CN105859868A - 一种血管紧张素转化酶抑制肽及其制备方法 - Google Patents

一种血管紧张素转化酶抑制肽及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种血管紧张素转化酶抑制肽，其氨基酸序列为：Trp‑Tyr‑Leu‑His‑Tyr‑Ala。本发明还提供其制备方法，以酪蛋白为原料，采用木瓜蛋白酶进行水解，将水解液加热使蛋白酶失活，再以镍磁性琼脂糖微粒富集活性组分，高效液相色谱进一步分离，然后冷冻干燥，从而制备出ACE抑制肽。采用本发明制备工艺可以直接制得可食用的ACE抑制肽，也可以将其作为功能因子制成各类食品添加剂，或直接作为食品辅料添加到各类食品。

Description

一种血管紧张素转化酶抑制肽及其制备方法
技术领域
本发明涉及一种血管紧张素转化酶抑制肽及其制备方法。
背景技术
高血压是危及人类身体健康的主要疾病之一。根据世界卫生组织预测，至2020年，非传染性疾病将占我国死亡原因79%，其中高血压等心血管疾病将占首位。作用于肾素-血管紧张素系统的药物推出后被广泛应用于各种心血管疾病的治疗，并已被证明对高血压有较好的降压作用。血管紧张素抑制剂是临床上广泛应用的一种降血压药物，天然产物来源的血管紧张素抑制剂由于其以食物蛋白为原料，对于日渐追求天然绿色保健品与药品的人们来说将具有更大的吸引力。
食品蛋白经过水解可以获得含有丰富氨基酸蛋白质片段的生物活性肽，生物活性肽对人体生理节律起到调节作用，具有如清除自由基、抗疲劳、抗菌、抗血栓、免疫调节和降血压等多种功能，可达到预防或辅助治疗疾病、促进健康的目的。在发现的诸多生物活性肽中，血管紧张素转换酶(ACE)抑制肽（ACE抑制肽）尤为引人注目，它是通过抑制ACE的活性达到降低人或动物血压的作用，这就为更好地利用蛋白质资源，特别是一些原来认为生物效价不高的蛋白质资源提供了新的机遇和可能。
至今为止，人们已经利用多种蛋白酶水解各种食物蛋白，得到了超过200多种的ACE抑制肽，酪蛋白是较好的制备ACE抑制肽蛋白源，目前虽然已有多个ACE抑制肽从酪蛋白中分离得到，但酪蛋白仍是制备、分离新的ACE抑制肽的重要蛋白源。
发明内容
本发明提供了一种血管紧张转化酶抑制肽，是利用酪蛋白为原料，采用木瓜蛋白酶水解，经镍磁性琼脂糖微粒吸附分离、反相高效液相色谱分离得到的。用串联飞行时间质谱MALDI-TOF-TOF质谱测定的氨基酸序列为 Trp-Tyr-Leu-His-Tyr-Ala (WYLHYA)。对ACE具有较高的抑制作用，半数抑制浓度（IC50）为16.22 μM。
本发明的第一个目的是提供一种血管紧张素转化酶抑制肽，其多肽序列为：Trp-Tyr-Leu-His-Tyr-Ala。
本发明的第二个目的是提供上述血管紧张素转化酶抑制肽的制备方法，是利用酪蛋白为原料，采用木瓜蛋白酶水解得到酶解液，将酶解液分离纯化得到的。
作为优选，所述将酶解液分离纯化包括将酶解液用镍磁性琼脂糖微粒分离、反相高效液相分离纯化的步骤。
作为优选，所述反相高效液相的参数为：高效液相色谱系统为Agilent 1200；色谱柱为 C18色谱柱(4.6 mm×150 mm，5 μm)；检测器为DAD二极管阵列检测器；流动相由两溶剂组成，其中溶剂A相为水、B相为乙腈，A、B相均含0.05-0.2% 三氟乙酸（V/V）；洗脱梯度为60min以内，B相比例可由0%匀速升至100%；流速：0.5 -1mL·min-1；色谱柱温度控制在30-40℃；检测波长220 nm。
作为优选，所述采用木瓜蛋白酶水解制备酶解液的具体方法为：在pH6.5～8.5的酪蛋白水溶液中加入木瓜蛋白酶，水解温度为30～50℃，水解过程中维持体系pH恒定，水解时间为0.5-8h，水解结束后，调pH至中性，加热至100℃灭酶5～15min。
