CN108918872A - 一种检测凝血酶的纸基光致电化学免疫传感器的构建方法 - Google Patents

一种检测凝血酶的纸基光致电化学免疫传感器的构建方法 Download PDF

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葛慎光
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Abstract

本发明公开了一种基于二氧化钛‑钒酸铋异质结微流控纸芯片光致电化学免疫传感器的构建方法，实现低浓度凝血酶的定量检测。利用蜡打印和激光切割技术在纸上确定亲疏水区域，并借助丝网印刷技术，印制三电极。利用水热法合成二氧化钛‑钒酸铋异质结，实现有效地促进载流子分离，产生较强的光电流信号。将硫化铅量子点‑发夹结构3连接到二氧化钛‑钒酸铋异质结表面，当凝血酶存在时，通过核酸内切酶辅助的信号放大策略及杂交链式反应，改变硫化铅量子点与异质结间的距离，实现对凝血酶高灵敏检测。

Description

一种检测凝血酶的纸基光致电化学免疫传感器的构建方法
技术领域
本发明涉及复合纳米材料技术、光致电化学分析检测技术及凝血酶检测技术领域，更具体地说是基于二氧化钛-钒酸铋异质结和核酸内切酶辅助的信号放大策略特异性检测凝血酶的光致电化学免疫传感器的构建。
背景技术
凝血酶 (TB) 是一种由凝血酶前体形成的丝氨酸蛋白质水解酶，可催化血浆中可溶性纤维蛋白原转变为不溶性纤维蛋白，具有促进和调控凝血等作用，在揭示肿瘤的发生机制及作为早期诊断、疗效及愈后判断依据等方面有重大意义。机体内TB水平过高，会引起血栓栓塞性疾病，而水平过低，会导致出血过多，危害人体健康。因此构建高灵敏的免疫传感器用于TB定量检测刻不容缓。
现如今，构建免疫传感器的方法主要有电化学、电化学发光和光致电化学 (PEC）法等。其中PEC免疫分析法具有成本低、环保和易于集成化等优点。且由于激发光源和检测信号完全分离，PEC免疫传感器具有背景信号低、灵敏度高、响应速度快等优势，被广泛应用于TB定量检测。目前，已经构建的用于检测TB的PEC免疫传感器中，最常用的方法是直接检测待测液中TB的含量。尽管这些PEC免疫传感器能够达到一定的分析灵敏度，但很难实现较低浓度TB的定量检测。鉴于此情况，迫切需要设计一种操作简单、灵敏度高、检测低浓度TB的PEC免疫传感器。
众所周知，PEC免疫传感器的灵敏度与光敏材料的光电转换效率密切相关。二氧化钛纳米片 (TiO2 NSs) 作为本发明的光敏材料，具有高光催化活性、大比表面积大，优良化学和光化学稳定性等优势。但TiO2 NSs作为宽带隙 (3.2 eV) 半导体材料，只能吸收紫外激发光，且其光生电子-空穴对复合速率过快，导致光电转换效率较差。为解决这些问题，将TiO2 NSs与其他窄带隙半导体复合，可显著提高TiO2 NSs的光电转换效率。钒酸铋 (BiVO4)作为窄带隙 (2.4 eV) 的半导体材料，其导带位置比TiO2 NSs导带位置低，与TiO2 NSs配对可产生能带电势差，且由于BiVO4与TiO2 NSs不同的能带结构会产生耦合作用，因而BiVO4与TiO2 NSs复合形成TiO2 NSs-BiVO4异质结，可将材料吸收范围拓展至可见光，有效促进光生载流子的转移，进而抑制电子-空穴对的复合，提高PEC传感器的灵敏度。
发明内容
在本发明中，我们构建了基于高性能TiO2 NSs-BiVO4异质结的PEC免疫传感器，用于TB定量检测。利用水热法合成高性能的TiO2 NSs-BiVO4异质结，有效地促进载流子分离，产生较强的光电流信号。一端连接硫化铅量子点 (PbS QDs) 的发夹结构 (HP3) 固定于电极表面，形成TiO2 NSs-BiVO4-PbS QDs结构，进一步促进光生载流子分离，产生更强的光电流信号。当TB存在时，通过核酸内切酶辅助的信号放大策略，将有限数量的TB转化为放大倍数的目标DNA并与HP3杂交，PbS QDs远离电极表面，TiO2 NSs-BiVO4-PbS QDs结构被破坏，同时PbS QDs与TiO2 NSs-BiVO4竞争光能和电子供体，产生的光电流信号急剧降低，通过检测TB加入前后光电流信号的变化，实现TB的准确、灵敏、低浓度检测。
