CN105056916A - 一种限进型手性色谱整体柱及其制备方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种限进型手性色谱整体柱及其制备方法与应用，所述限进型手性色谱整体柱制备过程包括如下步骤：(一)以反向原子转移自由基聚合法制备色谱整体柱骨架。(二)在整体柱骨架上修饰β-环糊精(β-CD)作为手性选择试剂。(三)利用整体柱骨架表面的活性位点，继续引发正向原子转移自由基聚合，接枝亲水性限进层。所得限进型手性整体色谱固定相的优点在于可应用于生物样品的直接进样分析，且具有稳定性高的优点，适合手性药物的快速分离分析。

Description

一种限进型手性色谱整体柱及其制备方法与应用

技术领域

本发明属于有机聚合材料的色谱固定相领域，特别涉及一种通过原子转移自由基聚合制备限进型手性色谱整体柱及其制备方法与应用。

背景技术

生物中基体成分复杂，如对血清、血浆和尿液等样品进行高效液相色谱(HPLC)分析前，必须对其进行前处理，因为生物样品中的生物大分子如蛋白质及核酸等遇到疏水性反相色谱填料时，结构会发生改变，导致其变性并吸附在色谱填料的表面，造成多孔填料的堵塞和柱效降低，最终严重干扰小分子分析物的测定。限进材料作为一种具有亲水性表面的新型色谱填料，可有效避免生物大分子在填料表面的死吸附。限进材料同时兼具对生物大分子的体积排阻功能和对小分子分析物的保留、分离能力，是针对复杂样品分离分析而出现的一种色谱固定相。限进型色谱固定相可实现复杂生物样品直接进样色谱分析，可极大简化分析步骤，缩短分析时间。

整体色谱固定相具备制备简单、整体结构好、传质效率高、高效分离等优点，在常规高效液相色谱中已被普遍应用，因其能方便地应用于常规的色谱分析系统中，并且能够实现复杂样品的快速分离分析。整体柱制备方法是利用原位聚合，将单体、引发剂、致孔剂等试剂混合并反应后，制备成的棒状整体。目前，有机整体柱的制备多采用自由基聚合方法，而传统自由基聚合法反应具有过程不易控制、产物分子量分布大的缺点。原子转移自由基聚合作为一种“活性”/可控自由基聚合法可利用能够发生钝化反应的自由基来控制聚合反应的速度及聚合物结构，克服了传统自由基聚合的缺点，已被广泛应用于制备各种不同类型的聚合物材料。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种限进型手性色谱整体柱，该限进型色谱整体柱可用于血浆样品的直接进样分析，提高HPLC检测效率。

本发明还要解决的技术问题是提供上述限进型手性色谱整体柱的制备方法。

本发明最后要解决的技术问题是提供上述限进型手性色谱整体柱的应用。

为解决上述技术问题，本发明的思路是：本发明首先以偶氮二异丁腈(AIBN)为引发剂，甲基丙烯酸间硝基苯酯(m-nitrophenylmethacrylate，NPMA)为单体、二甲基丙烯酸乙二醇酯(ethyleneglycoldimethacrylate，EGDMA)为交联剂，利用反向原子转移自由基聚合(Reverseatomtransferradicalpolymerization，简称RATRP)法制备有机整体柱。之后，在其表面修饰环糊精，并继续引发正向原子转移自由基聚合(directatomtransferradicalpolymerization，简称DATRP),接枝亲水性聚合物链，即限进层。该限进型色谱整体柱可用于血浆样品的直接进样分析，提高HPLC检测效率。

本发明采用的具体技术方案如下：

一种限进型手性色谱整体柱的制备方法，它包括如下步骤：

(1)将甲基丙烯酸间硝基苯酯(m-nitrophenylmethacrylate，NPMA)(合成方法参考Macromolecules，1976，9:701-704)、二甲基丙烯酸乙二醇酯(ethyleneglycoldimethacrylate，EGDMA)、偶氮二异丁腈(AIBN)、溴化铜和N,N,N',N,'N”-五甲基二亚乙基三胺(PMDETA)溶解于乙腈与月桂醇的混合溶液中，通入氮气置换溶液中的空气后，将该溶液注射入空的第一不锈钢色谱柱中，密封，水浴条件下聚合，得到的整体柱MC；

