CN100429503C - 利用纳米金颗粒催化增长提高表面等离子体共振传感器灵敏度的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种利用纳米金颗粒催化增长提高表面等离子体共振传感器灵敏度的方法，它是在表面等离子体共振传感器的金属薄膜表面包被一层20～35nm厚的二氧化硅SiO2薄层，利用纳米金颗粒催化增长增强了表面等离子体共振信号，提高了表面等离子体共振SPR传感器的灵敏度。本发明使纳米金颗粒催化增长可以应用于表面等离子体共振(SPR)传感器，在纳米金颗粒催化增长的过程中，金或者银的离子被催化还原沉积在纳米金颗粒表面的同时，不会被沉积在金属薄膜表面而引起背景增高。该方法简单易行、成本低、灵敏度高。
Description
技术领域
本发明属于提高生物传感器灵敏度的方法，具体涉及一种利用纳米金颗粒催化增长来提高表面等离子体共振(Surface Plsamon Resonance，简写为SPR)传感器灵敏度的方法。
背景技术
纳米金颗粒是指粒径在1～100nm之间的金颗粒。常以金颗粒分散在水中所形成的金溶胶进行应用，故又称胶体金。纳米金颗粒是属于介观粒子，具有特殊的电子结构，表现出许多独特的光学与电学性质，在材料科学、临床医学、生命科学等领域均获得广泛的应用。例如，在阵列芯片中利用不同尺寸的纳米金颗粒实现多色标记；又如，利用纳米金颗粒间距离的变化对吸收波长的影响，建立了检测特定寡聚多核苷酸序列的光学方法。
溶液中金或者银的离子被还原后沉积在纳米金颗粒的表面，使纳米金颗粒长大，这一过程被称为纳米金颗粒催化增长。纳米金颗粒生长过程中，其光学性质或者电学性质将随着尺寸的变化而变化。近年来，这一性质已经被应用于提高仪器分析方法的灵敏度，如石英晶体微天平(QCM)、表面拉曼散射(SERS)、扫描比色法、吸收光谱法、电容测量法等等。另外，利用纳米金颗粒催化增长还可对酶反应中的酶以及相关底物进行定量的测定。
表面等离子体共振(Surface Plasmon Resonance，SPR)是一种表面物理光学现象。当p偏振光在玻璃与金属薄膜界面处发生全内反射时，渗透到金属薄膜内的消失波引发金属中的自由电子产生表面等离子体，当表面等离子体与消失波的频率相等时，二者将发生共振，界面处的全反射条件将被破坏，呈现衰减全内反射现象，入射光被金属表面电子吸收，使反射光能量急剧下降。当入射光波长固定时，反射光强度是入射角的函数，其中反射光强度最低时所对应的入射角称为共振角；反之，当入射光角度固定时，反射光强度最低时所对应的入射波长称为共振波长。基于这一原理发展起来的表面等离子体共振(SPR)传感技术对附着在金属薄膜表面的介质折射率非常敏感，当表面介质的属性改变或者附着量改变时，共振角或共振波长将不同。因此，SPR信号(即共振角或共振波长)的变化能够反映与金属膜表面接触的体系的变化。表面等离子体共振(SPR)传感技术能够灵敏地反映金属薄膜(通常为金膜或者银膜)表面附着物的变化。不过一些重要的应用方面，如疾病的早期诊断，还需要进一步提高表面等离子体共振(SPR)传感技术的灵敏度。
虽然纳米金颗粒催化增长已经被用于提高很多仪器分析方法的灵敏度，但是在表面等离子体共振(SPR)传感技术中还没有得到应用。其原因：根据表面等离子体共振(SPR)传感技术的原理，金属薄膜是表面等离子体共振(SPR)传感器的关键元件之一。在纳米金颗粒催化增长的过程中，金或者银的离子被催化还原沉积在纳米金颗粒表面的同时，也会被沉积在金属薄膜表面，引起背景增高，难以将有效的信号从背景中提取出来。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是克服上述现有技术的缺陷，提供一种简单易行、成本低、灵敏度高的利用纳米金颗粒催化增长提高表面等离子体共振(SPR)传感器灵敏度的方法。
