CN100471556C

CN100471556C - 纳米金属手性识别固定相、手性分离色谱仪及制备方法

Info

Publication number: CN100471556C
Application number: CNB2005101262125A
Authority: CN
Inventors: 林金明; 曾湖烈; 赵利霞; 王栩
Original assignee: Research Center for Eco Environmental Sciences of CAS
Current assignee: Research Center for Eco Environmental Sciences of CAS
Priority date: 2005-11-25
Filing date: 2005-11-25
Publication date: 2009-03-25
Anticipated expiration: 2025-11-25
Also published as: CN1970140A

Abstract

本发明涉及贵金属离子纳米颗粒及手性分离色谱仪及其制备；先制备贵金属离子纳米颗粒溶胶和纳米金属手性识别固定相，再将该纳米金属手性识别固定相固定在毛细管中或微通道芯片的微流道中，便制得本发明的手性分离色谱仪；与现有的手性分离柱及微流控芯片相比较，具有制备方法简单、易行，制备条件温和等优点。本发明制得的手性分离色谱仪具有极高的分离效率，缩短了手性分离的时间，手性分离毛细管柱及微芯片性质稳定，经久耐用等优点。本发明适用于手性药物快速检测、手性环境污染物监测等对手性分离效率要求较高的应用领域。

Description

纳米金属手性识别固定相、手性分离色谱仪及制备方法

技术领域：

本发明属于手性色谱柱的制备方法领域，特别涉及一种纳米金属手性识别固定相、手性分离色谱柱及制备方法。

背景技术：

手性异构体是指两个分子结构互为镜像但又不能重合的化台物称为对映体，两个手性的分子式完全相同，只是原子和原子团的空间取向不同。在非手性的环境中对映体的化学性质和物理性质基本相同。但是一些手性异构体在毒性、药理学及生物代谢方面却存在着巨大的差异。就药学领域来说，就有多达30％～40％的药物具有手性。手性异构体在生物活性或药物动力学方面的差异使得手性对映体的分离尤为重要。震惊世界的沙立度胺致畸事件就是一个忽视立体化学效应的恶行事故。基于对映体分子的光学性质与其生物活性之间的特殊相关性，在1992年美国食品药品管理局(FAD)就做出了规定，凡研制具有不对称中心的药物，在药物的鉴定和审批报告中必须给出手性拆分结果。相应地，欧共体国家也提出了相类似的措施。另外，在环境化学研究领域，近年的研究也发现，一些手性异构体的环境效应和生态毒理学效应也不尽相同。因此，建立和发展快速准确的手性对映体拆分方法对于分析化学研究具有相当重要的实际意义。

众所周知，要实现分子式相同，化学性质及其相似的手性对映体的拆分必须有手性拆分试剂的参与。现在的手性对映体拆分方法中，主要有两个方面：把手性拆分试剂添加到流动相中，手性识别剂随着分离的进行而流走损失；手性拆分试剂固定于分离分析的固定相中，在一段时间内手性识别剂的分子识别效率保持不变。后一种手性识别剂的手性识别形式由于手性识别剂能够得到反复利用、分离重现性好、分离效率高而受到广大分析工作者的关注。

已有的手性固定相的制备方法包括：1)把手性识别剂固定于硅胶微珠表面，再把微珠填充于分离柱中；2)采用在线制备的方式把手性识别剂固定于分离柱中；3)采用物理吸附的方法把手性识别剂固定于分离柱壁上；4)用化学键和的方式把手性识别剂固定于分离柱壁。

但是，没有文献报道过把手性识别剂负载在纳米颗粒上作为固定相。本发明建立了一种新型的手性固定相，其有比表面积大，和被分析物接触充分的优点。把它应用于毛细管柱和微流控电泳芯片的手性分离中，大大提高了手性分离柱的分离效率，缩短了手性分离的时间。

发明内容

本发明的目的在于提供一种金属纳米手性识别固定相；

本发明的另一目的在于提供一种金属纳米手性识别固定相的制备方法；

本发明的再一目的在于提出一种手性分离色谱仪的制备方法，即把具有手性分离能力的手性识别剂负载在具有极大表面积的纳米颗粒上，可有效地增强手性识别剂和被分离物质之间的相互作用，提高其手性分离固定相的手性分离效率。