(2)将整体柱MC接到HPLC仪器上，以甲醇和水的混合溶液洗脱，然后将含β-环糊精的碳酸盐缓冲液以流动性方式注入色谱整体柱中，之后在加热条件下反应，上述洗脱、β-环糊精注入以及加热反应的过程重复三次后，得到β-环糊精修饰的整体柱CD-MC；

(3)将甲基丙烯酸羟乙酯(hydroxyethylmethacrylate，HEMA)、2-溴代异丁酰溴(2-bromoisobutyrylbromide，BIBB)、溴化亚铜和N,N,N',N,'N”-五甲基二亚乙基三胺(PMDETA)溶解于甲醇中得到混合溶液，利用高纯氮气除氧后，将混合溶液装入空的第二不锈钢色谱柱内，并连接到HPLC输液泵上，第二不锈钢色谱柱出口连接整体柱CD-MC，以甲醇为流动相输液后，将整体柱CD-MC拆下，密封，在水浴条件下加热反应，得到限进型手性整体柱RA-CD-MC。

步骤(1)中，甲基丙烯酸间硝基苯酯、二甲基丙烯酸乙二醇酯、偶氮二异丁腈、溴化铜和N,N,N',N,'N”-五甲基二亚乙基三胺的摩尔比为(250～350):(250～350):1:2:4，优选300:300:1:2:4。

步骤(1)中，甲基丙烯酸间硝基苯酯与乙腈与月桂醇的混合溶液的用量比为70～80mg:1mL；乙腈与月桂醇的体积比为85～95:5～15，优选90:10。

步骤(1)中，第一不锈钢色谱柱尺寸为150毫米×4.6毫米。

步骤(1)中，80～90℃水浴条件下聚合反应20～30小时，优选80℃水浴条件下聚合反应24小时。

步骤(1)结束后，步骤(2)开始前，优选将整体柱MC接在液相色谱泵上用甲醇冲洗，将柱床层内残留反应试剂、致孔剂以及产生的一些低聚度物冲洗除去。

步骤(2)中，甲醇和水的混合体积比为5～15:85～95，优选10:90；以甲醇和水的混合溶液洗脱30～40分钟，优选30分钟。

步骤(2)中，所述的含β-环糊精的碳酸盐缓冲液为含β-环糊精的碳酸钠缓冲液，其中β-环糊精浓度为15～25毫摩尔/升，所述的碳酸钠缓冲液为pH10～11、离子浓度为50～70毫摩尔/升的碳酸钠缓冲液；将含β-环糊精的碳酸盐缓冲液以流动性方式打入色谱整体柱中，之后在40～60℃加热条件下反应3～5小时，优选在50℃加热条件下反应4小时。

步骤(2)结束后，步骤(3)开始前，将β-环糊精修饰的整体柱CD-MC，以甲醇/水(1/1,v/v)为流动相，将柱床层内未反应的试剂和反应副产物除去。

步骤(3)中，甲基丙烯酸羟乙酯、2-溴代异丁酰溴、溴化亚铜和N,N,N',N,'N”-五甲基二亚乙基三胺的摩尔比为300～500：5：4：8，优选400：5：4：8；甲基丙烯酸羟乙酯在甲醇中的浓度为0.3～0.6毫摩尔/升。

