CN104353442A - 一种纳米硅胶-金手性分离固定相的制备方法 - Google Patents

Abstract

一种纳米硅胶-金手性分离固定相的制备方法，其步骤如下：(1)硅胶的修饰和活化：硅胶与硅烷化试剂反应制得表面被胺基或巯基修饰的硅胶；采用胺丙基硅烷化试剂，环氧丙基硅烷化试剂或巯丙基硅烷化试剂对硅胶进行修饰；所述的硅胶为纳米硅胶球；经过活化后的硅胶球带有氨基或者巯基；经胺基或巯基修饰过的硅胶在有机溶剂中与三聚氯氰反应，三聚氯氰的加入量为胺基摩尔数的1～10倍，活化反应在有机溶剂中进行，有机溶剂选自N，N-二甲基甲酰胺、四氢呋喃、二氧六环、或丙酮的惰性溶剂；反应温度在室温下进行；(2)制备贵金属纳米颗粒溶胶：采用水热法用柠檬酸钠或硼氢化钠作还原剂还原金离子化合物中的金，过0.20～0.45μm的醋酸纤维微孔滤膜，制得含10～80nm金纳米颗粒溶胶；(3)制备手性识别固定相：将步骤(1)获得的纳米硅胶颗粒经清洗后，再分散到步骤(2)所述的溶胶中，调整酸碱度在pH＝4～10的范围内，加入手性识别剂溶液，进行纳米硅胶颗粒与手性识别剂的结合，其结合完成时间为12-36小时；所述手性识别剂为蛋白质、手性表面活性剂、糖苷、皂甙或环糊精。

Description

一种纳米硅胶-金手性分离固定相的制备方法

技术领域

本发明涉及一种纳米手性分离固定相的制备方法。

背景技术

手性异构体是指两个分子结构互为镜像但又不能重合的化台物称为对映体，两个手性的分子式完全相同，只是原子和原子团的空间取向不同。在非手性的环境中对映体的化学性质和物理性质基本相同。但是一些手性异构体在毒性、药理学及生物代谢方面却存在着巨大的差异。

随着生命科学的进步和制药工业的发展，人类对手性异构在生命体中所起的作用认识越来越深刻。例如：互为对映体的药物在人体内的药理往往是不同的，有的甚至相反，在处理有生物活性的物质，如：维生素、信息素、辅醇、药物产品及一般天然存在的手性化合物时，对映体的分离和分析都是头等重要的问题，因此对映体的手性拆分日益受到人们的重视。就药学领域来说，就有多达30％～40％的药物具有手性。手性异构体在生物活性或药物动力学方面的差异使得手性对映体的分离尤为重要。震惊世界的沙立度胺致畸事件就是一个忽视立体化学效应的恶行事故。基于对映体分子的光学性质与其生物活性之间的特殊相关性，在1992年美国食品药品管理局(FAD)就做出了规定，凡研制具有不对称中心的药物，在药物的鉴定和审批报告中必须给出手性拆分结果。相应地，欧共体国家也提出了相类似的措施。另外，在环境化学研究领域，近年的研究也发现，一些手性异构体的环境效应和生态毒理学效应也不尽相同。因此，建立和发展快速准确的手性对映体拆分方法对于分析化学研究具有相当重要的实际意义。

众所周知，要实现分子式相同，化学性质及其相似的手性对映体的拆分必须有手性拆分试剂的参与。现在的手性对映体拆分方法中，主要有两个方面：把手性拆分试剂添加到流动相中，手性识别剂随着分离的进行而流走损失；手性拆分试剂固定于分离分析的固定相中，在一段时间内手性识别剂的分子识别效率保持不变。后一种手性识别剂的手性识别形式由于手性识别剂能够得到反复利用、分离重现性好、分离效率高而受到广大分析工作者的关注。

