CN104059127A - 一种天然高活性降血压肽及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种天然高活性降血压肽，含有P16降血压肽和P18降血压肽，其中P16降血压肽的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，P18降血压肽的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示，该降血压肽成分和结构明确，降血压活性好；还公开了上述天然高活性降血压肽的制备方法，该制备方法工艺简洁，成本低，可规范化产品质量，最后还公开了上述天然活性降血压多肽在制备具有降血压功效的药物或食品中的应用。

Description

一种天然高活性降血压肽及其制备方法和应用
技术领域
本发明多肽技术领域，具体涉及一种天然高活性降血压肽及其制备方法和应用。
背景技术
降血压肽是一类具有ACE抑制活性的多肽物质，通常由蛋白酶在温和条件下水解蛋白质而获得，食用安全性高，只对高血压患者起到降压作用，对血压正常者无降压作用。高血压是一种常见的心血管疾病，它不仅患病率高，而且常引起严重的心、脑、肾等其他疾病，是脑卒中、冠心病、心力衰竭和肾脏疾病主要的危险因素。据卫生部、科技部、国家统计局2004年10月统计，我国18岁及以上居民高血压发病率达18.8％，患病人数1.6亿多，比1991年增加7000多万人，并每年还在以300万人的速度递增。目前化学合成的降压药物，如赖诺普利(Lisinopril)，培哚普利(Perindopril)，虽然治疗高血压的效果非常明显，但是长期服用易引起皮疹、蛋白尿等不良反应。因此，研究开发高效安全的降血压药物已经成为国内外科学家积极探索的课题。而降血压肽通常由蛋白酶在温和条件下水解蛋白质而获得，食用安全性高。所以研究开发天然、安全的降血压肽具有重要的意义。
中国专利公开的《一种酪蛋白降血压肽的制备方法》(申请公布号CN102296100A)，采用胃蛋白酶、胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶分步酶解酪蛋白、经过灭酶，离心、干燥后得到降血压肽初品，再经过大孔吸附脂和萄聚糖凝胶层析得到具有ACE抑制活性的酪蛋白降血压肽。但没有指明特定的降血压肽成分和结构，也没有验证最终得到的产品是否具有降血压活性。
中国专利公开的《牦牛乳酪蛋白降血压肽的制备方法》(申请公布号CN102787155A)，涉及一种利用牦牛乳酪蛋白为原料制备降血压肽的方法，主要通过胰蛋白酶水解、灭酶、沉淀酪蛋白、超滤、纯滤、喷雾干燥等工艺制备了ACE抑制活性高的降血压肽混合样品。但也未对降血压活性最高的降血压肽成分进行结构鉴定，不能规范化产品质量。
发明内容
本发明的目的在于提供一种天然活性降血压肽，该降血压肽成分和结构明确，降血压活性好。
本发明的目的还在于提供上述天然活性降血压肽的制备方法，该制备方法工艺简洁，可规范化产品质量。
本发明的最后一个目的在于提供上述天然活性降血压多肽在制备具有降血压功效的药物或食品中的应用。
本发明的第一个目的是通过如下技术方案来实现的：一种天然高活性降血压肽，含有P16降血压肽和P18降血压肽，其中P16降血压肽的氨基酸序列如SEQID No.1所示，P18降血压肽的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。
本发明通过HPLC-MS/ESI测得P16降血压肽和P18降血压肽的分子量，经Edman反应测P16降血压肽和P18两个降血压肽的氨基酸序列，其中P16降血压肽的氨基酸序列为GPFPIIV(Gly-Pro-Phe-Pro-Ile-Ile-Val)，分子量为741.2Da，属于β酪蛋白203-209的片段(β-CN f(203-209))，在浓度为1mg/mL时，对ACE酶的抑制率可高达53.83％，其中P18降血压肽具有FFVAPFPEVFGK(NH2-Phe-Phe-Val-Ala-Pro-Phe-Pro-Glu-Val-Phe-Gly-Lys)的氨基酸序列，分子量为1385.1Da，属于αS1酪蛋白23-34的片段(αS1-CNf(23-34))，在浓度为1mg/mL时，对ACE酶的抑制率可高达70.00％。
其中本发明中P16降血压肽与P18降血压肽二者的质量份比优选为0.01～99.9:99.9～0.01，优选的P16降血压肽与P18降血压肽二者的质量份比为10～90:90～10，更进一步优选的，P16降血压肽与P18降血压肽二者的质量份比为30～70:70～30，较佳的，P16降血压肽与P18降血压肽二者的质量份比为40～60:60～40。
