CN103626934B

CN103626934B - 限进型聚(甲基丙烯酸3-磺酸丙酯)修饰硅胶色谱填料

Info

Publication number: CN103626934B
Application number: CN201310682773.8A
Authority: CN
Inventors: 董襄朝; 姜萍; 张颖颖; 朱旭东
Original assignee: Nankai University
Current assignee: Nankai University
Priority date: 2013-12-10
Filing date: 2013-12-10
Publication date: 2016-03-30
Anticipated expiration: 2033-12-10
Also published as: CN103626934A

Abstract

本发明涉及一种限进型聚(甲基丙烯酸3-磺酸丙酯-co-乙二醇二甲基丙烯酸酯)修饰硅胶色谱填料(Silica-g-p(SPM-co-EDMA)-g-pGMMA)及其制备方法。它是硅胶表面接枝双层聚合物的材料，内层为聚(甲基丙烯酸3-磺酸丙酯-co-乙二醇二甲基丙烯酸酯)，外层为聚(甲基丙烯酸甘油单酯)，其表达式如下：Silica-g-p(SPM-co-EDMA)-g-pGMMA，其中，Silica为多孔硅胶，g表示接枝，p(SPM-co-EDMA)表示甲基丙烯酸3-磺酸丙酯和乙二醇二甲基丙烯酸酯的交联聚合物，pGMMA表示聚(甲基丙烯酸甘油单酯)。本发明可作为生物样品及环境样品分析的色谱固定相或固相萃取材料，进行阳离子型化合物的直接进样提取，提高了分析效率及准确性。本发明建立了在线固相萃取/液相色谱联用技术测定牛奶中三聚氰胺和环丙氨嗪的测定方法，具有很好的准确性和重现性。

Description

限进型聚(甲基丙烯酸3-磺酸丙酯)修饰硅胶色谱填料

技术领域

本发明涉及一种限进型聚(甲基丙烯酸3-磺酸丙酯)修饰硅胶色谱填料，具体是限进型聚(甲基丙烯酸3-磺酸丙酯-co-乙二醇二甲基丙烯酸酯)修饰硅胶色谱填料(Silica-g-p(SPM-co-EDMA)-g-pGMMA)及其制备方法，材料以原子转移自由基聚合以及表面引发方法制备，应用此材料为固相萃取剂，建立了固相萃取(SPE)/液相色谱(HPLC)在线联用测定牛奶中三聚氰胺和环丙氨嗪的方法。

背景技术

离子型或可以离子化的分析物的色谱分离和测定在生命科学、医药等领域起到了重要的作用，有着广泛的应用。但是在生物样品中的小分子分析中，由于样品中的生物大分子在色谱柱上的不可逆吸附使柱效迅速降低，影响了色谱方法的应用。因此在实际样品的分析中必须先进行蛋白去除的前处理工作。沉淀蛋白是常用的传统方法，但是这些前处理过程不仅繁琐、耗时，而且有可能使待测物损失，严重影响了分析的效率和准确性。为了解决这些问题，色谱工作者发展了限进材料，这种材料以物理或化学屏蔽的方式使蛋白等大分子不能进入小分子结合层(材料内层)而流出柱外，而小分子可以进入内层而被保留及分离，可以应用于生物样品的直接进样分析，对于高效分离测定起到了重要作用。目前，国际市场上已经有限进型色谱材料，但仍有需要改进的问题，例如，在接枝高分子链时应用“graftingonto”方法，而这种方法不容易得到均匀的接枝密度。

