JP2022521147A - ｍＲＮＡディスプレイ抗体ライブラリー及び方法 - Google Patents
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Abstract
高多様性核酸ライブラリーから作製された別個の抗体又は抗体断片をコードする組換えウイルス及び／又は組換えウイルスベクターの組成物、方法、及び使用が示される。好ましくは、この組換えウイルスは、遺伝的に改変された低免疫原性ウイルスであり、例えばＥ２ｂ欠失アデノウイルスである。高多様性核酸ライブラリーは、（１）ＶＨ－ＣＤＲ１／２サブライブラリー、（２）複数のＶＨ－ＣＤＲ３サブライブラリー、及び（３）ＶＬサブライブラリーを含むか又はそれらに由来し、その各々が複数のメンバーを含む。好ましくは、サブライブラリーの各メンバーが、複数の縮重塩基位置を有する少なくとも１つのランダムカセットを含む。特に好ましい実施形態では、ＶＨ－ＣＤＲ１／２サブライブラリー、複数のＶＨ－ＣＤＲ３サブライブラリー、及びＶＬサブライブラリーの少なくとも２つのメンバーうちの少なくとも一部が組み換えられて、発現ライブラリーにおける発現ライブラリーメンバーを形成し、発現ライブラリーの各メンバーは、別個の抗体又は抗体断片をコードする。
Description
本発明の分野は、特に、ｍＲＮＡディスプレイライブラリー及び組換え高親和性バインダーを作製するためのｍＲＮＡディスプレイライブラリーの使用に関するため、極めて高い多様性の抗体ライブラリーのための組成物及び方法である。
背景の説明には、本発明の理解に有用であり得る情報が含まれる。本明細書で提供される情報がいずれも本明細書で請求される発明の先行技術であるか又はこれに関連するものであること、或いは具体的又は暗示的に参照される任意の刊行物が先行技術であることを認めるものではない。
本明細書における刊行物及び特許出願はいずれも、各々の個々の刊行物又は特許出願が具体的且つ個別に参照によって組み込まれることが示された場合と同程度に、参照によって組み込まれる。組み込まれる参考文献における用語の定義及び使用が、本明細書で提供される用語の定義と一致しないか、これに反する場合、本明細書で提供されるその用語の定義が適用され、参考文献中でのその用語の定義は適用されない。
高親和性、特異的抗体又は結合分子により腫瘍抗原又はネオエピトープを標的化することが、癌患者を治療するための効果的な方法であると証明されている。ますます多くの患者特異的且つ／若しくは癌特異的腫瘍抗原及び／又はネオエピトープが、オミクスデータ解析を介してインビボ、インビトロ、又はインシリコで同定されるにつれて、安定であり、可溶性であり、機能的であり、且つ適応可能である抗体又はバインダーを高い確率で選択できる抗体ライブラリー又はディスプレイライブラリーを作製することの要求が高まってきた。高親和性の特異的抗体又は結合分子は、天然の抗体プールの中で同定され得るか、又は天然の抗体プールに由来し得るが、そのような同定又は由来の天然抗体又はバインダーは、そのような抗原又はネオエピトープへの曝露の頻度又は強度に依存して、そのような天然抗体の多様性が制限される可能性があるため、効果的又は特異的ではない場合がある。
このような問題を解決するための１つのアプローチとして、組換えファージディスプレイライブラリーが使用され得る。このようなアプローチは、適度に高い多様性を有するライブラリーの作製を可能にするが、多くの場合、バインダーのために何度も濃縮を行う必要があり、手間と時間がかかる。さらに、比較的大きな多様性を有するにもかかわらず、バインダーは理想的な親和性と安定性を欠く傾向がある。さらに、多様性は通常、ライブラリー量、トランスフェクション効率などの実用的な考慮事項によって制限される。そのようなアプローチ及び他のアプローチはさらに、例えば、国際公開第２００６／０７２７７３号パンフレットに記載されるように複数の人工的な選択圧力を使用して最適化され得る。このような方法は、安定性の特徴を向上させる場合があるが、著しい量のライブラリー操作と時間が必要とされる。
さらに別のアプローチにおいて、ｍＲＮＡディスプレイが実施され得る。ここで、候補結合分子（典型的にはｓｃＦｖ）をコードするｍＲＮＡ配列は、それらの３’末端でピューロマイシン分子と結合し、ｍＲＮＡ配列によってコードされるペプチドは、インビトロ翻訳を介して生成され、ｍＲＮＡをｍＲＮＡによってコードされるタンパク質に直接結合した融合産物を生成する。しかしながら、現在のｍＲＮＡディスプレイ技術は、トランスフェクション制限に関連する問題を有利に回避し、少なくとも概念的にはより高い多様性を可能にするが、構造的完全性又は安定性、比較的低い親和性、及び／又は交差反応性の問題は依然として残っている。ｍＲＮＡディスプレイからのｓｃＦｖの少なくとも選択された結合特性をさらに改善するために、ＶＨ－ＣＤＲ３スペクトラタイピング分析が実施された（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｄｅｓｉｇｎ ＆ Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ，２０１５，ｖｏｌ．２８ ｎｏ．１０，ｐｐ．４２７－４３５を参照のこと）。しかしながら、このようなプロセスは反復分析を必要とし、全ての抗原に対して生産的ではない場合がある。
したがって、ｍＲＮＡディスプレイ及び他の方法を使用して候補バインダーを作製し且つ同定する方法は知られているが、高い構造的完全性／安定性、低い親和性、及び／又は低い交差反応性を有するバインダーによる高い多様性のライブラリーは、実現しないままであった。したがって、安定な組換え高親和性バインダーを迅速に作製するためのｍＲＮＡディスプレイライブラリーの改善された組成物、方法、及び使用の必要性が依然として存在する。
本発明の主題は、様々な生体分子、特に、癌抗原又はネオエピトープに対する安定で可溶性の機能的な抗体又はバインダーの信頼性があり且つ効率的な同定を可能にする複数の抗体又は抗体断片をコードする高多様性核酸ライブラリーの様々な組成物、方法、及び使用を対象とする。したがって、主題の一態様は、複数の抗体又は抗体断片をコードする高多様性核酸ライブラリーを作製する方法を含む。この方法では、各々が複数のメンバーを有する３つのサブライブラリー：（１）ＶＨ－ＣＤＲ１／２サブライブラリー、（２）複数のＶＨ－ＣＤＲ３サブライブラリー、及び（３）ＶＬサブライブラリーが作製されるか又は提供される。３つのサブライブラリーの各メンバーは、複数の縮重塩基位置を有する少なくとも１つのランダムカセットを含む。３つのライブラリーの少なくとも２つのメンバーの少なくとも一部が組み換えられて、発現ライブラリー中の発現ライブラリーメンバーを形成し、これは、複数の発現ライブラリーメンバーを有する。別々の抗体又は抗体断片をコードする各発現ライブラリーメンバー。好ましい実施形態では、発現ライブラリーメンバーは、ｍＲＮＡ断片に転写され、続いてこれは３’末端でピューロマイシン分子と結合される。
本発明の主題の別の態様では、本発明者らは、複数の核酸ライブラリーを有する組成物を企図する。複数の核酸ライブラリーは、（１）ＶＨ－ＣＤＲ１／２サブライブラリー、（２）複数のＶＨ－ＣＤＲ３サブライブラリー、及び（３）ＶＬサブライブラリーを含む。サブライブラリー（１）～（３）の各々は、複数のメンバーを含み、サブライブラリーの各メンバーは、複数の縮重塩基位置を有する少なくとも１つのランダムカセットを含む。
本発明の主題のさらに別の態様では、本発明者らは、高多様性の核酸ライブラリーを作製するための上の組成物の使用を企図する。
本発明の主題のさらに別の態様では、本発明者らは、複数の核酸ライブラリーメンバーを有する高多様性核酸ライブラリー組成物を企図する。高多様性核酸ライブラリーメンバーは、それぞれ複数の縮重塩基位置を有する複数のランダムカセットを含む組換え核酸を含む。複数のランダムカセットは、以下：（１）ＶＨ－ＣＤＲ１／２サブライブラリー、（２）複数のＶＨ－ＣＤＲ３サブライブラリー、及び（３）ＶＬサブライブラリーからの２つのライブラリーのいずれかからの少なくとも２つのメンバーに由来する。
本発明の主題のさらに別の態様では、本発明者らは、癌ネオエピトープに対する治療用組換え抗体を作製するための高多様性核酸ライブラリーの使用を企図する。
本発明の主題のさらに別の態様では、本発明者らは、組換え抗体を作製する方法を企図する。この方法では、各々が複数のメンバーを有する３つのサブライブラリー：（１）ＶＨ－ＣＤＲ１／２サブライブラリー、（２）複数のＶＨ－ＣＤＲ３サブライブラリー、及び（３）ＶＬサブライブラリーが作製されるか又は提供される。３つのサブライブラリーの各メンバーは、複数の縮重塩基位置を有する少なくとも１つのランダムカセットを含む。３つのライブラリーの少なくとも２つのメンバーの少なくとも一部が組み換えられて、発現ライブラリー中の発現ライブラリーメンバーを形成し、これは、複数の発現ライブラリーメンバーを有する。別々の抗体又は抗体断片をコードする各発現ライブラリーメンバー。次に、方法は、発現ライブラリーメンバーを用いて組換え抗体又はその断片の作製を続ける。