其中P16降血压肽与P18降血压肽可以一起被制备出来，也可以分别制备获得，比如P16降血压肽单体可以通过以下方法制备获得：
(1)取酪蛋白，加水溶解后，得酪蛋白的水溶液；
(2)在酪蛋白的水溶液中加入胰蛋白酶进行酶解，胰蛋白酶的加入量占酪蛋白总质量的0.1～0.2％，酶解温度为40～50℃，酶解时间为1～2h，pH值为7.0～9.0，酶解后进行灭酶处理，得灭酶液；
(3)调节pH值为4.0～5.0使灭酶液中未酶解的大分子进行蛋白沉淀，并除去未酶解的大分子蛋白沉淀，得含有降血压肽的清液；
(4)将含有降血压肽的清液采用HPLC进行反相硅胶纯化，收集含目标物的洗脱液，将洗脱液浓缩干燥后，即获得降血压肽。
在P16降血压肽单体的制备方法中：
步骤(1)中所述水的用量为酪蛋白总质量的4～6倍，溶解温度为40～60℃。
步骤(2)中灭酶时的温度为80～90℃，灭酶时间为20～30min。
步骤(3)中采用过滤或离心方式除去未酶解的大分子蛋白质沉淀，离心时离心机转速为3000～5000r/min，离心时间为20～30min。
步骤(4)HPLC采用LC-8A岛津高效液相色谱仪，色谱柱为HW-0121，色谱条件为：流速：8mL/min，检测波长：214nm，进样量：2mL，流动相：A泵超纯水，含体积百分含量为0.1％的TFA，B泵乙腈，B泵初始浓度为25％，洗脱方式，二元梯度洗脱，洗脱梯度：0.01～60min，25～36％，60.01min～80min，36％，80.01～90min，90％～90％，90.01～100min，90％～25％。
其中P18降血压肽单体的具体制备方法具体可以参阅文献Maruyama S,Suzuki H.Peptide inhibitor of angiotensin I converting enzyme in the tryptichydrolysate of casein[J].Agricultural Biological Chemistry,1982,46(5):1393-1394。
P16降血压肽与P18降血压肽也可以采用下面的方法同时制备获得。
本发明的第二个目的是通过如下技术方案来实现的：上述天然高活性降血压肽的一种优选的制备方法，含以下步骤：
(1)取酪蛋白，加水溶解，得酪蛋白水溶液；
(2)在酪蛋白水溶液中加入复合蛋白酶进行酶解，所述复合蛋白酶的添加量为酪蛋白总质量的0.1～0.2％，所述复合蛋白酶为胰蛋白酶、无花果蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰凝乳蛋白酶和菠萝蛋白酶中的两种以上，酶解温度为40～50℃，酶解时间为1～2h，pH值为7.0～9.0，酶解后进行灭酶处理，得灭酶液；
(3)调节灭酶液pH值为4.0～5.0，使灭酶液中未酶解的大分子蛋白沉淀，除去大分子蛋白沉淀，得到含有P16降血压肽和P18降血压肽的清液；
(4)将含有P16降血压肽和P18降血压肽的清液采用截留分子量为2000Da的超滤膜过滤，得到分子量小于2000Da的降血压多肽溶液，经干燥处理，得到含有P16降血压肽和P18降血压肽的天然高活性降血压肽。
在上述制备方法中：
本发明步骤(1)中水的用量优选占酪蛋白总质量的3～4倍，溶解时的温度优选为40～50℃。
本发明步骤(2)中所述胰蛋白酶的用量优选占所述复合蛋白酶总质量的10～50％，所述无花果蛋白酶的用量优选占所述复合蛋白酶总质量的10～50％，所述木瓜蛋白酶的用量优选占所述复合蛋白酶总质量的10～50％，所述胰凝乳蛋白酶的用量优选占所述复合蛋白酶总质量的10～50％，所述菠萝蛋白酶的用量优选占所述复合蛋白酶总质量的10～50％。
采用2种以上的尤其是四种蛋白酶同时酶解酪蛋白时，可以得到更多的小分子蛋白。
本发明步骤(2)中灭酶处理时温度优选为80～90℃，时间优选为20～30min。
本发明步骤(3)中优选采用过滤或离心处理除去大分子蛋白沉淀。
本发明步骤(4)中所述的干燥可以采用冷冻干燥、喷雾干燥或真空干燥等，但并不仅限于这几种。
本发明步骤(4)中得到含有P16降血压肽和P18降血压肽的天然高活性降血压肽中P16降血压肽和P18降血压肽的质量百分含量高于40％。
采用上述方法获得的含有P16降血压肽和P18降血压肽的天然高活性降血压肽，其纯度高，溶解性好，流动性好，颜色为纯白色，对ACE酶的抑制活性高，成本低。