本发明的技术方案如下：

本发明提供的纳米金属手性识别固定相(图1中用“41”表示)，其特征在于，包括：

贵金属离子纳米颗粒(图1中用“1”表示)；和

包覆在所述贵金属离子纳米颗粒周围的手性识别剂(图1中用“4”表示)；

所述的贵金属离子纳米颗粒为金、铂或银金属离子纳米颗粒；

所述的手性识别剂为蛋白质、手性表面活性剂、糖苷类、皂甙类或环糊精糖类。

本发明提供的纳米金属手性识别固定相的制备方法，其步骤如下：

1)制备贵金属离子纳米颗粒溶胶

采用水热法用柠檬酸钠或硼氢化钠作还原剂还原贵金属离子化合物中的原贵金属离子，过0.20～0.45μm的醋酸纤维微孔滤膜，制得含10～80nm贵金属离子的贵金属离子纳米颗粒溶胶；所述的贵金属离子纳米颗粒为金、铂或银金属离子纳米颗粒；

2)制备纳米金属手性识别固定相

调整贵金属离子纳米颗粒溶胶的酸碱度在pH＝4～10的范围内，加入手性识别剂溶液，进行贵金属离子纳米颗粒与手性识别剂的结合，其结合物纳米金属手性识别固定相完成结合的时间为12—36小时；所述手性识别剂溶液为蛋白质、手性表面活性剂、糖苷类、皂甙类或环糊精糖类；所述贵金属离子纳米颗粒溶胶与手性识别剂溶液的质量份配比为50：1-120：1。

本发明提供的手性分离色谱仪的制备方法，其步骤如下：

1)制备贵金属离子纳米颗粒溶胶

2)制备纳米金属手性识别固定相

调整贵金属离子纳米颗粒溶胶的酸碱度在pH＝4～10的范围内，加入手性识别剂溶液，进行贵金属离子纳米颗粒与手性识别剂的结合，其结合物纳米金属手性识别固定相完成结合的时间为12—36小时；所述手性识别剂溶液为蛋白质、手性表面活性剂、糖苷类、皂甙类或环糊精糖类；所述贵金属离子纳米颗粒溶胶与手性识别剂溶液的质量份配比为50：1-120：1；

3)制备手性分离色谱仪

先彻底清洁毛细管或微通道芯片；再用含有氨基、巯基或氰基的三甲氧基硅烷化合物(图1中“2”表示带有—NH₄，-SH，CN的硅氧烷分子)的甲醇溶液浸泡12～36小时后，然后依次用甲醇、纯水进行充分清洗，如附图1步骤A；

将纳米金属手性识别固定相的胶体溶液充入毛细管中或者微通道芯片的微流道中，反应12—36小时，之后用纯水冲去富余的没有固定上的纳米金属手性识别固定相，便制备出本发明的手性分离色谱柱、毛细管或微通道(图3中用“5”表示)，如附图1种步骤B。

4)将制得的手性分离色谱柱、毛细管或微通道芯片在1—4℃下纯水中浸泡进行保存。

所述的毛细管为石英毛细管或玻璃毛细管；所述的微流道芯片包括玻璃、石英、聚二甲基硅氧烷、聚甲基丙烯酸甲酯、聚碳酸酯或聚苯乙烯为基底的微流道芯片。

本发明的优点如下：

本发明把具有手性分离能力的手性识别剂负载在具有极大表面积的金属纳米颗粒上，有效地提高了手性识别剂在固定相中的分布密度，也提高了手性识别色谱仪中手性识别剂浓度。从而大大地加强了手性识别剂和被分离物质之间的相互作用，提高了手性识别固定相的手性识别效率。同时也增加了手性固定相的稳定性。为手性分离的高效率、微型化设备建立了方法基础。为手性物质的快速、实时检测提供了一种缩短手性分离时间的方法。可以广泛用于传统手性分离色谱柱及制备柱的制备及微型化手性分离芯片的制备。

