CN110078829B - 一种基于乙烯基砜表面反应的组氨酸标签蛋白定点共价固定方法 - Google Patents
一种基于乙烯基砜表面反应的组氨酸标签蛋白定点共价固定方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种基于乙烯基砜表面反应的组氨酸标签蛋白定点共价固定新方法。所述的组氨酸标签蛋白定点共价固定方法，以表面含有乙烯基砜基团的基底材料作为蛋白质固定载体，在近中性条件的蛋白质溶液中室温下即可以实现组氨酸标签与表面乙烯基砜的反应，从而实现组氨酸标签蛋白在乙烯基砜表面的定点共价固定。本发明的定点共价固定新方法定向性强，特异性高，固定化的蛋白质稳定性高，反应条件温和并且实验方法简单，该方法所用试剂均为常规试剂，成本低廉。本发明的组氨酸标签蛋白共价固定新方法在酶固定化，生物芯片制备，微阵列制备及靶向给药系统构建中均具有广泛的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于蛋白质固定化领域，涉及一种基于乙烯基砜表面反应的组氨酸标签蛋白的定点共价固定方法。
技术背景
蛋白质固定在生物传感，酶固定化及靶向载药系统等领域均具有重要的应用。传统的随机固定方法(如NHS活化羧基法)会导致蛋白质活性部位被遮蔽，从而影响固定化蛋白的生物活性。定点固定方法能够通过控制蛋白质在表面的取向使活性位点充分暴露，从而有效提高固定化蛋白的生物活性。寻找目标蛋白质与表面功能基团之间的特异性反应是实现定点固定的基础。常用的定点固定方法有特异性配体法、定点突变法、酶催化法及活性标签法。特异性配体法通过特异性配体与蛋白之间的特异性相互作用(如Fc片段特异性配体4-巯乙基吡啶)实现定点固定，但是其仅适用于特定的蛋白质，普适性差。定点突变法通常在蛋白质的特定位点引入半胱氨酸突变或含有点击化学基团的非天然氨基酸突变来实现蛋白质与表面活性基团的特异性反应。然而半胱氨酸突变可能会因为错误折叠影响蛋白活性，而引入非天然氨基酸的操作较为复杂，均不适合广泛应用。酶催化法是利用sortaseA(SrtA)催化表面多聚甘氨酸链与蛋白质LPXTG序列的反应实现定点固定。由于固定过程中需要酶的参与，提高了反应成本。相较于以上方法，亲和标签法通过在蛋白质末端引入具有特异性结合能力的亲和标签(例如Strep-TagⅡ，SNAP-Tag，His-Tag)来实现蛋白质的定点固定，具有较高的普适性，并且对蛋白质活性影响较低。
组氨酸标签是最为常用的亲和标签之一，通常由4-8个组氨酸构成，其较短的结构对蛋白质活性影响较低。组氨酸标签能够通过螯合作用特异性与表面固定的金属离子(Ni2 +,Cu2+,Co2+等)结合。近年来利用金属离子螯合作用定点固定组氨酸标签蛋白的方法被广泛应用于生物医学的各个领域。然而，组氨酸标签与金属离子之间的可逆螯合作用会导致固定化蛋白持续缓慢的解离(Xinfeng Zhao et al.Anal Bioanal Chem,2014,406:2975)，其对溶液中的金属螯合剂(如EDTA)非常敏感，并且重金属离子具有细胞毒性。因此，亟需开发一种基于组氨酸标签的无金属的共价固定方法。
乙烯基砜(VS)基于其与巯基，氨基和羟基的反应活性被广泛用作表面活性基团。根据文献报道显示在碱性水溶液条件下CT酶能够通过赖氨酸，组氨酸及N端的氨基与表面VS基团的反应实现固定化(Jose C.S.dos Santos et al.RSC Adv.,2015,5:20639)。然而，由于氨基在蛋白质表面的随机分布，无法实现定点固定。VS基团与不同氨基的反应属于迈克尔加成反应，反应活性与氨基的亲核性相关。组氨酸中咪唑基团上的仲胺的亲核性高于伯胺，这为实现组氨酸与VS基团的特异性反应提供了理论基础。实现组氨酸标签蛋白在VS表面的定点共价固定对于促进定点固定在生物传感、酶固定化、微阵列芯片及靶向载药系统等方向的应用具有重要意义。
发明内容
本发明的目的在于提供一种普适性强、稳定性高、操作简单的蛋白质定点共价固定方法。为实现上述目的，本发明采用了以下技术方案：
其中1为固体基质，2为表面乙烯基砜基团，3为组氨酸标签中的咪唑基团，4为组氨酸标签化的蛋白质。
一种基于乙烯基砜表面反应的组氨酸标签蛋白定点共价固定方法，其步骤如下：
