CN106824140B

CN106824140B - 一种以二乙烯基砜为模板制备色谱固定相的方法

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Publication number: CN106824140B
Application number: CN201510882143.4A
Authority: CN
Inventors: 梁鑫淼; 刘玉洁; 于龙; 付冬梅; 肖远胜; 薛兴亚
Original assignee: Dalian Institute of Chemical Physics of CAS
Current assignee: Dalian Institute of Chemical Physics of CAS
Priority date: 2015-12-04
Filing date: 2015-12-04
Publication date: 2019-08-02
Anticipated expiration: 2035-12-04
Also published as: CN106824140A

Abstract

本发明涉及硅胶色谱材料的制备技术领域，是首先合成含有二乙烯基砜硅烷的化学试剂，键合在以硅胶为基质表面，然后与含有巯基，氨基，羟基的试剂发生亲核加成反应。本发明制备色谱固定相方法简单，快捷，条件温和，成本低，键合量高。应用乙烯基砜易从外界环境中得到电子的活泼化学性质，改性硅胶表面，亲和试剂一端含有容易加成的巯基，氨基，羟基，另一端为含有C18、糖、羧基、氨基或者同时含有两性离子的氨基酸，及生物大分子如蛋白质等功能性的配基。本发明制备硅胶色谱材料的步骤简洁，条件温和，键合配基效率高，可以制备种类多样的色谱材料，并应用于高效液相色谱分离中。

Description

一种以二乙烯基砜为模板制备色谱固定相的方法

技术领域

本发明涉及硅胶色谱材料的制备技术领域，是一种以硅胶为基质，合成二乙烯基砜修饰的硅烷化试剂，并与含有巯基，氨基，羟基的试剂发生亲核加成反应制备具有疏水，亲水，两性离子，以及生物亲和性质的色谱固定相。

背景技术

高效液相色谱在生物医药领域中发挥着日益重要的作用，特别在化合物的有效纯化、制备及生物大分子如多肽和蛋白质的分离分析中起到关键的作用。

高效液相色谱材料的制备方法多种多样，所得到的色谱材料的类型因为制备方法的不同而产生不同的分离性质。但是在色谱材料的制备中也存在一些问题。(1)键合过程中化学试剂的毒性，影响材料本身的生物活性，特别是在亲和色谱材料的制备中，更应当注意的问题；(2)经过冗长的制备过程和多步反应得到的间隔臂，因键合效率不高而影响色谱材料的分离性能；(3)制备方法中用到的重金属在材料表面的残留，影响基质的生物活性及材料本身的分离性能。因此，发展一种简便经济、高效、高通量的方法用于制备不同类型的色谱分离材料十分必要。

自1975年开始，二乙烯基砜用于改性基质(凝胶，葡聚糖，纤维素，硅胶)表面[1](Vinyl sulfone:a versatile function for simple bioconjugation andimmobilization,Org.Biomol.Chem.8(2010)667-675)，用于研究材料表面的性质，其反应特点为:

(1)二乙烯基砜的官能团十分活泼(缺电子)，可以和环境中富含电子的巯基(SH-)，氨基(NH₂-，-NH-)，羟基(-OH)等官能团发生Michael类型的亲核加成反应，因而能够快速有效的改性基质表面[2](The thiol-Michael addition click reaction:apowerful and widely used tool in materials chemistry,Chem.Mater.26(2013)724-744)；

(2)二乙烯基砜是双官能团试剂，可以在反应中引入不同的官能团，丰富材料表面的类型；

(3)二乙烯基砜基团对含硫元素的大分子有亲和作用，在嗜硫色谱(T-gel)中应用广泛，可以富集IgG[3](Hydrophobic charge induction chromatography:saltindependent protein adsorption and facile elution with aqueous buffers,J.Chromatogr.A 814(1998)71-81)。

硅胶具有稳定的化学性质，表面容易改性，具有耐抗压等优良的机械性能，在高效液相色谱材料首选的基质。虽然二乙烯基砜在材料表面改性中的应用十分普遍，但是在硅胶基质表面进行改性并将得到的色谱材料应用在高效液相分离中的应用非常的少。

本研究基于二乙烯基砜的化学性质，对硅胶表面进行修饰，具体为以二乙烯基砜制备的硅烷试剂为间隔臂，末端的乙烯基砜为活化官能团，键合含有氨基、羟基和巯基官能团的试剂，制备得到不同类型的高效液相色谱分离材料，并将其应用于相应的色谱分离分析中，将所得到的硅胶色谱材料应用于高效液相色谱分离中，为色谱固定相的制备及丰富色谱固定相的类型提供一种参考。