附图说明

附图1为纳米金属手性固定相在色谱柱、毛细管壁和微通道表面的吸原理；

附图2为纳米金属手性识别固定相的结构示意图；

附图3为手性分离色谱柱、毛细管或微通道的结构示意图；

其中：A为色谱柱、毛细管壁和微通道表面的预处理过程；

B为纳米金属手性固定相在色谱柱、毛细管壁和微通道表面的固定过程。

具体实施方式

实施例1

用本发明的方法制备的以纳米颗粒为固定相载体的手性分离色谱柱，其步骤如下：

1、制备贵金属(金)纳米颗粒

在装有泠凝管的三口烧瓶中加入用纯水配制重量百分比浓度为0.01％的氯金酸水溶液100mL，在800rm/min搅拌下加热至沸后，加入重量百分比浓度为1％的柠檬酸三钠3mL，保持沸腾30分钟；然后自然冷却至室温；用0.20μm的醋酸纤维微孔滤膜过滤，制得10～20nm的纳米金胶体溶液，除去杂质；

2、制备手性识别剂(牛血清白蛋白或其他蛋白质)与金属纳米颗粒的结合物(即纳米金属手性识别固定相)

用0.1M的碳酸钾调整纳米金胶体溶液的pH值＝7～8；在小于100rm/min搅拌条件下加入新配制的1×10^-6M的牛血清白蛋白或其他蛋白质水溶液(纳米金溶液和蛋白质的物质的量之比为90：1)；将混合溶液置于4℃下放置过夜，得到手性识别剂(牛血清白蛋白或其他蛋白质)与金属纳米颗粒的结合物(即纳米金属手性识别固定相)；

3、制备手性分离色谱柱：

在固定纳米金属手性识别固定相之前需要清洗和处理毛细管：在20psi压力下用1M盐酸溶液冲洗毛细管5分钟；再用水冲洗3分钟；然后用1M氢氧化钠溶液冲洗30分钟；后用水冲洗15～20分钟；最后用色谱级甲醇冲洗10分钟；

用1：4(体积比)的3-氨基丙基三甲氧基硅烷：甲醇(色谱级)溶液在20psi压力下灌冲5分钟；然后用聚四氟乙烯膜密封毛细管两端在室温下保持12小时，待反应完全以后用色谱级甲醇冲洗毛细管5分钟，去除没有反应的3-巯基丙基三甲氧基硅烷；后用纯水冲洗毛细管10分钟；

在以上清洗好的毛细管中充入手性识别剂(牛血清白蛋白或其他蛋白)与贵金属纳米颗粒的结合物(即纳米金属手性识别固定相)的胶体溶液；用聚四氟乙烯膜密封毛细管两端在4℃下保持24小时；然后用纯水冲洗毛细管去除剩余的纳米金属手性识别固定相，即制得本实施例的手性分离色谱柱。

实施例2

1、制备贵金属(金)离子纳米颗粒：

在装有泠凝管的三口烧瓶中加入用纯水配制0.1％的氯金酸水溶液100mL，在1400rm/min转速下加热搅拌至沸后加入1％的柠檬酸三钠20mL，保持沸腾30分钟。然后自然冷却至室温。用0.45μm的醋酸纤维微孔滤膜过滤制备得的纳米金胶体溶液，除去杂质。即得到颗粒尺寸小于50nm金纳米颗粒。

2、制备手性识别剂——贵金属纳米颗粒结合物：

用0.1M的碳酸钾调整纳米金胶体溶液的pH值＝10。在100rm/min转速搅拌下加入新配制的1×10^-5M的中性洋地黄皂甙或其他皂甙水溶液(纳米金溶液和中性洋地黄皂甙或其他皂甙的物质的量之比为120：1)。将混合溶液置于1℃下放置过夜。

