CN1646912A - 担载了聚乙二醇化纳米粒子的生物传感器芯片表面 - Google Patents

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Abstract

本发明提供抑制生物学样品中的杂质例如蛋白质等的非特异性吸附、高敏感度的生物测定传感器系统。将内包有与传感器材料相同的金属、半导体的聚乙烯化粒子用于放大。

Description

担载了聚乙二醇化纳米粒子的生物传感器芯片表面
技术领域
本发明涉及生物测定的技术领域,更具体地说,涉及可降低或防止因除生物学流体等中含有的待测物之外的杂质而导致的非特异吸附或结合,提高对待测物的检测敏感度的生物传感器系统、以及使用该生物传感器系统的测定方法。
背景技术
对于检测存在于生物学样品中的待测物的方法,人们提出了具有各种各样的检测方式的生物传感器。这样的生物传感器中,利用表面等离子共振(以下也称为SPR)的传感器对于金属薄膜的表面及其附近的折射率的变化敏感(例如参照A.Szabo等人,Curr.Opin.Strnct.Biol.5(1995)699-705页)。SPR适合于能对表面与复杂的生物学溶液之间所发生的过程进行就地观察,并且例如无须使用标记,可实时地获得待测物的数据,取得动力学和热力学参数,因此是备受瞩目的传感器之一。
具有上述表面的典型的生物传感器芯片有可购自アマシヤムフアルマシアバイオテク(株)的BIACORE(商标)。该BIACORE中,末端羧基化的葡聚糖基质以半透明的状态固定在金薄膜上。更具体地说,提供了如下的生物传感器芯片(例如参照美国专利第5763191号):使用式HS-R-Y(R为具有超过10个原子的链长、可被杂原子中断的烃链,Y为配体或与生物适合性多孔基质共价结合用的活性基团)所表示的有机分子,经由其硫醇基(或巯基)与金、银等自由电子金属薄膜的表面结合,以紧密堆积的单层覆盖该表面,然后,作为生物适合性多孔基质,具有与水凝胶共价结合的表面,其中水凝胶包含琼脂糖、葡聚糖、聚乙二醇等,其可具有与配体结合用的官能团。检测这样的生物传感器芯片上的生物学物质例如蛋白质时,可实现SPR信号的一定的放大和防止非特异性吸附。
主要在测定作为目标的待测物蛋白质等时,为防止存在于生物学流体中等的杂质与传感器芯片表面非特异性吸附,有人也提供了具有如下表面的传感器芯片(例如参照美国专利第3071823号):在经由硫原子(巯基的)结合到支撑体上的间隔分子(碳原子数1-30的亚烷基链)上,亲水性接头部分(链长4-15个原子的直链分子)和固相反应物质(生物素衍生物残基)依次共价结合。另外还提供了:具有使用以HS-间隔分子(碳原子数11的亚烷基链)-亲水性接头(由3个或6个环氧乙烷单元构成的链)-为基础的化合物,经由巯基在金表面上自组装的单层的传感器芯片(例如参照Roberts等人,J.Am.Chem.Soc.1998,120,6548-6555)。并且还提出了具有担载了环氧乙烷单元在5-10,000范围的杂遥爪(hetero telechelic)聚合物的表面的传感器芯片(参照WO 01/86301 A1)。
如上所述,具有这样的表面的传感器芯片也可实现SPR信号的一定的放大。但是,大多数提供的都是使胶体金(Au)与具有金薄膜表面(如上述各文献所记载,这些表面上未担载葡聚糖层、聚乙二醇层)的传感器芯片组合使用,以作为可进一步提高检测敏感度的生物传感器系统。通常,这样的系统与不使用胶体金的系统相比,可以举出大的等离子体角度的变动、宽幅的等离子共振和最低反射率显著增大等优势(例如参照L.A.Lyon等人,Anal.Chem.1998,70,5177-5183页、特别是5177页的前序项;J.Am.Chem.Soc.2000,122,9071-9077页;E.Hutter等人,J.Phys.Chem.B 2001,105,11159-11168页;日本特开2002-267669号公报、日本特开2000-55920号公报)。将这些胶体金或金纳米粒子用于SPR的放大或增强的系统的传感器芯片表面,均是用链烷硫醇(例如3-巯基丙酸或3-巯基乙胺)等修饰金薄膜表面,然后与生物素或抗生物素蛋白或链亲和素(streptoaridin)、抗体等共价结合。胶体金或金纳米粒子使用或不使用上述链烷硫醇类,与蛋白质结合(包括化学吸附),如生物素-链亲和素、抗原-抗体,通过形成生物学特异性结合对,由此与上述传感器芯片的表面结合。另外,E.Hutter等人公开到,使用2-氨基乙硫醇(AET)或1,6-己二硫醇(HDT)直接将金纳米粒子固定在金或银的支撑体(传感器芯片)上,结果Au/AET/Au系统显示了得到增强的SPR敏感度,但Au/HDT/Au系统中,金纳米粒子的放大效果变得相当低(参照其第11159页的前序项)。并且还已知:使用上述金纳米粒子在玻璃制的传感器芯片上形成自组装单层,则通过可见-紫外分光光度计可以实时追踪芯片表面上生物分子之间的相互作用(例如参照N.Nath等人,Anal.Chem.2002,74,504-509页)。
另外,虽然不是构成上述的生物传感器系统的,但已知的是,将生物测定中作为标记使用的金属粒子的表面用聚乙二醇(或称为聚环氧乙烷)这样水溶性且在水性介质中迁移率高的聚合物链修饰,改善该粒子的分散稳定性的方法(W.Pwuelfine等人,J.Am.Chem.Soc.120(48),12696-12697页(1998));与金属粒子表面结合的聚乙二醇的该结合部位的另一末端上具有功能性化合物的残基的聚乙二醇化[以下称为PEG修饰]金属粒子、半导体粒子或磁性粒子在水性介质中显示出分散稳定性(参照Otsuka等人,J.Am.Chem.Soc.2001,123,8226-8230页;日本特开2001-200050号公报;日本特开2002-80903号公报)。另外还有人提出:将半导体纳米粒子用聚合物(例如丁二炔、苯乙烯等)包围,所得粒子作为用于检测生物学物质的探针使用(例如参照美国专利第6207392号说明书)。