发明内容

针对高效液相色谱固定相制备路线冗长，多步反应造成了不均一性的键合固定相表面，从而影响色谱分离性能的问题，本发明提供了一种高效简捷制备不同类型色谱固定相的方法，主要涉及二乙烯基砜活化硅胶固定相，与含有巯基，氨基或者羟基官能团的试剂发生亲核加成反应，制备出含有C8，C18,单糖或者聚糖，氨基酸，生物大分子(凝集素)等不同类型的色谱固定相；

以硅胶为基质，二乙烯基砜为活化双官能团试剂，制备得到不同类型的二乙烯基砜修饰的色谱固定相(包括疏水，亲水，两性离子，嗜硫亲和等类型的材料)；

操作步骤如下：

a)硅胶预处理：硅胶加入体积浓度为1～36％的盐酸或硝酸溶液中，加热回流搅拌1～48h，过滤，水洗至中性，在100～160℃,干燥5～12h至恒重；

b)二乙烯基砜烷氧基硅烷试剂的制备:惰气保护下，室温，氨基或者巯基烷氧基硅烷试剂溶于含有双官能团试剂的四氢呋喃溶液中，电磁搅拌4～6h，得到末端有活泼烯烃的二乙烯基砜烷氧基硅烷试剂；

c)二乙烯基砜键合硅胶固定相的制备：惰气保护，将步骤a处理好的硅胶溶于有机溶剂中，加入步骤b所得到的二乙烯基砜烷氧基硅烷试剂，加热回流，反应16～48h；反应体系冷却至室温，减压过滤，依次用甲苯，四氢呋喃，甲醇，水，甲醇洗涤，固体产品在60～100℃下干燥12～24h，得到含有二乙烯基砜键合的硅胶固定相(DVS SiO₂)；

d)二乙烯基砜键合不同硅胶固定相的制备：惰气保护，将上述干燥的硅胶加入含有巯基，氨基或者羟基等亲核试剂的无水有机溶剂中发生加成反应,制备得到不同类型的二乙烯基砜色谱固定相。

本发明与现有技术相比具有以下特点：

1.材料合成路线简捷。用于合成的原料方便易得，合成方法简易，可以大量生产，鉴于硅胶填料耐高压，由此可装填成色谱填料，应用于色谱分析；

2.合成二乙烯基砜烷氧基硅烷试剂减少了修饰硅胶表面的反应步骤，并且同时引入了活泼的烯基砜官能团，为硅胶固定相的进一步修饰建立了模板；

3.烯基砜官能团可以与含有巯基，氨基，羟基等亲核官能团试剂发生加成反应，用于制备不同类型的色谱固定相，具体为疏水，亲水，两性离子或者亲和类的色谱固定相；

4.反应效率高，硅胶表面经过修饰后的键合量高，具体可以通过比较反应前

后材料表面含碳量的变化，推测反应的键合效率；

5.配基经过化学键合的方式被固定在修饰材料的表面，键合配基的密度可以调控，并且在使用固定相的过程中配基流失少；

6.二乙烯基砜含有容易吸电子的砜基团，具有一定的亲水性，因而在蛋白质或者多肽富集分离过程中非特异性吸附低。

具体实施方式

下面结合实施例，对本发明做详细描述。

取5g硅胶，置于100mL玻璃圆底烧瓶中，加入50mL浓度为6M的盐酸加热回流1h，水洗至中性，在150℃下干燥5h。

实施例1

氮气保护，取氨基丙基三甲氧基硅烷试剂1.66g，溶于20mL无水处理的四氢呋喃溶液中，电磁搅拌，加入二乙烯基砜试剂1.027g，三乙胺调节pH值7.5，室温搅拌，液相色谱检测得到二乙烯基砜键合的硅烷试剂。氮气保护，将干燥好的硅胶(2.5g),溶于30mL无水甲苯中，加入二乙烯基砜键合的硅烷试剂，并滴加吡啶(6mmol,480uL)，加热回流，反应12h，停止反应，冷却抽滤，依次用无水甲苯，四氢呋喃，甲醇，水，甲醇洗涤，80℃下干燥固化6h,得到二乙烯基砜活化的硅胶，命名为SNDVS材料。

称量上述干燥的SNDVS材料2.5g,氮气保护，溶于10mL无水N，N-二甲基酰胺(DMF)中，加入氨基葡萄糖盐酸盐(6mmol,1.29g),室温搅拌10h,停止反应，减压抽滤，依次用30mLN，N-二甲基酰胺和20mL无水甲苯，20mL甲醇，20mL水，20mL甲醇洗涤，60℃下干燥固化6h,得到SNDVS-Glu室温保存。

实施例2

同实施例1的操作过程，不同之处在于：

称量上述干燥的SDVS材料2.5g,氮气保护，溶于10mL无水甲醇溶剂中，加入谷胱甘肽(6mmol,1.84g),三乙胺(6mmol,840μL)室温搅拌10h,停止反应，减压抽滤，依次用30mL甲醇,20mL水，20mL甲醇洗涤，60℃下干燥固化6h,得到SNDVS-GSH室温保存。