发明内容

本发明的目的是提供一种限进型聚(甲基丙烯酸3-磺酸丙酯-co-乙二醇二甲基丙烯酸酯)修饰硅胶色谱材料及其制备方法。材料应用原子转移自由基聚合(atomtransferradicalpolymerization，简称ATRP)法、在键合有ATRP引发剂的硅胶表面进行两次表面引发“graftingfrom”接枝聚合进行制备。首先以甲基丙烯酸3-磺酸丙酯(3-sulfopropylmethacrylate，SPM)为单体、乙二醇二甲基丙烯酸酯(ethyleneglycoldimethacrylate，EDMA)为交联剂，在硅胶表面接枝聚合，聚合后在硅胶表面形成带有磺酸基团的交联聚合物，材料简称为Silica-g-p(SPM-co-EDMA)；再以甲基丙烯酸缩水甘油酯(gIycidylmethacrylate，GMA)为单体，在Silica-g-p(SPM-co-EDMA)表面继续进行ATRP接枝聚合，水解后在外层形成带有二醇基的聚(甲基丙烯酸甘油单酯)[poly(glycerolmonomethacrylate)，pGMMA]。这种双层聚合物接枝的材料具有结合阳离子和排阻蛋白的功能，称为限进型聚(甲基丙烯酸3-磺酸丙酯-co-乙二醇二甲基丙烯酸酯)修饰硅胶，[Silica-g-p(SPM-co-EDMA)-g-pGMMA]。由于采用ATRP以及“graftingfrom”方法进行接枝聚合，接枝反应可控，也可以避免在溶液中非接枝聚合物的形成。该填料表面具有两种不同特性的化学结构层，内层为聚(甲基丙烯酸3-磺酸丙酯-co-乙二醇二甲基丙烯酸酯)，其聚合链上的磺酸基团能够通过静电作用结合阳离子；外层为聚(甲基丙烯酸甘油单酯)，其二醇基具有亲水性，可以避免蛋白的不可逆吸附。

本发明生物兼容性好，具有结合阳离子型小分子、排阻生物大分子的功能，可以作为生物样品及环境样品分析的色谱固定相或固相萃取材料，能够在免去蛋白沉淀的前处理过程的情况下对生物或环境复杂样品中的阳离子型化合物进行有效提取分离，其应用可减少样品前处理步骤及由此带来的损失，提高生物样品的分析效率及准确性。本发明以限进型聚(甲基丙烯酸3-磺酸丙酯-co-乙二醇二甲基丙烯酸酯)修饰硅胶为固相萃取柱填料，与HILIC分析柱通过柱切换阀连接，建立了在线固相萃取/液相色谱联用技术测定牛奶中三聚氰胺和环丙氨嗪的测定方法。

本发明提供的一种限进型聚(甲基丙烯酸3-磺酸丙酯-co-乙二醇二甲基丙烯酸酯)修饰硅胶色谱填料是硅胶表面接枝双层聚合物的材料，内层为聚(甲基丙烯酸3-磺酸丙酯-co-乙二醇二甲基丙烯酸酯)，外层为聚(甲基丙烯酸甘油单酯)，其表达式如下：Silica-g-p(SPM-co-EDMA)-g-pGMMA，其中，Silica为多孔硅胶，g表示接枝，p(SPM-co-EDMA)表示甲基丙烯酸3-磺酸丙酯和乙二醇二甲基丙烯酸酯的交联聚合物；pGMMA表示聚(甲基丙烯酸甘油单酯)。

其制备方法是经过如下步骤：

1)活化硅胶与(3-(2-溴异丁酰基)丙基)三乙氧基硅烷加热回流反应得到表面接枝ATRP引发剂的硅胶；

2)氮气保护下，在2，2′-联吡啶、CuBr和CuBr₂存在下，甲基丙烯酸3-磺酸丙酯钾盐为单体，乙二醇二甲基丙烯酸酯为交联剂，在键合有ATRP引发剂的硅胶表面进行ATRP接枝聚合反应得到Silica-g-p(SPM-co-EDMA)；

3)氮气保护下，在2，2′-联吡啶、CuBr和CuBr₂存在下，甲基丙烯酸缩水甘油酯(GMA)为单体，在Silica-g-p(SPM-co-EDMA)表面进行ATRP接枝聚合得到Silica-g-p(SPM-co-EDMA)-g-pGMA。

4)将Silica-g-p(SPM-co-EDMA)-g-pGMA进行酸性水解。

本发明合成所用的硅胶粒径为10-80微米，孔径为可以是球型或无定型。

(1)用元素分析法测得接枝聚(甲基丙烯酸甘油单酯)的重复单元数m为12.3～24.3：

(2)将其干法装入50mm×4.6mm不锈钢柱，流动相：磷酸盐缓冲液(pH4)/异丙醇/四氢呋哺(84/6/10，v/v)，流速为1.0mL/min，检测波长240nm的色谱条件下，以牛血清蛋白溶液进行测定，蛋白排阻率为95～109％。