在将上述的金纳米粒子用于提高SPR敏感度的系统中,发现因金纳米粒子与生物传感器芯片的金薄膜表面之间的距离、或粒子与表面的结合形式而导致敏感度增强效果不同(例如参照N.Nath等人)。因此,即使将上述使用金纳米粒子和生物传感器芯片的系统应用于美国专利第5763191号所记载的系统,也有可能敏感度低或无法防止杂质的非特异性吸附。
发明内容
本发明人将BIACORE的传感器芯片或具有聚乙二醇修饰表面的传感器芯片与主要作为改善在水性介质中的分散稳定性而提供的聚乙二醇修饰金属粒子或半导体粒子组合使用,发现可提高相应的传感器芯片的生物测定的敏感度,同时可防止或抑制由杂质引起的非特异性吸附。本发明基于上述认识而完成。
本发明提供用于生物测定的生物传感器系统,它包括(A)和(B)的套组:
(A)结构式I:
(X-W2-PEG-W1-L)x-PCL-(L-W1-PEG-W2-Y)y           (I)
表示的聚乙二醇修饰的纳米粒子,
式中,PCL表示自由电子金属微粒、金属氧化物微粒或半导体微粒,
X表示可与生物传感器芯片表面结合的官能团或功能性部分,
Y表示一种或以上选自C1-C6烷基、可用于形成X官能团或功能性部分的可被保护的官能团和与X相同或不同的功能性部分的基团或部分,
L表示与PCL结合的基团或结合部分,
W1和W2表示单键或相同或不同的连接基团,
PEG表示环氧乙烷单元:(-CH2CH2O-)n(其中n为5-10,000的任意的整数);
其中,(X-W2-PEG-W1-L)x与(L-W1-PEG-W2-Y)y中的W2-PEG-W1-L可以相同也可以不同,并且
x和y各自独立表示1或以上的整数,且合在一起表示在水性介质中PEG链足够覆盖PCL表面的整数,和
(B)生物传感器芯片,该芯片具有可经由X结合(A)粒子、且由玻璃等电介体或担当PCL材料的材料构成的表面。
本发明的另一种方案还提供聚乙二醇修饰纳米粒子,其中上述结构式I中的X是形成生物学特异性结合对的一个成员的残基,Y是形成生物学特异性结合对的残基以外的基团,
L表示下式
HS-(CH2)p-、
Figure A0380778600101
(其中,p表示2-12的任意的整数,R1、R2和R3各自独立表示C1-C6的烷基,m表示2-100的任意的整数)所示的基团,x+y为每1nm2PCL表面相当于0.1-0.5、优选0.25-0.40的任意的数,(x/x+y)×100为1-99、优选20-65的整数,PCL的横截面的平均尺寸为1-500nm、优选5-500nm。
另一形式的本发明还提供生物学流体中待测物的检测方法,该方法包括:(a)准备上述聚乙二醇修饰纳米粒子,
(b)准备生物传感器芯片,其中该生物传感器芯片具有与该纳米粒子的PCL材料相应的薄膜表面,具有直接或至少经由C1-C6亚烷基或(-CH2CH2O-)n(其中n为5-10,000的任意的整数)担载了与该纳米粒子的生物学特异性结合对的一个成员X相对应的另一个成员的表面,
(c)以可形成该生物学特异性结合的构成成员中的任意一个成员作为待测物,使(A)粒子和(B)生物传感器芯片与被怀疑含有上述待测物的生物学流体接触,
(d)确定因待测物的竞争作用导致的(A)粒子与(B)生物传感器芯片表面的结合程度的变化,
(e)以该变化作为生物学流体中待测物浓度的指标。
根据本发明的(A)粒子和(B)生物传感器芯片的套组,它们一旦形成键(共价键或非共价键(例如生物学特异性结合中可见的疏水键、离子键、化学吸附等)),则会通过表面敏感度增强效果而使例如共振拉曼散射增大。
特别是当为自由电子金属微粒时,会带来表面等离子共振信号的显著变化(大的等离子体角度的变动、宽幅的等离子共振以及最低反射率的增大)。令人惊奇的是:在生物传感器芯片上担载了具有相当厚度的葡聚糖层的BIACORE(商标)传感器芯片与该(A)粒子结合时也可见这样的变化。
根据本发明的被(A)粒子覆盖的(B)生物传感器芯片表面,假使该芯片表面即使未被上述葡聚糖层或聚乙二醇修饰,也可显著抑制例如存在于生物学流体中的蛋白质等的非特异性吸附。
附图简述
图1是表示本发明的PEG修饰的金纳米粒子与传感器芯片表面的关系的概念图。a)是将PEG修饰的金纳米粒子固定于金属面上的高敏感度系统的略图,(i)表示抑制非特异性吸附的PEG链,(ii)表示配体分子,iii)表示使SPR的响应得到强化的金粒子。b)是构成竞争测定系统的略图。
图2是为了验证lac65与凝集素的特异性结合而进行的实验结果的传感器曲线图。
图3是表PEG修饰的金纳米粒子表面上的乳糖密度与凝集素固定化表面之间的响应关系的曲线图。
图4是表示经由乳糖-凝集素结合的PEG修饰的金纳米粒子与传感器芯片因半乳糖的竞争而导致的解离状态的传感器曲线图。
图5是表示未结合末端具有氨基的PEG修饰的金纳米粒子的ζ电势测定结果的曲线图(●符号的曲线)、和表示未结合末端具有乙缩醛化甲酰基的金纳米粒子的同样的测定结果的曲线图(■符号的曲线)。
图6是表示测定蛋白质担载于未结合末端具有生物素残基的PEG修饰的金纳米粒子的担载量的结果的曲线图。
图7是表示使未结合末端具有氨基的PEG修饰的金纳米粒子直接吸附于金芯片表面的表面上各种蛋白质的吸附性的曲线图。
图8是表示利用SPDP使图7中使用的金纳米粒子结合于金芯片表面的表面上蛋白质的吸附性的曲线图。
发明的具体实施
本发明的生物传感器系统特别引人注目的应用面向利用表面等离子共振(SPR)的生物测定(生物分子的测定),本发明所述的测定还包括除SPR以外利用可追踪的信号、放射能、各种电磁波的接触角、沉降、紫外分光、拉曼散射等的变化的测定。本发明中所述生物测定中作为检测对象的生物分子是所谓的生物学特异性结合对(例如生物分子之间通过疏水键、离子键等形成。),更具体地说可以是形成非共价结合对的构成成员、配体与受体,例如形成如抗原或半抗原与抗体、糖与凝集素、底物与酶、激素与其受体、寡核苷酸与其互补链、生物素与抗生物素蛋白或链亲和素类等的结合对的任意的构成成员,但并不限于这些。