实施例3

氮气保护，取巯基丙基三乙氧基硅烷试剂1.05g，溶于20mL无水处理的四氢呋喃溶液中，电磁搅拌，加入二乙烯基砜试剂1.21g，三乙胺调节pH值7.5，室温搅拌，液相色谱检测得到二乙烯基砜修饰的巯基硅烷试剂。氮气保护，将干燥好的硅胶(2.5g),溶于30mL无水甲苯中，加入二乙烯基砜键合的硅烷试剂，并滴加吡啶(6mmol,480uL)，加热回流，反应12h，停止反应，冷却抽滤，依次用无水甲苯，四氢呋喃，甲醇，水，甲醇洗涤，80℃下干燥固化6h,得到二乙烯基砜活化的硅胶，命名为SSDVS材料。

称量上述干燥的SSDVS材料2.5g,氮气保护，溶于10mL无水N，N-二甲基酰胺(DMF)中，加入半胱氨酸(Cys)(6mmol,726mg),三乙胺(6mmol,840μL)室温搅拌10h,停止反应，减压抽滤，依次用30mL甲醇,20mL水，20mL甲醇洗涤，60℃下干燥固化6h,得到SSDVS-Cys室温保存。

实施例4

同实施例3的操作过程，不同之处在于：

称量上述干燥的SSDVS材料2.5g,氮气保护，溶于10mL无水甲醇溶剂中，加入甘露糖衍生物(6mmol,2.29g),三乙胺(6mmol,840μL)室温搅拌10h,停止反应，减压抽滤，依次用30mL甲醇,20mL水，20mL甲醇洗涤，45℃下干燥固化6h,得到SSDVSM材料，室温保存。

实施例5

氮气保护，取羟丙基三乙氧基硅烷试剂1.2g，溶于20mL无水处理的四氢呋喃溶液中，电磁搅拌，加入二乙烯基砜试剂2g，三乙胺调节pH值7.5，室温搅拌，液相色谱检测得到二乙烯基砜修饰的巯基硅烷试剂。氮气保护，将干燥好的硅胶(2.5g),溶于30mL无水甲苯中，加入二乙烯基砜键合的硅烷试剂，并滴加吡啶(6mmol,480uL)，加热回流，反应12h，停止反应，冷却抽滤，依次用无水甲苯，四氢呋喃，甲醇，水，甲醇洗涤，80℃下干燥固化6h,得到二乙烯基砜活化的硅胶，命名为SODVS材料。

称量上述干燥的SODVS材料1.2g,氮气保护，溶于100mL HEPES缓冲盐溶液中，加入凝集素Con A(1mmol,102mg),4℃搅拌10h,停止反应，离心过滤，多用50mLHEPES缓冲盐溶液洗涤，280nm紫外检测至洗涤液中观察不到蛋白质的吸收，得到SODVS-Con A材料，4℃保存。

本发明制备色谱固定相方法简单，三步完成过程简单，可制备多种类型的固定相；快捷，条件温和，成本低，键合量高。产物上带有乙烯基砜官能团，对小分子有亲水性，对生物大分子(IgG)具有亲和作用。

本发明涉及以硅胶为基质，以双活化试剂二乙烯基砜为模板，改性硅胶材料的表面，制备不同配基的色谱固定相，并将其应用于高效液相色谱的分离。其特点在于：应用乙烯基砜易从外界环境中得到电子的活泼化学性质，改性硅胶表面，配基末端为含有C18、糖、羧基、氨基或者同时含有两性离子等官能团的色谱材料。本发明制备硅胶色谱材料的步骤简洁，条件温和，键合配基效率高，可以制备种类多样的色谱材料，并应用于高效液相色谱分离中。

Claims

1.一种以二乙烯基砜为模板制备色谱固定相的方法，步骤如下：

(1)将二乙烯基砜和烷氧基硅烷试剂反应，得到经过二乙烯基砜改性的硅烷试剂，然后和硅胶反应，得到二乙烯基砜改性的硅胶固定相，其末端为含有烯基砜官能团的材料；(2)将二乙烯基砜改性的硅胶固定相与含有巯基、氨基、羟基中一种或二种以上官能团的亲核试剂发生加成反应，制备以二乙烯基砜为模板的硅胶色谱固定相；

