CN1280986A - 液相色谱蛋白质手性固定相的合成方法 - Google Patents
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Abstract
一种液相色谱蛋白质手性固定相的合成方法,其特征在于:采用表面带有胺基或巯基的基质;基质与三聚氯氰反应进行活化;活化的基质再与蛋白键合;以带有胺基的小分子进行封尾。用这种方法合成蛋白固定相可在12小时内完成,且蛋白键合量大、蛋白活性保持好、成功率高,以这种方法合成的蛋白手性固定相既可以先键合后装柱,也可以直接在柱上键合,因此除可用于高效液相色谱外,还特别适用于电色谱。
Description
本发明是一种合成蛋白质手性固定相的方法，用这种方法合成的手性色谱介质由于其具有柱上键合的特点，所以不仅可应用于高效液相色谱，还特别适用于电色谱等领域，另外本发明提供了一种方便、可靠的固载蛋白质的方法。
随着生命科学的进步和制药工业的发展，人类对旋光对映体在生命体中所起的作用认识越来越深刻。例如：互为对映体的药物在人体内的药理往往是不同的，有的甚至相反，在处理有生物活性的物质，如：维生素、信息素、辅醇、药物产品及一般天然存在的手性化合物时，对映体的分离和分析都是头等重要的问题，因此对映体的手性拆分日益受到人们的重视，经典的对映体拆分方法包括：机械法、化学法、生物法、色谱法等。色谱法以其具有高效、方便的优点，在手性拆分领域一直占有绝对优势，根据作用机理的不同可分为间接法：(即用非手性柱分离非对映体)和直接法：(即用手性柱拆分对映体)，而后者的优点是显然的。与气相色谱相比液相色谱由于适用对象广、可变因素多、既可分析又可制备的特点，因而有着更广阔的前景，目前已出现的液相色谱手性介质很多，如：Okamoto提出的以纤维素及其衍生物作为手性固定相，Armstrong发展的环糊精类手性介质，以及Pirkle小组研制的Pirkle型和采用分子烙印技术制备的聚合物手性介质等，由于这些手性固定相结构简单，与对映体之间的作用力差别小，因而每一种手性柱只适用于少数对映体的拆分。1972年Stewart等首次把牛血清白蛋白(BSA)键合于琼脂糖上，发现对DL-色氨酸有拆分作用，可用于手性分离。由于蛋白质结构复杂，与不同物质作用点不同，且其构象随溶液的pH值、离子强度等许多因素的变化而不同，因而具有较广的适用性，在其它手性柱上难以拆分或拆分不理想的对映体，在蛋白柱上往往能得到较好的分离。另外由于有众多的蛋白可供选择，这就有可能对不同的对映体，选择一最佳的蛋白手性柱，由于蛋白作固定相，蛋白柱还可用于研究药物与蛋白的相互作用，蛋白与蛋白的相互作用，以及药物中活性成分的筛选。最初蛋白被键合在琼脂糖上，这是因为琼脂糖具有表面亲水性的特征和易于化学修饰的优点，但琼脂糖是一种凝胶类物质，极易产生不可逆形变，即使通过交联增大强度所能承受的压力也有限，所以只能用于早期的低压色谱，硅胶则克服了以上的缺陷且表面易于修饰，所以一直作为色谱的主要填料，目前几乎所有的蛋白柱均以此为基质。关于蛋白的键合方法目前已有几种，如环氧法、戊二醛法、羰基咪唑法，但环氧法须在碱性条件下键合，不适用于对碱敏感的蛋白，虽可增加离子强度以产生盐析效应，但键合量相对较小。戊二醛法键合步骤繁多，并且在合成中使用了还原剂，对蛋白的活性有一定的影响，使合成的蛋白柱柱效往往较低。羰基咪唑法在合成中首先须在无水条件下反应，生成的活化介质容易水解，成功率不高，所以寻求一种条件温和、高效、通用的合成方法一直是一个重要课题。