将组氨酸标签蛋白溶于水溶液中，加入表面含有VS基团的基底材料，在15-60℃下反应0-48h，反应后对基底材料进行清洗，获得定点固定了组氨酸标签蛋白的基底材料。对于上文所述的技术方案中，优选的情况下，所述的组氨酸标签为在蛋白质C端或N端融合的包含2-8个组氨酸的序列。
对于上文所述的技术方案中，所述的基底材料为固体基质，具体为贵金属材料，硅材料，有机高分子材料。
对于上文所述的技术方案中，优选的情况下，所述的水溶液pH为6.5-8.0。更为优选的情况下，所述的水溶液pH为6.8-7.5。
对于上文所述的技术方案中，所述的组氨酸标签蛋白溶液的蛋白质浓度为0.01-20mg/mL。
对于上文所述的技术方案中，优选的情况下，所述的反应温度为15-45℃。更为优选的情况下，所述的反应温度为20-30℃。
对于上文所述的技术方案中，优选的情况下，所述的反应时间为0-40h。更为优选的情况下，所述的反应时间为0.5-24h。
此外，本发明还保护上文所述的一种基于表面VS基团的组氨酸标签蛋白定点共价固定方法在酶固定化，生物芯片制备及靶向给药系统中的应用。
进一步的，上述应用中，所述生物芯片的制备为微阵列的制备。
有益效果：
(1)定向性高：利用本发明上文所述的方法进行的组氨酸标签蛋白固定化，优选的情况下，在pH 7.0的PB缓冲液中，25℃反应12h，VS表面固定的组氨酸标签蛋白的定向性与NTA-Ni2+表面基本一致，并显著高于NHS活化的羧基表面。
(2)特异性强：利用本发明上文所述的方法进行的组氨酸标签蛋白固定化，优选的情况下，在pH 7.0的缓冲液中25℃条件下VS表面对组氨酸标签蛋白具有高特异性，其固定特异性远高于NHS活化的羧基表面，并略高于NTA-Ni2+表面。
(3)稳定性高：利用本发明上文所述的方法进行的组氨酸标签蛋白固定化，其固定方式为定点共价，相对于金属螯合固定方式，共价固定于VS表面的组氨酸标签蛋白不会发生解离，具有高稳定性。
(4)反应条件温和：利用本发明上文所述的方法进行的组氨酸标签蛋白固定化，优选的情况下，在pH为6.5-8.0的缓冲液中15-45℃条件下即可以实现组氨酸标签蛋白在VS表面的定点共价固定。
(5)固定量高：利用本发明所述的方法进行的组氨酸标签蛋白固定化，VS表面的组氨酸标签蛋白固定方法具有较高的固定量，可以达到NTA-Ni2+表面固定量的1.57倍。
(6)操作简单，成本低，原子经济性高：利用本发明上文所述的方法进行的组氨酸标签蛋白固定化，实验步骤少，操作简单；所用的试剂均为常规试剂，该反应在反应过程中没有副产物生成，原子经济性高，成本低廉。
附图说明
本发明附图幅，用以对本发明的进一步说明，并且构成说明书的一部分，与以下面的具体实施例方式一起用于来解释本发明，并不构成对本发明的限制。
图1为实施例1中的核磁共振碳谱，其中(a)为130-140ppm的谱图，(b)为35-50ppm的谱图，(1)为混合反应后的样品，(2)为N-α-Boc-L-赖氨酸，(3)为N-Boc-L-组氨酸，(4)为VS-EG3-OMe。
图2为实施例2中X射线光电子能谱表征结果，其中(a)为N-α-Boc-L-赖氨酸和N-Boc-L-组氨酸在VS表面反应示意图，(b)为pH 6.5,pH7.0,pH8.0条件下N-α-Boc-L-赖氨酸和N-Boc-L-组氨酸在表面反应后N 1s与S 2p的元素比。
图3为实施例3中表面等离子体共振检测的HaloTag-6His蛋白和BSA分别在VS表面，NHS活化的羧基表面，NTA-Ni2+表面的结合量。
图4为实施例4中石英晶体微天平检测的0.05mg/ml和0.5mg/ml的HaloTag-6His蛋白在VS表面，NHS活化的羧基表面，NTA-Ni2+表面的结合过程曲线。
图5为实施例5中VS表面，NHS活化的羧基表面，NTA-Ni2+表面的配体修饰的HRP的结合量与HaloTag-6His结合量的比值及未修饰的HPR对照。
图6为实施例7中固定了Herceptin Fab-6His的VS-PEG-SiNPs与Her2之间的等温吸附曲线。
具体实施方式
下述非限制性实施例可以使本领域的普通技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。
实施例1