本发明提供的限进型聚(甲基丙烯酸3-磺酸丙酯-co-乙二醇二甲基丙烯酸酯)修饰硅胶色谱材料的制备方法是经过如下步骤：

1)将硅球加入到体积比1∶1的盐酸水溶液中，搅拌、加热、回流反应10-12小时，反应产物抽滤，用水洗至中性，在100℃下真空干燥，得到活化好的硅胶，置于干燥器中备用；

2)以甲苯为溶剂，用活化的硅胶与3-(2-溴异丁酰基)丙基三乙氧基硅烷于N₂气中90℃加热回流反应10-15小时，冷却，抽滤，依次用甲苯、丙酮分别洗涤三次，用体积比1∶1的乙醇水溶液索提10-12小时后，40-50℃下真空干燥，得到表面接枝ATRP引发剂的硅胶(简称Silica-In)，保留在干燥器中待用；

3)氮气保护下，以体积比1∶1的DMF/H₂O为溶剂，2，2′一联吡啶、CuBr和CuBr₂(摩尔比10∶3∶1)存在下，以甲基丙烯酸3-磺酸丙酯钾盐(SPM)为单体，乙二醇二甲基丙烯酸酯(EDM)为交联剂，30℃下，在Silica-In表面进行ATRP接枝聚合反应。产物抽滤后用乙二胺四乙酸二钠(EDTA)饱和水溶液洗涤至无色，水洗涤，再用体积比1∶1的乙醇水溶液索提10-12小时后，40-50℃真空干燥，得到离子交换分离材料，产物标记为Silica-g-p(SPM-co-EDMA)，保存于干燥器中备用；

4)将聚(甲基丙烯酸3-磺酸丙酯-co-乙二醇二甲基丙烯酸酯)修饰硅胶，Silica-g-p(SPM-co-EDMA)，装入不锈钢色谱柱，以HPLC法考察材料对无机阳离子Na⁺、NH₄ ⁺、K⁺、Mg²⁺和Ca²⁺的保留性能及分离能力。

5)氮气保护下，以体积比5∶2的DMF/H₂O为溶剂，2，2′-联吡啶、CuBr和CuBr₂存在下，甲基丙烯酸缩水甘油酯(GMA)为单体，在Silica-g-p(SPM-co-EDMA)表面进行ATRP接枝聚合，50℃反应3-4小时。反应完成后抽滤，产物用EDTA饱和水溶液洗至无色，再用水洗涤，然后用体积比1∶1的乙醇水溶液索提10-12小时，60℃真空干燥。产物标记为Silica-g-p(SPM-co-EDMA)-g-pGMA。

6)将Silica-g-p(SPM-co-EDMA)-g-pGMA加入到0.1mol/L的稀硫酸中，60℃搅拌反应6-8小时，使聚甲基丙烯酸缩水甘油酯上的环氧基水解开环。反应完毕，用水洗涤至中性，60℃真空干燥。从而制得内层键合p(SPM-co-EDMA)、外层为pGMMA的限进型聚(甲基丙烯酸3-磺酸丙酯-co-乙二醇二甲基丙烯酸酯)修饰硅胶色谱材料，标记为Silica-g-p(SPM-co-EDMA)-g-pGMMA。

本发明提供的SPE/HPLC在线联用检测牛奶中三聚氰胺和环丙氨嗪的方法包括的步骤：以限进型聚(甲基丙烯酸3-磺酸丙酯-co-乙二醇二甲基丙烯酸酯)修饰硅胶[Silica-g-p(SPM-oo-EDMA)-g-pGMMA]为固相萃取(solidphaseextraction，SPE)柱填料，干法装入不锈钢色谱柱，与HILIC分析柱通过切换阀连接，经过色谱条件优化，建立SPE/HPLC在线联用测定牛奶中三聚氰胺和环丙氨嗪含量的方法；确定了测定牛奶中三聚氰胺和环丙氨嗪的线性范围及最低检出限和最低定量限，并测定了加标牛奶样品的回收率及重现性；

