CN105381631B

CN105381631B - 一种鲜味肽亲和柱的制备方法

Info

Publication number: CN105381631B
Application number: CN201510661351.1A
Authority: CN
Inventors: 党亚丽; 高新昌; 包国良; 李青青; 吴庆其
Original assignee: Zhejiang Academy of Medical Sciences
Current assignee: Zhejiang Academy of Medical Sciences
Priority date: 2015-10-14
Filing date: 2015-10-14
Publication date: 2017-09-26
Anticipated expiration: 2035-10-14
Also published as: CN105381631A

Abstract

本发明公开了一种鲜味肽亲和柱的制备方法，该方法先合成受体蛋白T1R1、T1R3，再进一步采用蛋白T1R1/T1R3琼脂糖凝胶作为固相载体，载体上的蛋白T1R1/T1R3与鲜味肽相偶联，偶联后的鲜味肽又与固定相化学键合，该亲和柱制备方法简单，可重复使用，提高了纯化效率，从而提高了该方法的灵敏度，理论上可适用于多种样品基质，由于使用了蛋白受体T1R1/T1R3，对于鲜味肽的分离效果良好，偶联的特异性高，吸附量大，可重复多次使用。

Description

一种鲜味肽亲和柱的制备方法

技术领域

本发明涉及一种鲜味肽亲和柱的制备方法。

背景技术

近年来，肽呈味功能的理论和应用引起了各国学者的广泛关注。鲜味肽是鲜味食品味觉的主导作用成分。采用传统的柱层析手段，学者们从肉、干酪、海产品和农作物中分离了若干具有鲜味或鲜味增强作用的蛋白肽，如Noguchi等人从鱼蛋白水解产物中分离出鲜味低聚肽Glu-Glu、Ser-Glu-Glu、Glu-Ser、Thr-Glu、Glu-Asp、Asp-Glu-Ser和风味增强肽Gly-Leu、Pro-Glu、Val-Glu、B-Ala-His。Yamasaki等人采用木瓜蛋白酶水解牛肉后，通过凝胶过滤和离子交换层析分离纯化，从水解液中获得了八肽Lys-Gly-Asp-Glu-Glu-Ser-Leu-Ala，其本身不具有肉味，却与MSG有较好的协同作用，不影响其它味觉(酸、甜、苦、咸)而增强鲜味，因此被命名为美味增强肽。赵谋明等采用沪酿米曲霉产蛋白粗酶处理花生，通过凝胶过滤和反相高效液相色谱分离，获得了2种鲜味肽，Arg-Asn-Glu-Gln-Ser、Glu-Gly-Ser-Glu-Ala-Pro-Asp-Gly-Ser-Ser-Arg。除借助生物手段外，通过化学合成也能制备一些鲜味肽。Tamura等人根据Yamasaki的美味增强肽氨基酸序列，采用化学合成的Lys-Gly、Asp-Glu-Glu和Ser-Leu-Ala这三个肽段的混合物，或用Glu-Glu代替酸味三肽Asp-Glu-Glu和Ser-Leu-Ala这三个肽段的混合物，或用Glu-Glu代替酸味三肽Asp-Glu-Glu，获得了与原八肽相似的效果。德国食品化学研究所Beksan等人以谷氨酸与葡萄糖为原料，通过Amadori重排反应合成了化学肽N-(1-deoxy-D-fructos-1-yl)-L-glutamic acid，其具有类似肉汤鲜味。

日、韩在鲜味肽的性质、应用规律方面居世界领先地位，而我国在鲜味肽基础理论以及应用研究方面比较薄弱，尤其是鲜味肽的分离纯化技术是鲜味肽研究的瓶颈。

目前鲜味肽分离纯化的方法一般是采用沉淀、电泳、透析、层析和离心等，其主要存在的缺陷是：(1)耗时长，效率不高(2)分离的鲜味肽纯度不高(3)分离步骤复杂，所得纯品少，且活性难以保持。

亲和色谱(Affinity chromatography，AFC)以其高选择性、高收率且一步得到高纯度产品的技术优势，成为纯化蛋白质的最有效的技术之一，它是建立在目的蛋白质与固定化配基之间特异性可逆相互作用基础上的吸附色谱。