本发明的最后一个目的是通过如下技术方案来实现的：上述的天然高活性降血压肽在制备具有降血压作用的药物或食品中的应用。
本发明利用复合蛋白酶分步水解酪蛋白，利用调等电点、过滤等脱大分子蛋白，利用膜过滤得到分子量小于2000Da的小分子多肽，多肽中P16降血压肽和P18降血压肽的含量总和大于40％，经具体实施例中的试验发现，在浓度为1mg/mL时，对ACE酶的抑制率大于53％，因此可以用于制备具有降血压作用的药物。
本发明具有如下优点：
(1)本发明中的天然高活性降血压肽，其成分和结构明确，分子量主要在500-1500Da之间，颜色为纯白色，其溶解性好，流动性好，纯度高；
(2)本发明中天然高活性降血压肽的制备方法，含酶解、灭酶、沉淀蛋白、膜过滤、干燥等工序，其工艺简单，可批量化生产；
(3)本发明制备获得的天然高活性降血压肽，其能有效地抑制ACE酶的活性，其中P16降血压肽和P18降血压肽的质量百分含量的总和大于40％，对ACE酶的抑制率大于53％，该天然高活性降血压肽具有巨大的实用价值和经济效益，提高了产品附加值，能促进降血压肽产品的升级。
附图说明
图1是本发明实施例1-11中P16降血压肽和P18降血压肽含量之和≥40％的天然高活性降血压肽的高效液相色谱图；
图2是本发明实施例1-11中P16降血压肽的高效液相色谱图；
图3是本发明实施例1-11中P18降血压肽高效液相色谱图；
图4是本发明实施例1-11中P16降血压肽质谱图；
图5是本发明实施例1-11中P18降血压肽质谱图。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明做进一步说明，但不以任何形式限制本发明。
实施例1
本实施例提供的天然高活性降血压肽，含有P16降血压肽和P18降血压肽，其中P16降血压肽的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，P18降血压肽的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。
该天然高活性降血压肽的制备方法，含以下步骤：
(1)向反应釜中加纯水750L，开搅拌200rpm，向反应釜中缓慢投入酪蛋白(恒天然进口酪蛋白，仅为列举，并不仅限于此)250kg，在50℃条件下搅拌溶解；
(2)加入复合蛋白酶进行酶解，酶解条件为：加入胰蛋白酶：无花果蛋白酶：木瓜蛋白酶：胰凝乳蛋白酶＝4:3:2:1(质量比)的复合蛋白酶，加酶量为酪蛋白总质量的0.2％，反应温度为50℃，反应时间为2h，pH值为9.0；
(3)将温度调节至90℃，保温30min，进行灭酶；
(4)调pH值5.0，过滤除去未酶解的大分子蛋白沉淀，得到含有P16降血压肽和P18降血压肽的清液；
(5)将得到含有P16降血压肽和P18降血压肽的清液利用超滤膜(截留分子量为2000Da)分离出降血压肽，得到小于2000Da的降血压多肽溶液；
(6)干燥，经过真空干燥，将得到产物干燥成粉，得到含有P16降血压肽和P18降血压肽的天然高活性降血压肽；
(7)测定分子量和氨基酸序列
将得到的含有P16降血压肽和P18降血压肽的天然高活性降血压肽的产品进液相，判断保留时间，具体色谱图如图1-3中所示。
通过HPLC-MS/ESI测得P16、P18的分子量，Edman反应测两个活性肽的氨基酸序列，其中P16降血压肽的HPLC-MS/ESI如图4中所示，P18降血压肽的HPLC-MS/ESI如图5中所示，P16降血压肽的序列为GPFPIIV(Gly-Pro-Phe-Pro-Ile-Ile-Val)，分子量为741.2Da，属于β酪蛋白203-209的片段(β-CN f(203-209))，P18降血压肽具有FFVAPFPEVFGK(NH2-Phe-Phe-Val-Ala-Pro-Phe-Pro-Glu-Val-Phe-Gly-Lys)的序列，分子量为1385.1Da，属于αS1酪蛋白23-34的片段(αS1-CN f(23-34))。
(8)ACE(血管紧张素转化酶)抑制活性测定：马尿酸法
a)反应液的制备
在样品管中加入10μL浓度为0.2U/mL的ACE溶液和10μL的样品溶液(本实施例中制备的降血压肽，配成1mg/mL溶液，按表1增加)，于37℃下保温5min，加入50μL浓度为6.5mmol·L-1的HHL溶液，混匀后在37℃下保温60min，再加85μL浓度为1.0moL/L的盐酸溶液静置5min终止反应，具体操作步骤如表1所示。
表1 ACE抑制活性马尿酸检测法反应液制备步骤
b)色谱条件
1.色谱柱：Diamonsil C18(200mm×4.6mm，5μm)