本发明的目的在于提供一种液相色谱蛋白质手性固定相的合成方法，该方法反应条件温和，成功率高，所用时间短且适用性广。
本发明提供了一种液相色谱蛋白质手性固定相的合成方法，其特征在于：采用表面带有胺基或巯基的基质；基质与三聚氯氰反应进行活化；活化的基质再与蛋白键合；以带有胺基的小分子进行封尾。所键合的蛋白既可以是白蛋白，也可以是其它蛋白(包括酶)。
具体地说，经胺基或巯基修饰过的基质在有机溶剂中或水中与三聚氯氰反应，三聚氯氰的加入量为胺基摩尔数的1～10倍，在有机溶剂中反应可采用普通的惰性溶剂，如：N，N-二甲基甲酰胺(DMF)、四氢呋喃(THF)、二氧六环、丙酮等，反应温度可在室温或低温下进行；在水中反应时，要不断加入无机碱，如碳酸钠、碳酸氢钠以维持溶液pH值在弱酸性，并且反应过程中温度不要过高。然后被活化的介质在水溶液中与蛋白反应，反应过程中pH值维持在中性，反应可在室温下进行，亦可在稍微加热条件下(20～60℃)进行。最后键合有蛋白的介质在水溶液中与带有胺基的小分子如乙醇胺、甘氨酸乙酯反应进行封尾，封尾剂的浓度为1％，反应过程中pH值维持在中性。
本发明中当基质为硅胶时，硅胶的修饰可采用胺丙基硅烷化试剂，环氧丙基硅烷化试剂或巯丙基硅烷化试剂，反应条件可采用普通技术进行。过程如下：
1．硅胶与硅烷化试剂反应制得表面被胺基或巯基修饰的硅胶；
2．表面带有胺基或巯基的硅胶与三聚氯氰反应制得活化硅胶；
3．被活化的硅胶在水溶液中与蛋白反应；
4．以带有胺基的小分子进行封尾。
合成路线可用下式表示：
使用这种键合方法既可先键合蛋白再装柱，又可以先把活化介质预装柱然后在柱上键合蛋白，键合反应保持在中性、室温下进行，反应迅速一般只需1～2h，12h之内即可完成手性色谱分高介质的合成。
按上述方法制备的手性柱成功率极高，蛋白活性维持较好，经过几个月几百次进样，其柱效几乎没有变化。下面通过在硅胶上键合牛血清白蛋白的实例对本发明的蛋白手性柱的制备及应用作进一步说明。
图1为DL-色氨酸的手性拆分谱图。流动相为：50mmol/L磷酸盐(pH=7.4)+5％乙腈，流速为1.0ml/min，进样量为1μl，检测波长为279nm。
图2为DL-丹酰化苏氨酸手性拆分谱图。流动相为：50mmol/L磷酸盐(pH=7.4)+10％乙腈+1％正丙醇，流速为0.8ml/min，进样量为0.5μl，检测波长为460nm。
图3为华法令手性拆分谱图。流动相为：50mmol/L磷酸盐(pH=7.4)+10％乙腈+2％异丙醇，流速为1.8ml/min，进样量为1.5μl，检测波长为280nm。
实例1：硅胶的修饰
1)与胺丙基硅烷化试剂的反应
取5g球形硅胶(5μ300A)置于150ml三口瓶中，加入100ml新配制的20％盐酸溶液，于110～120℃下回流4h，过滤，以去离子水洗至中性，在120℃下真空干燥12h以上取3g已干燥硅胶加入盛有50ml干燥甲苯的150ml三口瓶，在氮气氛围下加热、搅拌，当温度升到120℃时加入胺丙基三乙基硅烷5ml，于120℃回流24h，然后降温、过滤，硅胶以甲苯、丙酮充分洗涤，在五氧化二磷存在下60℃真空干燥。
2)与环丙基及巯丙基硅烷化试剂的反应