本发明是通过以下实验方案来实现：
（1）制备微流控纸芯片：用计算机设计微流控纸芯片的疏水蜡批量打印图案，式样如附图1所示，该微流控纸芯片包括两个蜡打印图案分别为A和B，单个单元尺寸为15~35 mm，亲水区域直径尺寸为5~9 mm，其中B亲水区域用于合成TiO2 NSs-BiVO4异质结。
（2）制备TiO2 NSs：首先B亲水区域表面丝网印刷银 (Ag)，干燥后以导电面向下的方式倾斜放入高压反应釜的聚四氟乙烯内衬中；称取0.1~10 g草酸钛钾氧化物加入5~50mL超纯水中，室温搅拌5 min，加入10~50 mL一缩二乙二醇，继续搅拌30 min得到混合溶液并转移至内衬中，封闭拧紧反应釜，于预热的160 ℃烘箱内恒温反应2~8 h；反应完毕后，取出样品，用超纯水彻底清洗3次，于真空干燥箱中60 ℃干燥6 h。
（3）制备TiO2 NSs-BiVO4异质结：称取0.1~10 g偏钒酸铵，1~10 g硝酸铋，10~100mL (2 mol L-1) 硝酸，室温混合并用氨水调节溶液pH值至9，继续搅拌30 min得到混合溶液并转移至高压反应釜的聚四氟乙烯内衬中，将步骤（2）制备的TiO2 NSs以导电面向下的方式放入内衬中，封闭拧紧反应釜，于预热的120 ℃烘箱内恒温反应1~6 h，取出样品，用超纯水冲洗3次，于真空干燥箱中60 ℃干燥6 h。
（4）制备PbS QDs及PbS QDs-发夹结构 (HP) 3：量取20 μL巯基乙酸，10~30 mL(4.5 mM) Pb(NO3)2水溶液，室温混合并搅拌30 min，用氢氧化钠调节混合溶液pH值至11。通入30 min 氮气 (N2) 后，加入1~5 mL (0.015 mM) 硫化钠。在N2气氛下继续搅拌4 h，取出样品，离心洗涤。量取20 μL PbS QDs溶液加入10~40 μL含有20 mg mL-1 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐 (EDC) 和10 mg mL-1 N-羟基琥珀酰亚胺 (NHS) 溶液中，室温活化30 min，离心洗涤后，加入20 μL 5’端修饰羧基的HP3且其碱基序列如核苷酸序列表所示，室温保持1 h，即制得PbS QDs-HP3溶液。
（5）制备磁珠 (MB)-HP2：量取40 μL MB，加入10~50 μL含有20 mg mL-1 EDC和10mg mL-1 NHS溶液中，室温活化30 min，加入10~30 μL 3’端修饰氨基的HP2且其碱基序列如核苷酸序列表所示，继续轻轻搅拌2 h。磁分离后，得MB-HP2溶液。
（6）核酸内切酶辅助的信号放大过程：取1~30 μL HP1溶液、1~30 μL MB-HP2溶液、1~30 μL NIB缓冲液 (10×) 和不同浓度TB，室温混合并孵育1 h。加入1~10 μL Nt.AlWI，室温孵育2 h，随后80 ℃保温20 min，磁分离后获得含不同浓度目标DNA (tDNA) 的PBS溶液。
（7）光致电免疫传感平台的构建：量取10~40 μL 壳聚糖滴加到电极表面，室温孵育2 h，用1 M NaOH和超纯水分别清洗3次，滴加10~40 μL戊二醛，室温孵育30 min，用超纯水彻底清洗3次，滴加10~40 μL PbS QDs-HP3溶液，孵育2 h，用pH 7.4 PBS彻底冲洗3次，滴加10~40 μL 己硫醇溶液，孵育30 min，将步骤（6）所得tDNA溶液滴加到电极表面，室温孵育1 h。