以SPE/HPLC在线联用技术测定牛奶中三聚氰胺和环丙氨嗪的含量，在0.005-200μg/mL浓度范围，三聚氰胺和环丙氨嗪的测定方法线性良好，三聚氰胺最低检出限为0.11μg/Kg，最低定量限为0.33μg/Kg，环丙氨嗪最低检出限为0.33μg/Kg，最低定量限为0.98μg/Kg)。在0.005至100.0μg/mL浓度范围内，加标牛奶样品的三聚氰胺和环丙氨嗪回收率为88％-109％，相对标准偏差RSD小于9％(n＝3)。

本发明应用原子转移自由基聚合(AtomicTransferRadicalPolymerization，ATRP)法，以“graftingfrom”方式，合成了内层为聚(甲基丙烯酸3-磺酸丙酯-co-乙二醇二甲基丙烯酸酯)，外层为亲水性聚(甲基丙烯酸甘油单酯)的限进型聚合物接枝硅胶阳离子交换色谱材料，亲水性聚(甲基丙烯酸甘油单酯)可以排阻蛋白，但阳离子小分子可以穿过亲水链到达阳离子结合层。应用ATRP活性/可控自由基聚合法，不但可以在表面接枝聚合中对于接枝量进行控制，使得接枝层均匀，而且可以方便地在第一层聚合物表面进行第二种单体的再接枝，达到合成多功能材料的目的。材料对于阳离子有很好的结合能力，而且能够屏蔽蛋白，对蛋白的平均排阻率为101.3％，避免了蛋白在材料表面的不可逆结合，提供了一种可用于生物或环境样品直接进样分析的限进型阳离子交换色谱固定相材料，而且材料具备聚合物的功能和硅胶的机械强度两种优越性。

本发明提供了限进型聚(甲基丙烯酸3-磺酸丙酯)修饰硅胶色谱填料，具体是限进型聚(甲基丙烯酸3-磺酸丙酯-co-乙二醇二甲基丙烯酸酯)修饰硅胶阳离子交换色谱填料，简称为限进型交联聚(甲基丙烯酸3-磺酸丙酯)修饰硅胶色谱填料(Silica-g-p(SPM-co-EDMA)-g-pGMMA)及其制备方法，材料以原子转移活性自由基“graftingfrom”聚合法在硅胶表面接枝聚合物而合成，内层为带有磺酸基团的聚(甲基丙烯酸3-磺酸丙酯-co-乙二醇二甲基丙烯酸酯)，外层为亲水性聚(甲基丙烯酸甘油单酯)，具有结合阳离子小分子、排阻生物大分子的双重功能。这种限进型分离材料可应用于生物或环境样品中阳离子(或在一定条件下可变为阳离子的化合物)的萃取和直接进样色谱分离分析，免去蛋白沉淀等样品前处理过程，达到对于生物复杂体系中小分子物质进行高效分析测定的目的。此材料作为固相萃取剂应用于生物或环境样品中阳离子的直接进样色谱测定，可减少样品前处理步骤带来的损失，提高生物或环境样品中阳离子的分析效率及准确性。

本发明建立了固相萃取(SPE)/液相色谱(HPLC)在线联用测定牛奶中三聚氰胺和环丙氨嗪的方法。该方法具有很好的准确性和重现性，避免了沉淀蛋白的前处理过程，是一种高效的分析方法。

附图说明

图1为本发明材料结构示意图：(a)为聚(甲基丙烯酸3-磺酸丙酯-co-乙二醇二甲基丙烯酸酯)修饰硅胶；(b)为限进型聚(甲基丙烯酸3-磺酸丙酯-co-乙二醇二甲基丙烯酸酯)修饰硅胶色谱材料。

图2为本发明制备反应流程图。

图3为Na⁺、NH₄ ⁺、K⁺、Mg²⁺和Ca²⁺在以交联聚(甲基丙烯酸3-磺酸丙酯)修饰硅胶Silica-g-p(SPM-co-EDMA)为色谱填料的色谱柱上得到的色谱图。

图4为固相萃取/液相色谱(SPE/HPLC)在线联用方法中的柱切换示意图。

图5为SPE/HPLC在线联用方法测定三聚氰胺和环丙氨嗪的色谱图。

具体实施方式

实施例1.