取实例1)中已酸化硅胶5g加入150ml三口瓶中，加入干燥的甲苯50ml，在氮气氛围下加热、搅拌，当温度升到90℃时加入环氧丙基三甲氧基硅烷5ml，在90～95℃反应10h，过滤，硅胶以甲苯、丙酮充分洗涤，在五氧化二磷存在下60℃真空干燥，已干燥的硅胶在pH值=9的氨水缓冲液中反应16h，即得到末端带有胺基的硅胶。
巯丙基硅胶的制备同上，只是与巯丙基硅烷化试剂反应后可直接使用。
实例2：活化硅胶的制备
1)在有机溶剂中反应
取实例1中已活化硅胶2g，加入盛有50ml DMF、2ml吡啶100ml小烧杯中，在室温搅拌下慢慢加入三聚氯氰0.37g，2h后过滤，硅胶以丙酮充分洗涤。
2)在水中反应
取实例1中已活化硅胶2g，加入100ml小烧杯中，量取100ml去离子水在搅拌下冰浴降温至4℃，慢慢加入三聚氯氰0.37g，其间不断加入碳酸钠以维持溶液pH值在5左右，反应过程中温度不要超过5℃，三聚氯氰加完后再反应2h，过滤，以去离子水充分洗涤。
实例3：硅胶蛋白手性柱的合成
1)普通方式
取实例2中已活化的硅胶2g加入30ml磷酸盐的缓冲液中(50mmol/L，pH=7)，在室温下缓慢搅拌，加入牛血清白蛋白150mg，于15～45℃反应，在不同时间内取溶液于280nm下检测吸收值，大约2h后吸收值不再变化，4h后停止搅拌，过滤，硅胶以上述磷酸盐缓冲液充分洗涤，配制含1％甘氨酸乙酯的磷酸盐缓冲液(pH=7)室温下反应过夜，反应好的硅胶即可以普通技术装柱。
2)柱上衍生方式
取实例2中已活化的硅胶2g装柱，柱子接在高效液相色谱仪上，以pH=7磷酸盐缓冲液冲至205nm基线平稳，取150mg牛血清白蛋自溶于上述磷酸盐缓冲液中，15～45℃下在柱上循环，于280nm下检测吸收值，大约2h后吸收值不再变化，循环4h以后以pH=7磷酸盐缓冲液冲至280nm基线平稳，配制含1％甘氨酸乙酯的磷酸盐缓冲液(pH=7)进行封尾，2h后以pH=7磷酸盐缓冲液冲洗即完成了蛋白柱的合成。
Claims (7)
1．一种液相色谱蛋白质手性固定相的合成方法，其特征在于：采用表面带有胺基或巯基的基质；基质与三聚氯氰反应进行活化；活化的基质再与蛋白键合；以带有胺基的小分子进行封尾。
2．按照权利要求1所述液相色谱蛋白质手性固定相的合成方法，其特征在于：活化反应中三聚氯氰的加入量为胺基摩尔数的1～10倍。
3．按照权利要求2所述液相色谱蛋白质手性固定相的合成方法，其特征在于：活化反应在有机溶剂中进行，有机溶剂选自N，N-二甲基甲酰胺、四氢呋喃、二氧六环、丙酮的惰性溶剂。
4．按照权利要求2所述液相色谱蛋白质手性固定相的合成方法，其特征在于：活化反应在水中进行，要不断地加入无机碱，如碳酸钠、碳酸氢钠以维持pH值在弱酸性。
5．按照权利要求1所述液相色谱蛋白质手性固定相的合成方法，其特征在于：键合反应在室温～60℃条件下进行，反应过程中pH值维持中性。
6．按照权利要求1所述液相色谱蛋白质手性固定相的合成方法，其特征在于：封尾剂选自乙酸胺、甘氨酸，封尾剂浓度为1％，反应过程中pH值维持中性。
7．按照权利要求1、2、3、4、5或6所述液相色谱蛋白质手性固定相的合成方法，其特征在于：基质为硅胶时，采用胺丙基硅--试剂、环氧丙基硅烷化试剂或巯丙基硅烷化试剂进行修饰。
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