甲基三聚乙二醇(OH-EG3-OMe，梯希爱化成工业发展有限公司)与二乙烯基砜(DVS)以体积比1:5的比例互溶，并加入20mg/ml的二甲氨基吡啶(DMAP，sigma-aldrich)25℃反应2h，利用柱色谱纯化得到甲基三聚乙二醇乙烯基砜衍生物(VS-EG3-OMe)。
1当量的VS-EG3-OMe与2当量的N-Boc-L-组氨酸(Acros Organics)和2当量的N-α-Boc-L-赖氨酸(Acros Organics)溶于pH7.0的PB缓冲液(20mM磷酸二氢钠)中，25℃反应48h。将反应液进行冻干并重溶于D2O，利用核磁共振碳谱对其进行表征，同时也分别对VS-EG3-OMe、N-Boc-L-组氨酸和N-α-Boc-L-赖氨酸进行核磁共振碳谱表征。如图1，结果显示131.5ppm和135.7ppm的乙烯基的特征峰基本消失，137.8ppm和40ppm处出现的峰分别可以归属于VS基团与N-Boc-L-组氨酸反应后咪唑上的碳和与咪唑基团相邻的碳，并且未检测到N-α-Boc-L-赖氨酸中氨基与VS基团反应的特征峰。该结果证明了在pH7.0的PB缓冲液中VS基团能够特异性与组氨酸上的咪唑基团反应。
实施例2
将镀金硅片置于0.2mg/mL的Hydroxy-EG6-undecanethiol((11-巯基十一烷基)六(乙二醇)，东人化学科技有限公司)乙醇溶液中25℃下反应24h。然后将其置于含有10％(v/v)DVS与1mM三苯基膦(PPh3，天津大茂化学试剂厂)的乙腈中，25℃反应6h。乙腈冲洗并用氮气吹干得到乙烯基砜封端的聚乙二醇表面(VS-EG6)的镀金硅片。VS-EG6表面的镀金硅片在pH 6.5、pH7.0和pH8.0的PB缓冲液中分别于25℃下与N-Boc-L-组氨酸和N-α-Boc-L-赖氨酸反应12h。利用X-射线光电子能谱对反应后的镀金硅片表面的元素进行表征并计算表面N1s与S 2p的比值，比值越大表明表面反应的氨基酸越多。如图2，结果显示在pH 7.0的PB缓冲液中VS表面能够与组氨酸反应并且不与赖氨酸反应。
实施例3
根据目的基因的核苷酸序列设计引物(引物序列：5`-CATATGGCTGAAGCTGGTAT-3`,5`-CCGCTGCTTCCTAATAAAAGCTT-3`)。以商业购买的pH6HTC质粒(普洛麦格生物技术有限公司，货号：G803A)中的HaloTag-6His基因序列为模板进行PCR扩增，PCR使用Tks Gflex DNAPolymerase(宝生物工程有限公司，货号：R060)进行扩增。PCR反应条件为98℃变性10s，60℃退火15s，68℃延伸30s，30循环。PCR产物经琼脂糖电泳检测，按Takara MiniBESTAgarose Gel Extraction Kit Ver 4.0(宝生物工程有限公司，货号：9762)切胶回收目的基因片段，将该目的基因片段连接至PET21a质粒(北京天恩泽基因科技有限公司)中，得到HaloTag-6His-PET21a质粒。将HaloTag-6His-PET21a质粒转染至大肠杆菌BL21(DE3)中。将转染质粒后的大肠杆菌在LB液体培养基中37℃培养2h,向培养基中加入终浓度为1mM的IPTG(异丙基硫代半乳糖苷，索莱宝生物科技邮箱公司)，在16℃下继续培养12h。菌液4500rpm离心15min弃上清，沉淀重溶于PBS中，利用细胞超声破碎仪进行破碎。破碎后的溶液11000rpm离心30min，上清液利用镍柱(Ni Sepharose,GE Healthcare)进行纯化，得到纯净的HaoloTag-6His蛋白。
将表面等离子体共振(SPR)芯片置于0.2mg/mL的Hydroxy-EG6-undecanethiol乙醇溶液中25℃反应24h。随后置于含有10％(v/v)DVS与1mM PPh3的乙腈中，25℃反应6h。乙腈冲洗并用氮气吹干得到VS-EG6表面的SPR芯片。利用SPR分别检测0.5mg/ml的HaloTag-6His蛋白和BSA(牛血清白蛋白，北京索来宝科技有限公司)在VS-EG6表面的固定量，如图3，结果显示HaloTag-6His在表面的固定量为220RU，BSA的固定量为10RU。