经典的手性对映体拆分方法包括：机械法、化学法、生物法、色谱法等。色谱法以其具有高效、方便的优点，在手性拆分领域一直占有绝对优势，根据作用机理的不同可分为间接法：(即用非手性柱分离非对映体)和直接法：(即用手性柱拆分对映体)，而后者的优点是显然的。与气相色谱相比液相色谱由于适用对象广、可变因素多、既可分析又可制备的特点，因而有着更广阔的前景，目前已出现的液相色谱手性介质很多，如：Okamoto提出的以纤维素及其衍生物作为手性固定相，Armstrong发展的环糊精类手性介质，以及Pirkle小组研制的Pirkle型和采用分子烙印技术制备的聚合物手性介质等，由于这些手性固定相结构简单，与对映体之间的作用力差别小，因而每一种手性柱只适用于少数对映体的拆分。1972年Stewart等首次把牛血清白蛋白(BSA)键合于琼脂糖上，发现对DL-色氨酸有拆分作用，可用于手性分离。由于蛋白质结构复杂，与不同物质作用点不同，且其构象随溶液的pH值、离子强度等许多因素的变化而不同，因而具有较广的适用性，在其它手性柱上难以拆分或拆分不理想的对映体，在蛋白柱上往往能得到较好的分离。另外由于有众多的蛋白可供选择，这就有可能对不同的对映体，选择一最佳的蛋白手性柱，由于蛋白作固定相，蛋白柱还可用于研究药物与蛋白的相互作用，蛋白与蛋白的相互作用，以及药物中活性成分的筛选。最初蛋白被键合在琼脂糖上，这是因为琼脂糖具有表面亲水性的特征和易于化学修饰的优点，但琼脂糖是一种凝胶类物质，极易产生不可逆形变，即使通过交联增大强度所能承受的压力也有限，所以只能用于早期的低压色谱，硅胶则克服了以上的缺陷。

但是，没有文献报道过把手性识别剂负载在纳米硅胶球-纳米金颗粒上作为固定相。本发明建立了一种新型的手性固定相，其有比表面积大，和被分析物接触充分的优点。把它应用于毛细管柱和微流控电泳芯片的手性分离中，大大提高了手性分离柱的分离效率，缩短了手性分离的时间。

发明内容

本发明的目的在于提出一种纳米手性分离固定相的制备方法。

为达此目的，本发明采用以下技术方案：

(1)、硅胶的修饰和活化

硅胶与硅烷化试剂反应制得表面被胺基或巯基修饰的硅胶；采用胺丙基硅烷化试剂，环氧丙基硅烷化试剂或巯丙基硅烷化试剂对硅胶进行修饰；所述的硅胶为纳米硅胶球；经过活化后的硅胶球带有氨基或者巯基；经胺基或巯基修饰过的硅胶在有机溶剂中与三聚氯氰反应，三聚氯氰的加入量为胺基摩尔数的1～10倍，活化反应在有机溶剂中进行，有机溶剂选自N，N-二甲基甲酰胺、四氢呋喃、二氧六环、或丙酮的惰性溶剂；反应温度在室温下进行；

(2)、制备贵金属纳米颗粒溶胶

采用水热法用柠檬酸钠或硼氢化钠作还原剂还原金离子化合物中的金，过0.20～0.45μm的醋酸纤维微孔滤膜，制得含10～80nm金纳米颗粒溶胶；

(3)、制备手性识别固定相

将步骤(1)获得的纳米硅胶颗粒经清洗后，再分散到步骤(2)所述的溶胶中，调整酸碱度在pH＝4～10的范围内，加入手性识别剂溶液，进行纳米硅胶颗粒与手性识别剂的结合，其结合完成时间为12-36小时；所述手性识别剂为蛋白质、手性表面活性剂、糖苷、皂甙或环糊精。

本发明使用了两种纳米颗粒结合制备手性固定相，当单独使用金纳米颗粒最为担体制备手性固定相时，手性识别物结合在担体上不牢固，但是又无法对其进行共价键的加固，而在使用纳米硅胶和纳米金颗粒结合后，经过修饰的纳米硅胶颗粒可以与纳米金粒子产生强作用力，同时固定了手性识别物的结合；使得固定相的使用寿命大大提高。

实例1：硅胶的修饰

1)与胺丙基硅烷化试剂的反应

取5g球形硅胶(5μ300A)置于150ml三口瓶中，加入100ml新配制的20％盐酸溶液，于110～120℃下回流4h，过滤，以去离子水洗至中性，在120℃下真空干燥12h以上取3g已干燥硅胶加入盛有50ml干燥甲苯的150ml三口瓶，在氮气氛围下加热、搅拌，当温度升到120℃时加入胺丙基三乙基硅烷5ml，于120℃回流24h，然后降温、过滤，硅胶以甲苯、丙酮充分洗涤，在五氧化二磷存在下60℃真空干燥。