（8）PEC检测在自制的配备500 W氙灯和单色仪的，外部电压为0 V，0.1 mol L-1的AA PBS溶液作为电子供体，激发光源为氙气灯所产生的白光，其光谱范围从200到2500 nm，每隔10秒打开，每隔10秒关闭，通过光电流强度与凝血酶浓度之间的关系，实现对凝血酶的检测。
本发明的有益效果：
（1）本发明中，利用水热法制备的TiO2 NSs-BiVO4异质结，显著促进光生载流子分离和传输，抑制电子-空穴对的复合，产生较强的光电流信号，显著提高传感器的灵敏度。
（2）本发明中，PbS QDs-HP3固定于电极表面，形成的TiO2 NSs-BiVO4-PbS QDs结构进一步促进光生载流子分离，产生更强的光电流信号。
（3）当TB存在时，通过核酸内切酶辅助的信号放大策略，将有限数量的TB转化为放大倍数的目标DNA并与HP3杂交，PbS QDs远离电极表面，TiO2 NSs-BiVO4-PbS QDs结构被破坏，同时PbS QDs与TiO2 NSs-BiVO4竞争光能和电子供体，产生的光电流信号急剧降低，通过检测添加TB前后光电流信号的变化，灵敏检测低浓度TB。
附图说明
下面结合附图和具体实施方案对本发明作进一步详细描述
图1微流控纸芯片的疏水蜡批量打印图案；
图2微流控纸芯片折叠示意图。
具体实施方式:
实施例1: 高灵敏的用于凝血酶检测的光致电化学免疫传感器。
（1）在计算机上利用Adobe Illustrator CS4软件设计微流控纸芯片，式样如附图1所示，该微流控纸芯片包括两个蜡打印疏水区域分别为A和B，单个单元大小为15×15mm，亲水区域的直径为8 mm，其中B亲水区域用于合成TiO2 NSs-BiVO4异质结。
（2）制备TiO2 NSs：B亲水区域表面丝网印刷Ag，干燥后以导电面向下的方式倾斜放入高压反应釜的聚四氟乙烯内衬中；称取0.512 g草酸钛钾氧化物加入8 mL超纯水中，室温搅拌5 min，加入12 mL一缩二乙二醇，继续搅拌30 min得到混合溶液并转移至内衬中，封闭拧紧反应釜，于预热的160 ℃烘箱内恒温反应6 h；反应完毕后，取出样品，用超纯水彻底清洗3次，于真空干燥箱中60 ℃干燥6 h。
（3）制备TiO2 NSs-BiVO4异质结：称取0.585 g偏钒酸铵，2.425 g硝酸铋加入50 mL(2 mol L-1) 硝酸中，室温搅拌30 min，用氨水调节溶液pH值至9，继续搅拌30 min得到混合溶液并转移至高压反应釜的聚四氟乙烯内衬中，将步骤（2）制备的TiO2 NSs以导电面向下的方式放入内衬中，封闭拧紧反应釜，于预热的120 ℃烘箱内恒温反应4 h，取出样品，用超纯水冲洗3次，于真空干燥箱中60 ℃干燥6 h。
（4）制备PbS QDs及PbS QDs-HP3：量取20 μL巯基乙酸加入25 mL (4.5 mM) 硝酸铅水溶液，室温搅拌30 min，用氢氧化钠调节混合溶液pH值至11。通入N2 30 min后，注入2.5 mL (0.015 mM) 硫化钠。在N2气氛下搅拌4 h，取出样品，离心洗涤，量取20 μL PbSQDs溶液加入20 μL含有20 mg mL-1 EDC和10 mg mL-1 NHS溶液中，室温活化30 min，离心洗涤后，加入20 μL 5’端修饰羧基的HP3且其碱基序列如核苷酸序列表所示，室温保持1 h。
（5）制备MB-HP2，取40 μL MB，加入40 μL含有20 mg mL-1 EDC和10 mg mL-1 NHS溶液中，室温活化30 min，加入20 μL (4 μM) 3’端修饰氨基的HP2且其碱基序列如核苷酸序列表所示，继续轻轻搅拌2 h。磁分离及离心洗涤后，将所得MB-HP2分散于20 μL PBS (pH7.0) 溶液。