1.基质硅胶的活化

将10g硅胶(粒径10μm，孔径比表面积380m²/g)加入到100mL盐酸/水(1∶1，v/v)溶液中，105℃搅拌回流12小时后过滤，用蒸馏水洗至中性，在100℃下真空干燥，干燥器中保存备用。

2.硅胶表面接枝ATRP引发剂(产物标记为Silica-In)

取10g经活化干燥的硅胶，加入60毫升干燥甲苯，搅拌下加入1.5毫升(3-(2-溴异丁酰基)丙基)三乙氧基硅烷，在N₂保护下，90℃加热回流，反应15小时，反应完毕后，产物进行抽滤，并用甲苯、丙酮分别洗涤三次，产物用乙醇水(1/1，v/v)索提12小时后，50℃下真空干燥。得到表面接枝ATRP引发剂的硅胶(标记为Silica-In)。

实施例2

1.以ATRP法在硅胶表面接枝聚(甲基丙烯酸3-磺酸丙酯-co-乙二醇二甲基丙烯酸酯)称取实施例1制备的Silica-In(1.0克)加入圆底三口烧瓶中，再加入甲基丙烯酸3-磺酸丙酯钾盐(SPM)0.62g、乙二醇二甲基丙烯酸酯(EDMA)0.26mL、2，2’-联吡啶(BiPy)0.15g、CuBr₂0.028g和DMF/H₂O(1/1，v/v)24mL，通氮气10min后，加入CuBr0.036g，氮气保护下30℃搅拌反应1小时。反应完成后，将反应物抽滤，用EDTA饱和水溶液将产物洗涤至无色，再用水洗涤后，用乙醇/水(1/1，v/v)索提12小时，50℃真空干燥12小时，得到聚(甲基丙烯酸3-磺酸丙酯-co-乙二醇二甲基丙烯酸酯)修饰硅胶材料，标记为Silica-g-p(SPM-co-EDMA)。通过氧瓶燃烧-离子色谱法测定磺酸基团的含量，计算得到SPM的接枝量为0.45～0.64mmol/g。

2.以ATRP法在硅胶表面接枝聚(甲基丙烯酸3-磺酸丙酯)

称取实施例1制备的Silica-In(1.0克)加入圆底三口烧瓶中，再加入甲基丙烯酸3-磺酸丙酯钾盐(SPM)0.62g、2，2’-联吡啶(BiPy)0.15g、CuBr₂0.028g和DMF/H₂O(1/1，v/v)24mL，通氮气10min后，加入CuBr0.036g，氮气保护下30℃搅拌反应1小时。反应完成后，将反应物抽滤，用EDTA饱和水溶液将产物洗涤至无色，再用水洗涤后，用乙醇/水(1/1，v/v)索提12小时，50℃真空干燥12小时，得到聚(甲基丙烯酸3-磺酸丙酯)修饰硅胶材料。

3.以ATRP聚合法在Silica-g-p(SPM-co-EDMA)表面接枝聚(甲基丙烯酸甘油单酯)

称取Silica-g-p(SPM-co-EDMA)0.5克加入三口烧瓶中，加入DMF/H₂O(5/2，v/v)14mL，机械搅拌下，通N₂30min，加甲基丙烯酸缩水甘油酯(GMA)7.0mL，2，2’-联吡啶(BiPy)0.47g，CuBr0.17g，CuBr₂0.06g，50℃搅拌反应3小时。抽滤后的产物用EDTA饱和水溶液洗至无色，再分别用水、乙醇洗涤三次，用滤纸包裹后以乙醇/水溶液(1/1，v/v)索提12小时，60℃真空干燥后，加入60毫升浓度为0.1摩尔/升的稀硫酸，于60℃搅拌反应6小时，使聚甲基丙烯酸缩水甘油酯上的环氧基水解开环，反应完毕，产物抽滤，用蒸馏水洗涤至中性，60℃真空干燥，得到限进型离子交换分离材料：Silica-g-p(SPM-co-EDMA)-g-pGMMA，反应流程图如图2。根据元素分析碳含量增加值，可计算得出接枝聚(甲基丙烯酸甘油单酯)的平均重复单元数。条件实验结果证明，在2～5小时的反应时间范围内，接枝聚(甲基丙烯酸甘油单酯)的重复单元数m为12.3～24.3，接枝量与接枝时间有较好的正相关性，牛血清蛋白排阻率为95～109％。调整接枝时间，可使限进层达到合适的厚度。当接枝时间为3小时，m为16.1，蛋白回收率到达100％(以牛血清蛋白溶液进行测定)，说明材料已经对于蛋白具有很好的排阻能力。