其特征在于：

a.硅胶预处理：硅胶加入体积浓度为1～36％的盐酸或硝酸溶液中，加热回流搅拌1～48h，过滤，水洗至中性，在100～160℃干燥5～12h；

b.二乙烯基砜烷氧基硅烷试剂的制备:惰气保护下，室温，二乙烯基砜双官能团试剂加入一种或两种以上的氨丙基烷氧基硅烷、巯基丙基烷氧基硅烷或者羟基丙基烷氧基硅烷试剂的极性有机溶液中，搅拌4～6h，得到末端活泼烯烃的二乙烯基砜烷氧基硅烷试剂；

c.二乙烯基砜键合硅胶固定相的制备：惰气保护，将步骤a处理好的硅胶溶于有机溶剂中，加入步骤b所得到的二乙烯基砜烷氧基硅烷试剂，加热回流，反应16～48h；反应体系冷却至室温，减压过滤，依次用甲苯，四氢呋喃，甲醇，水，甲醇洗涤，固体产品在60～100℃下干燥12～24h，得到含有二乙烯基砜键合硅胶固定相SDVS；

d.二乙烯基砜键合不同硅胶固定相的制备：惰气保护，将上述干燥的二乙烯基砜键合硅胶固定相加入亲核试剂，具体为含有巯基、氨基或者羟基可以提供电子的亲核试剂，在无水有机溶剂或者不含有伯氨试剂的缓冲盐溶液中发生加成反应，4～90℃搅拌4～24h，然后加入含有一级氨基官能团的试剂，对未反应完全的活化基团进行封尾反应2～4h，离心，收集固体，得到不同种类的硅胶色谱固定相。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：

步骤b:氨丙基烷氧基硅烷是氨丙基三甲氧基硅烷或者氨丙基三乙氧基硅烷中的一种或二种；巯基丙基烷氧基硅烷是巯基丙基三甲氧基烷氧基硅烷试剂或者巯基丙基三乙氧基烷氧基硅烷试剂中的一种或者两种；羟基丙基烷氧基硅烷是羟基丙基三甲氧基烷氧基硅烷试剂或者羟基丙基三乙氧基烷氧基硅烷试剂中的一种或者两种；

以四氢呋喃THF、N,N-二甲基甲酰胺DMF或者二甲基亚砜DMSO极性有机试剂中的一种或二种以上为溶剂，氨丙基烷氧基硅烷、羟基丙基烷氧基硅烷试剂或者巯基丙基烷氧基硅烷试剂中一种或两种以上在极性溶剂中质量浓度为1～10％；

氨丙基烷氧基硅烷、羟基丙基烷氧基硅烷试剂或者巯基丙基烷氧基硅烷试剂中一种或两种以上和二乙烯基砜试剂的物质的量比为1/0.5～1/5；

用三乙胺试剂或者二异丙基胺试剂中的一种控制溶液体系的pH值为7～9；搅拌，用液相色谱和质谱联用的检测方法，监测二乙烯基砜修饰硅烷试剂的反应进行程度。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：

步骤c中：所述有机溶剂为苯、甲苯、THF、DMF或者DMSO中的一种或二种以上，步骤a处理好的每克硅胶需要有机溶剂的体积为2～20mL；

步骤c体系中：每克步骤a处理好的硅胶对应于步骤b中使用的二乙烯基砜烷氧基硅烷试剂的量为0.5mmol～5.0mmol。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：

步骤d中的无水有机溶剂为甲醇，DMSO，DMF，THF中的一种试剂；

步骤d中：所述亲核试剂为巯基C18烷烃试剂，半胱氨酸，谷胱氨肽，NH₂(OEG)_nNH₂,氨基葡萄糖，壳寡糖，甘露糖，聚乙二醇OEG_n,和生物大分子中的BSA,HAS，凝集素试剂中的一种或二种以上；

步骤d中：反应完成后应加入一级氨基官能团的试剂为伯氨试剂，为三羟甲基氨基甲烷、氨基乙醇或者BSA缓冲溶液中的一种，其终质量浓度为1～10％。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：

步骤d中，将上述干燥的二乙烯基砜键合硅胶固定相每克加入5～20mL无水有机溶剂或者不含有伯氨试剂的缓冲盐溶液中，控制溶液体系的pH值为7～9，搅拌；每克二乙烯基砜键合硅胶固定相与加入的亲核试剂物质的量比例为1:0.5～1:2.0,4～90℃搅拌4～24h，过滤，依次用水，甲苯、四氢呋喃、甲醇、水、甲醇洗涤，然后加入含有一级氨基官能团的试剂，对未反应完全的活化基团进行封尾反应2～4h，离心，收集固体，固体产品在25～80℃，干燥12～24h，得到不同类型的硅胶色谱固定相。

6.根据权利要求1或5所述的方法，其特征在于：不含有伯氨试剂的缓冲盐溶液是指磷酸盐缓冲溶液,碳酸氢钠缓冲溶液或羟乙基哌嗪乙硫磺酸HEPES。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：

步骤a：硅胶加入体积浓度为1～10％盐酸或硝酸溶液中，每克硅胶需要盐酸或硝酸的体积为2～20mL，加热回流搅拌1～48h，过滤，水洗至中性。