味觉受体T1R家族是2001年发现的，该家族成员与小鼠中传递味觉的Sac具有很高的同源性。2002年又发现T1R家族中的2个成员T1R1和T1R3联合组成了异源二聚体转导鲜味信号，从而使鲜味研究取得了新的突破。这些结果证明异源二聚体T1R1和T1R3联合介导了谷氨酸等鲜味物质的信号转导。

鲜味肽亲和柱能特异性的纯化样品中的鲜味肽，采用4％的柱状琼脂糖凝胶作为固相载体，琼脂糖凝胶与鲜味肽受体偶联形成吸附剂，装柱制得亲和柱，它能特异性的纯化样品中的鲜味肽。鲜味肽亲和柱可广泛应用于海产品、火腿等鲜味样品的分离纯化，该方法速度快、操作简单、准确性高，对提高纯化效率起到十分重要的作用。

采用鲜味受体蛋白特异性吸附鲜味肽的亲和柱目前尚未见报道。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术的不足，提供一种鲜味肽亲和柱的制备方法。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：一种鲜味肽亲和柱的制备方法，包括以下步骤：

(1)用基因重组方法合成T1R1基因和T1R3基因，T1R1的基因序列如SEQ ID NO.1所示，T1R3基因序列如SEQ ID NO.2所示；

(2)受体蛋白T1R1、T1R3的制备：将步骤(1)得到的T1R1基因和T1R3基因，分别亚克隆至pcDNA3.1(+)[EF550208.1]载体，并采用哺乳动物细胞进行表达，His纯化，得到受体蛋白T1R1和受体蛋白T1R3。

(3)亲和柱的制备

(3.1)将12g经溴化氰(CNBr)活化后的琼脂糖干胶悬浮于120mL浓度为1mmol/L的HCl溶液中溶涨，砂芯漏斗中抽洗15min。滤出固体，用蒸馏水反复冲洗至中性，于70℃条件真空干燥8h。

(3.2)将步骤2得到的受体蛋白T1R1和T1R3按照质量比1：1混合，溶解于300mL偶联缓冲液中，受体蛋白T1R1的质量分数为2.5％；再加入步骤(3.1)处理后的琼脂糖干胶，在37℃搅拌1h；然后用偶联缓冲液洗去未偶联的受体蛋白，收集偶联的T1R1/T1R3受体蛋白产物；所述偶联缓冲液中含有0.1mol/L的NaHCO₃，0.5mol/L的NaCl，偶联缓冲液的pH为8.3。

(3.3)在步骤(3.2)收集的偶联受体蛋白产物中加入5-10倍蛋白产物体积的0.1mol/L的Tris-HCl封闭缓冲液(pH 8.0)，室温下振荡反应2h，形成封闭后的偶联受体蛋白产物。

(3.4)用约5倍琼脂糖干胶体积的0.1mol/L醋酸缓冲液(pH 4.0，含0.5mol/LNaCl)和约5倍琼脂糖干胶体积的0.1mol/L Tris-HCl(pH 8.0，含0.5mol/L NaCl)先后交替洗涤步骤(3.3)封闭后的偶联受体蛋白产物。

(3.5)用PBS缓冲液(pH 7.4)悬浮步骤(3.4)洗涤后的产物，装入50mm×10mm柱管中，至胶的高度为75mm，用PBS平衡琼脂糖胶，封住口底，冰箱4℃保存，得到鲜味肽亲和柱。

进一步地，步骤(3.5)中，亲和柱的上样条件：pH 7.2，流速3mL/min，洗脱条件：0.1mol/L醋酸缓冲液(pH 4.0，含0.5mol/L NaCl)。

本发明之亲和柱，具有以下优点：(1)以鲜味受体蛋白T1R1和T1R3为吸附剂，能特异性吸附鲜味肽，纯化效率高；(2)偶联溴化氢活化的琼脂糖凝胶，其柱容量大，偶联率高；(3)鲜味肽样品采用固相萃取小柱进行前处理，整个分离纯化操作过程简单易行。

附图说明

图1为本发明实施例之鲜味受体蛋白T1R1纯化结果图；其中，Lane 1：Loadsample；Lane 2：Flowthrough；Lane 3：Elution-1by 50mM Imidazole；Lane 4：Elution-2by 50mM Imidazole；Lane 5：Elution-3by 50mM Imidazole；Lane 6：Elution-1by 500mMImidazole；Lane 7：Elution-2by 500mM Imidazole；Lane 8：Elution-2by 500mMImidazole(non-reduced)；Lane 9：Elution-3by 500mM Imidazole；MK：Molecular weightmarker；