2.流动相与色谱条件：乙腈:超纯水＝25:75(含0.1％(v/v)TFA)，流速：1mL/min；检测波长：228nm；进样量：20μL。
c)结果计算
R = A - B - A 0 A - A 0 × 100 %
式中：
R：ACEI样品对ACE的抑制率(％)，
A：对照管中马尿酸的峰面积，
B：样品管中马尿酸的峰面积，
A0：空白管中马尿酸的峰面积。
在上述条件下，得到降血压肽17.5kg，降血压肽中P16降血压肽和P18降血压肽含量总和为43.96％，在浓度为1mg/mL时，ACE抑制率为55.4％，分子量为500Da～1500Da，溶解性好、20％(质量百分含量)降血压肽的乙醇溶液澄清透明，可用作制备具有降血压作用的药物或食品。
实施例2
本实施例提供的天然高活性降血压肽，含有P16降血压肽和P18降血压肽，其中P16降血压肽的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，P18降血压肽的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。
该天然高活性降血压肽的制备方法，含以下步骤：
(1)向反应釜中加纯水1000L，开搅拌200rpm，向反应釜中缓慢投入酪蛋白250kg，在45℃条件下搅拌溶解；
(2)加入复合蛋白酶进行酶解，酶解条件为：胰蛋白酶：木瓜蛋白酶：胰凝乳蛋白酶：菠萝蛋白酶(10％～50％)＝2:3:4:1的复合蛋白酶，加酶量为酪蛋白总质量的0.1％，反应温度45℃，反应时间1.5h，pH8.0；
(3)将温度调节至80℃，保温30min，进行灭菌；
(4)调pH值4.6，过滤除去未酶解的大分子蛋白沉淀，得到含有P16降血压肽和P18降血压肽的清液；
(5)将含有P16降血压肽和P18降血压肽的清液利用超滤膜(截留分子量为2000Da)分离出降血压肽，得到截留分子量小于2000Da的降血压肽溶液；
(6)干燥，对降血压肽溶液进行喷雾干燥，得到天然高活性降血压肽成品；
(7)测定分子量和氨基酸序列
将得到的含有P16降血压肽和P18降血压肽的天然高活性降血压肽的产品进液相，判断保留时间，具体色谱图如图1-3中所示。
通过HPLC-MS/ESI测得P16、P18的分子量，Edman反应测两个活性肽的氨基酸序列，其中P16降血压肽的HPLC-MS/ESI如图4中所示，P18降血压肽的HPLC-MS/ESI如图5中所示，P16降血压肽的序列为GPFPIIV(Gly-Pro-Phe-Pro-Ile-Ile-Val)，分子量为741.2Da，属于β酪蛋白203-209的片段(β-CN f(203-209))，P18降血压肽具有FFVAPFPEVFGK(NH2-Phe-Phe-Val-Ala-Pro-Phe-Pro-Glu-Val-Phe-Gly-Lys)的序列，分子量为1385.1Da，属于αS1酪蛋白23-34的片段(αS1-CN f(23-34))。
(8)ACE(血管紧张素转化酶)抑制活性测定：马尿酸法
测试方法同实施例1，得到降血压肽19.3kg，P16降血压肽和P18降血压肽质量百分含量总和为46.32％，在浓度为1mg/mL时，ACE抑制率为57.84％，分子量为500Da～1500Da，溶解性好、20％降血压肽的乙醇溶液澄清透明，可用作制备具有降血压作用的药物或食品。
实施例3
本实施例提供的天然高活性降血压肽，含有P16降血压肽和P18降血压肽，其中P16降血压肽的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，P18降血压肽的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。
该天然高活性降血压肽的制备方法，含以下步骤：
(1)向反应釜中加纯水900L，开搅拌200rpm，向反应釜中缓慢投入酪蛋白250kg，在40℃条件下搅拌溶解；
(2)加入复合蛋白酶进行酶解，酶解条件为：无花果蛋白酶：木瓜蛋白酶：胰凝乳蛋白酶：菠萝蛋白酶＝4:1:3:2的复合蛋白酶，加酶量为酪蛋白总质量的0.2％，反应温度为40℃，反应时间为1h，pH为7.0；
(3)将温度调节至85℃，保温25min，进行灭菌；
(4)调pH值4.0，离心除去未酶解的大分子蛋白沉淀，得到含有P16降血压肽和P18降血压肽的清液；
(5)将含有P16降血压肽和P18降血压肽的清液利用超滤膜(截留分子量2000Da)分离出降血压肽，得到截留分子量小于2000Da的降血压多肽溶液；
(6)干燥，对上清液进行喷雾干燥，得到的降血压肽成品；
