CN102133519B

CN102133519B - 限进手性色谱固定相材料及其制备方法

Info

Publication number: CN102133519B
Application number: CN2010105605089A
Authority: CN
Inventors: 董襄朝; 王怀松
Original assignee: Nankai University
Current assignee: Nankai University
Priority date: 2010-11-25
Filing date: 2010-11-25
Publication date: 2012-11-14
Anticipated expiration: 2030-11-25
Also published as: CN102133519A

Abstract

本发明涉及一种限进手性色谱固定相材料及其制备方法。应用原子转移自由基聚合法和点击化学方法，以含叠氮基的烯类化合物为单体，在硅胶表面进行嵌段聚合，制备了内层为键合环糊精的手性分离层，外层可以排阻蛋白的限进手性分离材料。本发明是具有多层结构及混合功能的新型限进材料，可以作为固定相，应用于含蛋白的样品直接色谱进样测定，并同时进行手性分离。作为手性样品分析的新材料，其应用可免去生物样品分析中的沉淀蛋白的前处理过程，提高分析效率及准确性。

Description

限进手性色谱固定相材料及其制备方法

技术领域

本发明属于新型色谱分离材料的合成，特别是一种限进手性色谱固定相材料及其制备方法。采用原子转移自由基聚合和点击化学方法制备这种多功能分离材料可应用于生物或环境样品中手性化合物的分离分析。

背景技术

生物样品分析是液相色谱的重要应用领域。在生物样品的分析中，样品中蛋白质在与固定相接触后很容易发生变性并吸附在色谱柱上，导致柱性能很快下降、柱子堵塞，成为生物样品分析的严重问题。为了避免蛋白在色谱柱上的沉淀，需要在色谱分析前进行沉降蛋白的前处理(例如加入有机溶剂、酸或盐)，这些前处理过程影响了分析效率，也成为准确性和精密度偏低的重要原因。限进材料(Restricted Access Material，或称为限进介质，Restricted Access Media，RAM)是20世纪80年代末开始研究开发的一类用于含有蛋白的生物样品直接进样分析的色谱固定相。这种固定相利用孔径对于大分子进行排阻，或利用高分子化学链的空间位阻使大分子物质如蛋白质不能渗透进入固定相的内层，另外，大分子屏蔽层具有生物相容性，不会导致蛋白沉淀，因此蛋白会在前沿流出。而固定相的内层为小分子结合层，小分子物质如药物可以进入内层，通过疏水、离子交换或其它亲和作用力与固定相材料结合，实现对小分子的分离。这类色谱固定相填料已经被用于生物和环境样品分析中的固相提取或直接进样药物分析，在医药研究及环境样品分析中起到了重要作用。但是可以进行手性分离的限进材料尚未见商品化。

近年来，有少量文献报道了限进手性分离材料的研究工作。Felix等(Chromatographia，2007，66，159)合成了牛血清蛋白包覆β-环糊精键合硅胶手性限进介质。β-环糊精(β-CD)与对硝基苯基氯甲酸酯反应后，与氨丙基修饰的硅球微球反应，得到键合β-CD的硅球微球。将牛血清蛋白磷酸盐缓冲溶液打入到装有键合β-CD的硅球微球的色谱柱中，使其变性后吸附于硅球表面，得到以牛血清蛋白为排阻层的限进材料。Gasparrini等(J.Chromatogr.A，2008，1191，205)以“grafting onto”方法将硅球微球表面直接包覆一层亲水性的聚乙烯醇，作为限进材料。然后将抗生素类药物替考拉宁或其苷类衍生物键合到硅球微球内表面上，进行了含有牛血清蛋白的溶液中几种手性药物分离实验。

发明内容

本发明的目的是提供一种限进手性色谱固定相材料及其制备方法。本发明应用原子转移自由基聚合(atom transfer radical polymerization，简称ATRP)法，以含叠氮基的烯类化合物和甲基丙烯酸缩水甘油酯为单体，在硅胶微球表面进行嵌段聚合，并通过点击化学方法在内层键合环糊精，制备了限进手性分离材料。合成采用“grafting from”方法接枝聚合物，使接枝层更为均匀，避免了物理吸附不牢固的缺点。新型限进手性分离材料的表面具有双化学结构层，内层为具有手性分离能力的β-环糊精键合层，外层为亲水性蛋白屏蔽层。这种具有多层结构及混合功能的限进材料可以作为固定相(简称限进固定相，RestrictedAccess Stationary Phase，RAST)，应用于含蛋白样品的直接色谱进样测定，同时进行手性分离。作为用于生物样品中手性分析的新材料，其应用可减少样品前处理步骤及由此带来的损失，提高生物样品的手性分析效率及准确性。