步骤(3)中，所述的第二不锈钢色谱柱尺寸为250毫米×4.6毫米。

步骤(3)中，以甲醇为流动相输液20分钟后，将整体柱CD-MC拆下，密封。

步骤(3)中，将整体柱CD-MC拆下，密封，在50～70℃水浴条件下加热反应3～5小时，优选在60℃水浴条件下加热反应4小时。

步骤(3)结束后，将限进型手性整体柱RA-CD-MC接到HPLC泵上，以甲醇为流动相，冲洗限进型手性整体柱RA-CD-MC。

上述方法制备得到的限进型手性色谱整体柱也在本发明的保护范围之内。

上述限进型手性色谱整体柱在高效液相色谱直接进样条件下分离分析血浆样品中手性药物中的应用也在本发明的保护范围之内。

有益效果：

1.以原子转移自由基聚合法制备色谱整体柱，可有效避免聚合过程中产生非理想聚合物的问题，使聚合过程更加可控。在色谱整体柱聚合方法上具有较强的创新性。

2.以环糊精作为手性选择试剂，在手性分离适用范围上较广。

3.本发明所制备的限进型手性色谱整体柱具有双重功能，既能实现大分子蛋白的排阻，又能实现手性化合物的分离。

4.应用本发明所制备的限进型手性色谱整体柱，无需复杂的样品前处理过程，可简化实验操作和提高色谱分析效率。

附图说明

图1限进型手性整体柱(RA-CD-MC)的合成示意图。

图2手性整体柱CD-MC的扫描电镜图。

图3为血浆样品中氯噻酮的直接进样高效液相色谱分析谱图。

图4为血浆样品中扑尔敏的直接进样高效液相色谱分析谱图。

具体实施方式

根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的内容仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。

实施例1：

整体柱MC的制备：将NPMA(1.41毫摩尔，292毫克)和EGDMA(1.41毫摩尔，266微升)加入含AIBN(4.7微摩尔，0.77毫克)、PMDETA(18.8微摩尔，4.0微升)和溴化铜(9.4微摩尔，2.1毫克)的4毫升乙腈/月桂醇(9/1,v/v)混合中，通入高纯氮气置换溶液中的空气，并将其注射入不锈钢色谱空柱中(150毫米×4.6毫米)，密封。在80℃水浴条件下反应24小时。将得到的MC整体柱接在液相色谱泵上用甲醇冲洗。

实施例2：

β-环糊精修饰的整体柱CD-MC的制备：将整体柱MC接到液相色谱泵上，以甲醇/水(1/9,v/v)洗脱30分钟。然后将含β-CD(17毫摩尔/升)的碳酸钠缓冲液(pH11，离子浓度60毫摩尔/升)以流动性方式打入色谱整体柱中。在50℃条件下反应4小时，上述洗脱、β-环糊精注入以及加热反应的过程重复三次。最后以甲醇/水(1/1,v/v)为流动相将反应副产物和未反应的试剂除去。从扫描电子显微镜图(图2)中可以看出，聚合物颗粒规则且颗粒间的通孔尺寸约为0.5微米，具有较好的通透性和孔隙率。

实施例3：

限进型手性整体柱RA-CD-MC的制备：将含HEMA(0.5毫摩尔/升)、BIBB(6.25微摩尔/升)、溴化亚铜(5微摩尔/升)和PMDETA(10微摩尔/升)的甲醇溶液，通高纯氮气除氧后，装入250毫米×4.6毫米不锈钢色谱柱内，连接到HPLC输液泵上，并在该不锈钢柱出口处连接CD-MC整体柱。以甲醇为流动相输液20分钟后，将CD-MC整体柱拆下，密封。在60℃水浴过中加热反应4小时。最后以甲醇为流动相，冲洗得到的RA-CD-MC整体柱。

实施例4：

利用实施例2中合成的β-环糊精修饰的整体柱CD-MC，采用高效液相色谱法，考察该色谱整体柱对手性药物氯噻酮、扑尔敏、氨氯地平和氨鲁米特的分离能力。色谱条件和色谱分离能力见表1。该色谱整体柱可实现对部分药物(氯噻酮和扑尔敏)的基线分离。

表1本发明手性色谱整体柱CD-MC对手性药物的分离能力

注：检测波长：254nm；流速：1.0毫升/分钟，(k₁为首先流出的对映体的保留因子)。流动相，氯噻酮：甲醇/(0.3％三乙胺乙酸缓冲液,pH4.9)(15/85,v/v)；扑尔敏：乙腈/(0.3％三乙胺乙酸缓冲液,pH6.8)(梯度洗脱：0-40分钟,1/9-3/7,v/v)；氨氯地平：乙腈/(0.3％三乙胺乙酸缓冲液,pH6.8)(梯度洗脱：0-20分钟,5/95-3/7,v/v)；氨鲁米特：甲醇/(0.3％三乙胺乙酸缓冲液,pH5.4)(梯度洗脱：0-50分钟,2/8-1/1,v/v)。

实施例5：

采用实施例3中制备的限进型手性色谱整体柱RA-CD-MC对血浆中氯噻酮(见图3)和扑尔敏进行分离(见图4)。结果表明该整体柱能在近死体积的情况下排阻血浆中的大分子蛋白类物质，而对进入内层的手性药物有较强的保留，且能达到手性分离的效果。