本発明の主題のさらに別の態様では、本発明者らは、上記の方法により構築された組成物に抗原を接触させることにより、抗原に対して１００ｎＭ以下の親和性を有する高親和性バインダーを単離する方法を企図する。
本発明の主題のさらに別の態様では、本発明者らは、下に提供される表１又は表２から選択されるオリゴヌクレオチドを用いて作製される組換え核酸断片を企図する。
本発明の主題のさらに別の態様では、本発明者らは、下に提供される表１又は表２から選択される核酸配列を有する合成核酸混合物を企図する。
本発明の主題のさらに別の態様では、本発明者らは、組換えウイルスを企図する。この組換えウイルスは、別個の抗体又は抗体断片をコードする発現ライブラリーのメンバーを含む組換え核酸を含む。この発現ライブラリーのメンバーは、（１）ＶＨ－ＣＤＲ１／２サブライブラリー、（２）複数のＶＨ－ＣＤＲ３サブライブラリー、及び（３）ＶＬサブライブラリーを作製するか又は提供する工程であって、これらのサブライブラリー（１）～（３）の各々は、複数のメンバーを含み、これらのサブライブラリーの各メンバーは、複数の縮重塩基位置を有する少なくとも１つのランダムカセットを含む、作製するか又は提供する工程、並びにＶＨ－ＣＤＲ１／２サブライブラリー、複数のＶＨ－ＣＤＲ３サブライブラリー、及びＶＬサブライブラリーの少なくとも２つのメンバーの少なくとも一部を組み換えて、発現ライブラリー中の発現ライブラリーメンバーを形成する工程により作製されている。
典型的には、この組換えウイルスは、遺伝的に改変された低免疫原性ウイルスであり、このウイルスは、最も好ましくは、下記の遺伝子：Ｅ１Ａ、Ｅ１Ｂ、Ｅ２Ｂ、Ｅ３の少なくとも１つにおいて変異を有するヒトアデノウイルス血清型５であり得る。
いくつかの実施形態では、ＶＨ－ＣＤＲ１／２サブライブラリーの複数のメンバーは、ＶＨ ＣＤＲ１の一部及びＶＨ ＣＤＲ２の一部の少なくとも一方に相当するランダムカセットを含む。そのような実施形態では、ＶＨ－ＣＤＲ１／２サブライブラリーの複数のメンバーは、ＶＨ ＣＤＲ２の少なくとも一部に相当する複数のランダムカセットを含む。他の実施形態では、ＶＨ－ＣＤＲ１／２サブライブラリーの複数のメンバーは、ＶＨ ＣＤＲ１の少なくとも一部及びＶＨ ＣＤＲ２の一部に相当する複数のランダムカセットを含む。
いくつかの実施形態では、ＶＨ－ＣＤＲ３サブライブラリーの複数のメンバーは、ＶＨ ＣＤＲ３の少なくとも一部に相当するランダムカセットを含む。ＶＨ－ＣＤＲ３サブライブラリーのメンバーの少なくとも２つのランダムカセットが様々な長さのペプチドをコードすることが企図される。或いは及び／又は加えて、ＶＬサブライブラリーの複数のメンバーは、ＶＬ ＣＤＲ３の一部でランダムカセットを含む。
典型的には、組み換える工程は、ＶＨ－ＣＤＲ１／２サブライブラリーのメンバーの少なくとも一部と、複数のＶＨ－ＣＤＲ３サブライブラリーの１つとを単離し、合わせて融合させて、ＶＨドメインライブラリー中のＶＨドメインライブラリーメンバーを形成する工程であって、このＶＨドメインライブラリーは、複数のＶＨドメインライブラリーメンバーを含む、形成する工程を含む。そのような実施形態では、発現ライブラリーのメンバーは、ＶＬサブライブラリーのメンバーの少なくとも一部を単離し、ＶＬサブライブラリーのメンバーの一部と、ＶＨドメインライブラリーメンバーの１つとを融合させて、発現ライブラリーメンバーを形成することにより作製されることが企図される。他の実施形態では、組み換える工程は、ＶＨ－ＣＤＲ１／２サブライブラリーのメンバーの少なくとも一部と、複数のＶＨ－ＣＤＲ３サブライブラリーの１つとを単離し、合わせて融合させて、発現ライブラリーメンバーの第１の群を形成する工程を含む。
任意選択により、組換え核酸は、別個の抗体又は抗体断片の分泌を促進するシグナル伝達ペプチドをコードする核酸断片をさらに含み得る。
本発明の主題のさらに別の態様では、本発明者らは、組換え抗体を作製する方法を企図する。この方法では、（１）ＶＨ－ＣＤＲ１／２サブライブラリー、（２）複数のＶＨ－ＣＤＲ３サブライブラリー、及び（３）ＶＬサブライブラリー（これらのサブライブラリー（１）～（３）の各々は、複数のメンバーを含む）を作製するか、又は提供する。最も好ましくは、サブライブラリーの各メンバーは、複数の縮重塩基位置を有する少なくとも１つのランダムカセットを含む。次に、この方法では、ＶＨ－ＣＤＲ１／２サブライブラリー、複数のＶＨ－ＣＤＲ３サブライブラリー、及びＶＬサブライブラリーの少なくとも２つのメンバーの少なくとも一部を組み換えて、発現ライブラリー中の発現ライブラリーメンバーを形成する工程であって、発現ライブラリーは、複数の発現ライブラリーメンバーを含み、各発現ライブラリーメンバーは、部個の抗体又は抗体断片をコードする、形成する工程が続く。次に、少なくとも１つの発現ライブラリーメンバーを含む組換えウイルスベクターが作製され得る。
典型的には、この組換えウイルスは、遺伝的に改変された低免疫原性ウイルスであり、このウイルスは、最も好ましくは、下記の遺伝子：Ｅ１Ａ、Ｅ１Ｂ、Ｅ２Ｂ、Ｅ３の少なくとも１つにおいて変異を有するヒトアデノウイルス血清型５であり得る。
いくつかの実施形態では、ランダムカセットは、配列番号１～配列番号２５から選択されるオリゴヌクレオチドを使用して作製されている。任意選択により、組換えウイルスベクターは、別個の抗体又は抗体断片の分泌を促進するシグナル伝達ペプチドをコードする核酸断片をさらに含む。
好ましくは、この方法は、組換えウイルスベクターを有する組換えウイルスと、哺乳類細胞とを接触させる工程をさらに含み得る。いくつかの実施形態では、接触させる工程は、哺乳類に組換えウイルスを投与する工程を含む。他の実施形態では、哺乳類細胞は、腫瘍を有する患者の自家細胞であり、接触させる工程は、エキソビボで自家細胞と哺乳類細胞とを共インキュベートする工程を含む。
本発明の主題の様々な目的、特徴、態様及び利点は、添付の図面とともに、好ましい実施形態の以下の詳細な説明からより明らかになるであろう。
本発明者らは目下、高多様性核酸ライブラリーのメンバーによってコードされる抗体又はその断片の選択されたドメインの標的化された多様性を用いて高多様性核酸ライブラリーを構築することによって、特異的且つ効果的な組換え抗体又はその断片が、作製又は同定され得ることを発見した。このような目的を達成するために、本発明者らは目下、抗体／バインダーの１つ以上のドメイン又はサブドメインを予め選択することができ、予め選択されたドメイン又はサブドメイン内のランダムカセットを使用して、複数の核酸サブライブラリーを作製できることを発見した。本発明者らはさらに、サブライブラリーのメンバーを組み換えて、ライブラリーのメンバー間で高い多様性を可能にしながらも、癌抗原又はネオエピトープ（好ましくは癌特異的、患者特異的ネオエピトープ又はネオ抗原）に対してインビボで使用された場合に、安定であり、可溶性であり、機能的であり、且つ適応可能である抗体／バインダーを同定する確率を高める高多様性核酸ライブラリーを構築できることを発見した。
実際に、以下でより詳細に示されるとおり、本明細書に提示されるライブラリーは、典型的には、シングルパス又はツーパスの濃縮において、バインダーが１００ｎＭ以下、より典型的には１０ｎＭ以下のＫｄを有する任意の抗原に対する少なくとも１つのバインダーの単離を可能にする。さらに、企図された系及び方法は、少なくとも１０９、少なくとも１０１０、少なくとも１０１１、少なくとも１０１２、少なくとも１０１３、少なくとも１０１４、少なくとも１０１５、又は少なくとも１０１６の異なるライブラリーメンバーの多様性を有するｓｃＦｖライブラリーを、従来のライブラリー構築と比較して大幅に短縮された時間枠内で可能にする。したがって、抗体発見の速度が実質的に上昇することが理解されるはずである。
本明細書で使用する場合、用語「腫瘍」は、人体内の１つ以上の解剖学的位置に配置され得るか、又は見出され得る１つ以上の癌細胞、癌組織、悪性腫瘍細胞、又は悪性腫瘍組織を指し、且つそれらと互換的に使用される。
本明細書で使用する場合、用語「結合する」は、用語「認識する」及び／又は「検出する」を指し、且つそれらと互換的に使用することができ、２つの分子間の相互作用は、１０－６Ｍ以下又は１０－７Ｍ以下のＫＤを有して高親和性を有する。
本明細書で使用する場合、用語「提供する」又は「提供すること」は、製造するか、作製するか、配置するか、使用可能にするか、又は使用の準備をすることのいずれかの行為を指し、且つ含む。
核酸サブライブラリーの構築