本发明提供的一种限进手性色谱固定相材料具有如下结构：

在红外光谱中，与硅胶表面接枝聚甲基丙烯酸甲基丁炔醇酯产物(简称pMBMA-sil)相比，接枝环糊精的手性分离材料(简称CD-sil)在位于2010cm^-1处的C≡C伸缩振动的吸收峰的减小，可确定C≡C与叠氮单取代的β-CD[mono-(6-deoxy-6-azido)-β-CD]的反应；与接枝环糊精的手性分离材料(简称CD-sil)相比，限进手性分离材料(CD-RAM)在1724cm^-1和2957cm^-1处分别为羰基和C-H伸缩振动的吸收峰的增加，可确定手性分离材料(简称CD-sil)已成功接枝聚(丙三醇单甲基丙烯酸酯)。

本发明提供的限进手性分离材料的制备方法是经过如下步骤：

本发明提供的限进手性分离材料的制备方法是具体经过如下步骤：

1)室温和在三乙胺存在下，二氯甲烷为溶剂甲基丁炔醇与甲基丙烯酰氯搅拌反应，分别用1％HCl、饱和碳酸氢钠溶液和水洗，有机相干燥、过滤，减压蒸馏得到甲基丙烯酸甲基丁炔醇酯(2-methyl-3-butyn-2-ol methacrylate，简称MBMA)；

2)甲苯溶液中，用盐酸水活化的多孔硅胶微球与(3-(2-溴异丁酰基)丙基)三乙氧基硅烷于N₂气中70-95℃加热回流反应8-12小时，冷却，抽滤，依次用乙醇和丙酮洗涤产物，干燥，得到表面接枝ATRP引发剂的硅胶(简称Br-sil)；

3)室温下环己酮为溶剂，2，2’-联吡啶和CuBr存在和N₂保护下，甲基丙烯酸甲基丁炔醇酯为单体，在Br-sil表面进行ATRP接枝聚合反应2-6小时，加入无水乙醇中止反应，分别用乙二胺四乙酸二钠饱和溶液、乙醇和丙酮洗涤产物，得到硅胶表面接枝聚(甲基丙烯酸甲基丁炔醇酯)产物，简称pMBMA-sil；

4)N，N-二甲基甲酰胺为溶剂，2，2’-联吡啶和CuBr存在下，pMBMA-sil与叠氮单取代的β-环糊精[mono-(6-deoxy-6-azido)-β-CD]在N₂保护下60-80℃下反应25-35小时。反应完成后，用乙二胺四乙酸二钠饱和溶液洗去吸附在硅球表面的铜离子，再用乙醇和丙酮洗去未反应物，得到以点击化学法键合环糊精的手性分离材料(简称CD-sil)；

5)环己酮为溶剂和N₂保护，2，2’-联吡啶，CuBr和2-溴异丁酰溴(2-bromoisobutyrylbromide简称BIBB)存在下，甲基丙烯酸缩水甘油酯(简称GMA)为单体，在CD-sil表面进行ATRP接枝聚合，室温反应2-6小时，用乙二胺四乙酸二钠饱和溶液洗去吸附在硅胶表面的铜离子，然后将其加入稀硫酸中40-60℃搅拌反应6-10小时，使聚甲基丙烯酸缩水甘油酯上的环氧基水解开环，反应完毕，用蒸馏水洗涤至中性，再用甲醇洗3次，45-50℃真空干燥，从而制得内层键合β-环糊精、外层为聚(丙三醇单甲基丙烯酸酯)的有机-无机复合限进材料(简称CD-RAM)。