图2为本发明实施例之鲜味受体蛋白T1R3纯化结果图；其中，Lane 1：Loadsample；Lane 2：Flowthrough；Lane 3：Elution-1by 50mM Imidazole；Lane 4：Elution-2by 50mM Imidazole；Lane 5：Elution-3by 50mM Imidazole；Lane 6：Elution-1by 500mMImidazole；Lane 7：Elution-2by 500mM Imidazole；Lane 8：Elution-2by 500mMImidazole(non-reduced)；Lane 9：Elution-3by 500mM Imidazole；MK：Molecular weightmarker；

图3为去离子水洗脱亲和柱的穿透峰图；

图4为0.1mol/L NaHCO₃(pH8.3，0.5mol/L NaCl)洗脱亲和柱的穿透峰图；

图5为0.1mol/L Tris-HCl(pH 8.0，含0.5mol/L NaCl)洗脱亲和柱的穿透峰图；

图6为0.1mol/L醋酸缓冲液(pH 4.0，含0.5mol/L NaCl)洗脱亲和柱的穿透峰图。

具体实施方式

以下结合实施例对本发明作进一步说明。

实施例1：本实施例之鲜味肽亲和柱的制备方法，包括以下步骤：

(1)受体蛋白T1R1和T1R3的纯化

用基因重组方法合成T1R1/T1R3基因，T1R1的基因序列如SEQ ID NO.1所示，T1R3基因序列如SEQ ID NO.2所示；

将步骤(1)得到的T1R1/T1R3基因，亚克隆至pcDNA3.1(+)[EF550208.1]载体，并采用哺乳动物细胞进行表达，His纯化，得到受体蛋白T1R1/T1R3；纯化后的受体蛋白T1R1/T1R3如图1和2所示。说明采用基因重组方法可制备鲜味肽亲和柱柱材，且其能特异性吸附鲜味肽，从而保证亲和柱的纯化效果。

(2)亲和柱制备

2.1 洗涤

将12g经溴化氰(CNBr)活化后的琼脂糖干胶悬浮于120mL浓度为1mmol/L的HCl溶液中溶涨，砂芯漏斗中抽洗15min。滤出固体，用蒸馏水反复冲洗至中性，于70℃条件真空干燥8h。

2.2 偶联

将步骤1得到的受体蛋白T1R1和T1R3按照质量比1:1混合，溶解于300mL偶联缓冲液中，受体蛋白T1R1的质量分数为2.5％；再加入步骤(2.1)处理后的琼脂糖干胶，在37℃搅拌1h；然后用偶联缓冲液洗去未偶联的受体蛋白，分别收集偶联的T1R1/T1R3受体蛋白产物和洗脱液，紫外分光光度计280nm处测定洗脱液中未联蛋白含量，计算偶联率；

2.3 封闭

在步骤2.2收集的偶联的受体蛋白产物中加入蛋白产物体积5-10倍的0.1mol/LpH 8.0的Tris-HCl封闭缓冲液，室温下振荡反应2h，形成封闭后的偶联受体蛋白产物。

2.4 洗涤

用约5倍琼脂糖干胶体积的0.1mol/L醋酸缓冲液(pH 4.0，含0.5mol/L NaCl)和约5倍琼脂糖干胶体积的0.1mol/L Tris-HCl(pH 8.0，含0.5mol/L NaCl)先后交替洗涤步骤2.3封闭后的偶联受体蛋白产物4～6次。

2.5 装柱

用PBS缓冲液(0.01mol/L，pH 7.4)悬浮步骤2.4洗涤后的产物，装入50mm×10mm柱管中，至胶的高度为75mm，PBS平衡琼脂糖胶，封住口底，冰箱4℃保存，得到鲜味肽亲和柱。亲和柱的上样条件：pH 7.2，流速3mL/min，洗脱条件：0.1mol/L醋酸缓冲液(pH 4.0，含0.5mol/L NaCl)。

(3)柱性能评价

柱容量测定：

首先加入800mg的肽标准品，通过亲和柱，经洗脱，利用ELISA测定洗脱液中的肽含量为500mg，由此可知此亲和柱可吸附500mg鲜味肽，即该柱的柱容量为500mg。