一般に、抗体の構造部品（重鎖、軽鎖、定常ドメイン、可変ドメイン）は、それらの機能に密接に関係する。例えば、重鎖における可変ドメイン（ＶＨ）及び軽鎖（ＶＬ）はともに、抗体に特異性をもたらすエピトープ結合ドメインを構成する。ＶＨ及びＶＬの各々は、抗原に対するそれらの特異性に基づく固有のアミノ酸配列を有する３つの相補性決定領域（ＣＤＲｓ、ＣＤＲ１～３）を含む。したがって、ＶＨ及びＶＬのＣＤＲをコードする配列をランダム化することにより、抗体を作製又は同定するための組換え核酸ライブラリーが作製され得ることが以前に企図されていた。しかしながら、本発明者らは、ＶＨ及びＶＬの全てのＣＤＲを完全にランダム化することは、ライブラリーに大きな多様性をもたらす可能性がある一方で、全てのランダム化されたＶＨ及びＶＬが、抗体（例えば、ＩｇＧ１など）を形成するために組み換えられるときに可溶性又は安定に発現され得るわけではないため、ランダム配列の全ての組合せを作製し、全てのランダム化された組合せをスクリーニングすることにおいて非効率も生じさせることを見出した。さらに、多様性空間全体を網羅することは、可能なライブラリーメンバーの数が非常に多いため、現実的ではない。
一般に、抗体の構造部品（重鎖、軽鎖、定常ドメイン、可変ドメイン）は、それらの機能に密接に関係する。例えば、重鎖における可変ドメイン（ＶＨ）及び軽鎖（ＶＬ）はともに、抗体に特異性をもたらすエピトープ結合ドメインを構成する。ＶＨ及びＶＬの各々は、抗原に対するそれらの特異性に基づく固有のアミノ酸配列を有する３つの相補性決定領域（ＣＤＲｓ、ＣＤＲ１～３）を含む。したがって、ＶＨ及びＶＬのＣＤＲをコードする配列をランダム化することにより、抗体を作製又は同定するための組換え核酸ライブラリーが作製され得ることが以前に企図されていた。しかしながら、本発明者らは、ＶＨ及びＶＬの全てのＣＤＲを完全にランダム化することは、ライブラリーに大きな多様性をもたらす可能性がある一方で、全てのランダム化されたＶＨ及びＶＬが、抗体（例えば、ＩｇＧ１など）を形成するために組み換えられるときに可溶性又は安定に発現され得るわけではないため、ランダム配列の全ての組合せを作製し、全てのランダム化された組合せをスクリーニングすることにおいて非効率も生じさせることを見出した。さらに、多様性空間全体を網羅することは、可能なライブラリーメンバーの数が非常に多いため、現実的ではない。
したがって、本発明者らは、ＶＨ及びＶＬのサブドメインを２つのカテゴリー：異なる抗体（又はその抗体をコードする遺伝子）のＶＨ又はＶＬの間で一般的に共通するフレームワーク領域、並びに最終的なペプチド生成物（例えば、ｓｃＦｖ、ＩｇＧ１など）の安定性及び／又は可溶性に著しい影響を与えることなく、少なくとも部分的に又は完全にランダム化され得る標的化される多様化領域に分割できることを企図する。好ましくは、ＶＨの標的化される多様化領域は、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２－ｎ（ＣＤＲ２のＮ末端側）、ＣＤＲ２－ｃ（ＣＤＲ２のＣ末端側）、及びＣＤＲ３の少なくとも一部を含む。さらに好ましい態様では、ＶＬの標的化される多様化領域は、ＣＤＲ３の少なくとも一部を含む。
そのため、本発明の主題の１つの例示的且つ特に好ましい態様では、核酸ライブラリーは、ＶＨ及び／又はＶＬの１つ以上の標的化される多様化領域における１つ以上のランダム配列カセットを含む組換え核酸を生成することによって作製され得る。一つの好ましい実施形態では、本発明者らは、単一のサブライブラリー内のランダム化された組換え配列が多すぎて、単一のサブライブラリーの量を迅速又は適時のスクリーニングのために扱うことが非実用的又は非効率的になり得ることを回避しながら、各サブライブラリーが、ランダム化された標的化される多様化領域内の多様性を保持するように、異なる標的化される多様化領域内に異なるセットのランダム配列カセットを有する３つの異なるサブライブラリーを企図している。さらに、標的化される多様化領域間の保存された領域は、最大の安定性及び可溶性のために選択されるか又は設計される。
一実施形態では、サブライブラリーは、ＶＨ－ＣＤＲ１／２サブライブラリーを含む。ＶＨ－ＣＤＲ１／２サブライブラリーは、ＶＨ ＣＤＲ１の少なくとも一部及び／又はＶＨ ＣＤＲ２の一部に相当する１つ以上のランダム配列カセットを有する複数の組換え核酸（例えば、組換えＤＮＡ）を含む。本明細書で使用する場合、ＶＨ ＣＤＲ１の一部に相当するランダムカセットは、ランダムカセットが組換え核酸の領域内に位置することを意味し、その中でＣＤＲ１部分をコードする配列が、天然抗体のＶＨドメインに少なくとも構造的又は機能的に類似しているＶＨドメインの一部をコードするために存在すべきである。例えば、ＶＨ－ＣＤＲ１／２サブライブラリー中の組換え核酸は、以下のとおりの構造を有する（ランダム化された領域は下線が引かれ、固定の配列決定された領域は括弧に入れられる）：
本明細書で使用する場合、ＵＴＲは非翻訳領域を指し、ＦＷはフレームワーク領域（例えば、ＦＷ１は、第２のフレームワーク領域（ＦＷ２）とは異なり得る第１のフレームワーク領域である）を指す。この構造において、ランダム配列カセットは、ＣＤＲ１若しくはＣＤＲ２、又は好ましくは、ＣＤＲ１とＣＤＲ２の両方の領域において挿入され得る。いくつかの実施形態では、２つ以上ランダム配列カセット、好ましくは２つのランダム配列カセットは、ＣＤＲ２の領域において挿入され得る：ＣＤＲ２－ｎ（ＣＤＲ２の５’－末端側に関して）及びＣＤＲ－ｃ（ＣＤＲ２の３’－末端側に関して）。
サブライブラリーはまた、複数のＶＨ－ＣＤＲ３サブライブラリーを含み得る。ＶＨ－ＣＤＲ３サブライブラリーの各々は、ＶＨ ＣＤＲ３の少なくとも一部に相当する１つ以上のランダム配列カセットを有する複数の組換え核酸（例えば、組換えＤＮＡ）を含む。ＶＨ－ＣＤＲ１／２サブライブラリーと同様に、ＶＨ－ＣＤＲ１／２サブライブラリー中の組換え核酸は以下のとおりの構造を有し得る（ランダム化された領域は下線が引かれ、固定の配列決定された領域は括弧に入れられる）：
好ましくは、ＶＨ－ＣＤＲ１／２サブライブラリー及び／又はＶＨ－ＣＤＲ３サブライブラリーの組換え核酸の固定配列（例えば、プロモーター－５’ＵＴＲ－ＦＷ１＋ＣＤＲ１＋ＦＷ２＋ＣＤＲ２＋ＦＷ３、ＦＷ４）は、固定配列が最も発現可能であり、一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、ｓｃＦｖの改変形態、全長免疫グロブリン、又は免疫グロブリンの一部として発現されるペプチドを含む複数の形態に適応可能であるように、天然抗体（例えば、種々の抗原に対するＩｇＧ１）の中で最も一般的及び／又は保存された配列を使用するように選択される。したがって、好ましい実施形態では、ＶＨ－ＣＤＲ１／２サブライブラリーの組換え核酸及びＶＨ－ＣＤＲ３サブライブラリーの組換え核酸の固定配列は、互いに少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％同一である（共有される）。
サブライブラリーはまた、ＶＬサブライブラリーを含み得る。ＶＬサブライブラリーは、ＶＬ ＣＤＲ３の少なくとも一部に相当する１つ以上のランダム配列カセットを有する複数の組換え核酸（例えば、組換えＤＮＡ）を含む。ＶＨ－ＣＤＲ１／２サブライブラリーと同様に、ＶＨ－ＣＤＲ１／２サブライブラリー中の組換え核酸は以下のとおりの構造を有し得る（ランダム化された領域は下線が引かれ、固定の配列決定された領域は括弧に入れられる）：
好ましくは、ＶＬサブライブラリーの組換え核酸の固定配列は、ＶＨ－ＣＤＲ１／２サブライブラリー又はＶＨ－ＣＤＲ３サブライブラリーの組換え核酸のものと少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％同一である（共有される）。
任意のランダム化された配列は、ランダム配列カセットを作製するために考慮され得るが、本発明者らは、ＶＨのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３及びＶＬドメインのＣＤＲ３のための戦略化されたランダム配列カセットが、結合ペプチド（例えば、ｓｃＦｖなど）として発現された場合に、高い複雑性及び大きな潜在的な結合面を与えることを企図する。例えば、ＶＨ－ＣＤＲ１／２サブライブラリーのＣＤＲ１、ＣＤＲ２のための戦略化されたランダム配列カセットは、カセット１個当たり３個以下、好ましくは２個以下、又はより好ましくは１個のランダム配列（カセット１個当たり３個以下、２個以下、又は１個のランダムアミノ酸をコードする）を有するセミランダム配列カセットであってもよい。ランダムカセット中のランダム配列の位置は、カセット中のランダムアミノ酸に応じて変動し得る。別の例において、ＶＨ－ＣＤＲ３サブライブラリーのＣＤＲ３のための戦略化されたランダム配列カセットは、カセット１個当たり４個以上、好ましくは５個以上、又はより好ましくは６個以上のランダム配列（カセット１個当たり４個以上、好ましくは５個以上、又はより好ましくは６個以上のランダムアミノ酸をコードする）が存在するように、よりランダム化された配列を含み得る。さらに別の例において、ＶＬサブライブラリーのＣＤＲ３のための戦略化されたランダム配列は、カセット１個当たり４個以上、好ましくは５個以上、又はより好ましくは６個以上のランダム配列（カセット１個当たり４個以上、好ましくは５個以上、又はより好ましくは６個以上のランダムアミノ酸をコードする）が存在するように、よりランダム化された配列を含み得る。