步骤3)所述的ATRP引发剂、溴化亚铜、2，2’联吡啶和甲基丙烯酸甲基丁炔醇酯的摩尔比为：1∶4∶8∶200。

步骤5)所述的ATRP引发剂：CuBr∶2，2’-联吡啶∶GMA∶BIBB＝1∶4∶8∶600∶6(摩尔数之比)；所述的稀硫酸浓度为0.1摩尔/升。

本发明提供的一种具有多层结构及混合功能的限进手性色谱固定相材料，这种限进材料作为固定相，可以应用于含蛋白的样品直接色谱进样测定，同时进行手性分离。作为样品分析的新材料，可减少样品前处理步骤中例如沉淀蛋白的前处理及由此带来的损失，提高生物样品手性分析效率及准确性。

附图说明

图1、图2、图3和图4分别为扑尔敏、扁桃酸、氯噻酮和安息香在手性分离材料(CD-sil)上的分离色谱图。

图5和图6分别为人血浆样品中氯噻酮和扁桃酸在限进手性分离材料(CD-RAM)上的色谱分离图。

图7分别为pMBMA-sil(a)，CD-sil(b)和CD-RAM(c)的傅立叶变换红外光谱谱图(KBr)。

具体实施方式

实施例1.

1.甲基丙烯酸甲基丁炔醇酯的合成

甲基丁炔醇(21.0毫升，217毫摩尔)，三乙胺(29.8毫升，207毫摩尔)溶于干燥的二氯甲烷(120毫升)搅拌，把溶液放到冰水浴中降至0℃，滴加甲基丙烯酰氯(20.0毫升，207毫摩尔)，反应0.5小时后，室温搅拌20小时。溶液分别用1％HCl(重量百分比浓度)、饱和碳酸氢钠溶液和水洗两次，有机相用无水硫酸镁干燥、过滤，减压蒸馏得到甲基丙烯酸甲基丁炔醇酯(简称MBMA)，产率74％。

2.在硅球表面接枝ATRP引发剂

基质硅胶的预处理：将多孔硅胶微球(粒径10μm，孔径

)6.0克加入到盐酸/水(1∶1，V/V)溶液中，搅拌回流12小时后过滤，用蒸馏水洗至中性，再用丙酮洗涤，120℃真空干燥5小时，保存备用。

硅胶表面接枝ATRP引发剂步骤如下：取3.3克经活化干燥的硅胶微球，加入30毫升干燥甲苯，搅拌下加入20微升(3-(2-溴异丁酰基)丙基)三乙氧基硅烷，于N₂气中90℃加热回流，反应10小时，冷却，抽滤，依次用乙醇和丙酮洗涤，50℃下真空干燥，得到表面接枝ATRP引发剂的硅胶(简称Br-sil)，通过氧瓶燃烧-离子色谱法测定Br-sil中溴在硅胶表面接枝密度为0.034μmol/m²。

实施例2

1.在硅胶表面引发ATRP，接枝聚(甲基丙烯酸甲基丁炔醇酯)(产物简称pMBMA-sil)

称取实施例1制备的Br-sil 2.1克加入圆底三口烧瓶中，加入甲基丙烯酸甲基丁炔醇酯0.83毫升(5.49毫摩尔)和环己酮30毫升，通N₂10分钟后，加入2，2’-联吡啶0.0343克(0.22毫摩尔)和CuBr 0.0158克(0.11毫摩尔)，N₂保护下室温反应4小时。反应完成后，将反应溶液倾入乙醇中，停止聚合反应，用饱和乙二胺四乙酸二钠水溶液洗去吸附在硅球表面的铜离子，再用乙醇和丙酮洗去未反应物，真空干燥，得到pMBMA-sil，根据元素分析结果碳含量增加值计算得到接枝pMBMA的重复单元数n为4.0。

2.点击化学法在pMBMA-sil表面键合β-CD

β-CD(10.0克，8.8毫摩尔)溶于90毫升0.3摩尔/升的NaOH水溶液中，室温下，缓慢滴加含对甲苯磺酰氯(1.67克，8.8毫摩尔)的乙腈(5毫升)溶液，搅拌反应2小时后，向混合溶液中再加入对甲苯磺酰氯(1.67克，8.8毫摩尔)，反应3小时后过滤，滤液用10％HCl调pH至7，溶液置0-5℃下出现大量白色沉淀，收集沉淀，在水中重结晶，真空干燥后得白色粉末状的产物对甲苯磺酰单取代的β-环糊精[mono-6-deoxy-6-(p-tolylsulfonyl)-β-CD](J.Am.Chem.Soc.，1990，112，3860)。