3、手性分离微流道芯片的制作：

该技术中所使用的玻璃或石英微流控芯片采用传统的湿法化学方法刻蚀，熔融法键合。微流控芯片的具体制备方法见文献(Su，R-G.；Lin，J.-M.；Qu，F.；Chen，Z.；Gao，Y.；Yamada，M.Anal.Chim.Acta.2004，508，11-15.)。制备手性分离微芯片之前先要对微芯片进行彻底的清洗及处理：用1：4的30％过氧化氢：浓硫酸于70℃处理微芯片两小时。小心取出，后用纯水充分冲洗去掉浓硫酸。最后用色谱级甲醇冲洗。把1：4的3-巯基甲基-二甲基甲氧基硅烷：甲醇(色谱级)溶液灌注于微通道中。室温下保持36小时，等反应完全以后用色谱级甲醇冲洗毛细管5分钟，去除没有反应的3-巯基丙基三甲氧基硅烷。后用纯水冲洗毛细管10分钟。

在清洗好的微芯片中充入上面制备好的中性洋地黄皂甙或其它皂甙——金纳米颗粒结合物，置于4℃冰箱中保持24小时。最后用纯水冲洗去未结合的中性洋地黄皂甙或其它皂甙——金纳米颗粒结合物，即可得到实施例的手性分离微流控芯片。

实施例3：

1、制备纳米贵金属(铂)颗粒

在装有泠凝管的三口烧瓶中加入用纯水配制0.01％的氯铂酸水溶液100mL，在剧烈搅拌下加热至沸后加入1％的柠檬酸三钠1mL，保持沸腾30分钟。然后自然冷却至室温。用0.45μm的醋酸纤维微孔滤膜过滤制备得的纳米铂胶体溶液，除去杂质。即得到颗粒尺寸小于80nm铂纳米颗粒。

2、制备右旋糖苷——金纳米颗粒结合物(纳米金属手性固定相)：

用0.1M的碳酸钾调整纳米铂胶体溶液的pH值＝4～5。在100rm/min转速搅拌下加入新配制的1×10^-5M的右旋糖苷(或其他糖类化合物或环糊精类化合物)水溶液(纳米金溶液和右旋糖苷(或其他糖类化合物或环糊精类化合物)的物质的量之比为50：1)。将混合溶液置于4℃下放置过夜。

3、手性毛细管柱的制备：

在制备手性毛细管柱前，需要先对毛细管进行清洁处理。在固定手性固定相之前需要清洗和处理毛细管：在20psi压力下用1M盐酸溶液冲洗毛细管5分钟；再用水冲洗3分钟；然后用1M氢氧化钠溶液冲洗30分钟；后用水冲洗15～20分钟；最后用色谱级甲醇冲洗10分钟。

用1：4的3-巯基丙基三甲氧基硅烷：甲醇(色谱级)溶液在20psi压力下灌冲5分钟。然后用聚四氟乙烯膜密封毛细管两端在室温下保持24小时，等反应完全以后用色谱级甲醇冲洗毛细管5分钟，去除没有反应的3-巯基丙基三甲氧基硅烷。后用纯水冲洗毛细管10分钟。

在清洗好的微芯片中充入上面制备好的右旋糖苷(或其他糖类化合物或环糊精类化合物)——铂纳米颗粒结合物，置于4℃冰箱中保持36小时。最后用纯水冲洗去未结合的右旋糖苷或其他糖类化合物——铂纳米颗粒结合物，即制得实施例手性分离色谱柱。

实施例4

1、制备纳米贵金属(银)颗粒

在装有泠凝管的三口烧瓶中加入用纯水配制重量百分比浓度为0.01％的氯化银水溶液100mL，在1200rm/min搅拌下加热至沸后，加入重量百分比浓度为1％的柠檬酸三钠3mL，保持沸腾30分钟；然后自然冷却至室温；用0.2μm的醋酸纤维微孔滤膜过滤，制得20nm的纳米银胶体溶液，除去杂质；

2、制备胆酸钠或其他手性表面活性剂与金属纳米颗粒的结合物

用0.1M的碳酸钾调整纳米银胶体溶液的pH值＝9～10；在80rm/min搅拌条件下加入新配制的1.5×10^-5M的胆酸钠或其他手性表面活性剂水溶液(纳米银和胆酸钠其他手性表面活性剂的物质的量之比为90：1)；将混合溶液置于4℃下放置过夜，得到胆酸钠或其他表面活性剂与金属纳米颗粒的结合物；