本発明の主題の特定の好ましい態様では、本発明者らは、サブライブラリーのための好ましいランダム配列カセットが、表１（ＶＨ－ＣＤＲ１／２サブライブラリー及びＶＨ－ＣＤＲ３サブライブラリーに関する）、及び表２（ＶＬサブライブラリーに関する）において提示されるオリゴヌクレオチドを使用して作製され得ることを企図する。表１及び２において示されるとおり、各オリゴヌクレオチドは、ＩＵＰＡＣアンビギュイティコードとして示される縮重コードを有する（強調された）ランダム配列を含む。例えば、ＣＤＲ１ランダム配列カセットのための１つのオリゴヌクレオチドは、ランダム配列「ＲＶＴ」を含み、これは、「Ａ／Ｇ、Ａ／Ｃ／Ｇ、Ｔ」を表し、その組合せは、スレオニン（Ｔ）、アラニン（Ａ）、アスパラギン（Ｎ）、アスパラギン酸（Ｄ）、セリン（Ｓ）又はグリシン（Ｇ）のうちの１つをコードできる。縮重コドンによってコードされるアミノ酸の選択は、右に表され、Ｘとともに示される。
さらに且つ好ましくは、ＶＨ－ＣＤＲ３サブライブラリーのためのランダム配列カセットは、異なる長さの核酸配列を含み得る。例えば、ＶＨ－ＣＤＲ３サブライブラリーのためのランダム配列カセットは、１０～３０個のアミノ酸、好ましくは１０～２５個のアミノ酸、より好ましくは１０～２０個のアミノ酸の任意の長さであり得る。したがって、表１において示されるとおり、ＶＨ－ＣＤＲ３サブライブラリーのためのランダム配列カセットを作製するためのオリゴヌクレオチドは、Ｄ／Ｇ－Ｒ／Ｌ及びＡ／Ｇをコードする配列間に「ＮＮＫ」（Ｇ／Ａ／Ｔ／Ｃ、Ｇ／Ａ／Ｔ／Ｃ、Ｇ／Ｔを表す）の様々なリピート（例えば、４～１０のリピート）を含み得る（図３も参照のこと）。軽鎖配列の作製及び多様性は、図４において例示的に示される。
最も典型的には、表１及び２において提示されるオリゴヌクレオチドは、一本鎖ＤＮＡにおいて提供され、これはＤＮＡポリメラーゼＩ（クレノー断片）を使用して二重鎖ＤＮＡ断片に変換されて、固定の配列決定された領域（例えば、ＶＬサブライブラリーなどの組換え核酸に関して、５’－（プロモーター－５’ＵＴＲ－ＦＷ１＋ＣＤＲ１＋ＦＷ２＋ＣＤＲ２＋ＦＷ３）－（ＦＷ４））を含む骨格に挿入され得る。さらに、表１及び２に提示されるオリゴヌクレオチドはまた、ポリメラーゼ酵素を使用せずに二重鎖核酸を形成するために相補的なオリゴヌクレオチドとともに存在することもまた企図される。
いくつかの実施形態では、サブライブラリーの組換え核酸はまた、組換え核酸によってコードされるペプチドが、タンパク質タグに対するバインダーを使用して単離され得るように、タンパク質タグをコードする核酸配列を含む。例えば、好ましいタンパク質タグとしては、ＦＬＡＧタグ（配列モチーフＤＹＫＤＤＤＤＫを有する）、Ｍｙｃタグ（配列モチーフＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬを有する）、及びＨＡ－タグが挙げられる。いくつかの実施形態では、タンパク質タグは、シグナルを強化するか又は検出を増大させるために繰り返され得る（例えば、ＦＬＡＧタグの３回の反復（３Ｘ ＦＬＡＧ）など）。
サブライブラリーの組換え核酸に挿入されたいくつかのランダム配列カセットは、フレームシフト、ナンセンス変異、及び組換え核酸によってコードされるペプチドの構造を不安定化させている配列を導入し得ることが企図される。したがって、いくつかの実施形態では、本発明者らは、不安定又はミスフォールドしたペプチドをコードする任意の組換え核酸がライブラリーから除去され得るように、サブライブラリーの組換え核酸をインビトロで試験することを企図する。例えば、ＶＨ－ＣＤＲ３サブライブラリー又はＶＬサブライブラリーの組換え核酸は、それぞれＣＤＲ配列とは独立して免疫グロブリンのＶＨ３ドメイン又はＶＬ（Ｖκ）ドメインの構造化エピトープに結合するスタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）のプロテインＡ又はフィネゴルディア・マグナ（Ｆｉｎｅｇｏｌｄｉａ ｍａｇｎａ）のプロテインＬに対するそれらの結合親和性について試験され得る。
プロテインＡ又はプロテインＬに対するそれらの結合親和性によって組換え核酸をスクリーニングするための任意の好適な方法が企図される。例示的な一実施形態では、サブライブラリーの組換え核酸は、インビトロ転写によってｍＲＮＡに転写され、ｍＲＮＡの３’末端がピューロマイシンに結合（共有結合）される。ピューロマイシン結合型ｍＲＮＡから転写されるペプチドがピューロマイシンを介してｍＲＮＡと結合されるように、ピューロマイシン結合型ｍＲＮＡはインビトロで転写される。次に、ペプチドをプロテインＡ又はプロテインＬと接触させて、プロテインＡ又はプロテインＬに効率的に結合するペプチドを同定する。好ましくは、１０－６Ｍ以下、好ましくは１０－７Ｍ以下のＫＤを有する親和性を有するプロテインＡ又はプロテインＬに結合するペプチドが選択され、単離される。プロテインＡ又はプロテインＬに対して高い親和性を有するペプチドが単離されると、単離されたペプチドのｃＤＮＡが、ピューロマイシン及びペプチドと結合したｍＲＮＡのインビトロ逆転写を介して作製され得る。次に、そうして作製された単離ペプチドのｃＤＮＡは、ＶＨ－ＣＤＲ３サブライブラリー又はＶＬサブライブラリーの選択された組換え核酸を作製するためのランダム配列カセットとして挿入され得る。或いは、サブライブラリーの組換え核酸が、組換え核酸のためのインビトロ転写工程（ＤＮＡフォーマットにおける）が必要とされなくてもよいように、任意選択によりピューロマイシン分子と予め結合されたｍＲＮＡの形態で存在し得ることもまた企図される。
サブライブラリーからのｓｃＦｖライブラリーの構築
本発明者らはさらに、サブライブラリーのうちの少なくとも２つの組換え核酸（メンバー）を組み換えて、組換えｓｃＦｖ核酸を形成できることを企図する。好ましい実施形態では、少なくとも２つの組換え核酸（メンバー）の各々は、異なるサブライブラリーから選択される。例えば、１つの組換え核酸は、ＶＨ－ＣＤＲ１／２サブライブラリー、複数のＶＨ－ＣＤＲ３サブライブラリー、及びＶＬサブライブラリーの各々から選択され得る。他の例に関して、１つの組換え核酸は、ＶＨ－ＣＤＲ１／２サブライブラリー、複数のＶＨ－ＣＤＲ３サブライブラリー、及びＶＬサブライブラリーのうちの２つの各々から選択され得る。好ましくは、サブライブラリーから選択される組換え核酸のうちの少なくとも１つ、より好ましくはそのうちの全ては、上記のとおりの親和性結合スクリーニングにより予め選択される。
本発明者らはさらに、サブライブラリーのうちの少なくとも２つの組換え核酸（メンバー）を組み換えて、組換えｓｃＦｖ核酸を形成できることを企図する。好ましい実施形態では、少なくとも２つの組換え核酸（メンバー）の各々は、異なるサブライブラリーから選択される。例えば、１つの組換え核酸は、ＶＨ－ＣＤＲ１／２サブライブラリー、複数のＶＨ－ＣＤＲ３サブライブラリー、及びＶＬサブライブラリーの各々から選択され得る。他の例に関して、１つの組換え核酸は、ＶＨ－ＣＤＲ１／２サブライブラリー、複数のＶＨ－ＣＤＲ３サブライブラリー、及びＶＬサブライブラリーのうちの２つの各々から選択され得る。好ましくは、サブライブラリーから選択される組換え核酸のうちの少なくとも１つ、より好ましくはそのうちの全ては、上記のとおりの親和性結合スクリーニングにより予め選択される。
最も典型的には、組換えｓｃＦｖ核酸は、サブライブラリーに由来する組換え核酸の一部を組み換えることによって構築され得る。この実施形態では、組換え核酸の一部は、組換え核酸に挿入されたランダム配列カセットを含む。したがって、例えば、第１の工程として、ＶＨ－ＣＤＲ１／２サブライブラリーの組換え核酸の一部は、
（ランダム配列カセットは下線が引かれる）、好ましくは、
より好ましくは、
であってもよい。同様に、例えば、ＶＨ－ＣＤＲ３サブライブラリーの組換え核酸の一部は、
（ランダム配列カセットは下線が引かれる）、好ましくは、
より好ましくは、
であってもよい。次に、ＶＨ－ＣＤＲ１／２サブライブラリー及びＶＨ－ＣＤＲ３サブライブラリーに由来する組換え核酸の一部が単離され（例えば、ＰＣＲによって）、組み換えられて（例えば、制限－ライゲーション法を介して融合される、組換えＰＣＲを介して作製されるなど）、ＶＨドメイン組換え核酸が形成され得る。したがって、通常、ＶＨドメイン組換え核酸は、
（ランダム配列カセットは下線が引かれる）の構造であろう。任意選択により、ＶＨドメイン組換え核酸はまた、上記のとおりその３’末端においてタンパク質タグ（例えば、ＦＬＡＧタグ、Ｍｙｃタグ、ＨＡタグなど）をコードする核酸配列を含み得る。加えて、このように作製されたＶＨドメイン組換え核酸は、ＶＨドメインライブラリーメンバーとしてＶＨドメインライブラリー中に配置され得る。