作为优选，所述酪蛋白与木瓜蛋白酶的质量比为10:1～100:1。
作为优选，所述将酶解液用镍磁性琼脂糖微粒分离的具体方法为：用磁性镍磁性琼脂糖微粒吸附酶解液，离心，将上清液去掉，并用去离子水多次清洗沉淀以去掉游离蛋白，抽滤，往沉淀中加入5-50 mL 0.05M 盐酸，在30℃，振荡频率为50-120r/min下震荡30-60min；离心，取上清液用0. 45μm的滤膜过滤后，将滤液冷冻干燥。
本发明的第三个目的是提供上述抑制肽在制备血管素紧张转化酶抑制剂中的应用。
本发明的第四个目的是提供一种血管素紧张转化酶抑制剂，其包括权利要求1所述的抑制肽。
本发明的第五个目的是提供上述抑制剂在制备用于减缓高血压的症状的功能食品中的应用。
本发明的优点如下：
1、本发明原料来源广泛、廉价，资源丰富。分离方法简单，成本低易操作。
2、工艺科学合理，简单易行。
3、所得的ACE抑制肽为首次从酪蛋白木瓜蛋白酶水解物中所得的血管紧张素转换酶抑制肽，具有良好的活性。
附图说明
附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。在附图中：
图1为反相高效液相色谱法分离镍磁性琼脂糖微粒酪蛋白木瓜蛋白酶水解物所得组分的色谱图；
图2为基质辅助激光解析串联飞行时间质谱（MALDI-TOF-TOF）测定酪蛋白来源ACE抑制肽氨基酸序列的质谱图。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为市售。
本发明的血管紧张转化酶抑制肽的氨基酸序列为：
Trp-Tyr-Leu-His-Tyr-Ala。
本发明的血管紧张转化酶抑制肽的制备方法为：
(1) 酪蛋白酶解液的制备：取酪蛋白粉（干酪素）（国药集团化学试剂有限公司），加水使蛋白含量约为0.3～3%（w/w），用NaOH溶液将其调至pH6.0～8.5，形成反应原料液。往反应原料液中，加入酪蛋白质量的1/100～1/10木瓜蛋白酶启动反应。温度控制在30～50℃，水解过程中加入NaOH溶液维持体系pH恒定，水解时间为0.5-8 h，水解结束后，调pH至中性，加热至100℃灭酶5～15min。
（2）酪蛋白来源ACE抑制肽的制备：用镍磁性琼脂糖微粒（sigma公司）吸附酶解液，离心，将上清液去掉，并用去离子水多次清洗沉淀以去掉游离蛋白，抽滤，备用。往沉淀中加入5-50 mL 0.05M 盐酸，在30℃，振荡频率为50-120r/min下震荡30-60min。离心，取上清液用0.45μm的滤膜过滤后，将滤液冷冻干燥，备用。
然后用高效液相色谱柱分离（色谱条件：Agilent 1200高效液相色谱系统；色谱柱：Zorbax SB C18色谱柱(4.6 mm×150 mm，5 μm)；检测器：DAD二极管阵列检测器；流动相：溶剂A相为水、B相为乙腈，A、B相均含0.05-0.2%三氟乙酸（TFA）（V/V）；洗脱梯度：0-60 min，B相比例由0%匀速上升到100%；流速：0.5 -1.0mL·min-1；柱温：30-40 ℃；检测波长220 nm）。根据高效液相色谱柱分离所得的肽谱图，分别收集各吸收峰的活性组分，测定其体外ACE抑制活性，将活性高的组分多次收集，冷冻干燥。
用基质辅助激光解析串联飞行时间质谱MALDI-TOF-TOF质谱测定该酪蛋白来源ACE抑制肽的氨基酸序列，谱图如图2所示，序列为WYLHYA。
测定该酪蛋白来源ACE抑制肽的半数抑制浓度（IC50，抑制50%ACE活性所需抑制剂的浓度）：50μL 5mmol HHL 、1mU血管紧张素转化酶(ACE)和不同浓度30μL的0.02-2mg/ml酪蛋白来源ACE抑制肽混合得到若干组样品。所述的系列样品反应液和酪蛋白来源ACE抑制肽用的硼酸缓冲液（含0.3M Nacl，pH 8.3）。反应液在37 ℃反应 60min后，加入0.15 mL 1mol/L HCl中止反应，离心15 min后，取上清液用高效液相（HPLC）法分析马尿酸的含量并计算被测物对ACE的活性。采用统计软件SPSS13.0（P>0.05）分析其IC50。