本发明所述“生物传感器系统”是指在进行如上所述的测定中可使用的各要素或它们的装配体或组合体。本说明书中,“微粒”和“纳米粒子”可互换使用,如没有特别说明,并不限定于纳米级的物质,使用时甚至包括亚纳米或数微米的物质。
以下对本发明的构成进行详细阐述。
(A)关于结构式I所表示的PEG修饰的纳米粒子
PCL可以是选自自由电子金属(例如金、银、铂、铝、铜等)、半导体(例如CdS、ZnS、CdSe、InAs等)和金属氧化物(例如TiO4、Cr2O3等)的材料制的微粒。适宜地可使用具有1-500nm平均横截面尺寸的,但这不是限定本发明。
L是介由可与上述粒子表面结合(为化学键或化学吸附、金属氧化物时,介由因氢氧化而产生的表面-OH基的共价键等)的基团或部分的键,只要顺应本发明的目的,可以是任意的键。但是优选表示介由选自下式(i)、(ii)和(iii)
(i)HS-(CH2)p-、
Figure A0380778600131
的基团的键(其中,p表示2-12的任意的整数,R1、R2和R3各自独立表示C1-C6的烷基,m表示2-500、优选5-100的任意的整数。)。当上述键例如是(i)和(iii)的基团或部分(或片段)时,可以是与上述粒子表面之间形成的键;另外当为(ii)的基团或部分时,可以是被氢氧化的金属氧化物表面的-OH与硅烷醇基之间伴随着脱醇反应而形成的键。
PEG是环氧乙烷单元:(-CH2CH2O-)n(其中n为5-10,000,优选10-10,000,更优选20-2500的任意的整数)。
X表示可与生物传感器芯片表面结合的官能团或功能性部分。作为形成上述L的物质,官能团或功能性部分可以是作为可形成上述L而例举的式(i)、(ii)和(iii)所示的基团或部分,还可以是可形成上述生物学特异性结合对的一个构成成员的残基,以及不对生物测定产生影响的蛋白质的残基。
该特异性结合对的构成成员中,通常优选来自分子量小的、例如半抗原、糖、底物、激素、寡核苷酸、生物素的残基。
Y可以是C1-C6的烷基,针对X所定义的基团或功能性部分或以其被保护的形式存在的部分、或与X不同的基团或功能性部分或以其被保护的形式存在的基团或部分。与X不同的代表性基团或部分有选自下式(iv)、(v)和(vi)
Figure A0380778600141
和(vi)-COOH
(其中,Ra独立表示氢原子或C1-C6烷基,Rb独立表示C1-C6烷氧基或两个Rb一起表示形成可被氧或C1-C6烷基取代的亚乙基的原子团。)所示基团的。优选的Y可以例举选自上式(iv)、(v)和(vi),针对X所定义的式(i),以及C1-C6烷基的基团或部分。
W1和W2各自独立,可以是选自连接基团例如单键、C1-C6亚烷基、-COO-(经由氧原子与环氧乙烷单元的亚甲基结合)、-O-、-S-、-(C1-C6亚烷基)-COO-、-(C1-C6亚烷基)-O-和-(C1-C6亚烷基)-S-的基团。
由以上各基团、部分和/或片段构成的式(II)和(III):
(II)X-W2-PEG-W1-L和
(III)L-W1-PEG-W2-Y所表示的聚合物可以是可由上述X和Y的定义所理解的那样是相同的,但优选不同。另外,这些式中的W2-PEG-W1-L可以相同或不同。式(II)和式(III)所表示的聚合物分别独立地,以1个或以上的整数个数(分别对应x和y的整数)在单一的PCL表面上结合。这些x+y以PEG链足以覆盖PCL表面的整数存在。该数是可以在水性介质中可抑制非特异性蛋白质等吸附在本发明的聚乙二醇化粒子表面(以上述粒子覆盖传感器芯片表面时,其覆盖表面)的数。关于抑制程度,可以参考后述的实施例。非特异性蛋白质等的吸附是指例如X为可形成生物学特异性结合对的一个成员例如抗原时,除了介由对应的抗体与其结合这样的特异性结合的吸附之外的吸附。x+y的具体数字可以是相当于每1nm2 PCL表面为0.1-0.5,优选0.25-0.40的数的任意的数。x与y的比例如上所述,可以是为了使式(II)和式(III)所表示的聚合物可以相同的任意的比例。但是如后所述,在利用待测物对生物传感器表面与该PEG修饰的粒子的生物学特异性结合的竞争作用的测定中,x占x和y的总数的比例可以是1-99,优选20-65。可以以这样的比例将式(II)(X为形成生物学特异性结合对的一个成员)的聚合物和式(III)(Y与X不同,是不与X结合的基团或部分)的聚合物配置于PCL上。这样形式的粒子利于进行迅速且高敏感度的测定。
上述聚乙二醇化粒子的典型例子刊载于上述Otsuka等人,J.Am.Chem.Soc.2001,123,8226-8230、日本特开2001-200050号公报、日本特开2002-80903号公报,并且可以按照这些记载来制造。并且可以用来形成该粒子。特别是对于杂遥爪聚合物,只要参考本发明的一部分提出的WO 96/32434、WO 96/33233、WO 97/06202所记载的嵌段共聚物的α,ω-末端的功能化,对于本领域技术人员来说可很容易地制造。
上述定义中使用的C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、C1-C6亚烷基,即使在不同的基团或部分中使用,它们也具有共同的含义。例如C1-C6烷基表示甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、仲丁基、正己基等,C1-C6烷氧基的例子有上述C1-C6烷基分别对应的烷氧基。另外C1-C6亚烷基为亚甲基、亚乙基、亚丙基、1,3-亚丙基、1,6-亚己基等。
(B)关于生物传感器芯片