将mono-6-deoxy-6-(p-tolylsulfonyl)-β-CD(2.3克，1.78毫摩尔)溶于30毫升N，N-二甲基甲酰胺中，室温搅拌下加入叠氮化钠(174毫克，2.68毫摩尔)，加热至60℃反应12小时。将溶液冷却至室温，加入丙酮得到白色沉淀物，真空干燥后得到白色粉末状的产物[mono-(6-deoxy-6-azido)-β-CD]。收率为68％。¹HNMR：δ_H(300MHz；DMSO-d₆；Me₄Si)5.73-5.61(m，14H)，4.82-4.42(m，6H)，3.70-3.32(m，28H).IR：2055(N₃)cm^-1。元素分析(C₄₂H₆₉O₃₄N₃：C 43.49％，H 5.95％，N 3.62％)结果：C 42.72％，H 5.72％，N 3.07％.ESI MS(m/z)：1161.4[M+H⁺].

取mono-(6-deoxy-6-azido)-β-CD 0.5克(0.33毫摩尔)溶于30毫升干燥的N，N-二甲基甲酰胺中，加入2.1克pMBMA-sil，通N₂10分钟后，加入2，2’-联吡啶0.0686克(0.44毫摩尔)和CuBr 0.0317克(0.22毫摩尔)，混合溶液在80℃下反应30小时，反应过程中一直保持通N₂。反应完成后，用乙二胺四乙酸二钠饱和水溶液洗去吸附在硅球表面的铜离子，再用乙醇和丙酮洗去未反应物，真空干燥，得到CD-sil。

3.以ATRP聚合法在CD-sil表面接枝聚(丙三醇单甲基丙烯酸酯)

称取CD-sil 2.1克加入圆底三口烧瓶中，加入甲基丙烯酸缩水甘油酯2.2毫升(16.47毫摩尔)和30毫升环己酮，通N₂10分钟后，加入2，2’-联吡啶0.0343克(0.22毫摩尔)、CuBr 0.0158克(0.11毫摩尔)和2-溴异丁酰溴23微升(0.16毫摩尔)，室温反应4小时，反应过程中一直保持通N₂。反应后，用乙二胺四乙酸二钠洗去吸附在硅胶表面的铜离子，然后将其加入60毫升浓度为0.1摩尔/升稀硫酸，于60℃水浴中磁力搅拌反应8小时，使聚甲基丙烯酸缩水甘油酯上的环氧基水解开环，反应完毕，用蒸馏水洗涤接枝硅胶至中性，再用甲醇洗3次，50℃真空干燥，从而制得限进手性分离材料(CD-RAM)，根据元素分析结果碳含量增加值计算得到接枝聚(丙三醇单甲基丙烯酸酯)的重复单元数m为49.2。

pMBMA-sil、CD-sil和CD-RAM的红外光谱图如图7所示。2010cm^-1处为C≡C伸宿振动的吸收峰。1724cm^-1和2957cm^-1处分别为羰基和C-H伸缩振动的吸收峰。

实施例3.

将实施例2中合成的手性分离材料(CD-sil)，匀浆法装入150mm×4.6mm i.d.的不锈钢色谱柱中，采用HPLC法，考察这种材料对手性药物氯噻酮、扁桃酸、扑尔敏和安息香的分离能力。色谱条件和分离结果见表1，色谱分离图见图1-4。对于四种药物的手性选择性α值＞1.1。

实施例4.

将实施例2中合成的限进手性分离材料(CD-RAM)，匀浆法装入不锈钢色谱柱中，以含扁桃酸的人血浆样品进行液相色谱测定，含扁桃酸的人血浆样品以标准加入法制备(空白血浆采自健康志愿者)，加入扁桃酸后的血浆样品在离心(10000×g)后取上清液20微升直接进样，考察限进色谱填料对血浆样品中扁桃酸的手性分离能力。血浆样品中的蛋白回收率为98.2％。

采用HPLC法对血浆样品中扁桃酸进行分离，见图5。

色谱条件：150mm×4.6mm i.d.的不绣钢色谱柱，以甲醇/(0.3％三乙胺乙酸盐缓冲液，pH 4.9)(3/97，v/v)(30/70，v/v)为流动相，流速：0.5毫升/分钟，254nm为检测波长。三乙胺乙酸盐缓冲液配制方法：在0.3％三乙胺水溶液中加入适量乙酸调至所需pH值。

实施例5.