（6）核酸内切酶辅助的信号放大过程：取20 μL HP1溶液、20 μL MB-HP2溶液、20 μL NIB缓冲液 (10×) 和不同浓度TB，室温混合并孵育1 h。加入5 μL (2 U μL-1) Nt.AlWI，室温孵育2 h，随后在80 ℃保温20 min，磁分离后，获得含不同浓度tDNA的PBS溶液。
（7）光致电免疫传感平台的构建：量取20 μL (0.5 mg mL-1) 壳聚糖滴加到电极表面，室温孵育2 h，用1 M NaOH和超纯水分别清洗3次，滴加20 μL戊二醛，室温孵育30 min，用超纯水彻底清洗3次，量取20 μL PbS QDs-HP3溶液滴加到电极表面，孵育2 h，用pH 7.4PBS冲洗3次，滴加20 μL 己硫醇溶液，孵育30 min，将步骤（6）所得tDNA溶液滴加到电极表面，室温孵育1 h。
（8）PEC检测在自制的配备500 W氙灯和单色仪的，外部电压为0 V，0.1 mol L-1的AA PBS溶液作为电子供体，激发光源为氙气灯所产生的白光，其光谱范围从200到2500 nm，每隔10秒打开，每隔10秒关闭，通过光电流强度与凝血酶浓度之间的关系，实现对凝血酶的检测。
序列表
<110> 济南大学
<120> 一种检测凝血酶的纸基光致电化学免疫传感器的构建方法
<130> 2018
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ggttggtgtg gttggagaag aaggccaacc acaccaaccg atcc 44
<210> 2
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ccattatcac gtgggtgtgg ctgggatcgg ttggttcacg tgataatttt 50
<210> 3
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
aaccgatccc agccacacca caacgtggct gggata 36
<210> 4
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
ccaaccacac caacc 15

Claims (9)

1. 基于二氧化钛-钒酸铋 (TiO2 NSs-BiVO4) 异质结特异性检测凝血酶的光致电化学(PEC) 免疫传感器的制备方法，其特征包括以下步骤：
（1）制备微流控纸芯片；
（2）制备二氧化钛纳米棒 (TiO2 NSs)；
（3）制备二氧化钛-钒酸铋异质结 (TiO2 NSs-BiVO4)；
（4）制备硫化铅量子点 (PbS QDs) 及PbS QDs-发夹结构 (HP) 3；
（5）制备磁珠 (MB)-HP2；
（6）构建PEC免疫传感器；
（7）PEC免疫传感器的光致电化学免疫检测。
2.根据权利要求1所述基于TiO2 NSs-BiVO4异质结特异性检测凝血酶的PEC免疫传感器的构建方法，制备微流控纸芯片，其特征是：在计算机上设计微流控纸芯片的疏水蜡批量打印图案，该微流控纸芯片的蜡打印图案包括两个颜色区域：灰色区域和浅灰色区域，单个单元尺寸为15~35 mm，亲水区域直径尺寸为5~9 mm，其中灰色亲水区域用于合成TiO2 NSs-BiVO4异质结，所用纸芯片为普通滤纸或色谱纸。
3.根据权利要求1所述基于TiO2 NSs-BiVO4异质结特异性检测凝血酶的PEC免疫传感器的构建方法，制备TiO2 NSs，其特征是：在灰色亲水区域表面丝网印刷银，干燥后以导电面向下的方式倾斜放入高压反应釜的聚四氟乙烯内衬中；称取0.1~10 g草酸钛钾氧化物加入5~50 mL超纯水中，室温搅拌5 min，加入10~50 mL一缩二乙二醇，继续搅拌30 min得到混合溶液并转移至内衬中，封闭拧紧反应釜，于预热的160 ℃烘箱内恒温反应2~8 h；反应完毕后，取出样品，用超纯水彻底清洗3次，于真空干燥箱中60 ℃干燥6 h。