生物传感器芯片只要是其表面可与上述(A)中详述的PEG修饰的纳米粒子的X基团或部分结合,可用于生物测定即可,对其形状、尺寸没有限制。但是,优选其表面选择以与套组中使用的、形成PCL的材料相同或同一类别(例如为自由电子金属时的金和金、金和银;为半导体时的CdS和CdS、CdS和InAs),这会增强由(A)粒子和该传感器芯片得到的如上所述的信号,因而优选。但是,使用可见-紫外分光光度计检测信号时,也可以是透射这些光的晶体或玻璃。该表面通常可以是蒸镀相应的材料形成的薄膜。
这样的表面被修饰为可促进与上述(A)粒子中的X基团或部分成键,并且当X为蛋白质时,可以是这些材料本身。如式(I)中对L的记载那样,这样的修饰可通过在至少一侧的末端具有显示与PCL的结合性的基团或部分的有机化合物来进行。例如在具有由金、银、半导体形成的表面的芯片中,可用链烷硫醇(例如3-巯基丙酸或2-巯基胺)修饰表面,然后利用游离的羧基或氨基,与可形成生物学特异性结合对的一个成员(与一个成员X相对应的成员)共价结合,从而完成优选的表面。具有这样的表面的生物传感器芯片的例子有上述L.A.Lyon等人,E.Hutter等人,日本特开2002-267669号公报、日本特开2000-55920号公报所记载的芯片。
另外,本发明也可以使用表面上担载了葡聚糖层的BIACORE(商标)传感器芯片、具有被中间具有聚(氧乙烯)链的杂遥爪聚合物覆盖的表面的传感器芯片(参照例如WO 01/86301 A1)。
关于其它的传感器芯片,只要是本领域技术人员,均可以参照以上的现有技术制造。
可用于修饰上述PCL表面和传感器芯片表面的典型的杂遥爪聚合物可按照下述反应方案制造。
反应方案I:
Figure A0380778600171
反应方案II-a:
Figure A0380778600172
反应方案II-b:
Figure A0380778600181
(以上各式中的简称符号为:M表示钾、钠、锂。)
以上的活性聚合步骤可在其本身公知的反应条件下实施(例如参照上述WO 96/32434、WO 97/06202等)。其它可以根据后述的实施例或改变记载的条件来实施。
下式
可根据本发明人一部分的kataoka等人,Macromolecules、1999、32、6892-6894页中记载的方法获得。将PEG Mw=5000g/mol、PAMA(聚[甲基丙烯酸(2-N,N-二甲基氨基)乙基酯])的聚合度m=68)用于制作后述的PEG修饰的微粒。
下面简述对使用这些聚合物的PCL进行的PEG修饰,构成结构式I中的PCL的自由电子金属微粒、金属氧化物微粒或半导体微粒可分别利用市售的产品,也可以利用通过形成各自相应的胶体而得到的微粒。另外,本发明的PEG修饰的纳米粒子例如在形成各自相应的微粒(例如平均粒径0.5nm-1μm,优选1nm-200nm)的步骤中,使上述前体聚合物共存而形成,由此可制作前体聚合物与微粒表面结合的结构式I的表面或其前体表面。
关于(A)粒子与(B)传感器芯片的套组
(B)传感器芯片表面如BIACORE(商标)那样具有葡聚糖层,或像WO 01/86301 A1所记载的那样被中间具有聚(环氧乙烷)链的聚合物修饰,除此之外,按照与被怀疑含有待测物的样品液接触的表面基本上被(A)粒子覆盖的方式,使用(A)粒子和(B)传感器芯片,特别是以它们结合的状态使用。这样,通过(A)粒子表面上的式(II)和式(III)所示的聚合物的作用,以(A)粒子覆盖了(B)传感器芯片表面的形式存在的表面可以显著抑制蛋白质等对表面的非特异性吸附。当然,也获得了因粒子而致的各种信号的放大效果。
(A)粒子中的X是形成生物学特异性结合对的一个成员,当(B)传感器芯片的表面上存在与该构成成员相对应的另一成员时,可以以针对测定概念简略图示的图1所示的形式使用(A)粒子和(B)传感器芯片的套组。图中的三角符号表示例如糖、生物素、抗原或半抗原、激素、寡核苷酸等,与该三角配合的符号分别表示凝集素、抗生物素蛋白或链亲和素、抗体、受体蛋白、互补性寡核苷酸或含有该核苷酸序列的多核苷酸等。另外,与这些符号结合的波浪线可以是聚(环氧乙烷)链段。
由这样的概念图表示的生物测定方法也是本发明的一个形式。
一般而言提供包括下述步骤的检测生物学流体中待测物的方法:
(a)准备可根据上述制造的(A)粒子,
(b)准备生物传感器芯片,其中该生物传感器芯片具有与该纳米粒子的PCL的材料相对应的薄膜表面,具有直接或至少经由C1-C6亚烷基或(-CH2CH2O-)n(其中n为5-10,000的任意的整数)担载了与该纳米粒子的生物学特异性结合对的一个成员X相对应的另一成员的表面,
(c)以可形成该生物学特异性结合的构成成员中的任意一个成员作为待测物,使(A)粒子和(B)生物传感器芯片与被怀疑含有上述待测物的生物学流体接触,
(d)确定因待测物的竞争作用导致的(A)粒子与(B)生物传感器芯片表面的结合程度的变化,
(e)以该变化作为生物学流体中待测物浓度的指标。
优选上述步骤(d)中,(A)粒子与(B)传感器芯片的结合程度的变化是表面等离子共振谱的变化,例如等离子体角度的变动、最低反射率的增大。
这样的测定方法旨在理论上对于任何被怀疑含有形成生物学特异性结合对的一个成员(待测物)的水性液体样品均可适用,特别适用于生物学流体例如血清、血浆、尿液、唾液等,或它们的浓缩或稀释液。
根据上述方法,可以迅速且高敏感度地进行测定。
以下,举例进一步具体说明本发明,但本发明并不受这些限定。
制备例1:PEG修饰的金微粒的制备方法(之一):
所用聚合物:乙缩醛-PEG-SH(Mn=5000)
乙缩醛-PEG-SH:HAuCl4=1/6∶1(摩尔比),向按上述比混合的水溶液中添加相对于HAuCl4为10倍摩尔量的NaBH4,通过还原法调节胶体金。用pH 2的盐酸处理末端乙缩醛基,还原为醛基,然后与对氨基苯基-β-D-乳吡喃糖苷反应,得到由乳糖-PEG-SH修饰的胶体金水溶液(平均粒径:8.7nm)。
乙缩醛-PEG-SH如下制备。