采用实施例2中合成的限进材料(CD-RAM)为色谱固定相，匀浆法装柱，对人血浆样品中氯噻酮进行分离，含氯噻酮的血浆样品制备方法与实施例4相同。

采用HPLC法对血浆样品中氯噻酮进行手性分离，色谱见图6。

色谱条件：150mm×4.6mm i.d.的不锈钢色谱柱，以0.3％三乙胺乙酸盐缓冲液(pH 4.9)为流动相，流速：0.5毫升/分钟，254nm为检测波长。

表1本发明手性分离材料(CD-sil)对手性药物的分离结果

注：150mm×4.6mm i.d.的不锈钢色谱柱；检测波长：254nm；流动相：

用于氯噻酮和扁桃酸分析：甲醇/(0.3％三乙胺乙酸盐缓冲液，pH 4.9)(1/9，v/v)，用于扑尔敏分析：乙腈/(0.3％三乙胺乙酸盐缓冲液，pH 6.8)(1/9，v/v)，用于安息香分析：甲醇/(0.3％三乙胺乙酸盐缓冲液，pH 4.9)(5/95，v/v)；流速：0.5毫升/分钟；k₁为首先流出的对映体的保留因子。

Claims

1.一种限进手性色谱固定相材料，其特征在于它具有如下结构：

2.一种用于制备限进手性色谱固定相材料的中间体，其特征在于它具有如下结构：

其中，2＜n＜10。

3.根据权利要求2所述的中间体，其特征在于：在红外光谱中，位于2010cm^-1处，有C≡C伸缩振动的吸收峰的减小，可确定硅胶表面接枝聚甲基丙烯酸甲基丁炔醇酯产物已成功接枝叠氮单取代的β-环糊精。

4.根据权利要求1所述的限进手性色谱固定相材料的制备方法，其特征在于它是经过如下步骤：

1)室温和在三乙胺存在下二氯甲烷为溶剂甲基丁炔醇与甲基丙烯酰氯搅拌反应，分别用1％HCl、饱和碳酸氢钠溶液和水洗涤，有机相干燥、过滤，减压蒸馏得到甲基丙烯酸甲基丁炔醇酯；

2)甲苯溶液中，用盐酸水溶液活化的多孔硅胶微球与(3-(2-溴异丁酰基)丙基)三乙氧基硅烷于N₂气中70-95℃加热回流反应8-12小时，冷却，抽滤，依次用乙醇和丙酮洗涤产物，干燥，得到表面接枝ATRP引发剂的硅胶；

3)室温下环己酮为溶剂，2，2’-联吡啶和溴化亚铜存在和N₂保护下，表面接枝ATRP引发剂的硅胶、甲基丙烯酸甲基丁炔醇酯反应2-6小时，用无水乙醇中止聚合反应，分别用乙二胺四乙酸二钠饱和溶液、乙醇和丙酮洗涤产物，得到硅胶表面接枝聚甲基丙烯酸甲基丁炔醇酯产物；

4)N，N-二甲基甲酰胺为溶剂，2，2’-联吡啶和溴化亚铜存在下，表面接枝聚甲基丙烯酸甲基丁炔醇酯的硅胶与叠氮单取代的β-CD在N₂保护下60-80℃下反应25-35小时；反应完成后，用乙二胺四乙酸二钠饱和溶液洗去吸附在硅球表面的铜离子，再用乙醇和丙酮洗去未反应物，得到接枝环糊精的手性分离材料；

5)环己酮为溶剂和N₂保护，2，2’-联吡啶，溴化亚铜和2-溴异丁酰溴存在下，接枝环糊精的手性分离材料与甲基丙烯酸缩水甘油酯室温反应2-6小时，用乙二胺四乙酸二钠饱和溶液洗去吸附在硅胶表面的铜离子后，将其加入稀硫酸中40-60℃搅拌反应6-10小时，用蒸馏水洗涤接枝硅胶至中性，再用甲醇洗3次，45-50℃真空干燥，从而制得限进手性色谱固定相材料。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于步骤3)所述的ATRP引发剂、溴化亚铜、2，2’-联吡啶和甲基丙烯酸甲基丁炔醇酯的摩尔比为1∶4∶8∶200。

6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于所述的稀硫酸浓度为0.1摩尔/升。