为解决上述技术问题，本发明采用下述技术方案。一种利用纳米金颗粒催化增长提高表面等离子体共振传感器灵敏度的方法，其特征在于该方法是在表面等离子体共振传感器的金属薄膜表面包被一层20～35nm厚的二氧化硅(SiO2)薄层，利用纳米金颗粒催化增长增强表面等离子体共振信号，提高了表面等离子体共振(Surface PlasmonResonance，简写为SPR)传感器的灵敏度。
作为本发明的进一步改进，其具体步骤为：采用真空镀膜的方法，在金膜的表面蒸发或者溅射一层20-35nm厚的二氧化硅(SiO2)薄层，该由二氧化硅(SiO2)薄层包被的金膜作为表面等离子体共振(SPR)传感器的金属薄膜；通过物理吸附的方法，在二氧化硅(SiO2)薄层包被的金膜表面吸附生物素化的牛血清白蛋白(BSA)，再加入亲和素与生物素化的牛血清白蛋白(BSA)结合，得到表面富含亲和素的二氧化硅(SiO2)薄层包被的金膜；通过生物素-亲和素之间的结合，将生物素标记的DNA探针A固定在富含亲和素的表面等离子体共振(SPR)传感器的金属薄膜表面，然后通过杂交捕获目标DNA，再加入过量的采用巯基标记的DNA探针B修饰的粒径为10～20nm的纳米金颗粒，进行充分杂交，使纳米金颗粒固定在金属薄膜表面；再加入氯金酸和能还原氯金酸的还原剂的混合溶液，处理时间10分钟-1小时，使纳米金颗粒催化增长，利用纳米金颗粒催化增长增强表面等离子体共振信号，提高了表面等离子体共振(SPR)传感器的灵敏度。
所述氯金酸和能还原氯金酸的还原剂的混合溶液可为：1.8×10-4mol/L的氯金酸HAuCl4和2×10-4mol/L的还原剂还原型辅酶NADH的混合溶液。
本发明采用二氧化硅(SiO2)薄层包被的金膜作为表面等离子体共振(SPR)传感器的金属薄膜，使纳米金颗粒催化增长可以应用于表面等离子体共振(SPR)传感器，提高了表面等离子体共振(SPR)传感器的灵敏度，在纳米金颗粒催化增长的过程中，金或者银的离子被催化还原沉积在纳米金颗粒表面的同时，不会被沉积在金属薄膜表面而引起背景增高。该方法简单易行、成本低、灵敏度高。当纳米金颗粒催化增长以后，可用变性剂(体积比浓度为70％甲酰胺溶液或者90℃热水)使采用了二氧化硅(SiO2)薄层包被金膜的表面等离子体共振(SPR)传感器再生。
附图说明
图1为氯金酸(HAuCl4)和还原剂还原型辅酶(NADH)的混合溶液对二氧化硅(SiO2)薄层包被的金膜的影响；
图2为利用纳米金颗粒催化增长提高表面等离子体共振传感器灵敏度的方法原理示意图；
图3为利用纳米金颗粒催化增长检测33nmol/L目标DNA的SPR光谱图；
图4为利用纳米金颗粒催化增长检测系列浓度的目标DNA的SPR光谱图。
图中各标号表示：
1、金膜
2、(SiO2)薄层
3、生物素标记的DNA探针A
4、目标DNA
5、巯基标记DNA探针B修饰的纳米金颗粒
51、巯基标记的DNA探针B
52、纳米金颗粒
6、1.8×10-4mol/L氯金酸(HAuCl4)和2×10-4mol/L的还原剂还原型辅酶(NADH)的混合溶液
7、催化增长的纳米金颗粒
具体实施方式
下面以检测DNA的表面等离子体共振(SPR)传感器为例，在该传感器中利用纳米金颗粒催化增长来提高灵敏度。其中，该SPR传感器是基于波长变化的，响应信号是共振波长λ1的位移。对检测同一浓度的目标DNA而言，共振波长位移值越大说明该DNA传感器的灵敏度越高。