实施例 1
本发明的血管紧张转化酶抑制肽的制备方法为：
（1）酪蛋白酶解液的制备：取酪蛋白粉，加水使蛋白含量约为1%（w/w），用NaOH溶液将其调至pH6.5，形成反应原料液。往反应原料液中，加入酪蛋白质量的1/10木瓜蛋白酶启动反应。温度控制在40 ℃，水解过程中加入NaOH溶液维持体系pH恒定，水解时间为4h，水解结束后，调pH至中性，加热至100 ℃灭酶15 min。
（2）酪蛋白来源ACE抑制肽的制备：用镍磁性琼脂糖微粒（sigma公司）吸附酶解液，离心，将上清液去掉，并用去离子水多次清洗沉淀以去掉游离蛋白，抽滤，备用。往沉淀中加入20 mL 0.05M 盐酸，在30℃、振荡频率为100r/min下震荡40min。离心，取上清液用0.45μm的滤膜过滤后，将滤液冷冻干燥，备用。
然后用反相高效液相色谱柱分离（色谱条件：Agilent 1200高效液相色谱系统；色谱柱：Zorbax SB C18色谱柱(4.6 mm×150 mm，5 μm)；检测器：DAD二极管阵列检测器；流动相：溶剂A相为水、B相为乙腈，A、B相均含0.05-0.2%三氟乙酸（TFA）（V/V）；洗脱梯度：0-60 min，B相由0%匀速上升到100%；流速：0.5 -1.0mL·min-1；柱温：30-40 ℃；检测波长220 nm）。根据反相高效液相色谱柱分离所得的肽谱图，分别收集各吸收峰的活性组分，测定体外血管紧张素转化酶抑制活性，将活性高的组分多次收集，冷冻干燥。
用基质辅助激光解析串联飞行时间质谱MALDI-TOF-TOF质谱测定该酪蛋白来源ACE抑制肽的氨基酸序列，谱图如图2所示，序列为WYLHYA。
经测定，本发明的酪蛋白来源ACE抑制肽的半数抑制浓度IC50为16.22μM。
实施例 2
本发明的血管紧张转化酶抑制肽的制备方法为：
（1）酪蛋白酶解液的制备：取酪蛋白粉，加水使蛋白含量约为2%（w/w），用NaOH溶液将其调至pH7.0，形成反应原料液。往反应原料液中，加入酪蛋白质量的1/20木瓜蛋白酶启动反应。温度控制在40℃，水解过程中加入NaOH溶液维持体系pH恒定，水解时间为0.5h，水解结束后，调pH至中性，加热至100℃灭酶10min。
（2）酪蛋白来源ACE抑制肽的制备：用镍磁性琼脂糖微粒（sigma公司）吸附酶解液，离心，将上清液去掉，并用去离子水多次清洗沉淀以去掉游离蛋白，抽滤，备用。往沉淀中加入25 mL 0.05M 盐酸，在30℃、振荡频率为100r/min下震荡40min。离心，取上清液用0.45μm的滤膜过滤后，将滤液冷冻干燥，备用。
然后用反相高效液相色谱柱分离（色谱条件：Agilent 1200高效液相色谱系统；色谱柱：Zorbax SB C18色谱柱(4.6 mm×150 mm，5 μm)；检测器：DAD二极管阵列检测器；流动相：溶剂A相为水、B相为乙腈，A、B相均含0.05-0.2%三氟乙酸（TFA）（V/V）；洗脱梯度：0-60 min，B相由0%匀速上升到100%；流速：0.5 -1.0mL·min-1；柱温：30-40 ℃；检测波长220 nm）。根据反相高效液相色谱柱分离所得的肽谱图，分别收集各吸收峰的活性组分，测定体外血管紧张素转化酶抑制活性，将活性高的组分多次收集，冷冻干燥。
用基质辅助激光解析串联飞行时间质谱MALDI-TOF-TOF质谱测定该酪蛋白来源ACE抑制肽的氨基酸序列，谱图如图2所示，序列为WYLHYA。
经测定，本发明的酪蛋白来源ACE抑制肽的半数抑制浓度IC50为16.22μM。