そのように形成されたＶＨドメイン組換え核酸はさらに、ＶＬサブライブラリーの組換え核酸と組み換えられて、組換えｓｃＦｖ核酸が形成され得る。図５は、サブライブラリーからの配列を組み換える１つの例示的な方法を示す。示されるとおり、また典型的には、ＶＨドメイン組換え核酸の一部及びＶＬサブライブラリーの組換え核酸の一部が、組換えｓｃＦｖ核酸に融合される。例えば、ＶＬサブライブラリーの組換え核酸が、ＶＨドメイン組換え核酸の一部の３’末端に融合され得るように、ＶＨドメイン組換え核酸の一部は、
（好ましくは、その３’末端においてタンパク質タグをコードする任意の核酸を伴わない）を含んでもよく、且つＶＬサブライブラリーの組換え核酸の一部は、
（プロモーター及び５’－ＵＴＲを伴わない）を含んでもよい。したがって、典型的な組換えｓｃＦｖ核酸は、
の構造であろう。ＶＨドメイン組換え核酸の一部及びＶＬサブライブラリーの組換え核酸の一部は、単一のポリペプチドをコードするように同じ読み枠に置かれることが非常に好ましい。
好ましくは、ＶＨドメイン組換え核酸の一部及びＶＬサブライブラリーの組換え核酸の一部は、２つの部分の間のリンカー（短いペプチドスペーサー断片）をコードする核酸を介して融合される。リンカー又はスペーサーのためのペプチド配列の任意の好適な長さ及び順序が使用され得る。しかしながら、リンカーペプチドの長さは、３～３０個のアミノ酸、好ましくは５～２０個のアミノ酸、より好ましくは５～１５個のアミノ酸であることが好ましい。例えば、本発明者らは、グリシンリッチ配列（例えば、ｇｌｙ－ｇｌｙ－ｓｅｒ－ｇｌｙ－ｇｌｙなど）が、ＶＨとＶＬドメイン間でｓｃＦｖの可動性をもたらすように利用されることを企図する。
任意選択により、組換えｓｃＦｖ核酸はまた、上記のとおりその３’末端においてタンパク質タグ（例えば、ＦＬＡＧタグ、Ｍｙｃタグ、ＨＡタグなど）をコードする核酸配列を含み得る。加えて、このように作製された組換えｓｃＦｖ核酸は、発現ライブラリーメンバーとして発現ライブラリー中において配置され得る。
いくつかの実施形態では、そのように形成された組換えｓｃＦｖ核酸はさらに、１つ以上の目的のリガンド（例えば、癌抗原、ネオエピトープなど）に対するそれらの結合親和性、安定性、ｐＨ感受性、及び／又は種間交差反応性に基づいて、スクリーニング及び／又は分類される。例えば、組換えｓｃＦｖ核酸によってコードされるｓｃＦｖペプチドの安定性は、経時的にペプチドのサイズを測定するサイズ排除クロマトグラフィーによって分析され得る。他の例に関して、組換えｓｃＦｖ核酸によってコードされるｓｃＦｖペプチドのｐＨ感受性及び結合親和性は、異なる緩衝液条件（ｐＨ、温度など）においてｓｃＦｖペプチドを１つ以上のリガンドと接触させることによって分析され得る。
発現ライブラリーに由来する所望の組換えｓｃＦｖ核酸のそれらの分析及びさらなる単離に関して、本発明者らは、組換えｓｃＦｖ核酸が、ｍＲＮＡの形態で存在する場合があり、任意選択により、ｍＲＮＡの３’末端でピューロマイシン分子と予め結合されることを企図する。次に、ピューロマイシン結合型ｍＲＮＡから転写されるペプチドがピューロマイシンを介してｍＲＮＡと結合されるように、ピューロマイシン結合型ｍＲＮＡはインビトロで転写され得る。次に、ペプチドは、１つ以上のリガンドと、任意選択により異なる緩衝液条件（ｐＨ、温度など）において接触される。好ましくは、ｐＨ５．０～８．０、好ましくはｐＨ６．０～８．０、より好ましくはｐＨ６．５～８．０で１０－６Ｍ以下、好ましくは１０－７Ｍ以下のＫＤを有する親和性を有してリガンドに結合するペプチドが、選択され、且つ単離される。リガンドに対して高い親和性を有するペプチドが単離されると、単離されたペプチドのｃＤＮＡが、ピューロマイシン及びペプチドと結合したｍＲＮＡのインビトロ逆転写を介して作製され得る。
さらに、組換えｓｃＦｖ核酸によってコードされる単離ペプチドのそのように作製されたｃＤＮＡを、免疫グロブリンの部分に移植し、置き換えて、組換え免疫グロブリン又はその断片を形成できる。例えば、そのように作製されたｃＤＮＡは、免疫グロブリンの重鎖及び軽鎖の可変領域が単離ペプチドによって形成されるｓｃＦｖと置き換えられ得るように、免疫グロブリン重鎖定常領域の骨格と融合され得る。或いは、本発明者らはまた、組換えｓｃＦｖ核酸のＶＨ部分（又はＶＨドメイン組換え核酸に由来する）及びＶＬ部分（又は組換えｓｃＦｖ核酸に由来する）を、免疫グロブリンの部分に移植し、置き換えて、組換え免疫グロブリン又はその断片を形成できることを企図する。例えば、組換えｓｃＦｖ核酸のＶＨ部分（又はＶＨドメイン組換え核酸に由来する）及びＶＬ部分（又は組換えｓｃＦｖ核酸に由来する）を、それぞれ免疫グロブリン重鎖定常領域又は軽鎖定常領域の骨格と融合させて、所望のリガンドに特異的な可変領域を有する免疫グロブリンを形成する。
これらの例において、免疫グロブリンは、異なる型の免疫グロブリンを構成する重鎖又は定常ドメインの任意の型（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡ及びＩｇＹ）及び任意のクラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１及びＩｇＡ２）を含み得ることが企図される。加えて、「抗体」は、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体を含んでもよいが、これらに限定されない。この文脈において、企図された系及び方法により、単離されたＶＨ及びＶＬドメインを所望の種（例えば、ヒト）の抗体の残部に移植することによって種特異的抗体の作製が可能になることが留意されるべきである。別の例において、そのように作製されたｃＤＮＡを、免疫グロブリンの他の部分をコードする核酸と融合させて、免疫グロブリンの断片を形成できる。この例において、免疫グロブリンの断片は、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ’）２、ジスルフィド結合Ｆｖ（ｓｄＦｖ）、及びＦｖであり得ることが企図される。本発明者らはさらに、そのように作製されたｃＤＮＡの一部を、免疫グロブリンの他の部分をコードする核酸と融合させて、ＶＨセグメント及び／又はＶＬセグメントのいずれかを含む任意の断片を形成できることを企図する。
さらに、本発明者らは、ｓｃＦｖ部分が、様々なタンパク質及び非タンパク質分子のための標的化実体として使用され得ることを企図する。例えば、ｓｃＦｖ部分を、（典型的にはキメラタンパク質として）ＡＬＴ－８０３型分子に結合させて、特異的な標的化性能を有するＴｘＭ実体を形成してもよい（例えば、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．２０１６ Ｎｏｖ １１；２９１（４６）：２３８６９－２３８８１を参照のこと）。別の例において、ｓｃＦｖ部分を担体タンパク質（例えば、アルブミン）に結合して、薬物が担体に結合される場合に腫瘍微小環境における特定の位置に１つ以上の薬物の標的特異的な送達を可能にし得る。
本発明者らはさらに、ランダム配列の標的化された多様化を介してサブライブラリーを構築すること、及び／又はサブライブラリーのメンバーを予め選択することによって、発現ライブラリーが、不安定配列、非結合配列、又は誤って折り畳まれた配列を除去することにより、多様性の犠牲を最小限に抑えながら、約１０１２の複雑さを達成できることを企図する。したがって、発現ライブラリーを作製するための上記のアプローチは、配列の複雑さに意味のある大きさを提供しつつ、少量でバインダー／抗体をスクリーニングするのに実用的である。加えて、発現ライブラリーを作製するための上記のアプローチは、バインダー／抗体のスクリーニング手順を単純化した。従来、結合ドメイン（又はモチーフ）をコードする任意の核酸配列（例えば、ランダム化された配列）のインビトロバリデーションは、核酸配列をＦａｂドメインに変換することを必要とし、その後、結合親和性を、目的のリガンドとのプルダウンアッセイを介して試験することができた。本明細書に提示される方法は、核酸配列をＦａｂドメインに変換することなく、親和性（例えば、Ｋｄ値）、ｐＨ感受性、及び種間交差反応性（例えば、表面プラズモン共鳴アッセイなどを介して）による順位付けを介して、結合ドメイン（又はモチーフ）をコードする核酸配列のインビトロバリデーションを可能にする。さらに、安定性及び感受性に基づく各ライブラリーからのメンバーの事前選択は、所望のバインダー／ｓｃＦｖ／抗体ドメインがより迅速且つ効率的に同定され得るように、ライブラリーにおいて試験されることになるプールを減少させる。したがって、本発明者らはまた、インビトロ翻訳後のライブラリーメンバーが固相結合抗原に対してスクリーニングされるｍＲＮＡディスプレイ技術を用いて、高多様性プールから高親和性バインダー（例えば、ナノ及びピコモルＫｄを有する）を単離するための方法を企図する。バインダーが同定されると、それらは、以下にさらに記載されるとおり、親和性及びＫｏｎ／Ｋｏｆｆ特性に関して表面プラズモン共鳴分光法によってさらに特徴付けられ得る。別の観点から見ると、企図された系及び方法は、インビボ免疫系から完全に独立したプロセスにおいて、バインダーの迅速な検出及びｓｃＦｖ又は抗体の作製を可能にする。
