CN107583630A - 一种具有可逆修饰的凝聚素基亲和色谱柱的制备方法 - Google Patents

Abstract

一种具有可逆修饰的凝聚素基亲和色谱柱的制备方法。本发明涉及一种配基可逆修饰的亲和色谱柱的制备方法，属于材料技术领域。该制备方法为通过纤维素的阴离子液体溶液与乳化剂混合形成双乳化溶液，之后将其倒入色谱柱中，除去多余的油相和离子液体，得到多孔纤维柱材料。并采用基质中螯合的铜离子与亲和配基物理性结合，并可通过吸附/解析反应使此亲和色谱柱再生利用。结果表明，由IDA改性后的纤维素柱结晶度略微降低，但结构未改变，保持了良好的机械性能。亲和色谱对糖蛋白的吸附量高达18.9 mg mL‑1，并且循环使用后保持良好的吸附效率。以上结果表明该方法制备的配基可逆修饰的亲和色谱柱材料是一种能高效应用于蛋白质吸附等领域的活性材料。

Description

一种具有可逆修饰的凝聚素基亲和色谱柱的制备方法

技术领域

本发明属于材料技术领域，具体而言，涉及一种高选择性、低成本的亲和配基的设计合成，特别涉及一种利用金属螯合作用构建具有配基可逆修饰的凝聚素亲和整体柱的新方法。

背景技术

在亲和色谱法是一种分离和分析生物大分子的重要方法，它可以特异性结合混合溶液中的生物分子。这种亲和吸附方法关键是在生物分子和固定在色谱基质多孔表面的配体间的可离解的特定配合物。目前，不同的配合物，如酶-底物，抗原-抗体和受体的补充物等已广泛应用于亲和色谱的制备。

通常，可利用一系列的化学反应将亲和配体固定在基质上，使吸附剂获得较好的稳定性。然而，这种方式是使亲和配体通过共价结合的方式固定在载体上，这种固定方式是不可逆的。其缺点是：在反复分离操作之后，一旦载体上的亲和配体失去活性，昂贵的色谱基质则需作为废物被移除，因此分离成本较高。另外，这种共价结合方式是一种随机化学反应，存在着使配体上起亲合作用的氨基酸残基屏蔽掉的风险，从而导致非特异性吸附，降低最终的分离效率。

为了弥补以上制备亲和色谱过程中的缺点，本发明设计了一种新型制备方法，用以制备高效率的蛋白色谱中的亲和吸附剂。该制备方法的关键点在于：在配基结构设计上，引入具有螯合作用的金属离子，使其通过物理吸附作用分别连接载体和亲和配基，配基的可逆修饰通过螯合的金属离子实现。需要注意的是，在制备具有可逆修饰特性的亲和吸附剂过程中，需要对蛋白质/亲和配基的体系进行系统筛选，使亲和配基对蛋白质的吸附解析作用不受金属螯合作用的影响。基于这种思路，我们通过三步合成了具有可逆修饰的亲和色谱柱。研制过程如下：（1）选择多孔纤维素整体柱为色谱柱载体，通过系列化学反应修饰上羧基基团，并螯合上二价铜离子；（2）选择凝聚素为亲和配基，继续螯合到载体表面修饰的铜离子上，获得具有配基可逆修饰的亲和色谱柱；（3）选择糖蛋白作为待分离生物大分子，对亲和色谱柱进行分离评价，测试其亲和选择性及吸附效果。

发明内容

本发明的目的在于针对传统亲和色谱介质的不足，提供一种配基可逆修饰的亲和色谱柱的制备方法。本发明所述方法制备出的亲和色谱可通过螯合的铜离子对亲和配基进行吸附和解析，从而实现配基的可逆修饰，提高色谱载体的利用率，从而降低应用成本，提高分离效率。本发明的目的是通过如下技术方案实现的。

一种配基可逆修饰的亲和色谱柱的制备方法，具体包括如下步骤：

(1) 将无水的高结晶度纤维素溶于氯化1-丁基3-甲基咪唑，油浴反应温度为80~110℃，在磁力搅拌下反应11~13小时，形成浓度为5~10 wt%的溶液;

(2) 将环己烷和吐温60加入上述溶液，加入比例分别为0.5~1.0和0.05~0.1，进行磁力搅拌，转速为2000rpm，形成纤维素乳化溶液；

(3) 迅速将上述油/水乳化液倒入至玻璃色谱柱中，冷却后加入0.1~0.3M的硫酸钠溶液进行侵泡，分别用酒精和蒸馏水冲洗，用乙二醇二环氧丙醚进一步交联，得到多孔纤维素柱；