实施例 3
本发明的血管紧张转化酶抑制肽的制备方法为：
（1）酪蛋白酶解液的制备：取酪蛋白粉，加水使蛋白含量约为1.5%（w/w），用NaOH溶液将其调至pH 7.5，形成反应原料液。往反应原料液中，加入1/25木瓜蛋白酶启动反应。温度控制在45℃，水解过程中加入NaOH溶液维持体系pH恒定，水解时间为8h，水解结束后，调pH至中性，加热至100℃灭酶10min。
（2）酪蛋白血管紧张素转化酶抑制肽的制备：用以镍磁性琼脂糖微粒吸附酶解液，离心，将上清液去掉，并用去离子水多次清洗以去掉游离蛋白，抽滤，备用。往磁性微粒中再加入30 mL 0.05M 盐酸，在30°C，振荡频率为90r/min下震荡50min。离心，取上清液用0.45μm的滤膜过滤后，将滤液冷冻干燥，备用。
然后用高效液相色谱柱分离，（色谱条件：Agilent 1200高效液相色谱系统；色谱柱：Zorbax SB C18色谱柱(4.6 mm×150 mm，5 μm)；检测器：DAD二极管阵列检测器；流动相：溶剂A相为水、B相为乙腈，A、B相均含0.05-0.2%三氟乙酸（TFA）（V/V）；洗脱梯度：0-60 min，B相比例由0%匀速上升到100%；流速：0.5 -1.0mL·min-1；柱温：30-40 ℃；检测波长220 nm）。根据高效液相色谱柱分离所得的肽谱图，分别收集各吸收峰的活性组分，测定ACE抑制活性，将活性高的组分多次收集，冷冻干燥。
用基质辅助激光解析串联飞行时间质谱MALDI-TOF-TOF质谱测定氨基酸序列，谱图如图2所示，序列为WYLHYA。
经测定，本发明的酪蛋白来源ACE抑制肽的半数抑制浓度IC50为16.22 μM。
实施例 4
本发明的血管紧张转化酶抑制肽的制备方法为：
（1）酪蛋白酶解液的制备：取酪蛋白粉，加水使蛋白含量约为2.5%（w/w），用NaOH溶液将其调至pH6.8，形成反应原料液。往反应原料液中，加入酪蛋白质量的1/30木瓜蛋白酶启动反应。温度控制在40℃，水解过程中加入NaOH溶液维持体系pH恒定， 水解时间为6h，水解结束后, 调pH至中性，加热至100℃灭酶10min。
（2）酪蛋白来源ACE抑制肽的制备：用以镍磁性琼脂糖微粒吸附酶解液，离心，将上清液去掉，并用去离子水多次清洗沉淀以去掉游离蛋白，抽滤，备用。往沉淀中加入40 mL 0.05M 盐酸，在40℃、振荡频率为100r/min下震荡40min。离心，取上清液用0.45μm的滤膜过滤后，将滤液冷冻干燥，备用。
然后用反相高效液相色谱柱分离，（色谱条件：Agilent 1200高效液相色谱系统；色谱柱：Zorbax SB C18色谱柱(4.6 mm×150 mm，5 μm)；检测器：DAD二极管阵列检测器；流动相：溶剂A相为水、B相为乙腈，A、B相均含0.05-0.2%三氟乙酸（TFA）（V/V）；洗脱梯度：0-60 min，B相由0%匀速上升到100%；流速：0.5 -1.0mL·min-1；柱温：30-40 ℃；检测波长220 nm）。根据反相高效液相色谱柱分离所得的肽谱图，分别收集各吸收峰的活性组分，测定体外血管紧张素转化酶抑制活性，将活性高的组分多次收集，冷冻干燥。
用基质辅助激光解析串联飞行时间质谱MALDI-TOF-TOF质谱测定该酪蛋白来源ACE抑制肽的氨基酸序列，谱图如图2所示，序列为WYLHYA。
经测定，本发明的酪蛋白来源ACE抑制肽的半数抑制浓度IC50为16.22μM。
实施例 5
本发明的血管紧张转化酶抑制肽的制备方法为：
（1）酪蛋白酶解液的制备：取酪蛋白粉，加水使蛋白含量约为2%（w/w），用NaOH溶液将其调至pH7.3，形成反应原料液。往反应原料液中，加入酪蛋白质量的1/40木瓜蛋白酶启动反应。温度控制在40℃，水解过程中加入NaOH溶液维持体系pH恒定，水解时间为2h，水解结束后，调pH至中性，加热至100℃灭酶10min。