実施例
効率を維持しながら多様性を最大化するために、標的化される多様化領域（複数可）を同定するための任意の好適な多様化スキームが企図され得るが、本発明者らは、ＶＨ３／Ｖｋ１が、免疫グロブリンの様々なドメインの中でランダム化のための良好な候補領域の１つであり得、ＶＨ３が、最も安定で可溶性のＶＨドメインであると考えられ、且つ軽鎖のＶｋ１が、安定で可溶性であることを見出した。したがって、ＶＨ３／Ｖｋ１ランダム化対が、より効率的に完全なサイズの免疫グロブリンに変換することが企図される。したがって、本発明者らは、ＶＨ３及びＶｋ１フレームワークを使用する事前選択戦略を開発した。図１は、ＶＨ３／Ｖｋ１の対を使用する１つの例示的ランダム化戦略を示す。１個の抗原に特異的な少なくとも１４個の免疫グロブリン分子のタンパク質配列が比較され、分析される。１４個の免疫グロブリン分子の中で最も安定で保存された配列がフレームワークとして使用され、可変配列の位置を分析して、ランダム化された配列及びランダム化の程度（例えば、完全にランダム、部分的にランダムなど）として使用する。
効率を維持しながら多様性を最大化するために、標的化される多様化領域（複数可）を同定するための任意の好適な多様化スキームが企図され得るが、本発明者らは、ＶＨ３／Ｖｋ１が、免疫グロブリンの様々なドメインの中でランダム化のための良好な候補領域の１つであり得、ＶＨ３が、最も安定で可溶性のＶＨドメインであると考えられ、且つ軽鎖のＶｋ１が、安定で可溶性であることを見出した。したがって、ＶＨ３／Ｖｋ１ランダム化対が、より効率的に完全なサイズの免疫グロブリンに変換することが企図される。したがって、本発明者らは、ＶＨ３及びＶｋ１フレームワークを使用する事前選択戦略を開発した。図１は、ＶＨ３／Ｖｋ１の対を使用する１つの例示的ランダム化戦略を示す。１個の抗原に特異的な少なくとも１４個の免疫グロブリン分子のタンパク質配列が比較され、分析される。１４個の免疫グロブリン分子の中で最も安定で保存された配列がフレームワークとして使用され、可変配列の位置を分析して、ランダム化された配列及びランダム化の程度（例えば、完全にランダム、部分的にランダムなど）として使用する。
このランダム化戦略に基づいて、本発明者らはさらに、ＶＨドメインのＣＤＲ１、ＣＤＲ２－ｎ、ＣＤＲ２－ｃ（図２を参照のこと）及びＶＨドメインのＣＤＲ３（図３を参照のこと）について、標的化された多様化配列（ランダム化された配列、ランダムオリゴ）を作製した。ＶＨドメインのＣＤＲ１、ＣＤＲ２－ｎ、ＣＤＲ２－ｃ、ＣＤＲ３、及びＶＬドメインのＣＤＲ３のランダムオリゴを用いて組換えｓｃＦｖ核酸を作製する工程は上に記載され、図４の模式図においても示される。高多様性ライブラリーは、図５において例示的に示されるとおりに構築され、上でより詳細に論じられた。
図１～５において記載されるとおりの組換えｓｃＦｖ核酸を作製する標的化された多様化スキーム及び方法を使用して、本発明者らは、高多様性ライブラリーを作製し、それから組換えα－Ｂ７－Ｈ４８０１（α－Ｂ７－Ｈ４、クローンナンバー８０１）バインダーを単離した。組換えα－Ｂ７－Ｈ４８０１の安定性は、抗体の分解又は変形を評価するための１５分間の分析的サイズ排除クロマトグラフィーにより決定された。図６において示されるとおり、α－Ｂ７－Ｈ４８０１の溶出物は、著しく小さいピークを伴わない単一のピークを示し、これは上記の方法によって作製されたα－Ｂ７－Ｈ４８０１バインダーが、高い安定性を有するｓｃＦｖ又は抗体を生成できたことを示している。
本発明者らは、組換えα－Ｂ７－Ｈ４８０１が、他の市販のα－Ｂ７－Ｈ４抗体（リツキサン（登録商標）、ＬＥＡＦ（登録商標））と実質的に同様な抗体成分を含むことを見出した。組換えα－Ｂ７－Ｈ４８０１と２つの市販のα－Ｂ７－Ｈ４抗体（リツキサン（登録商標）、ＬＥＡＦ（登録商標））の断片が、キャピラリー電気泳動ドデシル硫酸ナトリウム（ＣＥ－ＳＤＳ）を介して分析された。図７において示されるとおり、組換えα－Ｂ７－Ｈ４８０１抗体と２つの市販のα－Ｂ７－Ｈ４抗体（リツキサン（登録商標）、ＬＥＡＦ（登録商標））断片のＣＥ－ＳＤＳ分離は、２つの著明なピークを示し、各々が軽鎖（中央のピーク）及びグリコシル化された重鎖（右のピーク）に相当する。左のピークは、ＣＥ－ＳＤＳ分析のための１０Ｋｄの標準的なマーカーの位置を示す。
本発明者らはさらに、様々な組換えα－Ｂ７－Ｈ４抗体が、標的リガンドに対する異なる結合特性（例えば、親和性、特異性など）を示し得ることを見出した。図８は、平均蛍光強度（ＭＦＩ）によって測定される、Ｂ７－Ｈ４発現２９３Ｔ細胞との結合について試験される２つの組換えα－Ｂ７－Ｈ４抗体であるα－Ｂ７－Ｈ４８０１及びα－Ｂ７－Ｈ４８１７を示す。結果は、α－Ｂ７－Ｈ４８０１抗体が、α－Ｂ７－Ｈ４８１７抗体と比較してＢ７－Ｈ４発現２９３Ｔ細胞に対してより高い結合親和性を有することを示し、これは、別々にランダム化されたＣＤＲドメインが、リガンドに対して異なる結合親和性をもたらし得ることを示している。一番右端のパネルは、非特異的ヒトＩｇＧ１（ｈＩｇＧ１）による対照実験を示す。
組換えα－Ｂ７－Ｈ４抗体はさらに、フローサイトメトリーを使用して、抗原提示細胞（ＡＰＣ）上で発現されるリガンド（Ｂ７－Ｈ４）に対する特異的且つ効率的な結合を決定するために試験された。図９において示されるとおり、組換えα－Ｂ７－Ｈ４抗体は、Ｂ７－Ｈ４リガンドに特異的に結合でき（非特異的アイソタイプ結合からピークアウトを分離している）、これは、組換えα－Ｂ７－Ｈ４抗体が十分に機能的であることを示している。
本発明者らはまた、Ｂ７－Ｈ４（ｓｃＦｖ Ｂ７－Ｈ４８０１）対するｓｃＦｖペプチドとｓｃＦｖ Ｂ７－Ｈ４８０１とともに同じｓｃＦｖペプチドによって作製された組換えα－Ｂ７－Ｈ４抗体（ＩｇＧ α－Ｂ７－Ｈ４８０１）が、表面プラズモン共鳴アッセイを使用して機能的に互換性があることを見出した。このアッセイにおいて、Ｆｌａｇタグ付きｓｃＦｖ Ｂ７－Ｈ４８０１は、表面結合ニュートラアビジンと結合されるα－Ｆｌａｇビオチン化抗体を介して表面に固定化される。次に、表面に固定化されたｓｃＦｖ Ｂ７－Ｈ４８０１ペプチドは、Ｂ７－Ｈ４を含む分析物と接触される。同様のアッセイがα－Ｂ７－Ｈ４抗体により実施された。図１０及び表３において示されるとおり、ｓｃＦｖ Ｂ７－Ｈ４８０１及びＩｇＧ α－Ｂ７－Ｈ４８０１は、Ｂ７－Ｈ４に対して実質的に同様の親和性及び結合特性を示し、それらが、機能的に互換性があることを示している。さらに、インビトロ翻訳ペプチド（ｓｃＦｖ）の結合親和性は、ペプチドを抗体骨格に移植することなく直接的に測定され得るため、発現ライブラリー中のより多くの組換えｓｃＦｖ核酸が効率的にスクリーニングされ得る。
ＶＨのＣＤＲ１～３及びＶＬのＣＤＲ３において様々なランダム配列カセットを有するＢ７－Ｈ４に対する複数のｓｃＦｖペプチドの間で、本発明者らは、特定のドメイン（特定のランダム配列カセット）における類似性が、ｓｃＦｖペプチドにリガンドに対する同様の結合特性を有するようにし得るかどうかを試験した。５つのｓｃＦｖペプチド（８０１、８０２、９０５、９０６、及び８１７）は、Ｂ７－Ｈ４に対するそれらの結合親和性について試験された。表４において示されるとおり、それらの中で４つのｓｃＦｖペプチド（クローン８０１、８０２、９０５、９０６）は、同様のＣＤＲ３配列を有する。ＶＨのＣＤＲ３において同様のランダム配列カセットを有するそれらの４つのｓｃＦｖペプチドは、２５℃と３７℃の両方においてＢ７－Ｈ４に対する同様の結合親和性を示し（表５において示されるとおり）、これは、少なくともＢ７－Ｈ４に対するｓｃＦｖペプチド中において、ＶＨのＣＤＲ３における配列が、リガンドに対する結合に重要であり得ることを示している。
本発明者らはまた、サブライブラリー及び発現ライブラリーを用いてインターロイキン－８（ＩＬ－８）（ｓｃＦｖ ＩＬ－８）に結合する複数のｓｃＦｖペプチドを作製し、様々な条件（温度及びｐＨ）においてＩＬ－８に対する親和性を試験した。例示的なｓｃＦｖ ＩＬ－８ペプチド及び様々な条件において測定されたそれらの結合親和性は、表６において示される。表６において示されるクローンの中で、クローン４９－７、４９－１及び４９－１２が同様のＶＨ ＣＤＲ３配列を含有し、クローン４９－１９、４９－３７、及び４９－２５が同様のＶＨ ＣＤＲ３配列を含有する。加えて、クローン４９－３及び４３－２は、同様のＶＨ ＣＤＲ３配列を含有する。Ｂ７－Ｈ４に対するｓｃＦｖペプチドとは対照的に、本発明者らは、ｓｃＦｖ ＩＬ－８ペプチドの結合親和性が、ＶＨのＣＤＲ３におけるランダム配列における類似性に決定的に依存的ではない場合があることを見出した。例えば、クローン４９－１８、４９－３７、及び４９－２５が、同様のＶＨ ＣＤＲ３配列を含有する一方で、それらの配列の結合親和性（ＫＤＸ１０－９Ｍにおいて測定される単位）は、０．８９４Ｘ１０－９Ｍと２５Ｘ１０－９Ｍの間で変動する。