采用真空镀膜的方法，在金膜1(参见图2)表面蒸发或者溅射一层25nm厚的二氧化硅(SiO2)薄层2，并将该二氧化硅(SiO2)薄层2包被的金膜1作为表面等离子体共振(SPR)传感器的金属薄膜。采用6×SSC(pH 7.0)作为缓冲溶液，该6×SSC是由0.9mol/L氯化纳和0.09mol/L柠檬酸钠组成，并用浓度为0.1mol/L盐酸调节该溶液的pH为7.0。用表面等离子体共振(SPR)传感器记录此时的共振曲线，如图1中曲线a，该共振波长为λa。然后加入1.8×10-4mol/L氯金酸(HAuCl4)和2×10-4mol/L的还原剂还原型辅酶(NADH)的混合溶液6，处理0.5小时，再用缓冲溶液反复冲洗。用表面等离子体共振(SPR)传感器记录此时的共振曲线，如图1中曲线b，该共振波长为λb。可以发现共振波长λa和λb基本没有变化，共振波长位移Δλ(b-a)＝λb-λa为0。这说明该二氧化硅(SiO2)薄层可以有效地防止氯金酸(HAuCl4)和还原剂还原型辅酶(NADH)的混合溶液在基底表面沉积一层金，从而避免了背景升高。
实施例一：
利用纳米金催化增长增强的表面等离子体共振(SPR)传感器检测33nmol/L目标DNA。
如图2所示，本发明的具体步骤为：
1)在金膜1表面蒸发或者溅射一层25nm厚的二氧化硅(SiO2)薄层2，采用被二氧化硅(SiO2)薄层2包被的金膜1作为表面等离子体共振(SPR)传感器的金属薄膜，用表面等离子体共振(SPR)传感器监测以下反应过程。
2)通过物理吸附的方法，在二氧化硅(SiO2)薄层2包被的金膜1表面吸附生物素化的牛血清白蛋白(BSA)，再加入亲和素与生物素化的牛血清白蛋白(BSA)结合，得到表面富含亲和素的二氧化硅(SiO2)薄层包被的金膜；通过生物素-亲和素之间的结合，将生物素标记的DNA探针A3固定在富含亲和素的表面等离子体共振(SPR)传感器的金属薄膜(二氧化硅(SiO2)薄层2包被的金膜1)表面。采用6×SSC(pH 7.0)作为缓冲溶液，该6×SSC由0.9mol/L氯化纳和0.09mol/L柠檬酸钠组成，并用浓度为0.1mol/L盐酸调节该溶液的pH为7.0。用表面等离子体共振(SPR)传感器记录以上生物素标记的DNA探针A3固定在二氧化硅(SiO2)薄层2包被的金膜1表面之后的SPR光谱如图3中曲线a，共振波长为λa，以下反应引起的共振波长位移均以λa作为参比而得。然后加入33nmol/L目标DNA4进行杂交，再加入过量的经巯基标记的DNA探针B51修饰的纳米金颗粒52(粒径为12±1nm)进行杂交，反应0.5小时之后，纳米金颗粒52以及目标DNA4通过杂交就固定在二氧化硅(SiO2)薄层2包被的金膜1表面，引起SPR光谱向长波方向移动，如图3所示，由曲线a变化至曲线b，共振波长由λa变化为λb，且λb大于λa，共振波长位移Δλ(b-a)为5.1±0.1nm(Δλ(b-a)＝λb-λa)；。在该基础上，再加入氯金酸和能还原氯金酸的还原剂的混合溶液：1.8×10-4mol/L的氯金酸(HAuCl4)和2×10-4mol/L的还原剂还原型辅酶(NADH)的混合溶液6反应0.5小时并用缓冲溶液冲洗，用表面等离子体共振(SPR)传感器记录此时SPR光谱，发现由于固定在金膜1表面的纳米金颗粒52被催化增长，成为催化增长的纳米金颗粒7，使得SPR光谱继续向长波方向移动，由曲线b变化至曲线c，共振波长由λb变化为λc，且λc远大于λa，共振波长位移Δλ(c-a)为12.4±0.1nm(Δλ(c-a)＝λc-λa)，从图3可以看出，Δλ(c-a)大于Δλ(b-a)，说明对33nmol/L目标DNA4而言，由于加入了1.8×10-4mol/L氯金酸(HAuCl4)和还原剂2×10-4mol/L还原型辅酶(NADH)的混合溶液，共振波长位移明显增大，响应信号增强，即提高了该传感器的灵敏度。
当纳米金颗粒催化增长以后，用体积比浓度为70％的甲酰胺溶液再生，可以使SPR光谱朝短波方向移动，即从曲线c蓝移至曲线d，共振波长变为λd。比较曲线d和曲线a的共振波长λd和λa，可以发现共振波长位移Δλ(d-a) ＝λd-λa为0，说明采用了二氧化硅(SiO2)薄层2包被的金膜1的表面等离子体共振(SPR)传感器可以再生。
实施例二：
利用纳米金催化增长增强的表面等离子体共振(SPR)传感器检测不同浓度的目标DNA。
具体步骤为：