4.根据权利要求1所述基于TiO2 NSs-BiVO4异质结特异性检测凝血酶的PEC免疫传感器的构建方法，制备TiO2 NSs-BiVO4异质结，其特征是：称取0.1~10 g偏钒酸铵，1~10 g硝酸铋，10~100 mL (2 mol L-1) 硝酸，室温混合，用氨水调节溶液pH值至9，继续搅拌30 min得到混合溶液并转移至高压反应釜的聚四氟乙烯内衬中，将TiO2 NSs以导电面向下的方式倾斜放入内衬中，封闭拧紧反应釜，于预热的120 ℃烘箱内恒温反应1~6 h，取出样品，用超纯水冲洗3次，于真空干燥箱中60 ℃干燥6 h。
5.根据权利要求1所述基于TiO2 NSs-BiVO4异质结特异性检测凝血酶的PEC免疫传感器的构建方法，制备PbS QDs及PbS QDs-HP3，其特征是：量取20 μL巯基乙酸与10~30 mL (4.5mM) 硝酸铅水溶液混合，室温搅拌30 min，用氢氧化钠调节混合溶液pH值至11。通入30 min氮气后，加入1~5 mL (0.015 mM) 硫化钠。在氮气气氛下继续搅拌4 h，取出样品，离心洗涤。量取20 μL PbS QDs溶液加入10~40 μL含有20 mg mL-1 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐 (EDC) 和10 mg mL-1 N-羟基琥珀酰亚胺 (NHS) 溶液中，室温活化30 min，离心洗涤后，加入20 μL 5’端修饰羧基的HP3且其碱基序列如核苷酸序列表所示，室温保持1 h，得PbS QDs-HP3溶液。
6.根据权利要求1所述基于TiO2 NSs-BiVO4异质结特异性检测凝血酶的PEC免疫传感器的构建方法，制备MB-HP2，其特征是：量取40 μL MB，加入10~50 μL含有20 mg mL-1 EDC和10mg mL-1 NHS溶液中，室温活化30 min，加入10~30 μL 3’端修饰羧基的HP2且其碱基序列如核苷酸序列表所示，继续轻轻搅拌2 h。磁分离后，得MB-HP2溶液。
7.根据权利要求1所述基于TiO2 NSs-BiVO4异质结特异性检测凝血酶的PEC免疫传感器的构建方法，进行凝血酶信号转导及放大过程，其特征是：量取1~30 μL HP1溶液、1~30 μLMB-HP2溶液、1~30 μL NIB缓冲液 (10×) 和不同浓度TB，室温混合并孵育1 h。加入1~10 μL Nt.AlWI，室温孵育2 h，随后80 ℃保温20 min，磁分离后，获得含不同浓度目标DNA的PBS溶液。
8.根据权利要求1所述基于TiO2 NSs-BiVO4异质结特异性检测凝血酶的PEC免疫传感器的构建方法，构建PEC免疫传感器，其特征是：量取10~40 μL 壳聚糖滴加到TiO2 NSs-BiVO4电极表面，室温孵育2 h，用1 M NaOH和超纯水分别清洗3次，滴加10~40 μL戊二醛，室温孵育30 min，用超纯水彻底清洗3次，滴加10~40 μL PbS QDs-HP3溶液，孵育2 h，用pH 7.4PBS彻底冲洗3次，滴加10~40 μL 己硫醇溶液，孵育30 min，滴加目标DNA，室温孵育1 h。
9.根据权利要求1所述基于TiO2 NSs-BiVO4异质结特异性检测凝血酶的PEC免疫传感器的构建方法，进行PEC免疫测量，其特征是：PEC检测在自制的配备500 W氙灯和单色仪的，外部电压为0 V，0.1 mol L-1 AA的PBS溶液作为电子供体，激发光源为氙气灯所产生的白光，其光谱范围从200到2500 nm，每隔10秒打开，每隔10秒关闭，通过光电流强度与凝血酶浓度之间的关系，实现对凝血酶的检测。
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