(7)测定分子量和氨基酸序列
将得到的含有P16降血压肽和P18降血压肽的天然高活性降血压肽的产品进液相，判断保留时间，具体色谱图如图1-3中所示。
通过HPLC-MS/ESI测得P16、P18的分子量，Edman反应测两个活性肽的氨基酸序列，其中P16降血压肽的HPLC-MS/ESI如图4中所示，P18降血压肽的HPLC-MS/ESI如图5中所示，P16降血压肽的序列为GPFPIIV(Gly-Pro-Phe-Pro-Ile-Ile-Val)，分子量为741.2Da，属于β酪蛋白203-209的片段(β-CN f(203-209))，P18降血压肽具有FFVAPFPEVFGK(NH2-Phe-Phe-Val-Ala-Pro-Phe-Pro-Glu-Val-Phe-Gly-Lys)的序列，分子量为1385.1Da，属于αS1酪蛋白23-34的片段(αS1-CN f(23-34))。
(8)ACE(血管紧张素转化酶)抑制活性测定：马尿酸法
测试方法同实施例1，得到降血压肽15.9kg，P16降血压肽和P18降血压肽含量总和为41.69％，在浓度为1mg/mL时，ACE抑制率为54.29％，分子量为500Da～2000Da，溶解性好、20％降血压肽的乙醇溶液澄清透明，可用作制备具有降血压作用的药物或食品。
实施例4
本实施例提供的天然高活性降血压肽，含有P16降血压肽和P18降血压肽，其中P16降血压肽的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，P18降血压肽的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。
该天然高活性降血压肽的制备方法，含以下步骤：
(1)向反应釜中加纯水800L，开搅拌200rpm，向反应釜中缓慢投入酪蛋白250kg，在48℃条件下搅拌溶解；
(2)加入复合蛋白酶进行酶解，酶解条件为：无花果蛋白酶和菠萝蛋白酶＝5:5的复合蛋白酶，加酶量为酪蛋白总质量的0.15％，反应温度为42℃，反应时间为1.8h，pH为7.2；
(3)将温度调节至88℃，保温22min，进行灭菌；
(4)调pH值4.3，离心除去未酶解的大分子蛋白沉淀，得到含有P16降血压肽和P18降血压肽的清液；
(5)将含有P16降血压肽和P18降血压肽的清液利用超滤膜(截留分子量2000Da)分离出降血压肽，得到截留分子量小于2000Da的降血压多肽溶液；
(6)干燥，对上清液进行喷雾干燥，得到的降血压肽成品；
(7)测定分子量和氨基酸序列
将得到的含有P16降血压肽和P18降血压肽的天然高活性降血压肽的产品进液相，判断保留时间，具体色谱图如图1-3中所示。
通过HPLC-MS/ESI测得P16、P18的分子量，Edman反应测两个活性肽的氨基酸序列，其中P16降血压肽的HPLC-MS/ESI如图4中所示，P18降血压肽的HPLC-MS/ESI如图5中所示，P16降血压肽的序列为GPFPIIV(Gly-Pro-Phe-Pro-Ile-Ile-Val)，分子量为741.2Da，属于β酪蛋白203-209的片段(β-CN f(203-209))，P18降血压肽具有FFVAPFPEVFGK(NH2-Phe-Phe-Val-Ala-Pro-Phe-Pro-Glu-Val-Phe-Gly-Lys)的序列，分子量为1385.1Da，属于αS1酪蛋白23-34的片段(αS1-CN f(23-34))。
(8)ACE(血管紧张素转化酶)抑制活性测定：马尿酸法
测试方法同实施例1，得到降血压肽15.9kg，P16降血压肽和P18降血压肽含量总和为41.69％，在浓度为1mg/mL时，ACE抑制率为54.5％，分子量为500Da～2000Da，溶解性好、20％降血压肽的乙醇溶液澄清透明，可用作制备具有降血压作用的药物或食品。
本发明上述实施例所制得的降血压肽中，P16降血压肽和P18降血压肽含量之和≥40％，对ACE酶的抑制率大于53％，流动性好、20％(质量百分含量)降血压肽的乙醇溶液澄清透明，颜色为纯白色粉末，制备的乳源性降血压肽的分子量主要在500～1500Da之间，有利于人体吸收，是一种成本低，工艺简单的制备方法，适合工业化生产，可用作制备具有降血压作用的药物或食品。
实施例5
本实施例提供的天然高活性降血压肽，含有P16降血压肽和P18降血压肽，其中P16降血压肽的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，P18降血压肽的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示，其中P16降血压肽和P18降血压肽二者的质量比为3:5。其中P16降血压肽通过以下方法制备获得：