在氩气置换的容器中加入20ml经蒸馏的四氢呋喃(THF)和0.2mmol(0.032ml)3,3-二乙氧基-1-丙醇引发剂,再加入当量的萘基钾,搅拌15分钟,进行金属化作用。之后,加入22.7mmol(1,135ml)环氧乙烷,在室温下搅拌2天,使其聚合。将0.4mmol(0.125g)N-琥珀酰亚氨基-3-(2-吡啶硫代)丙酸酯(SPDP)终止剂溶解于少量蒸馏的THF中,将上述聚合反应溶液用恒压滴液漏斗、在冰冷却下向该溶液中滴加。搅拌过夜,进行终止反应,然后经过饱和食盐水洗涤、氯仿萃取、乙醚再沉淀、苯冷冻干燥,回收聚合物。将回收的聚合物用1H-NMR确认结构,通过与2-巯基乙醇反应而游离的2-硫代吡啶酮的UV吸收,来确认引入到末端的SPDP残基的量。
使2.0×10-2mmol(100mg)PEG-SS-Py溶解于4ml蒸馏水中,再加入5倍摩尔量即0.1mmol(15.42mg)的二硫苏糖醇,在室温下搅拌30分钟。反应后,经过饱和食盐水洗涤、氯仿萃取、乙醚再沉淀回收聚合物(以下简称为PEG5000)。回收的聚合物用1H-NMR确认其结构,再通过与2-吡啶基二硫化物(2-PDS)反应来对末端SH基进行定量。制备例2:PEG修饰的金微粒的制备方法(之二)
所用聚合物:乙缩醛-PEG-SH(Mn=3200)
(1)所用聚合物的制备
根据反应方案I,使用引发剂3,3-二乙氧基-1-丙醇、终止剂甲磺酰氯,通过阴离子聚合来合成具有乙缩醛基和甲磺酰基的杂双官能性PEG。再在四氢呋喃(THF)中与钾オルト乙基二硫代碳酸酯在室温下反应3小时,得到甲磺酰基转化为乙基二硫代碳酸酯基的聚合物。
之后,同样通过在THF中与丙胺反应,得到上式所示的α-末端具有巯基的杂双官能性PEG(乙缩醛-PEG-SH)。
(2)金粒子的PEG修饰
称取乙缩醛-PEO-SH(Mn=3200)和乙缩醛-PEO-OH(比较例)(Mn=3000),分别使聚合物与金粒子的摩尔比为5.0×106∶1,溶解于2.0mL纯水中。用NaOH溶液调节为pH 6.5,加入1.0mL(2.58×10-13mol、pH 6.5)胶体金,在室温下剧烈搅拌3小时。接着进行离心分离[42,000g(g为重力加速度)、30分钟],然后除去溶液,向残余物中加入3mLTHF,通过超声波进行再分散。使用UV对这些样品进行特性分析。
调制使用该聚合物的金粒子时,离心分离后,由再分散于THF溶液时的UV-vis光谱可以表明:未修饰的金粒子的UV光谱因粒子凝集导致在600nm或以上显示出大的吸收峰。用乙缩醛-PEO-OH(比较例)处理的金粒子不像未修饰的金粒子的UV光谱那样在600nm或以上具有大的吸收峰,但峰整体向高波长一侧位移,显示微粒分散有些不稳定。另外发现,离心操作后,再分散于pH3的水溶液中时,只有乙缩醛-PEG-SH非常稳定,用苯进行冷冻干燥后的再分散性依然很好。
(3)PEG修饰的金微粒的特性(ζ电势)
在通常的金微粒的水溶液分散系中,使粒子表面荷载负电荷,通过其电荷排斥来实现分散的稳定,而与此相对,PEG化金微粒中,通过测定ζ电势(大塚电子:ELS8000)可知其表面完全没有电荷。即,市售的金微粒为-34.5mV,而与此相对,这里制备的金微粒-杂PEG复合物(乙缩醛-PEG-SH/Au)为-0.86mV,可以说在误差范围内,粒子表面几乎没有电荷,由此推测表面被PEG链覆盖。
测定数据如表1所示。
表1:乙缩醛-PEG-SH/金(Au)粒子的ζ电势
    样品     ζ电势(mV)
    未修饰的金粒子     -34.5
    乙缩醛-PEG-SH/Au     -0.86(3次的平均值)
测定溶液:
加入10mM(摩尔浓度)缓冲剂NaH2PO4·2H2O和Na2HPO4·12H2O,使离子强度调节为0.015,pH为7.5的磷酸缓冲溶液。
测定仪器:ELS-8000大塚电子)
制备例3:PEG修饰的金微粒的制备方法(之三)
该例中使用的聚合物(乙缩醛-PEG-PAMA):
(按照上述的kataoka等人,Macromolecules、1999、32、6892-6894页中记载的方法获得。使用PEG Mw=5000g/mol、PAMA(聚[甲基丙烯酸(2-N,N-二甲基氨基)乙基酯])的n=130、m=100),制作聚乙二醇化CdS半导体微粒。将1mL 2.5mg/mL的氯金酸(HAuCl4)水溶液和5mL6mg/mL的乙缩醛-PEG/PAMA嵌段共聚物水溶液(NH∶Au=8∶1)混合,在室温下搅拌24小时。每隔规定时间测定UV-vis光谱,可确认来自金微粒的540nm的峰逐渐上升,在不加入还原剂的状态下生成胶体金粒子(微粒)分散体。通过光散射测定该溶液(DLS:动态光散射),证实生成了平均粒径为12nm的单分散胶体粒子。
通过透射电子显微镜还证实生成了完全均匀的粒子。即使使该溶液在pH=2-10的范围内变化,放置1天,也完全未见光谱变化,可证实该系统中可获得极为稳定的胶体金粒子(微粒)。
向该溶液中加入嵌段共聚物10倍当量的1,2-二氨基-4,5-二甲氧基二盐酸盐(DDB),用NaCl调节pH为2.45。用分部分子量500的透析膜透析溶液,用269nm激发波长进行荧光测定,结果在410nm处显示了强的荧光。该结果表明:在经调节的金粒子表面,乙缩醛-PEG/PAMA嵌段共聚物的末端乙缩醛基转变为醛基,与DDB高效地反应。经由这样形成的醛基,可以给出各种功能性部分。
制备例4:PEG修饰的半导体微粒的制备
向80mL蒸馏水中加入上述乙缩醛-PEG/PAMA嵌段(4.19×10-7mol)、CdCl2(6×10-6mol)和Na2S.9H2O(6×10-6mol),用搅拌器(750rpm)搅拌20分钟。将所得PEG修饰的半导体(CdS)微粒(粒径4nm)用300nm的激发波长进行荧光测定,出现了CdS微粒特有的强荧光。
实施例1:PEG修饰的微粒在传感器芯片表面的固定化
(1)传感器芯片表面的调制