色谱条件：流动相，氯噻酮：甲醇/(0.3％三乙胺乙酸缓冲液,pH4.9)(1/9,v/v)；扑尔敏：乙腈/(0.3％三乙胺乙酸缓冲液,pH6.8)(梯度洗脱：0-40分钟,1/9-25/75,v/v).，流速：1.0毫升/分钟，检测波长为254nm。

Claims (10)

1.一种限进型手性色谱整体柱的制备方法，其特征在于，它包括如下步骤：

(1)将甲基丙烯酸间硝基苯酯、二甲基丙烯酸乙二醇酯、偶氮二异丁腈、溴化铜和N,N,N',N,'N”-五甲基二亚乙基三胺溶解于乙腈与月桂醇的混合溶液中，通入氮气置换溶液中的空气后，将该溶液注射入空的第一不锈钢色谱柱中，密封，水浴条件下聚合，得到的整体柱MC；

(2)将整体柱MC接到HPLC仪器上，以甲醇和水的混合溶液洗脱，然后将含β-环糊精的碳酸盐缓冲液以流动性方式注入色谱整体柱中，之后在加热条件下反应，上述洗脱、β-环糊精注入以及加热反应的过程重复三次后，得到β-环糊精修饰的整体柱CD-MC；

(3)将甲基丙烯酸羟乙酯、2-溴代异丁酰溴、溴化亚铜和N,N,N',N,'N”-五甲基二亚乙基三胺溶解于甲醇中得到混合溶液，利用高纯氮气除氧后，将混合溶液装入空的第二不锈钢色谱柱内，并连接到HPLC输液泵上，第二不锈钢色谱柱出口连接整体柱CD-MC，以甲醇为流动相输液后，将整体柱CD-MC拆下，密封，在水浴条件下加热反应，得到限进型手性整体柱RA-CD-MC。

2.根据权利要求1所述的限进型手性色谱整体柱的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，甲基丙烯酸间硝基苯酯、二甲基丙烯酸乙二醇酯、偶氮二异丁腈、溴化铜和N,N,N',N,'N”-五甲基二亚乙基三胺的摩尔比为(250～350):(250～350):1:1:2。

3.根据权利要求1所述的限进型手性色谱整体柱的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，甲基丙烯酸间硝基苯酯与乙腈与月桂醇的混合溶液的用量比为70～80mg:1mL；乙腈与月桂醇的体积比为85～95:5～15。

4.根据权利要求1所述的限进型手性色谱整体柱的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，80～90℃水浴条件下聚合反应20～30小时。

5.根据权利要求1所述的限进型手性色谱整体柱的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，甲醇和水的混合体积比为5～15:85～95；以甲醇和水的混合溶液洗脱30～40分钟。

6.根据权利要求1所述的限进型手性色谱整体柱的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，所述的含β-环糊精的碳酸盐缓冲液为含β-环糊精的碳酸钠缓冲液，其中β-环糊精浓度为15～25毫摩尔/升，所述的碳酸钠缓冲液为pH10～11、离子浓度为50～70毫摩尔/升的碳酸钠缓冲液；将含β-环糊精的碳酸盐缓冲液以流动性方式打入色谱整体柱中，之后在40～60℃加热条件下反应3～5小时。

7.根据权利要求1所述的限进型手性色谱整体柱的制备方法，其特征在于，步骤(3)中，甲基丙烯酸羟乙酯、2-溴代异丁酰溴、溴化亚铜和N,N,N',N,'N”-五甲基二亚乙基三胺的摩尔比为300～500：5：4：8；甲基丙烯酸羟乙酯在甲醇中的浓度为0.3～0.6毫摩尔/升。

8.根据权利要求1所述的限进型手性色谱整体柱的制备方法，其特征在于，步骤(3)中，将整体柱CD-MC拆下，密封，在50～70℃水浴条件下加热反应3～5小时。

9.权利要求1～8中任意一项所述的方法制备得到的限进型手性色谱整体柱。

10.权利要求9所述的限进型手性色谱整体柱在高效液相色谱直接进样条件下分离分析血浆样品中手性药物中的应用。