至沸腾，然后快速把柠檬酸三钠(38.8mmol/L,10mL)加入到上述溶液，继续反应10min溶液由淡黄色慢慢变为深酒红色，继续回流15min，停止加热，边搅拌边自然冷却至室温，冰箱4℃避光保存。

(2)铱配合物羧基的活化：将铱配合物(0.064g,0.05mmol)溶于10mL无水DMF中，加入EDC(0.058g,0.3mmol)，NHS(0.035g,0.3mmol)，充分混匀反应6h，最后溶液置于4℃冰箱保存。

(3)金纳米探针的制备：将已购买的信号DNA高速离心后配制成100μM的溶液，4℃冷藏备用。取1.5μL 0.5mol/L tris-HCl(pH 7.4)、6μL 10mmol/L TCEP、7.2μL 100μM的探针DNA于样品管中，室温孵化30min，之后加入7.2μL 100μM的β-巯基乙胺溶液，混匀，静置20min。加入1mL纳米金溶液混匀，室温条件下孵化6h。将制备的DNA-AuNPs中加入18μL 5×10^-3mol/L活化铱配合物溶液和120μL 0.1M硼酸缓冲溶液(pH＝9.0)，置于37℃摇床上震荡12h。取出后离心(12000rpm,20min)，产物用0.025mol/L pH＝7.4的Tris-HCl(含0.1MNaCl)洗液洗3次，制得铱配合物胶体金纳米探针。

实施例3

基于实例2中所制备铱配合物金纳米探针，制备光电化学生物传感器用于凝血酶的检测。

(1)工作电极的制备：将ITO电极依次用丙酮、乙醇、超纯水进行充分清洗，然后在氮气氛围下充分干燥。将ITO电极浸泡在含有1mL超纯水、0.2mL NH₄OH(30％)、0.2mL H₂O₂(30％)的混合液中，浸泡10min后取出，用超纯水继续充分清洗，氮气氛围充分干燥，将上述处理好的ITO电极浸泡在APTES的乙醇溶液中(5％(V/V))，室温下浸泡过夜。用乙醇进行充分清洗，以去除未被牢固吸附的APTES，氮气氛围充分干燥，而后将其置于110℃烘箱中，保持1h。随后，将其浸泡于已制备好的胶体金溶液中过夜，用超纯水进行充分清洗，氮气下干燥。将捕获发夹DNA溶解在10mM的tris-HCl缓冲液中(含有100mM NaCl、50mM MgCl₂、10mMTCEP、pH 7.4)，使其浓度为2μM。暗处室温下活化1h，然后将20μL的2μM的已活化的捕获发夹DNA滴到已经被金胶修饰好的ITO电极上，在室温下反应16h，然后将已孵化好的电极浸入10mM Tris-HCl(含有2mM MCH)缓冲液中，浸泡1h，随后Tris-HCl缓冲液进行充分洗涤，氮气氛围下干燥，制得ITO工作电极。

(2)凝血酶的识别：用0.01M Tris-HCl(含0.1M NaCl、50mM MgCl₂、pH 8.0)将凝血酶适体发夹DNA HP1和辅助发夹HP2稀释至1μM，将20μL Tris-HCl(0.01M)、10μL的HP1(1μM)、10μL的HP2(1μM)、10μL的Exo III(2U/μL)以及10μL的不同浓度的凝血酶溶液混合于样品管中，37℃孵化90min。然后将该混合液加热至80℃，保持15min，用以终止剪切酶Exo III的酶切反应。

(3)光电化学生物传感器的制备：将20μL凝血酶识别后释放的T-DNA溶液滴加到工作电极上，37℃孵化2h，用Tris-HCl(0.01M)缓冲液进行充分洗涤，氮气氛围下进行干燥。然后将20μL的上述制备的铱配合物纳米金探针滴加在已经修饰好的上述电极上，37℃孵化2h，用Tris-HCl(0.01M)缓冲液进行充分洗涤，氮气氛围下进行干燥，制得光电化学生物传感器。

(4)光电信号检测：将制备好的传感器浸入0.1M PBS缓冲溶液中(pH＝7.4)，采用480nm可见光进行激发，以0.1M抗坏血酸为电子供体，测定光电流响应，实现对凝血酶的检测。光电流强度与凝血酶的浓度在20fM至10pM范围内成线性关系，线性方程为I＝38.06lgc+97.78，R²＝0.9936，其中I为光电流强度(nA)，c为凝血酶浓度(pM)。

所采用DNA序列如下所示(从5’到3’)：

信号DNA:CAC CTC TCT ACG AAG TT-(CH₂)₆-SH；

HP1:CCA CAC CAA CCT CTT CGT TTC TTG GTT GGT GTG GTT GG；

HP2:CAA CCT CTT CGT AGA GAG GTG TTT CCG AAG AGG TTG GTG TGG；

捕获发夹DNA:CTT CGT AGA GAG GTG CAC GAT TTC CAC CTC TCT ACG AAG AGGTTG-SH；

实施例4

光电化学生物传感器用于检测血清中的凝血酶

步骤(1)、(3)和(4)与实施例3相同。

步骤(2)中凝血酶的识别采用标准加入法，将不同浓度的凝血酶加入20倍稀释的人血清中，其它步骤与实施例3中步骤(2)相同。光电信号响应结果与实施例3相同，表明该传感器可以应用在实际生物血样中。

Claims

1.一种用于凝血酶检测的铱配合物光电化学生物传感器的制备方法，包括以下步骤：

（1）基于环金属铱配合物金纳米探针的制备，其特征在于采用环金属铱配合物作为光电信号活性材料，所述环金属铱配合物的环金属化配体为香豆素-6，辅助配体为4,4'-二羧酸-2,2'-联吡啶，其化学结构如下图所示：

；

向柠檬酸根保护的胶体金溶液中加入经三(2-羧基乙基)膦盐酸盐活化的双功能连接剂β-巯基乙胺和末端巯基化的信号DNA，室温条件下孵育6 h；然后加入活化羧基的环金属铱配合物溶液，置于37 ℃摇床上震荡12 h，离心分离进行洗涤，如此重复三次，得到用于制备光电化学生物传感器的环金属铱配合物金纳米探针；

（2）工作电极的制备，将ITO电极浸入3-氨基丙基三乙氧基硅烷溶液中，在电极表面形成氨基化的单分子层，然后将其浸泡在胶体金溶液中得到胶体金修饰的ITO电极，最后通过金-硫键将捕获发夹DNA固定在电极上得到ITO工作电极；

（3）凝血酶识别体系，包括特异性识别发夹HP1、辅助发夹HP2及核酸外切酶Exo III，特异性识别发夹HP1及辅助发夹HP2的序列为：

HP1: 5’-CCA CAC CAA CCT CTT CGT TTC TTG GTT GGT GTG GTT GG-3’

HP2: 5’-CAA CCT CTT CGT AGA GAG GTG TTT CCG AAG AGG TTG GTG TGG-3’

（4）将凝血酶识别后释放的溶液滴加到工作电极上，与环金属铱配合物金纳米探针的信号DNA杂交，将探针捕获在工作电极上，制得光电化学生物传感器；

（5）光电化学生物传感器的信号检测：检测液为0.1 M PBS缓冲溶液pH = 7.4，采用480nm可见光进行激发，以0.1 M抗坏血酸作为电子供体。

2.根据权利要求1所述方法制备得到的光电化学生物传感器在检测凝血酶中的应用。