将分别以1mM、2mM混合有N-琥珀酰亚氨基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)和作为SPDP的二硫化物结合还原剂的二硫苏糖醇(DTT)的乙醇溶液在传感器芯片的金表面反应2小时。之后,使洗净的金表面浸渍于该溶液中30分钟,再用0.1mg/ml链亲和素PBS溶液(pH 6.4)流过20分钟,由此进行金表面的链亲和素化。
(2)制备由制备例2得到的PEG(乙缩醛-PEG-SH)修饰的金微粒,然后将金微粒溶液调节到pH 2,进行2小时的缩醛基的脱保护,转变为醛基。将溶液调节至pH 6,添加PEG的4倍量的生物胞素酰肼,一边搅拌6小时,一边使其反应(这里,PEG的4倍量是,由粒径计算金微粒的表面积,假设PEG的表面密度为0.25-0.40条/nm2。该值是由微粒的个数计算出PEG的条数所得的值。通常表面密度使用0.25。0.25的值是由PEG化金微粒的Tg计算得出的)。之后,加入NaBH4,搅拌3天。离心提纯后,用10mM-PBS(pH 6.4)置换溶剂,制成溶液。通过将具有(1)中制备的金表面的芯片浸渍于上述得到的生物素化的PEG修饰的金微粒溶液中,可使PEG修饰的金微粒固定于该表面。
(3)表面的特性
将(2)中制备的PEG修饰金微粒固定化表面在0.1mg/ml牛血清白蛋白(BSA)PBS溶液(pH 6.4)中浸渍1小时,通过SPR测定对表面的吸附量。结果,根据SPR角度变化,BSA对未处理的金表面的吸附是Δθ=0.21°,而PEG修饰金微粒固定化表面中,Δθ=0.02°。这些数据显示:PEG修饰金微粒固定化表面抑制了血液中的蛋白质BSA的非特异性吸附。
实施例2:通过采用了PEG修饰的金纳米粒子的SPR进行的测定
以下通常而言,SPR的流速通常是10μL/分钟,设定温度为25℃。另外缓冲液全部使用通过0.22μm的过滤器、然后进行脱气的缓冲液。另一流道是未固定化凝集素的对照流道。使结合于传感器芯片表面的凝集素上的金纳米粒子全部解离的再生溶液采用含有100mg/mL半乳糖的缓冲液。
A)凝集素于传感器芯片上的固定化
实验方法和结果
插入SPR传感器芯片(CM5:购自BIACORE),将磷酸缓冲溶液(pH7.4、10.15)流过SPR的流道,直至其稳定。接着注射100μl EDC(N-乙基-N’-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐)和NHS(N-羟基琥珀酰亚胺)1∶1的混合溶液,使芯片上的羧基活化。继续注射RCA120(50μg/mL、溶剂为pH 5.0的乙酸缓冲溶液),使其固定化,最后注射70μL 1M的乙醇酰胺盐酸盐,封端残余的活化NHS基。通过此时的RU与最初的RU的差,得到凝集素的固定量为5600RU(~5.6ng/mm2=2.8×10-2凝集素nm2)。
B)lac65与凝集素的特异性结合的确认(lac65是在金纳米粒子(PEG520条)上65%的PEG的末端具有乳糖的样品)
实验方法
通过用1800秒的时间注射300μL 40μg/mL的lac65,测定传感器芯片表面的凝集素与金纳米粒子的结合。之后流过缓冲液3000秒,测定金纳米粒子的解离,最后注射100mg/mL的半乳糖,使传感器芯片再生。
结果与讨论
图2表示lac65的传感器曲线图。同样浓度的游离的乳糖-PEG-S-S-PEG-乳糖几乎不使RU增加,相反,lac65得到了5200RU的增加。另外,与表面具有乳糖的胶束系比较,在结合了7000RU的凝集素的传感器芯片上注射500μg/mL的胶束,则得到了~1400RU的响应,但本实验中使用的金纳米粒子的粒径与该胶束大致相同,却以十分之一的浓度得到了4倍的响应,由此可以说金纳米粒子使响应有很大提高。得到这样大的响应的原因可以举出:其一是金纳米粒子的比重非常大,因此芯片表面的介电常数大幅上升;以及芯片的金基板与金纳米粒子的表面等离子彼此之间的相互作用。
关于接下来流过缓冲液时的解离,即使流过缓冲液也几乎未解离。因此可认为金纳米粒子与凝集素的结合非常强。
另外,lac0未确认到结合,而lac65确认有结合,以及通过加入半乳糖,响应大幅减少、即确认金纳米粒子发生解离,由此显示出金纳米粒子表层的乳糖与RCA120凝集素的特异性结合。
C)结合中配体密度的效果
实验方法
将乳糖密度0-65%的金纳米粒子(lac0、lac10、lac20、lac30、lac40、lac50、lac65)分别以40、10、1、0.1μg/mL的浓度注射300μL,测定其结合量。
结果与讨论
首先,将lac0-lac65中的浓度与响应的关系表示在图3(a)中。由此可得出乳糖密度越大,且浓度越大,RU越增加的结果。以10μg/mL的浓度注射时,lac0-lac65的传感器曲线图如图3(b)所示,配体密度与结合量(RU)的关系如图3(c)所示。这些结果表明:lac10时,凝集素与乳糖几乎未结合,lac20时确认有少许结合,进一步在这以上时,随着配体密度的增加,则促进了结合,这与UV的结果大体一致。在UV试验的讨论中,临界值为20%的理由可以考虑下述三个理由:1)凝集素过剩地存在于溶液中,粒子被凝集素封闭,2)以光谱变化的方式检测表面等离子时,需要一定程度或以上的金纳米粒子的凝集,3)多价结合,但SPR时并未发生封闭,却没有看到UV时那样表面等离子的光谱变化,因此存在临界值的原因可认为是多价结合。具体来讲,可认为配体密度大,则多个配体与凝集素结合,产生牢固的结合;而配体密度小,则如1对1的配体与凝集素的结合那样,只有少数的配体参与结合。
D)解离中的配体密度的效果
实验方法
将乳糖密度30-65%的金纳米粒子(lac30、lac40、lac50、lac65)以40μg/mL分别注射数10μL,结合约400RU的金纳米粒子。之后注射含有0.1、1μg/mL半乳糖的缓冲液,测定各半乳糖浓度下的解离量。
结果和讨论