(1)向烧杯中加纯水600mL，开搅拌200rpm，向烧杯中缓慢投入酪蛋白100g，在50℃条件下搅拌溶解；
(2)加入胰蛋白酶进行酶解，酶解条件为：加酶量为酪蛋白质量的0.2％，反应温度50℃，反应时间2h，pH9.0；
(3)将温度调节至90℃，保温20min，进行灭酶；
(4)调pH值5.0，5000r/min离心20min，除去未酶解的大分子蛋白沉淀；
(5)反相硅胶纯化，洗脱液再进行反相硅胶纯化，HPLC系统：LC-8A岛津制备高效液相色谱仪；色谱柱：HW－0121；色谱条件：流速：8mL/min；检测波长：214nm；进样量：2mL；流动相：A泵超纯水(含0.1％(v/v)TFA)，B泵乙腈，B泵初始浓度为25％；洗脱方式：二元梯度洗脱；洗脱梯度：0.01min～60min，25％～36％；60.01min～80min，36％；80.01min～90min，90％～90％；90.01min～100min，90％～25％。重复进样，收集P16洗脱峰，收集过程同实施例1；
(6)将高活性降血压肽洗脱液离心后，收集上清液，真空浓缩，冷冻干燥，得到P16降血压肽单体；
(7)降血压肽的鉴定
根据图4中的液质联用测定P16分子量，再到上海中科新生命生物科技有限公司做Edman降解，测定P16一级结构，再与酪蛋白的氨基酸排列比对验证可知，本发明中获得的降血压肽P16的氨基酸序列为GPFPIIV(Gly-Pro-Phe-Pro-Ile-Ile-Val)，具体如SEQ ID No.1中所示。
其中P18降血压肽单体的具体制备方法具体可以参阅文献Maruyama S,Suzuki H.Peptide inhibitor of angiotensin I converting enzyme in the tryptichydrolysate of casein[J].Agricultural Biological Chemistry,1982,46(5):1393-1394中公开的制备方法，获得的降血压肽P18的氨基酸序列为FFVAPFPEVFGK(NH2-Phe-Phe-Val-Ala-Pro-Phe-Pro-Glu-Val-Phe-Gly-Lys)的序列，具体如SEQID No.2中所示。
实施例6
本实施例提供的天然高活性降血压肽，含有P16降血压肽和P18降血压肽，其中P16降血压肽的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，P18降血压肽的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示，其中P16降血压肽和P18降血压肽二者的质量比为99.9:0.01。其中P16降血压肽通过以下方法制备获得：
(1)向烧杯中加纯水4000mL，开搅拌200rpm，向烧杯中缓慢投入酪蛋白(恒天然食品级进口酪蛋白，仅为列举，并不仅限于此)1kg，在40℃条件下搅拌溶解，得酪蛋白的水溶液；
(2)在酪蛋白的水溶液中加入胰蛋白酶进行酶解，酶解条件为：加酶量为酪蛋白总质量的0.1％，反应温度40℃，反应时间1h，pH7.0；
(3)将温度调节至80℃，保温30min，进行灭菌；
(4)调pH值4.0，3000r/min离心30min，除去未酶解的大分子蛋白沉淀，得含有高活性降血压肽的清液；
(5)反相硅胶纯化，将含有高活性降血压肽的清液再进行反相硅胶纯化，HPLC系统：LC-8A岛津制备高效液相色谱仪；色谱柱：HW－0121；色谱条件：流速：8mL/min；检测波长：214nm；进样量：2mL；流动相：A泵超纯水(含0.1％(v/v)TFA，三氟乙酸)，B泵乙腈，B泵初始浓度为25％；洗脱方式：二元梯度洗脱；洗脱梯度：0.01min～60min，25％～36％；60.01min～80min，36％；80.01min～90min，90％～90％；90.01min～100min，90％～25％，重复进样，收集高活性降血压肽(命名为P16降血压肽)洗脱液，P16单峰液相图谱的保留时间如图1-2中所示；
(6)将高活性降血压肽洗脱液离心后，收集上清液，真空浓缩，冷冻干燥，得到P16降血压肽单体；
(7)降血压肽的鉴定
根据4中的液质联用测定P16分子量，再到上海中科新生命生物科技有限公司做Edman降解，测定P16一级结构，再与酪蛋白的氨基酸排列比对验证可知，本发明中获得的降血压肽的氨基酸序列为GPFPIIV(Gly-Pro-Phe-Pro-Ile-Ile-Val)，具体如SEQ ID No.1中所示。