随机固定对照组将SPR芯片置于0.2mg/mL的Carboxy-EG6-undecanethiol(32-巯基-3,6,9,12,15,18,21七氧杂三十二碳-1-酸，东人化学科技有限公司)乙醇溶液中25℃反应24h。之后利用乙醇将芯片冲洗干净,得到COOH-EG6表面的芯片。芯片提前在NHS(N-羟基琥珀酰亚胺)/EDC(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐)溶液中活化30min，利用SPR分别检测0.5mg/ml的HaloTag-6His蛋白和BSA在NHS活化的COOH-EG6表面的固定量，如图3，结果显示HaloTag-6His在表面的固定量为180RU，BSA的固定量为150RU。
金属螯合对照组将VS-EG6表面的芯片置于含有20mM ab-NTA(N-(5-氨基-1-羧基戊基)亚氨基二乙酸,sigma-aldrich)的HEPES缓冲液(pH 8.5)中25℃下反应12h，之后在含有50mm的乙醇胺的HEPES缓冲液(pH 8.5)中反应12h进行封闭。超纯水冲洗干净后氮气吹干得到NTA-EG6表面的芯片。芯片提前在硫酸镍水溶液(1mM)中反应15min，利用SPR分别检测0.5mg/ml的HaloTag-6His蛋白和BSA在NTA-Ni2+-EG6表面的固定量，如图3，结果显示HaloTag-6His在表面的固定量为140RU，BSA的固定量为12RU。
以上结果表明基于VS表面的组氨酸标签蛋白固定方法具有较高的固定量，可以达到NTA-Ni2+表面固定量的1.57倍，并且基于VS表面的固定法对于组氨酸标签蛋白具有高特异性。
实施例4
利用实施例3的方法得到VS-EG6表面，NHS活化的COOH-EG6表面和NTA-Ni2+-EG6表面的石英晶体微天平(QCM)芯片。利用QCM分别检测0.05mg/ml和0.5mg/ml的HaloTag-6His蛋白在三种芯片表面的固定过程。利用Sauerbrey公式对蛋白结合量进行计算：
Δm＝-CΔf/n
其中Δm为芯片表面蛋白结合量，Δf为QCM频率响应，n为倍频数，C＝17.7ng Hz- 1cm-2。
如图4，结果显示0.05mg/ml和0.5mg/ml的HaloTag-6His蛋白在VS-EG6表面的结合量分别为9.8pmol/cm2和15.6pmol/cm2，在NHS活化的COOH-EG6表面的结合量分别为6.5pmol/cm2和13.5pmol/cm2，NTA-Ni2+-EG6表面的结合量分别为0.5
pmol/cm2和10.6pmol/cm2。可以看出VS表面具有最高的组氨酸标签蛋白固定量，并且在低浓度蛋白溶液条件下依然具有较高的固定量。此外可以观察到NTA-Ni2+-EG6表面固定的蛋白会发生持续缓慢的解离现象，而基于VS表面的固定法避免了该情况的发生。
实施例5
利用实施例3的方法修饰得到VS-EG6表面，NHS活化的COOH-EG6表面和NTA-Ni2+-EG6表面的镀金硅片(1cm*1cm)。分别将三种镀金硅片浸于0.5mg/ml HaloTag-6His溶液(pH7.0PB缓冲液)中反应12h，随后在1mg/ml BSA溶液中25℃下封闭12h，超纯水清洗并吹干后将镀金硅片置于0.1mg/ml的HaloTag特异性配体修饰的辣根过氧化物酶(HRP)溶液中在25℃下反应1h。水洗干净后，利用TMB显色液检测表面结合的配体修饰的HRP的量。配体修饰的HRP结合量与实施例4中HaloTag-6His固定量的比值可以用来表示表面固定的HaloTag的定向性。如图5，从结果可以看出基于VS表面的固定方法的定向性与NTA-Ni2+螯合固定法基本相当，并且显著高于随机固定的NHS活化羧基法。这一结果验证了基于VS的组氨酸标签蛋白固定法具有高定向性。
实施例6
取1ml硅纳米粒子(sigma-aldrich)分散于30ml 95％乙醇中，加硝酸调节pH 4,40℃搅拌4h，离心并去除上清，纳米粒子用乙醇清洗3次。将纳米粒子重新悬浮于30ml水中，加入300μl聚乙二醇硅烷偶联剂((hydroxy(polyethyleneoxy)propyl)triethoxysilane,GELEST,Inc.),利用氨水调节至pH10,70℃反应24h。水洗后得到聚乙二醇修饰的硅纳米粒子(PEG-SiNPs)。100mg PEG-SiNPs与0.5ml DVS溶于10ml含有1mM DMAP的乙腈中，25℃反应12h。反应后用乙腈清洗3次，得到乙烯基砜表面的硅纳米粒子(VS-PEG-SiNPs)。