取已活化硅胶2g，加入盛有50ml DMF、2ml吡啶100ml小烧杯中，在室温搅拌下慢慢加入三聚氯氰0.37g，2h后过滤，硅胶以丙酮充分洗涤。

2)制备金纳米颗粒

在装有泠凝管的三口烧瓶中加入用纯水配制重量百分比浓度为0.01％的氯金酸水溶液100mL，在800rm/min搅拌下加热至沸后，加入重量百分比浓度为1％的柠檬酸三钠3mL，保持沸腾30分钟；然后自然冷却至室温；用0.20μm的醋酸纤维微孔滤膜过滤，制得10～20nm的纳米金胶体溶液，除去杂质；

取已活化的硅胶2g加入30ml纳米金胶体溶液，在室温下缓慢搅拌，加入牛血清白蛋白150mg，于15～45℃反应，在不同时间内取溶液于280nm下检测吸收值，大约2h后吸收值不再变化，4h后停止搅拌，过滤，洗涤，配制含1％甘氨酸乙酯的磷酸盐缓冲液(pH＝7)室温下反应过夜，反应好的固定相即可以普通技术装柱。

实施例2

1)与环丙基及巯丙基硅烷化试剂的反应

取实例1)中已酸化硅胶5g加入150ml三口瓶中，加入干燥的甲苯50ml，在氮气氛围下加热、搅拌，当温度升到90℃时加入环氧丙基三甲氧基硅烷5ml，在90～95℃反应10h，过滤，硅胶以甲苯、丙酮充分洗涤，在五氧化二磷存在下60℃真空干燥，已干燥的硅胶在pH值＝9的氨水缓冲液中反应16h，即得到末端带有胺基的硅胶。

取已活化硅胶2g，加入盛有50ml DMF、2ml吡啶100ml小烧杯中，在室温搅拌下慢慢加入三聚氯氰0.37g，2h后过滤，硅胶以丙酮充分洗涤。

2)制备金纳米颗粒

在装有泠凝管的三口烧瓶中加入用纯水配制重量百分比浓度为0.01％的氯金酸水溶液100mL，在800rm/min搅拌下加热至沸后，加入重量百分比浓度为1％的柠檬酸三钠3mL，保持沸腾30分钟；然后自然冷却至室温；用0.20μm的醋酸纤维微孔滤膜过滤，制得10～20nm的纳米金胶体溶液，除去杂质；

取已活化的硅胶2g加入30ml纳米金胶体溶液，在室温下缓慢搅拌，加入牛血清白蛋白150mg，于15～45℃反应，在不同时间内取溶液于280nm下检测吸收值，大约2h后吸收值不再变化，4h后停止搅拌，过滤，洗涤，配制含1％甘氨酸乙酯的磷酸盐缓冲液(pH＝7)室温下反应过夜，反应好的固定相即可以普通技术装柱。

实施例3

巯丙基硅胶的制备同上，其它步骤与实施例1相同。

Claims (1)

1.一种纳米硅胶-金手性分离固定相的制备方法，其步骤如下：

(1)、硅胶的修饰和活化

硅胶与硅烷化试剂反应制得表面被胺基或巯基修饰的硅胶；采用胺丙基硅烷化试剂，环氧丙基硅烷化试剂或巯丙基硅烷化试剂对硅胶进行修饰；所述的硅胶为纳米硅胶球；经过活化后的硅胶球带有氨基或者巯基；经胺基或巯基修饰过的硅胶在有机溶剂中与三聚氯氰反应，三聚氯氰的加入量为胺基摩尔数的1～10倍，活化反应在有机溶剂中进行，有机溶剂选自N，N-二甲基甲酰胺、四氢呋喃、二氧六环、或丙酮的惰性溶剂；反应温度在室温下进行；

(2)、制备贵金属纳米颗粒溶胶

采用水热法用柠檬酸钠或硼氢化钠作还原剂还原金离子化合物中的金，过0.20～0.45μm的醋酸纤维微孔滤膜，制得含10～80nm金纳米颗粒溶胶；

(3)、制备手性识别固定相

将步骤(1)获得的纳米硅胶颗粒经清洗后，再分散到步骤(2)所述的溶胶中，调整酸碱度在pH＝4～10的范围内，加入手性识别剂溶液，进行纳米硅胶颗粒与手性识别剂的结合，其结合完成时间为12-36小时；所述手性识别剂为蛋白质、手性表面活性剂、糖苷、皂甙或环糊精。