图4(a)表示注射0.1μg/mL半乳糖时的传感器曲线图。其中可确认:随着时间的延长,lac30、lac40慢慢解离,但lac65、lac50几乎未见解离,因此配体密度与解离量的关系如图4(b)所示。由此可见40%和50%之间的显著差异。即,与lac30、lac40的解离量相比,lac50、lac65的解离量非常少。可认为这与UV实验中NIA的增加在40%和50%之间有大的差异有关联。这可能是在该配体密度下,多价结合的价数发生了变化。
另外,考虑到通过解离高敏感度地检测,则如果配体密度在30%或以下,表现为可以检测直至0.1μg/mL或以下。与此相对,如果为50%或以上,则检测界限为较之以上的浓度,在解离中,当配体密度为某种程度低时,则可更高敏感度地检测,通过详细研究配体密度的效果,也可以考虑这种应用。
制备例5:未结合末端氨基化粒子的制备
向相对于市售的金微粒溶液(5nm)为5×104倍量的乙缩醛-PEG-SH中加入NaBH4作为还原剂,反应1小时后,将与金微粒溶液同样调节至pH=6.5的所得物与金微粒溶液混合,搅拌1小时使其反应。加入1mg/ml HO-PEG-OH,保持在75℃水浴中反应2小时。对该稳定化胶体金溶液(金微粒粒径:5nm、PEG4500)进行离心分离(4℃、350000×g、40分钟)除去剩余的聚合物,然后用HCl调节至pH 2,进行乙缩醛基的脱保护(2小时)。脱保护后,用NaOH调节至pH 6,在下表2所示的条件下加入乙酸铵反应3小时。3小时后相对于PEG加入各个还原剂并搅拌。24小时后,进行离心提纯(4℃、350000×g、30分钟),再分散于超纯水中。测定ζ电势以确认末端氨基化。
表2:氨基化反应条件
  试验(RUN) 乙酸铵添加量 还原剂的种类 还原剂的添加方法
1 10mg/ml 甘油三乙酸酯   每隔2小时添加PEG的10倍量,添加3次后搅拌1天
    2     10mg/ml   硼氢化钠   添加PEG的10倍量后搅拌1天
测定结果如图5所示。图中,低pH下的ζ电势为正,表明已被氨基化。
实施例3:将金纳米粒子直接固定于SPR芯片表面,PEG末端进行生物素化的方法
准备用臭氧洗涤的金芯片(用臭氧洗涤机洗涤15分钟)。将其在1mg/ml含有另外准备的具有氨基的PEG化金纳米粒子(PEG4500粒径5nm、0.76×10-10mol/mL)的PEG-OH(2000)中浸渍(过夜)(样品1)。
装载入BiaCore3000中,流过磺基琥珀酰亚氨基D-生物素(0.1mg/ml、流速20μl/分钟)10分钟,进行PEG末端氨基的生物素化(样品2)。接着流过乙酸酐10%水溶液(流速10μl/分钟)20分钟,进行未反应氨基的乙酰化(样品3)。对上述调制的SPR传感器芯片表面进行蛋白质吸附试验。
实施例4:用SPDP将活性酯引入SPR传感器芯片表面,使具有氨基的PEG化金纳米粒子固定的方法
准备用臭氧洗涤的金芯片(用臭氧洗涤机洗涤15分钟)。将其在含有1mM SPDP和2mM DTT的乙醇溶液中浸渍30分钟。
再在1mg/ml含有另外准备的氨基化金纳米粒子(PEG4500粒径5nm、0.76×10-10mol/mL)的PEG-OH(2000)中浸渍(过夜)(样品4)。
装载入BiaCore3000中,流过磺基琥珀酰亚氨基D-生物素(0.1mg/ml、流速20ml/分钟)10分钟,进行PEG末端氨基的生物素化(样品5)。接着流过乙酸酐10%水溶液(流速10μl/分钟)20分钟,进行未反应氨基的乙酰化(样品6)。对上述调制的SPR传感器芯片表面进行蛋白质吸附试验。
结果如图6所示。图6中的Run1是采用样品1的结果,Run2是采用乙缩醛-PEG金纳米粒子代替样品1的结果,Run3是采用样品4的结果,Run4是采用乙缩醛-PEG金纳米粒子代替样品4的结果。由图6可知:具有氨基的PEG化金纳米粒子在SPR传感器芯片表面的担载量大。
另外,调制各表面时,各阶段的响应变化的情况如下表3所示
表3:各顺次阶段下的响应变化情况
通过直接吸附的固定化1-(1)(×10-40) 通过SPDP的固定化1-(2)(×10-40)
    SPDP导致的变化量     -     2800
    金微粒导致的变化量     5500     2980
活性酯生物素导致的变化量     397     949
    乙酸酐导致的变化量     390     158
通过使金芯片表面直接浸渍于氨基化金纳米粒子而调制的直接吸附产生的表面(1)中,观察到的特异、非特异吸附结果如图7所示。图7中,最上边的线是链亲和素,中间的线是BSA(氨基残余状态)、最下边的线是BSA的吸附,柱状图由左至右依次为使链亲和素吸附于样品1,使BSA吸附于样品2,使BSA吸附于样品3的试验结果。
另外,利用SPDP将氨基化金纳米粒子固定于金芯片表面得到的表面(2)中,观察到的特异、非特异吸附的结果如图8所示。
由图7和图8可知:在图8通过SPDP固定化的表面(2)中,观察到与链亲和素的特异性吸附更多。而至今为止调制的使用生物素化金微粒的表面中,即使观察到BSA与链亲和素的吸附,也未观察到称得上特异·非特异这么大的差异,与此相对,图8中则可以确认有2500(×10-40)和9(×10-40)这样大的差异。
产业实用性
本发明提供:在检测生物学流体中的待测物时,抑制杂质蛋白质等的非特异性吸附,且具有高敏感度的生物测定用的传感器系统。从而可在各种诊断仪器的制造业、以及诊断业上利用本发明。

Claims (15)

1.用于生物测定的生物传感器系统,该系统包括(A)和(B)的套组:
(A)结构式I:
(X-W2-PEG-W1-L)x-PCL-(L-W1-PEG-W2-Y)y          (I)
表示的聚乙二醇修饰纳米粒子,
式中,PCL表示自由电子金属微粒、金属氧化物微粒或半导体微粒,
X表示可与生物传感器芯片表面结合的官能团或功能性部分,
Y表示一种或以上选自C1-C6烷基、可用于形成X官能团或功能性部分的可被保护的官能团、和与X相同或不同的功能性部分的基团或部分,
L表示与PCL结合的基团或结合部分,