3、手性分离微流道芯片的制作：

该技术中所使用的聚二甲基硅氧烷或其他高聚物微流控芯片采用浇铸法制备，紫外辐照方法键合。微流控芯片的具体制备方法见文献(Zeng，H.-L；Li，H.-F.；Lin，J.-M，.Anal.Chim.Acta.2005，551，1-8.)。键和好的聚二甲基硅氧烷或其他高聚物微芯片不需要特别的清洗即可以直接用作手性分离微芯片的制作。

把1：4的3-氰基甲基-二甲基甲氧基硅烷：甲醇(色谱级)溶液直接灌注于微通道中，让3-氰基甲基-二甲基甲氧基硅烷：甲醇溶液在通道中浸泡24小时。等反应完全以后用色谱级甲醇冲洗微通道，去除没有反应的3-巯基丙基三甲氧基硅烷。后用纯水冲洗。

在清洗好的微芯片中充入上面制备好的胆酸钠或其它手性表面活性剂——金纳米颗粒结合物，置于4℃冰箱中保持36小时。最后用纯水冲洗去未结合的胆酸钠或其它手性表面活性剂——金纳米颗粒结合物，即制的实施例手性分离高聚物微芯片。

Claims

1、一种纳米金属手性识别固定相，其特征在于，包括：

贵金属纳米颗粒；和

包覆在所述贵金属纳米颗粒周围的手性识别剂；

所述的贵金属纳米颗粒为金、铂或银金属纳米颗粒；

所述的手性识别剂为蛋白质、手性表面活性剂、糖苷、皂甙或环糊精。

2、一种权利要求1所述纳米金属手性识别固定相的制备方法，其步骤如下：

1)制备贵金属纳米颗粒溶胶

采用水热法用柠檬酸钠或硼氢化钠作还原剂还原贵金属离子化合物中的原贵金属离子，过0.20～0.45μm的醋酸纤维微孔滤膜，制得含10～80nm贵金属的贵金属纳米颗粒溶胶；所述的贵金属纳米颗粒为金、铂或银金属纳米颗粒；

2)制备纳米金属手性识别固定相

调整贵金属纳米颗粒溶胶的酸碱度在pH＝4～10的范围内，加入手性识别剂溶液，进行贵金属纳米颗粒与手性识别剂的结合，其结合物纳米金属手性识别固定相完成结合的时间为12—36小时；所述手性识别剂为蛋白质、手性表面活性剂、糖苷、皂甙或环糊精；所述贵金属纳米颗粒溶胶与手性识别剂溶液的质量份配比为50：1-120：1。

3、一种手性分离色谱仪的制备方法，其步骤如下：

1)制备贵金属纳米颗粒溶胶

2)制备纳米金属手性识别固定相

调整贵金属纳米颗粒溶胶的酸碱度在pH＝4～10的范围内，加入手性识别剂溶液，进行贵金属纳米颗粒与手性识别剂的结合，其结合物纳米金属手性识别固定相完成结合的时间为12—36小时；所述手性识别剂为蛋白质、手性表面活性剂、糖苷、皂甙或环糊精；所述贵金属纳米颗粒溶胶与手性识别剂溶液的质量份配比为50：1-120：1；

3)制备手性分离色谱仪

先彻底清洁毛细管或微通道芯片，再用含有氨基、巯基或氰基的三甲氧基硅烷化合物的甲醇溶液浸泡12～36小时后，然后依次用甲醇、纯水进行充分清洗；

将纳米金属手性识别固定相的胶体溶液充入毛细管中或者微通道芯片的微流道中，反应12—36小时，之后用纯水冲去富余的没有固定上的纳米金属手性识别固定相，便制备出手性分离毛细管色谱柱或手性分离微通道芯片；

4)将制得的手性分离毛细管色谱柱或手性分离微通道芯片在1—4℃下纯水中浸泡进行保存。

4、按权利要求3所述的手性分离色谱仪的制备方法，其特征在于，所述的毛细管为石英毛细管或玻璃毛细管。

5、按权利要求3所述的手性分离色谱仪的制备方法，其特征在于，所述的微流道芯片包括玻璃、石英、聚二甲基硅氧烷、聚甲基丙烯酸甲酯、聚碳酸酯或聚苯乙烯为基底的微流道芯片。