1)、采用真空镀膜的方法，在金膜1(参见图2)表面蒸发或者溅射一层25nm厚的二氧化硅(SiO2)薄层2，该由二氧化硅SiO2薄层包被的金膜1作为表面等离子体共振SPR传感器的金属薄膜。
2)、通过物理吸附的方法，在二氧化硅(SiO2)薄层2包被的金膜1表面吸附生物素化的牛血清白蛋白(BSA)，再加入亲和素与生物素化的牛血清白蛋白(BSA)结合，得到表面富含亲和素的二氧化硅(SiO2)薄层包被的金膜；通过生物素-亲和素之间的结合，将生物素标记的DNA探针A3固定在富含亲和素的表面等离子体共振(SPR)传感器的金属薄膜(二氧化硅(SiO2)薄层2包被的金膜1)表面。采用6×SSC(pH 7.0)作为缓冲溶液，该6×SSC由0.9mol/L氯化纳和0.09mol/L柠檬酸钠组成，并用浓度为0.1mol/L盐酸调节该溶液的pH为7.0。用表面等离子体共振(SPR)传感器记录此时共振波长为λ0，以下反应引起的共振波长位移均以λ0作为参比而得到的；然后加入5.5×10-3～33nmol/L范围内不同浓度的目标DNA4和过量的巯基标记的DNA探针B51修饰的纳米金颗粒52(粒径为12±1nm)进行反应0.5小时之后，纳米金颗粒52以及目标DNA4通过杂交就固定在金膜1表面，引起SPR光谱向长波方向移动，不同浓度的目标DNA4杂交对应不同的共振波长位移，见图4中曲线a。在该基础上，加入1.8×10-4mol/L的氯金酸(HAuCl4)和2×10-4mol/L的还原剂还原型辅酶(NADH)的混合溶液6反应0.5小时并用缓冲溶液冲洗，用表面等离子体共振(SPR)传感器记录此时SPR光谱，发现由于固定在金膜1表面的纳米金颗粒52被催化增长，使SPR光谱继续向长波方向移动，此时不同浓度的目标DNA4对应的共振波长位移见图4中曲线b。从图4可以看出，对同一浓度的目标DNA而言，加入了1.8×10-4mol/L氯金酸(HAuCl4)和还原剂2×1-4mol/L还原型辅酶(NADH)的混合溶液使固定在金膜1表面的纳米金颗粒52催化增长之后，共振波长位移明显增大，响应信号增强，提高了表面等离子体共振(SPR)传感器的灵敏度。
Claims (3)
1、一种利用纳米金颗粒催化增长提高表面等离子体共振传感器灵敏度的方法，其特征在于该方法是在表面等离子体共振传感器的金属薄膜表面包被一层20-35nm厚的二氧化硅薄层，利用纳米金颗粒催化增长增强表面等离子体共振信号，提高了表面等离子体共振传感器的灵敏度。
2、根据权利要求1所述的利用纳米金颗粒催化增长提高表面等离子体共振传感器灵敏度的方法，其特征在于其具体步骤为：采用真空镀膜的方法，在金膜的表面蒸发或者溅射一层20-35nm厚的二氧化硅薄层，该由二氧化硅薄层包被的金膜作为表面等离子体共振传感器的金属薄膜；通过物理吸附的方法，在二氧化硅薄层包被的金膜表面吸附生物素化的牛血清白蛋白，再加入亲和素与生物素化的牛血清白蛋白结合，得到表面富含亲和素的二氧化硅薄层包被的金膜；通过生物素-亲和素之间的结合，将生物素标记的DNA探针A固定在富含亲和素的表面等离子体共振传感器的金属薄膜表面，然后通过杂交捕获目标DNA，再加入过量的采用巯基标记的DNA探针B修饰的粒径为10～20nm的纳米金颗粒，进行充分杂交，使纳米金颗粒固定在金属薄膜表面；再加入氯金酸和能还原氯金酸的还原剂的混合溶液，处理时间10分钟-1小时，使纳米金颗粒催化增长，利用纳米金颗粒催化增长增强表面等离子体共振信号，提高了表面等离子体共振传感器的灵敏度。
3、根据权利要求2所述的利用纳米金颗粒催化增长提高表面等离子体共振传感器灵敏度的方法，其特征在于所述氯金酸和能还原氯金酸的还原剂的混合溶液为：1.8×10-4mol/L的氯金酸HAuCl4和2×10-4mol/L的还原剂还原型辅酶NADH的混合溶液。
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