W1和W2表示单键或相同或不同的连接基团,
PEG表示环氧乙烷单元:(-CH2CH2O-)n(其中n为5-10,000的任意的整数);
其中,(X-W2-PEG-W1-L)x与(L-W1-PEG-W2-Y)y中的W2-PEG-W1-L可以相同也可以不同,并且
x和y各自独立表示1或以上的整数,且合在一起表示在水性介质中使PEG链足够覆盖PCL表面的整数,和
(B)生物传感器芯片,该生物传感器芯片具有经由X可结合(A)粒子、且由玻璃或担当PCL材料的材料构成的表面。
2.权利要求1的生物传感器系统,其中通过(A)粒子与(B)生物传感器芯片表面经由X结合,按使得(A)粒子基本上覆盖(B)生物传感器芯片的一个表面的一部分区域或全部区域的方式进行担载。
3.权利要求1的生物传感器系统,(A)粒子与(B)生物传感器芯片表面以可以相互结合,或为了在水性介质中通过待测物的竞争作用被待测物置换而结合的状态使用。
4.权利要求1的生物传感器系统,其中,结构式I中的-L-表示
HS-(CH2)p-、
Figure A038077860003C1
所示的基团,其中,p独立表示2-12的任意的整数,R1、R2和R3独立表示C1-C6的烷基,m表示2-100的任意的整数,
W1和W2独立表示选自单键、C1-C6亚烷基、-COO-(经由氧原子与环氧乙烷单元的亚甲基结合)、-O-、-S-、-(C1-C6亚烷基)-COO-、-(C1-C6亚烷基)-O-和-(C1-C6亚烷基)-S-的基团。
5.  权利要求1的生物传感器系统,其中(A)粒子中结构式I的X是形成生物学特异性结合对的一个成员的残基,(B)传感器芯片具有与形成结构式I的PCL的材料相应的材料制的薄膜表面,而且将与形成生物学特异性结合对的一个成员X相对应的另一个成员直接或至少经由C1-C6亚烷基或(-CH2CH2O-)n(其中n为5-10,000的任意的整数)担载于该表面上。
6.权利要求1的生物传感器系统,其中(A)粒子中结构式I的X表示
HS-(CH2)p-、H2N-(CH2)p-或
Figure A038077860003C3
所示的基团,其中,p独立表示2-12的任意的整数,R1、R2和R3独立表示C1-C6烷基,(B)传感器芯片具有由任意的形成结构式I的PCL的材料制造的薄膜表面、或玻璃表面,而且(A)粒子与(B)的表面经由X官能团结合,不过当(B)的表面为玻璃制时,X具有三烷氧基甲硅烷基。
7.权利要求5的生物传感器系统,其中(A)粒子的结构式I中的Y是下式
或-COOH
所示的基团,其中,Ra独立表示氢原子或C1-C6烷基,Rb独立表示C1-C6烷氧基或两个Rb一起表示形成可被氧或C1-C6烷基取代的亚乙基的原子团。
8.权利要求1的生物传感器系统,其中(A)粒子的结构式(I)中的x+y是每1nm2相当于0.1-0.5的任意的整数。
9.权利要求1的生物传感器系统,其中(A)粒子中的PCL具有5-500nm的平均横截面长度。
10.聚乙二醇修饰纳米粒子,它是结构式I:
(X-W2-PEG-W1-L)x-PCL-(L-W1-PEG-W2-Y)y            (I)
式中,PCL表示自由电子金属微粒、金属氧化物微粒或半导体微粒,
X表示可与生物传感器芯片表面结合的官能团或功能性部分,
Y表示一种或以上选自C1-C6烷基、可用于形成X官能团或功能性部分的可被保护的官能团、和与X相同或不同的功能性部分的基团或部分,
L表示与PCL结合的基团或结合部分,
W1和W2表示单键或相同或不同的连接基团,
PEG表示环氧乙烷单元:(-CH2CH2O-)n(其中n为5-10,000的任意的整数);
其中,(X-W2-PEG-W1-L)x与(L-W1-PEG-W2-Y)y中的W2-PEG-W1-L可以相同也可以不同,X是形成生物学特异性结合对的一个成员的残基,Y是形成生物学特异性结合对的残基以外的基团,
L表示下式
HS-(CH2)p-、
Figure A038077860005C1
Figure A038077860005C2
所示的基团,其中,p表示2-12的任意的整数,R1、R2和R3各自独立表示C1-C6烷基,m表示2-100的任意的整数,
而且x+y为每1nm2 PCL表面相当于0.1-0.5的任意的数,(x/x+y)×100为1-99的整数,PCL的横截面的平均尺寸为5-500nm。
11.权利要求10的聚乙二醇化纳米粒子,其中形成生物学特异性结合对的一个成员X是来自选自单糖或寡糖、抗原或半抗原、底物、激素和寡核苷酸的物质的残基。
12.生物学流体中待测物的检测方法,该方法包括:
(a)准备权利要求10的聚乙二醇修饰纳米粒子,
(b)准备生物传感器芯片,该生物传感器芯片具有与该纳米粒子的PCL材料相应的薄膜表面,具有直接或至少经由C1-C6亚烷基或(-CH2CH2O-)n(其中n为5-10,000的任意的整数)担载了与该纳米粒子的生物学特异性结合对的一个成员X相对应的另一个成员的表面,
(c)使(A)粒子和(B)生物传感器芯片与被怀疑含有可形成该生物学特异性结合的构成成员中的任意一个成员作为待测物的生物学流体接触,
(d)确定因待测物的竞争作用导致的(A)粒子与(B)生物传感器芯片表面的结合程度的变化,
(e)以该变化作为生物学流体中待测物浓度的指标。
13.权利要求12的检测方法,其中步骤(d)的(A)粒子与(B)生物传感器芯片的结合程度的变化通过表面等离子共振光谱的变化检测。
14.权利要求12的检测方法,其中可形成生物学特异性结合对的构成成员选自糖和与其对应的凝集素、抗原或半抗原和与其对应的抗体、底物和与其对应的酶、激素和与其对应的受体蛋白、寡核苷酸和含有其互补链序列的寡核苷酸或多核苷酸。
15.权利要求12的检测方法,其中(A)粒子与(B)生物传感器芯片表面形成生物学特异性结合对而预先结合。
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