本発明者らはさらに、好中球サイズを測定することにより、ｓｃＦｖ ＩＬ－８が、ＩＬ－８を効率的に捕捉することによってＩＬ－８の作用を中和できるかどうかを試験した。一般に、好中球は、ＩＬ－８によって刺激されると拡大される（例えば、より大きな直径を有するなど）（図１１に示されるとおり）。本発明者らは、好中球拡大に対するそのようなＩＬ－８作用を、組換えα－ＩＬ－８抗体（ｍＡｂ αＩＬ－８２０１、図１２において示されるとおり、上段左のグラフ）又はいくつかのｓｃＦｖ ＩＬ－８ペプチド（αＩＬ－８＃２、αＩＬ－８４９－３、αＩＬ－８４９－１０、図１２において示されるとおり、下段のグラフ）の添加によって大幅に消失できたことを見出したが、これは、ｓｃＦｖ ＩＬ－８ペプチドが、培地中の遊離ＩＬ－８に結合することによってＩＬ－８の作用を効率的に中和できたことを示している。
ＩＬ－８は、好中球をＩＬ－８放出の部位（例えば、感染の部位）に向かって遊走させる好中球走化性因子である。ｓｃＦｖ ＩＬ－８ペプチドの機能的作用を評価するために、好中球を、多孔性膜を有する挿入物の底に置き、ＩＬ－８によって誘引された好中球が多孔性膜を介して挿入物から培地に向かって遊出できるように、様々な濃度のＩＬ－８を含む媒体中に置いた。図１３において示されるとおり、培地中のＩＬ－８濃度を増大させることによって、遊走した好中球の数が増加した。興味深いことに、そのようなＩＬ－８作用は、ｓｃＦｖ ＩＬ－８ペプチド（αＩＬ－８４３－２）又はｓｃＦｖ ＩＬ－８ペプチドに由来する組換えＩＬ－８抗体（ｍＡｂ αＩＬ－８２０１）の添加により、ほぼ完全に消失した。
図１４は、本明細書に提示されるｍＲＮＡディスプレイライブラリーを使用して単離された様々なｓｃＦｖに関するさらなる実験データを示す。より具体的には、各データポイントは下部に示される標的に対するｓｃＦｖを表し、各ｓｃＦｖに対する親和性値を決定した。見てのとおり、（同じ）ライブラリーにより、様々な異なる標的に対して複数の高親和性のバインダーが得られ、全てのバインダーはマイクロＭ以下で、及び多くはナノＭ以下の親和性範囲を有した。さらに、本発明者らはまた、ヒトＩｇＧ上にＣＤＲを移植した際に、ｓｃＦｖの親和性が維持され得るかどうかについても検討している。図１５は、ヒトＩｇＧ１足場に移植された選択されたｓｃＦｖについての２９個のＣＤＲ移植実験の例示的な結果を示す。図１５の結果から分かるとおり、ヒト化ＩｇＧ１抗体は高い特異性と親和性を保持した（通常、１桁以内）。
発現ライブラリーを使用する組換え実体の作製
ＶＨドメイン組換え核酸及びＶＬサブライブラリーの組換え核酸の組換えにより形成された、組換えｓｃＦｖ核酸、又は１種若しくは複数種の抗体（例えば、ＩｇＧ、ＩＧＭ、ＩｇＥ、ＩｇＡ等）をコードする組換え核酸、又はその断片を、組換えｓｃＦｖ断片が、組換え実体（例えば、細菌、酵母、ウイルス）又はこの組換え実体に感染した細胞により産生され得るように、この組換え実体の発現ベクターにさらに挿入し得ることがさらに企図される。組換えｓｃＦｖ断片をコードする組換え核酸を担持し得る及び／又は組換え核酸を発現し得る任意の適切な組換え実体が企図される。例えば、組換え実体として、任意の適切なウイルスが挙げられ得、例えば、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、アルファウイルス、ヘルペスウイルス、レンチウイルス等が挙げられ得る。しかしながら、アデノウイルスが特に好ましい。さらに、このウイルスが複製欠損及び非免疫原性ウイルスであることがさらに好ましく、このウイルスは、典型的には、選択されたウイルスタンパク質（例えば、Ｅ１、Ｅ３タンパク質）の標的を定めた欠失により実現される。そのような所望の特性を、Ｅ２ｂ遺伝子機能を欠失させることによりさらに増強し得、最近報告されているように、組換えウイルスの高力価を、遺伝的に改変されたヒト２９３細胞を使用して実現し得る（例えば、Ｊ Ｖｉｒｏｌ．１９９８ Ｆｅｂ；７２（２）：９２６－９３３）。そのため、本発明者らは、１つの望ましいウイルスベクターが、Ｅ２ｂ遺伝子が欠失されているか又は機能していない組換えアデノウイルスゲノムを含み得ることを企図する。
ＶＨドメイン組換え核酸及びＶＬサブライブラリーの組換え核酸の組換えにより形成された、組換えｓｃＦｖ核酸、又は１種若しくは複数種の抗体（例えば、ＩｇＧ、ＩＧＭ、ＩｇＥ、ＩｇＡ等）をコードする組換え核酸、又はその断片を、組換えｓｃＦｖ断片が、組換え実体（例えば、細菌、酵母、ウイルス）又はこの組換え実体に感染した細胞により産生され得るように、この組換え実体の発現ベクターにさらに挿入し得ることがさらに企図される。組換えｓｃＦｖ断片をコードする組換え核酸を担持し得る及び／又は組換え核酸を発現し得る任意の適切な組換え実体が企図される。例えば、組換え実体として、任意の適切なウイルスが挙げられ得、例えば、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、アルファウイルス、ヘルペスウイルス、レンチウイルス等が挙げられ得る。しかしながら、アデノウイルスが特に好ましい。さらに、このウイルスが複製欠損及び非免疫原性ウイルスであることがさらに好ましく、このウイルスは、典型的には、選択されたウイルスタンパク質（例えば、Ｅ１、Ｅ３タンパク質）の標的を定めた欠失により実現される。そのような所望の特性を、Ｅ２ｂ遺伝子機能を欠失させることによりさらに増強し得、最近報告されているように、組換えウイルスの高力価を、遺伝的に改変されたヒト２９３細胞を使用して実現し得る（例えば、Ｊ Ｖｉｒｏｌ．１９９８ Ｆｅｂ；７２（２）：９２６－９３３）。そのため、本発明者らは、１つの望ましいウイルスベクターが、Ｅ２ｂ遺伝子が欠失されているか又は機能していない組換えアデノウイルスゲノムを含み得ることを企図する。
或いは、組換え実体は細菌であり得、発現ベクターは、ヒト細胞中で内毒素反応を起こさない程度に低いレベルで内毒素を発現する遺伝子操作細菌中で発現され得る及び／又は人体に導入された場合にＣＤ１４媒介性敗血症を誘発するのに不十分であり得る細菌ベクターであり得る。改変されたリポ多糖を有する細菌株の一例として、ＣｌｅａｒＣｏｌｉ（登録商標）ＢＬ２１（ＤＥ３）エレクトロコンピテントセルが挙げられる。この細菌株は、遺伝子型Ｆ－ｏｍｐＴ ｈｓｄＳＢ（ｒＢ－ｍＢ－）ｇａｌ ｄｃｍ ｌｏｎ λ（ＤＥ３［ｌａｃＩ ｌａｃＵＶ５－Ｔ７遺伝子１ ｉｎｄ１ ｓａｍ７ ｎｉｎ５］）ｍｓｂＡ１４８ ΔｇｕｔＱΔｋｄｓＤ ΔｌｐｘＬΔｌｐｘＭΔｐａｇＰΔｌｐｘＰΔｅｐｔＡを有するＢＬ２１である。これに関連して、いくつかの特異的欠失変異（ΔｇｕｔＱ ΔｋｄｓＤ ΔｌｐｘＬ ΔｌｐｘＭΔｐａｇＰΔｌｐｘＰΔｅｐｔＡ）はＬＰＳの脂質ＩＶＡへの改変をコードするが、１つの追加的な補償変異（ｍｓｂＡ１４８）によりＬＰＳ前駆体脂質ＩＶＡの存在下で細胞が生存を維持することが可能になることを理解すべきである。これらの変異により、ＬＰＳからオリゴ糖鎖が欠失される。より具体的には、６本のアシル鎖の内の２本が欠失される。ＬＰＳの６本のアシル鎖は、ミエロイド分化因子２（ＭＤ－２）との複合体であるＴｏｌｌ様受容体４（ＴＬＲ４）により認識されるトリガーであり、ＮＦ－κＢの活性化及び炎症性サイトカインの産生を引き起こす。わずか４本のアシル鎖を含む脂質ＶＩＡは、ＴＬＲ４により認識されず、そのため内毒素反応を引き起こさない。エレクトロコンピテントＢＬ２１細菌が一例として記載されているが、本発明者らは、遺伝的に改変された細菌はまた、化学的にコンピテントな細菌でもあり得ることを企図する。或いは又は加えて、組換え実体は酵母であり、発現ベクターはまた、酵母（好ましくはサッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）（例えば、ＧＩ－４００シリーズ組換え免疫療法酵母株等））中で発現され得る酵母ベクターでもあり得る。
本発明者らは、複数の組換えｓｃＦｖ核酸及び／又は１種若しくは複数種の抗体（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＡ等）をコードする組換え核酸を使用して組換え実体（例えば組換えウイルス）のセットを作製して、治療上有効な組換え実体の多様性を増加させ得る。好ましくは、複数の組換えｓｃＦｖ、及び／又は１種若しくは複数種の抗体（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＡ等）をコードする核酸組換え核酸を、結合親和性又は他の結合特性が最も高いｓｃＦｖ断片又は抗体の上位３０％、上位２０％、上位１０％、又は５％までをｓｃＦｖ断片又は抗体のプールから選択し得るように、抗原に対するｓｃＦｖ断片又は抗体の親和性及び／又は結合特性（例えば結合キネティクス等）に基づいて選択し得る。いくつかの実施形態では、そのような選択プロセスは、複数ラウンドの選択を介したハイパス断片（ｈｉｇｈ－ｐａｓｓ ｆｒａｇｍｅｎｔ）の選択及びその富化を含み得る。例えば、いくつかの実施形態では、結合親和性が最も高いｓｃＦＶ断片又は抗体の上位３０％を、第１ラウンドの選択で選択し得、結合親和性が最も高い（第１ラウンドからの）上位３０％のｓｃＦｖ断片又は抗体の上位５０％を、第２ラウンドの選択で選択し得、以下同様である。選択の任意の適切な数のラウンド及び通過率（例えば、上位３０％、上位２０％等）を使用し得るが、最終セットのｓｃＦｖ断片又は抗体は、ｓｃＦｖ断片又は抗体のプール全体において結合親和性が最も高いｓｃＦｖ断片の上位３０％、上位２０％、上位１０％、又は５％までを構成し得ることが好ましい。