实施例3.

将实施例2中合成的聚(甲基丙烯酸3-磺酸丙酯-co-乙二醇二甲基丙烯酸酯)修饰硅胶材料Silica-g-p(SPM-co-EDMA)，干法装入50mm×4.6mmi.d.不锈钢色谱柱中，采用HPLC法，考察这种材料对无机阳离子Na⁺、NH₄ ⁺、K⁺、Mg²⁺和Ca²⁺的分离能力。色谱条件和分离结果见表1，色谱图见图3。由图3可见，基本可以将一价阳离子分离，且峰形对称；二价阳离子有很好的分离，说明该色谱固定相具有较好的阳离子分离性能。

表1交联聚(甲基丙烯酸3-磺酸丙酯)修饰硅胶对阳离子的色谱选择性^a

^a色谱柱：不锈钢柱(50mm×4.6mmi.d.)；流动相：15mmol/LCuSO4，流速：1.0mL/min，检测波长：250nm，进样量：20μL，柱温：室温。选择性α由相邻两个离子的保留因子之比计算。

实施例4.

将实施例2中合成的Silica-g-p(SPM-co-EDMA)-g-pGMMA装入不锈钢柱(30×4.6mm)中，作为固相萃取(solidphaseextraction，SPE)柱，通过切换阀连接分析柱(Luna5μHILIC柱，150×4.6mm)用于分离待测物质。建立SPE/HPLC在线联用测定牛奶中三聚氰胺和环丙氨嗪含量的方法，通过切换阀进行柱切换方式示于图4。

色谱条件：

流动相A：乙酸铵(5mM，pH3.0)/乙腈(98/2，v/v)，流动相B：乙酸铵(100mM，pH8.0)/乙腈(15/85，v/v)。流速：1.0毫升/分钟，检测波长：205nm。

乙酸铵缓冲溶液的配制：配制5mM乙酸铵溶液，使用pH计以乙酸或氨水来调节缓冲液的pH。

三聚氰胺和环丙氨嗪贮备液配制：精密称取一定量三聚氰胺和环丙氨嗪，以水溶解并稀释至一定体积；三聚氰胺和环丙氨嗪标准溶液配制：以流动相A为溶剂，准确稀释储备液到一定体积，配制三聚氰胺和环丙氨嗪浓度均为0.005-200μg/mL的标准溶液。

牛奶加标样品配制：牛奶和标准溶液以1/1体积混合，于15000g条件下离心8min，取中间层清液，经0.45μm针头滤器过滤，直接进行SPE/HPLC进样分析。牛奶空白样品配制方法除了以流动相A取代标准溶液外，其它和牛奶加标样品相同。

SPE/HPLC在线联用方法：在进样时，切换阀在位置A，首先用流动相A平衡萃取柱(流速为1.0mL/min)，进样之后，以流动相A继续冲洗，将样品中的蛋白和其它基质成分冲出SPE柱，此为上样和净化过程；4min之后将阀切换至位置B，以流动相B将三聚氰胺和环丙氨嗪冲到HILIC分析柱中进行分离，此阶段为洗脱和分析过程。本发明对流动相pH值、浓度及有机相的比例等色谱条件进行了优化筛选，采用以上条什三聚氰胺和环丙氨嗪得到了很好的分离，色谱图见图5。

实施例5.