其中P18降血压肽单体的具体制备方法具体可以参阅文献Maruyama S,Suzuki H.Peptide inhibitor of angiotensin I converting enzyme in the tryptichydrolysate of casein[J].Agricultural Biological Chemistry,1982,46(5):1393-1394中公开的制备方法，获得的降血压肽P18的氨基酸序列为FFVAPFPEVFGK(NH2-Phe-Phe-Val-Ala-Pro-Phe-Pro-Glu-Val-Phe-Gly-Lys)的序列，具体如SEQID No.2中所示。
实施例7
本实施例提供的天然高活性降血压肽，含有P16降血压肽和P18降血压肽，其中P16降血压肽的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，P18降血压肽的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示，其中P16降血压肽和P18降血压肽二者的质量比为0.01:99.9。其中P16降血压肽通过以下方法制备获得：
(1)取酪蛋白，加水溶解后，得酪蛋白的水溶液，其中水的用量为酪蛋白总质量的5倍，溶解温度为50℃；
(2)在酪蛋白的水溶液中加入胰蛋白酶进行酶解，胰蛋白酶的加入量占酪蛋白总质量的0.15％，酶解温度为45℃，酶解时间为1.5h，pH值为8.0，酶解后进行灭酶处理，灭酶时的温度为85℃，灭酶时间为25min，得灭酶液；
(3)调节pH值为4.5使灭酶液中未酶解的大分子进行蛋白沉淀，采用过滤方式除去未酶解的大分子蛋白沉淀，得含有高活性降血压肽的清液；
(4)将含有高活性降血压肽的清液采用HPLC进行反相硅胶纯化，HPLC系统：LC-8A岛津制备高效液相色谱仪；色谱柱：HW－0121；色谱条件：流速：8mL/min；检测波长：214nm；进样量：2mL；流动相：A泵超纯水(含0.1％(v/v)TFA)，B泵乙腈，B泵初始浓度为25％；洗脱方式：二元梯度洗脱；洗脱梯度：0.01min～60min，25％～36％；60.01min～80min，36％；80.01min～90min，90％～90％；90.01min～100min，90％～25％。重复进样，收集P16洗脱峰，收集过程同实施例1；
(5)将高活性降血压肽洗脱液离心后，收集上清液，真空浓缩，冷冻干燥，得到P16降血压肽单体。
(6)降血压肽的鉴定
根据图4中的液质联用测定P16分子量，再到上海中科新生命生物科技有限公司做Edman降解，测定P16一级结构，再与酪蛋白的氨基酸排列比对验证可知，本发明中获得的降血压肽的氨基酸序列为GPFPIIV(Gly-Pro-Phe-Pro-Ile-Ile-Val)，具体如SEQ ID No.1中所示。
其中P18降血压肽单体的具体制备方法具体可以参阅文献Maruyama S,Suzuki H.Peptide inhibitor of angiotensin I converting enzyme in the tryptichydrolysate of casein[J].Agricultural Biological Chemistry,1982,46(5):1393-1394中公开的制备方法，获得的降血压肽P18的氨基酸序列为FFVAPFPEVFGK(NH2-Phe-Phe-Val-Ala-Pro-Phe-Pro-Glu-Val-Phe-Gly-Lys)的序列，具体如SEQID No.2中所示。
实施例8
本实施例提供的天然高活性降血压肽，含有P16降血压肽和P18降血压肽，其中P16降血压肽的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，P18降血压肽的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示，其中P16降血压肽和P18降血压肽二者的质量比为40:60。其中P16降血压肽和P18降血压肽的制备方法同实施例4。
实施例9
本实施例提供的天然高活性降血压肽，含有P16降血压肽和P18降血压肽，其中P16降血压肽的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，P18降血压肽的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示，其中P16降血压肽和P18降血压肽二者的质量比为80:20。其中P16降血压肽和P18降血压肽的制备方法同实施例5。