（2）酪蛋白来源ACE抑制肽的制备：用以镍磁性琼脂糖微粒吸附酶解液，离心，将上清液去掉，并用去离子水多次清洗沉淀以去掉游离蛋白，抽滤，备用。往沉淀中加入50 mL 0.05M 盐酸，在40℃、振荡频率为100r/min下震荡40 min。离心，取上清液用0.45μm的滤膜过滤后，将滤液冷冻干燥，备用。
然后用反相高效液相色谱柱分离，（色谱条件：Agilent 1200高效液相色谱系统；色谱柱：Zorbax SB C18色谱柱(4.6 mm×150 mm，5 μm)；检测器：DAD二极管阵列检测器；流动相：溶剂A相为水、B相为乙腈，A、B相均含0.05-0.2%三氟乙酸（TFA）（V/V）；洗脱梯度：0-60 min，B相由0%匀速上升到100%；流速：0.5 -1.0mL·min-1；柱温：30-40 ℃；检测波长220 nm）。根据反相高效液相色谱柱分离所得的肽谱图，分别收集各吸收峰的活性组分，测定体外血管紧张素转化酶抑制活性，将活性高的组分多次收集，冷冻干燥。
用基质辅助激光解析串联飞行时间质谱MALDI-TOF-TOF质谱测定该酪蛋白来源ACE抑制肽的氨基酸序列，谱图如图2所示，序列为WYLHYA。
经测定，本发明的酪蛋白来源ACE抑制肽的半数抑制浓度IC50为16.22μM。
最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种血管紧张素转化酶抑制肽，其特征在于：其多肽序列为：Trp-Tyr-Leu-His-Tyr-Ala。
2.权利要求1所述的血管紧张素转化酶抑制肽的制备方法，其特征在于：是利用酪蛋白为原料，采用木瓜蛋白酶水解得到酶解液，将酶解液分离纯化得到的。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述将酶解液分离纯化包括将酶解液用镍磁性琼脂糖微粒吸附分离、反相高效液相色谱法分离纯化的步骤。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述反相高效液相的参数为：高效液相色谱系统为Agilent 1200；色谱柱为 C18色谱柱；检测器为DAD二极管阵列检测器；流动相由两溶剂组成，其中溶剂A相为水、B相为乙腈，A、B相均含0.05-0.2% 三氟乙酸（V/V）；洗脱梯度为60min以内，B相比例可由0%匀速升至100% ；流速：0.5 -1mL·min-1；色谱柱温度控制在30-40℃；检测波长220 nm。
5.根据权利要求2-4任一所述的方法，其特征在于：所述采用木瓜蛋白酶水解制备酶解液的具体方法为：在pH6.0～8.5的酪蛋白水溶液中加入木瓜蛋白酶，水解温度为30～50℃，水解过程中维持体系pH恒定，水解时间为0.5-8h，水解结束后，调pH至中性，加热至100℃灭酶5～15min；作为优选，所述酪蛋白与木瓜蛋白酶的质量比为10:1～100：1。
6.根据权利要求2-4任一所述的方法，其特征在于：所述将酶解液用镍磁性琼脂糖微粒分离的具体方法为：用镍磁性琼脂糖微粒吸附酶解液，离心，将上清液去掉，并用去离子水多次清洗沉淀以去掉游离蛋白，抽滤，往沉淀中加入5-50 mL 0.05M 盐酸，在30℃、振荡频率为50-120r/min下震荡30-60min；离心，取上清液用0.45μm的滤膜过滤后，将滤液冷冻干燥。
7.权利要求1所述的抑制肽在制备血管素紧张转化酶抑制剂中的应用。
8.一种血管素紧张转化酶抑制剂，其特征在于：其包括权利要求1所述的抑制肽。
9.权利要求1所述的抑制剂在制备用于减缓高血压的症状的功能食品中的应用。
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