偶联率测定：

蛋白浓度＝(A₀-A₁)/1.35×稀释倍数；

偶联率(％)＝(偶联前蛋白总量-未偶联蛋白总量)/偶联前蛋白总量×100％；

注：A₀-受体蛋白在280nm处的吸光度值；A₁-空白对照的吸光度值；1.35-蛋白系数。

利用上述测定方法，由计算公式得偶联率。结果表明：偶联前肽含量为139mg，偶联后剩余小肽含量为27mg，则偶联率为80％，说明偶联效果较好。

(4)以添加800mg Glu-Glu鲜味肽标准品的火腿为原料，采用固相萃取小柱对火腿鲜味肽进行分离纯化。接着将预处理后的鲜味肽与0.01mol/L，pH7.0的磷酸盐缓冲液混合，并进行最佳分离纯化条件筛选，结果如图3-6所示，偶联缓冲液中0.1mol/L醋酸缓冲液(pH4.0，含0.5mol/L NaCl)洗脱效果较好。图3和4表明，增大离子强度，峰面积明显增大，总得率也有所增加；图5和6表明洗脱液的酸碱性对洗脱效果影响不大，仅峰的比例稍有不同。

该亲和柱能特异性的纯化样品中的鲜味肽，仅需一步纯化即可得到鲜味肽，鲜味肽的纯度达90％以上。该方法速度快、操作简单、准确性高，对提高提取效率起到十分重要的作用。

Claims

1.一种鲜味肽亲和柱的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）用基因重组方法合成T1R1基因和T1R3基因，T1R1的基因序列如SEQ ID NO.1所示，T1R3基因序列如SEQ ID NO.2所示；

（2）受体蛋白T1R1、T1R3的制备：将步骤（1）得到的T1R1基因和T1R3基因，分别亚克隆至pcDNA3.1(+)[EF550208.1]载体，并采用哺乳动物细胞进行表达，His纯化，得到受体蛋白T1R1和受体蛋白T1R3；

（3）亲和柱的制备

（3.1）将12g经溴化氰(CNBr)活化后的琼脂糖干胶悬浮于120 mL浓度为1mmol/L的HCl溶液中溶涨，砂芯漏斗中抽洗15 min；滤出固体，用蒸馏水反复冲洗至中性，于70℃条件真空干燥8h；

（3.2）将步骤2得到的受体蛋白T1R1和T1R3按照质量比1:1混合，溶解于300mL偶联缓冲液中，受体蛋白T1R1的质量分数为2.5%；再加入步骤（3.1）处理后的琼脂糖干胶，在37℃搅拌1h；然后用偶联缓冲液洗去未偶联的受体蛋白，收集偶联的T1R1/T1R3受体蛋白产物；所述偶联缓冲液中含有0.1 mol/L的NaHCO₃，0.5 mol/L的NaCl，偶联缓冲液的pH为8.3；

（3.3）在步骤（3.2）收集的偶联受体蛋白产物中加入5-10倍蛋白产物体积的0.1 mol/L的Tris-HCl 封闭缓冲液，所述Tris-HCl 封闭缓冲液pH 为8.0，室温下振荡反应2 h，形成封闭后的偶联受体蛋白产物；

（3.4）用5倍琼脂糖干胶体积的0.1 mol/L醋酸缓冲液和约5倍琼脂糖干胶体积的0.1mol/L Tris-HCl先后交替洗涤步骤（3.3）封闭后的偶联受体蛋白产物，所述醋酸缓冲液pH为4.0，其中含0.5 mol/L NaCl；所述Tris-HClpH 为8.0，其中含0.5 mol/L NaCl；

（3.5）用PBS缓冲液悬浮步骤（3.4）洗涤后的产物，所述PBS缓冲液pH为 7.4，装入50mm×10mm柱管中，至胶的高度为75mm，用PBS平衡琼脂糖胶，封住口底，冰箱4℃保存，得到鲜味肽亲和柱。

2.根据权利要求1所述的鲜味肽亲和柱的制备方法，其特征在于，步骤（3.5）中，亲和柱的上样条件：pH 7.2，流速3 mL/min，洗脱条件：0.1 mol/L醋酸缓冲液，所述醋酸缓冲液的pH 4.0，其中含0.5 mol/L NaCl。