实施例10
本实施例提供的天然高活性降血压肽，含有P16降血压肽和P18降血压肽，其中P16降血压肽的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，P18降血压肽的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示，其中P16降血压肽和P18降血压肽二者的质量比为50:50。其中P16降血压肽和P18降血压肽的制备方法同实施例6。
实施例11
本实施例提供的天然高活性降血压肽，含有P16降血压肽和P18降血压肽，其中P16降血压肽的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，P18降血压肽的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示，其中P16降血压肽和P18降血压肽二者的质量比为60:40。其中P16降血压肽和P18降血压肽的制备方法同实施例6。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种天然高活性降血压肽，其特征是：含有P16降血压肽和P18降血压肽，其中P16降血压肽的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，P18降血压肽的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。
2.根据权利要求1所述的天然高活性降血压肽，其特征是：所述P16降血压肽和P18降血压肽二者的质量份比为0.01～99.9:99.9～0.01。
3.根据权利要求2所述的天然高活性降血压肽，其特征是：所述P16降血压肽与P18降血压肽二者的质量份比为30～70:70～30。
4.根据权利要求3所述的天然高活性降血压肽，其特征是：所述P16降血压肽与P18降血压肽二者的质量份比为40～60:60～40。
5.权利要求1-4任一项所述的天然高活性降血压肽的制备方法，其特征是含以下步骤：
(1)取酪蛋白，加水溶解，得酪蛋白水溶液；
(2)在酪蛋白水溶液中加入复合蛋白酶进行酶解，所述复合蛋白酶的添加量为酪蛋白总质量的0.1～0.2％，所述复合蛋白酶为胰蛋白酶、无花果蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰凝乳蛋白酶和菠萝蛋白酶中的四种，酶解温度为40～50℃，酶解时间为1～2h，pH值为7.0～9.0，酶解后进行灭酶处理，得灭酶液；
(3)调节灭酶液pH值为4.0～5.0，使灭酶液中未酶解的大分子蛋白沉淀，除去大分子蛋白沉淀，得到含有P16降血压肽和P18降血压肽的清液；
(4)将含有P16降血压肽和P18降血压肽的清液采用截留分子量为2000Da的超滤膜过滤，得到分子量小于2000Da的降血压多肽溶液，经干燥处理，得到含有P16降血压肽和P18降血压肽的天然高活性降血压肽。
6.根据权利要求5所述的天然高活性降血压肽的制备方法，其特征是：步骤(1)中水的用量占酪蛋白总质量的3～4倍，溶解时的温度为40～50℃。
7.根据权利要求5所述的天然高活性降血压肽的制备方法，其特征是：步骤(2)中所述胰蛋白酶的用量占所述复合蛋白酶总质量的10～50％，所述无花果蛋白酶的用量占所述复合蛋白酶总质量的10～50％，所述木瓜蛋白酶的用量占所述复合蛋白酶总质量的10～50％，所述胰凝乳蛋白酶的用量占所述复合蛋白酶总质量的10～50％，所述菠萝蛋白酶的用量占所述复合蛋白酶总质量的10～50％；步骤(2)中灭酶处理时温度为80～90℃，时间为20～30min。
8.根据权利要求5所述的天然高活性降血压肽的制备方法，其特征是：步骤(3)中采用过滤或离心处理除去大分子蛋白沉淀；步骤(4)中所述的干燥采用冷冻干燥、喷雾干燥或真空干燥；步骤(4)中得到含有P16降血压肽和P18降血压肽的天然高活性降血压肽中P16降血压肽和P18降血压肽的质量百分含量高于40％。
9.权利要求1中所述的天然高活性降血压肽在制备具有降血压作用的药物中的应用。
10.权利要求1中所述的天然高活性降血压肽在制备具有降血压作用的食品中的应用。
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