进行SPE/HPLC在线联用技术测定牛奶中三聚氰胺和环丙氨嗪的方法评价。采用实施例4中的SPE/HPLC在线联用方法及其色谱条件，进行牛奶中三聚氰胺和环丙氨嗪测定方法评价。结果为：在三聚氰胺和环丙氨嗪浓度均为0.005-200μg/mL时，浓度和峰面积线性关系良好，相关系数>0.999。三聚氰胺检出限为0.12ng/mL，定量限为0.37ng/mL，环丙氨嗪检出限为0.33ng/mL，定量限为1.0ng/mL(若以μg/Kg为单位，则三聚氰胺最低检出限为0.11μg/Kg，最低定量限为0.33μg/Kg，环丙氨嗪最低检出限为0.33μg/Kg，最低定量限为0.98μg/Kg。)。

以加标回收方法进行方法验证，对于准确性和重现性进行评价，加标牛奶样品在三聚氰胺和环丙氨嗪浓度为0.005至100.0μg/mL范围内，三聚氰胺和环丙氨嗪的回收率为88％-109％，相对标准偏差RSD小于9％。

Claims

1.一种限进型聚(甲基丙烯酸3-磺酸丙酯-co-乙二醇二甲基丙烯酸酯)修饰硅胶色谱材料，其特征在于它是硅胶表面接枝双层聚合物，内层为聚(甲基丙烯酸3-磺酸丙酯-co-乙二醇二甲基丙烯酸酯)，外层为聚(甲基丙烯酸甘油单酯)，其表达式如下：

Silica-g-p(SPM-co-EDMA)-g-pGMMA，其中，Silica为多孔硅胶，g表示接枝，p(SPM-co-EDMA)表示甲基丙烯酸3-磺酸丙酯和乙二醇二甲基丙烯酸酯的交联聚合物；pGMMA表示聚(甲基丙烯酸甘油单酯)；

其制备方法经过如下步骤：

2)氮气保护下，在2，2′-联吡啶、CuBr和CuBr₂存在下，甲基丙烯酸3-磺酸丙酯钾盐为单体，乙二醇二甲基丙烯酸酯为交联剂，在表面接枝ATRP引发剂的硅胶表面进行ATRP接枝聚合反应得到Silica-g-p(SPM-co-EDMA)；

3)氮气保护下，在2，2′-联吡啶、CuBr和CuBr₂存在下，甲基丙烯酸缩水甘油酯(GMA)为单体，在Silica-g-p(SPM-co-EDMA)表面进行ATRP接枝聚合得到Silica-g-p(SPM-co-EDMA)-g-pGMA；

4)将Silica-g-p(SPM-co-EDMA)-g-pGMA进行酸性水解，得到表面具有二醇基团的材料，Silica-g-p(SPM-co-EDMA)-g-pGMMA；

将其干法装入50mm×4.6mm不锈钢柱，流动相：pH4磷酸盐缓冲液/异丙醇/四氢呋喃，体积比为84/6/10，流速为1.0mL/min，检测波长240nm的色谱条件下，以牛血清蛋白溶液进行测定，蛋白排阻率为95～109％。

2.按照权利要求1所述的修饰硅胶色谱材料，其特征在于所述的硅胶粒径为10-80微米，孔径为

3.按照权利要求1所述的修饰硅胶色谱材料，其特征在于接枝的聚(甲基丙烯酸甘油单酯)的重复单元数m为12.3～24.3。

4.一种权利要求1所述的限进型聚(甲基丙烯酸3-磺酸丙酯-co-乙二醇二甲基丙烯酸酯)修饰硅胶色谱材料的制备方法，其特征在于是经过如下步骤：

2)以甲苯为溶剂用活化的硅胶与3-(2-溴异丁酰基)丙基三乙氧基硅烷于N₂气中90℃加热回流反应10-15小时，冷却，抽滤，依次用甲苯、丙酮分别洗涤三次，用体积比1∶1的乙醇水溶液索提10-12小时后，40-50℃下真空干燥，得到表面接枝ATRP引发剂的硅胶(标记为Silica-In)；