(4) 将上述纤维素柱与高碘酸钠溶液作用4.0小时，然后将50℃的0.5M PEHA与0.1M氢氧化钠混合液循环作用12小时，依次与三种溶液（戊二醛，0.2M, pH9.0, 2.5h; IDA,0.1M, pH11, 12h, 70℃; CuSO4, 0.5M, Ph5.0, 2h）作用，得到Cu(II)-IDA-MCM型纤维素柱；

(5) 将上述纤维素柱依次与1 mg mL-1凝聚素（Con A） 在4℃下作用12h，得到Con A-Cu(II)-IDA-MCM型亲和色谱柱。

在上述技术方案中，所述阴离子液体是氯化1-丁基3-甲基咪唑，但不仅限于此一种。

在上述技术方案中，步骤（1）反应温度优化为85~95℃，反应时间优化为11~12小时。

在上述技术方案中，步骤（2）中溶解的纤维素被均匀分散到乳化溶液中。

在上述技术方案中，步骤（4）中IDA溶液的pH用磷酸缓冲液进行调节。

在上述技术方案中，步骤（5）中凝聚素（Con A）溶解于含20 mM 磷酸, 0.15 M 氯化钠, 1 mM 氯化锰, 1 mM 氯化钙的缓冲液。

本发明与现有技术相比，具有以下优点：（1）本发明以高结晶度纤维素作为原料，成本低廉，对环境无污染。（2）本发明操作简单，原料易得，易于规模化工业生产。（3）本发明制备的亲和色谱可根据需要，改变配基种类，拓宽了其应用领域。（4）本发明制备的亲和色谱柱可通过螯合的金属离子对配基的解析和吸附过程，使其再生循环使用，降低了使用成本。

附图说明

图1是本发明实施实例1产物配基可逆修饰的原理示意图。

图2是本发明实施实例1产物X射线衍射图谱。

图3是本发明实施实例1产物中螯合铜离子浓度图。

图4是本发明实施实例1产物对糖蛋白的等温吸附曲线图。

图5是本发明实施实例1产物对糖蛋白的动态吸附图。

图6是本发明实施实例1产物对混合液中糖蛋白的色层分离图谱。

图7是本发明实施实例1产物对糖蛋白循环吸附动态吸附含量图。

具体实施方式

为了更好地理解本发明，下面将结合实施实例和附图对本发明作进一步解释。但需要特别说明的是，实施实例仅用于对本发明进行进一步解释，本发明要求保护的范围并不局限于实施实例表示的范围。

实施实例1

取10g无水的高结晶度纤维素溶于阴离子液体（氯化1-丁基3-甲基咪唑），控温在90℃，磁力搅拌12h。取20ml上述溶液，加入15ml环己烷和1.5ml吐温60，磁力搅拌，转速为2000rpm。待乳液混合均匀后，立即倒入至玻璃色谱柱中。冷却后加入0.1~0.3M的硫酸钠溶液进行侵泡。最后，分别用酒精和蒸馏水冲洗上述色谱柱，除去多余的油相和阴离子液体，得到多孔纤维柱材料。

将上述方法得到的多孔纤维柱材料进一步交联并用氯化二乙胺乙基进行改性，以此来考察该材料的应用特性。向上述多孔纤维柱材料中加入30ml乙二醇二环氧丙醚，用蠕动泵将40℃、3M的氢氧化钠溶液置于柱中循环至交联反应完成。加入2.0M氯化二乙胺乙基，在60℃下反应120分钟，然后加入3.5M氢氧化钠溶液。反应结束后，冷却至室温并用蒸馏水中和pH。最后，按步骤（4）、（5）反应得到Con A-Cu(II)-IDA-MCM型亲和色谱柱。

从Con A-Cu(II)-IDA-MCM型色谱配基可逆修饰的原理示意图（图1）可以看出，螯合的金属铜离子作为连接桥梁，可释放或固定配基，从而使亲和色谱得到再生利用。由X射线衍射图谱（图2）可以看出由IDA改性后的纤维素柱结晶度略微降低，但结构未改变，保持了良好的机械性能。由图3可以看出，随着氧化时间的增加，螯合铜离子临界浓度增加。图4显示了该亲和色谱吸附糖蛋白为作用于凝聚素(Con A)配基表面的单层吸附。图5显示了该亲和色谱柱的良好动态吸附性能。图6显示了该亲和色谱柱对糖蛋白吸附的高选择性。图7显示了该亲和色谱柱循环吸附后仍保持较高的吸附效率。