20mg VS-PEG-SiNPs与0.5mg六组氨酸标签的赫赛汀单抗Fab片段(HerceptinFab-6His)混合溶于1ml pH 7.0的PB缓冲液中,25℃反应12h。经检测，反应后VS-PEG-SiNPs表面的Herceptin Fab-6His固定量为7.5mg/g。
实施例7
利用实施例6的方法得到固定了Herceptin Fab-6His的VS-PEG-SiNPs。
取96孔板，首先每孔加100μl 1μg/ml的Her2(人表皮生长因子受体2，北京义翘神州科技有限公司)，4℃静置12h，PBS清洗3次，然后向每孔加入150μl 3％的BSA水溶液进行封闭，4℃静置12h，PBS清洗3次，随后分别向孔板中加入100μl 5mg/ml,2.5mg/ml,1mg/ml,0.5mg/ml,0.25mg/ml,0.1mg/ml的固定了Herceptin Fab-6His的VS-PEG-SiNPs，37℃静置1h,利用含有0.1％曲拉通-100的PBS清洗3次，再用PBS清洗3次，之后每孔加入100μl 1.25μg/ml的HRP-protein L(辣根过氧化物酶偶联的蛋白L),37℃静置1h并利用PBS清洗3次。最后，每孔加入100μl TMB显色液(北京索来宝科技有限公司)25℃反应15min后加入1M硫酸终止，酶标仪检测450nm吸光度。
通过对结果进行统计得到了固定了Herceptin Fab-6His的VS-PEG-SiNPs与Her2之间的等温吸附曲线，见图6。结果显示KD(平衡解离常数)为0.5mg/ml，换算为纳米粒子上赫赛汀Fab片段的量为0.073μM,与游离赫赛汀Fab片段(KD值为3.139μM)相比，通过VS基团固定于纳米粒子后结合强度提高了43倍。
对于任何熟悉本领域的技术人员而言，在不脱离本发明技术方案范围情况下，都可利用上述揭示的技术内容对本发明技术方案作出许多可能的变动和修饰，或修改为等同变化的等效实施例。因此，凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所做的任何简单修改、等同变化及修饰，均应仍属于本发明技术方案保护的范围内。
Claims (8)
1.一种基于乙烯基砜表面反应的组氨酸标签蛋白定点共价固定方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：将组氨酸标签蛋白溶于水溶液中，所述的水溶液pH为6.8-7.5，加入表面含有乙烯基砜基团的基底材料，在15-60℃下反应0-48 h，得到定点共价固定了组氨酸标签蛋白的基底材料。
2.根据权利要求1所述的一种基于乙烯基砜表面反应的组氨酸标签蛋白定点共价固定方法，其特征在于，所述的组氨酸标签为在蛋白质C端或N端融合的包含2-8个组氨酸的序列。
3.根据权利要求1所述的一种基于乙烯基砜表面反应的组氨酸标签蛋白定点共价固定方法，其特征在于，所述的基底材料为固体基质，包括贵金属材料、硅材料或有机高分子材料。
4.根据权利要求1所述的一种基于乙烯基砜表面反应的组氨酸标签蛋白定点共价固定方法，其特征在于，所述的反应温度为15-45℃。
5. 根据权利要求1所述的一种基于乙烯基砜表面反应的组氨酸标签蛋白定点共价固定方法，其特征在于，所述的反应时间为0-40 h。
6. 根据权利要求1所述的一种基于乙烯基砜表面反应的组氨酸标签蛋白定点共价固定方法，其特征在于，所述的组氨酸标签蛋白浓度为0.01-20 mg/mL。
7.权利要求1所述的一种基于乙烯基砜表面反应的组氨酸标签蛋白定点共价固定方法在酶固定化，生物芯片制备及靶向给药系统中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述生物芯片的制备为微阵列的制备。
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Legal Events
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
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