3)氮气保护下，以体积比1∶1的DMF/H₂O为溶剂，2，2′-联吡啶、CuBr和CuBr₂存在下，以甲基丙烯酸3-磺酸丙酯钾盐为单体，乙二醇二甲基丙烯酸酯为交联剂，30℃下，在Silica-In表面进行ATRP接枝聚合反应；产物抽滤后用乙二胺四乙酸二钠饱和水溶液洗涤至无色，水洗涤，再以体积比1∶1的乙醇水溶液索提10-12小时后，40-50℃真空干燥，得到离子交换分离材料，产物标记为Silica-g-p(SPM-co-EDMA)；

4)将聚(甲基丙烯酸3-磺酸丙酯-co-乙二醇二甲基丙烯酸酯)修饰硅胶，

Silica-g-p(SPM-co-EDMA)，装入不锈钢色谱柱，以HPLC法考察材料对无机阳离子Na⁺、NH₄ ⁺、K⁺、Mg²⁺和Ca²⁺的保留性能及分离能力；

5)氮气保护下，以体积比5∶2的DMF/H₂O为溶剂，2，2′-联吡啶、CuBr和CuBr₂存在下，甲基丙烯酸缩水甘油酯为单体，在Silica-g-p(SPM-co-EDMA)表面进行ATRP接枝聚合，50℃反应3-4小时，反应完成后抽滤，产物用EDTA饱和水溶液洗至无色，再用水洗涤，然后用体积比1∶1的乙醇水溶液索提10-12小时，60℃真空干燥，产物标记为Silica-g-p(SPM-co-EDMA)-g-pGMA；

6)将Silica-g-p(SPM-co-EDMA)-g-pGMA加入到0.1mol/L的稀硫酸中，60℃搅拌反应6-8小时，使聚甲基丙烯酸缩水甘油酯上的环氧基水解开环，反应完毕，用水洗涤至中性，60℃真空干燥，从而制得内层键合p(SPM-co-EDMA)、外层为pGMMA的限进型聚(甲基丙烯酸3-磺酸丙酯-co-乙二醇二甲基丙烯酸酯)修饰硅胶色谱材料，标记为Silica-g-p(SPM-co-EDMA)-g-pGMMA。

5.权利要求1所述的修饰硅胶色谱材料的应用，其特征在于它应用于固相萃取(SPE)/液相色谱(HPLC)在线联用测定牛奶中三聚氰胺和环丙氨嗪。

6.按照权利要求5所述的应用，其特征在于它包括的步骤：

以限进型聚(甲基丙烯酸3-磺酸丙酯-co-乙二醇二甲基丙烯酸酯)修饰硅胶[Silica-g-p(SPM-co-EDMA)-g-pGMMA]为固相萃取(solidphaseextraction，SPE)填料，干法装入不锈钢色谱柱，与HILIC分析柱通过切换阀连接，以在线联用方法测定牛奶中三聚氰胺和环丙氨嗪含量；确定了测定牛奶中三聚氰胺和环丙氨嗪的线性范围及最低检出限和最低定量限，并测定了加标牛奶样品的回收率及重现性；具体步骤为：

在进样时，切换阀在位置A，首先用流动相A平衡萃取柱，流速为1.0mL/min，进样之后，以流动相A继续冲洗，将样品中的蛋白和其它基质成分冲出SPE柱，此为上样和净化过程；4min之后将阀切换至位置B，以流动相B将三聚氰胺和环丙氨嗪冲到HILIC分析柱中进行分离，此阶段为洗脱和分析过程；

色谱条件：

流动相A的组成：5mM，pH3.0的乙酸铵缓冲溶液与乙腈的体积比：98∶2；

流动相B：100mM，pH8.0的乙酸铵缓冲溶液与乙腈的体积比：15∶85；

流速：1.0毫升/分钟，检测波长：205nm；

乙酸铵缓冲溶液的配制：配制5mM乙酸铵溶液，使用pH计，以乙酸或氨水来调节缓冲液的pH。

7.一种聚(甲基丙烯酸3-磺酸丙酯-co-乙二醇二甲基丙烯酸酯)修饰硅胶，其特征在于它具有如下结构式：Silica-g-p(SPM-co-EDMA)，其中Silica为多孔硅胶，g表示接枝，p(SPM-co-EDMA)表示甲基丙烯酸3-磺酸丙酯和乙二醇二甲基丙烯酸酯的交联聚合物。