实施实例2

取5g无水的高结晶度纤维素溶于阴离子液体（氯化1-丁基3-甲基咪唑），由于控温在85℃，磁力搅拌11h。取10ml上述溶液，加入7.5ml环己烷和0.75ml吐温60，磁力搅拌，转速为2000rpm。待乳液混合均匀后，立即倒入至玻璃色谱柱中。冷却后加入0.1~0.3M的硫酸钠溶液进行侵泡。最后，分别用酒精和蒸馏水冲洗上述色谱柱，除去多余的油相和阴离子液体，得到多孔纤维柱材料。最后，按步骤（4）、（5）反应得到Con A-Cu(II)-IDA-MCM型亲和色谱柱。

实施实例3

取20g无水的高结晶度纤维素溶于阴离子液体（氯化1-丁基3-甲基咪唑），由于控温在95℃，磁力搅拌12h。取40ml上述溶液，加入30ml环己烷和3.0ml吐温60，磁力搅拌，转速为2000rpm。待乳液混合均匀后，立即倒入至玻璃色谱柱中。冷却后加入0.1~0.3M的硫酸钠溶液进行侵泡。最后，分别用酒精和蒸馏水冲洗上述色谱柱，除去多余的油相和阴离子液体，得到多孔纤维柱材料。最后，按步骤（4）、（5）反应得到Con A-Cu(II)-IDA-MCM型亲和色谱柱。

Claims (6)

1.一种具有可逆修饰的凝聚素基亲和色谱柱的制备方法，其特征在于包括如下步骤：（1）将无水的高结晶度纤维素溶于氯化1-丁基3-甲基咪唑，油浴反应温度为80~110℃，在磁力搅拌下反应11~13小时，形成浓度为5~10 wt%的溶液;（2）将环己烷和吐温60加入上诉溶液，加入比例分别为0.5~1.0和0.05~0.1，进行磁力搅拌，转速为2000rpm，形成纤维素乳化溶液；（3）迅速将上述油/水乳化液倒入至玻璃色谱柱中，冷却后加入0.1~0.3M的硫酸钠溶液进行侵泡，分别用酒精和蒸馏水冲洗，用乙二醇二环氧丙醚进一步交联，得到多孔纤维素柱；（4）将上述纤维素柱与高点酸钠溶液作用4.0小时，然后将50℃的0.5M PEHA与0.1M氢氧化钠混合液循环作用12小时，依次与三种溶液（戊二醛，0.2M, pH9.0, 2.5h; IDA, 0.1M,pH11, 12h, 70℃; CuSO4, 0.5M, Ph5.0, 2h）作用，得到Cu(II)-IDA-MCM型纤维素柱；（5）将上述纤维素柱依次与1 mg mL-1凝聚素（Con A）在4℃下作用12h，得到Con A-Cu(II)-IDA-MCM型亲和色谱柱。

2.根据权利要求1所述的一种具有可逆修饰的凝聚素基亲和色谱柱的制备方法，其特征在于所述阴离子液体是氯化1-丁基3-甲基咪唑，但不仅限于此一种。

3.根据权利要求1所述的一种具有可逆修饰的凝聚素基亲和色谱柱的制备方法，其特征在于步骤（1）反应温度优化为85~95℃，反应时间优化为11~12小时。

4.根据权利要求1所述的一种具有可逆修饰的凝聚素基亲和色谱柱的制备方法，其特征在于步骤（2）中溶解的纤维素被均匀分散到乳化溶液中。

5.根据权利要求1所述的一种具有可逆修饰的凝聚素基亲和色谱柱的制备方法，其特征在于步骤（4）得到的纤维素柱具有多孔性，进一步交联和改性后，可用作色谱分析基质。

6.根据权利要求1所述的一种具有可逆修饰的凝聚素基亲和色谱柱的制备方法，其特征在于步骤（5）中凝聚素（Con A）溶解于含20 mM 磷酸, 0.15 M 氯化钠, 1 mM 氯化锰, 1mM 氯化钙的缓冲液。