そのようにして得られた組換えｓｃＦｖ核酸、及び／又は１種若しくは複数種の抗体（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＡ等）をコードする組換え核酸のセットをさらに使用して、同一抗原に結合する複数の様々なｓｃＦｖ断片及び／又は抗体をさらに作製し得る組換え実体（例えば組換えウイルス）の異種プールを作製し得る。任意の特定の理論に拘束されることを望まないが、本発明者らは、そのようなアプローチが、高親和性の候補ｓｃＦｖ断片のプールを増加させることにより、抗原に最も効果的に結合し得るｓｃＦｖ断片及び／又は抗体を同定する機会を増加させ得ると予期する。見方を変えると、結合親和性が最も高い組換えｓｃＦｖ断片又は抗体は、インビボでの多くの変数（例えば、患者間での抗原におけるわずかな個々の構造的差違、異なる結合条件（例えば、ｐＨ、他の環境障害等）等）に起因して、又は結合親和性が最も高い組換えｓｃＦｖ断片若しくは抗体が治療用抗体として望ましくないキネティック特性を有する可能性があるために、最も治療上有効なｓｃＦｖ断片又は抗体ではない可能性がある。そのため、様々なｓｃＦｖ断片又は抗体をコードする核酸のセットを使用して組換え実体の異種プールを作製することにより、（たとえ抗原への結合親和性が最も高いものでなくても）治療に有効なｓｃＦｖ断片を同定する機会がある。加えて、同一抗原に結合する（組換え実体の異種プールから作製された）抗体の異種プールは、特定のインビボ条件下で同時に有効性を失う可能性がある抗体の同種プールと比較して、インビボで抗原を標的とするための有効性を増加させ得る。見方を変えると、本発明者らは、組換え実体（特に、同一抗原を標的とする様々なｓｃＦｖ断片又は抗体をコードする組換え核酸を担持する組換えウイルス）の異種プールが、腫瘍を有する患者の治療において、より治療上の有益であり及び／又は有効であり得ると予期する。
いくつかの実施形態では、発現ベクターは、産生された組換えｓｃＦｖ又は抗体が細胞から分泌され得るように、細胞外分泌用のシグナル伝達ペプチドをコードする核酸セグメントを含み得る。任意の適切なシグナル伝達ペプチドが企図されるが、例示的なシグナル伝達ペプチドは、正電荷を帯びたＮ末端領域（ｎ－領域）、疎水性の中心領域（ｈ－領域）、及び中性の極性Ｃ末端領域（ｃ－領域）を有する５～３０個のアミン酸を含み得、このアミノ酸は、細胞内輸送中に切断され得る。シグナル伝達ペプチドをコードする核酸セグメントは、好ましくは、（任意選択により、より短いリンカー（例えば、グリシンリッチリンカーをコードする核酸）を介して）ｓｃＦｖをコードする組換え核酸のＮ末端に位置し得る。
或いは及び／又は加えて、発現ベクターは、腫瘍に対する免疫反応を誘発し得るか若しくは増加させ得る及び／又は作製されたｓｃＦｖ断片の活性を増加させ得る１種又は複数種の要素をさらに含み得る。そのため、いくつかの実施形態では、発現ベクターは、ネオ抗原、腫瘍関連抗原、又は腫瘍特異的患者特異的ネオエピトープ、共刺激性分子、免疫刺激性サイトカイン、組換え免疫グロブリンタンパク質複合体、及び／又はチェックポイント阻害剤をコードする別の核酸セグメントを含み得る。このサイトカインに関して、免疫反応を調節し得る（例えば、Ｔ細胞活性を増加させるか又は減少させる等）任意の適切なサイトカインが企図される。そのため、企図される共刺激性分子として、Ｂ７．１（ＣＤ８０）、Ｂ７．２（ＣＤ８６）、ＣＤ３０Ｌ、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ４８、ＣＤ７０、ＣＤ１１２、ＣＤ１５５、ＩＣＯＳ－Ｌ、４－１ＢＢ、ＧＩＴＲ－Ｌ、ＬＩＧＨＴ、ＴＩＭ３、ＴＩＭ４、ＩＣＡＭ－１、ＬＦＡ３（ＣＤ５８）、及びＳＬＡＭファミリのメンバーが挙げられ得る。加えて、このサイトカインは、ＩＬ－１５スーパーアゴニスト（ＩＬ－１５Ｎ７２Ｄ）、並びに／又はＩＬ－７、ＩＬ－１５、ＩＬ－１８、ＩＬ－２１、及びＩＬ－２２の少なくとも１つに結合したか若しくは好ましくはＩＬ－７及びＩＬ－２１の両方に結合したＩＬ－１５スーパーアゴニスト／ＩＬ－１５ＲαＳｕｓｈｉ－Ｆｃ融合複合体（例えばＡＬＴ－８０３）であり得る。企図される共刺激性分子として、Ｂ７．１（ＣＤ８０）、Ｂ７．２（ＣＤ８６）、ＣＤ３０Ｌ、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ４８、ＣＤ７０、ＣＤ１１２、ＣＤ１５５、ＩＣＯＳ－Ｌ、４－１ＢＢ、ＧＩＴＲ－Ｌ、ＬＩＧＨＴ、ＴＩＭ３、ＴＩＭ４、ＩＣＡＭ－１、ＬＦＡ３（ＣＤ５８）、及びＳＬＡＭファミリのメンバーが挙げられ得る。例示的なチェックポイント阻害剤として、ＣＴＬＡ－４（特にＣＤ８＋細胞の場合）、ＰＤ－１（特にＣＤ４＋細胞の場合）、ＴＩＭ１受容体、２Ｂ４、及びＣＤ１６０に対する抗体又は結合分子が挙げられ、例えば、イピリムマブ、ニボルマブが挙げられる。
いくつかの実施形態では、組換え実体を使用して、インビトロでｓｃＦｖ断片及び／又は抗体を作製し得る。例えば、組換え細菌又は組換え酵母を誘導して及び／又は培養して、ｓｃＦｖタンパク質を発現させ得、そのように発現されたｓｃＦｖ断片タンパク質を、さらなる使用のために、任意の適切な方法（例えば、親和性結合精製等）によりさらに精製し得る、及び／又は単離し得る。他の実施形態では、組換え実体を使用して、インビボ及び／又はエキソビボで哺乳類細胞を感染させ得る。例えば、ｓｃＦｖ断片をコードする組換え核酸を有する組換えウイルスは、この組換えウイルスと哺乳類細胞とを共インキュベートして、この哺乳類細胞中でｓｃＦｖ断片を産生させることにより、インビトロで（又はエキソビボで）哺乳類細胞に感染し得る。そのような例では、哺乳類細胞は、組換えｓｃＦｖ断片を分泌する外来性核酸からのタンパク質を産生し得る任意の適切な哺乳類細胞であり得、この哺乳類細胞として、任意の確立された細胞系統（ヒト若しくは非ヒト、例えば、ＨＥＫ－２９３細胞、ＣＨＯ細胞等）、又は腫瘍を有する患者から得られた自家細胞（例えば、エキソビボで単離された及び／若しくは拡大された自家Ｂ細胞等）が挙げられ得る。
或いは、ｓｃＦｃ断片及び／又は抗体をコードする組換え核酸を有する組換えウイルスを、このｓｃＦｃ断片及び／又は抗体をインビボで産生させて分泌させ得るように、（腫瘍を有する）ヒト又は哺乳類に投与し得る。そのような実施形態では、組換えウイルスを、任意の薬学的に許容される担体で製剤化し得、好ましくは、ウイルス力価が投与単位当たり１０４～１０１２個のウイルス粒子である無菌注射用組成物として製剤化し得る。しかしながら、本明細書では代替の製剤も使用に適していると思われ、本明細書では全ての既知の投与経路及び投与様式も企図される。本明細書で使用する場合、組換えウイルス製剤を「投与する」という用語は、組換えウイルス製剤の直接的投与及び間接的投与の両方を指し、組換えウイルス製剤の直接的投与は、典型的には、医療従事者（例えば、医師、看護師等）により実施され、間接的投与は、（例えば、注射、注入、経口送達、局所送達等による）直接的投与のために医療従事者に組換えウイルス製剤を提供するか又は利用可能にする工程を含む。
いくつかの実施形態では、組換えウイルス製剤を、皮下（ｓｕｂｃｕｔａｎｅｏｕｓ）、皮下（ｓｕｂｄｅｒｍａｌ）注射、又は静脈内注射等の全身注射により投与する。他の実施形態では、全身注射が効率的でない可能性がある場合（例えば脳腫瘍の場合等）には、組換えウイルス製剤を腫瘍内注射により投与することが企図される。
組換えウイルス製剤投与の用量及びスケジュールに関して、この用量及び／又はスケジュールは、腫瘍の種類、大きさ、位置、患者の健康状態（例えば、年齢、性別等を含む）、及び任意の他の関連する条件に応じて変動し得ることが企図される。変動し得るが、この用量及びスケジュールを、組換えウイルスが宿主の正常細胞に有意な毒性効果を全くもたらさないように選択して調節し得、それでも、腫瘍をそのように治療するために組換えｓｃＦｖ断片の産生を誘導するのに効果的であるのに十分である。例えば、組換えウイルス製剤の企図される用量は、少なくとも１０６個のウイルス粒子／日、又は少なくとも１０８個のウイルス粒子／日、又は少なくとも１０１０個のウイルス粒子／日、又は少なくとも１０１１個のウイルス粒子／日である。いくつかの実施形態では、組換えウイルス製剤の単回用量を、少なくとも１日、少なくとも３日、少なくとも１週間、少なくとも２週間、少なくとも１ヶ月、又は任意の他の所望のスケジュールにわたり、少なくとも１日に１回又は１日に２回（１回の投与当たり半分の用量）で投与し得る。他の実施形態では、組換えウイルス製剤の用量を、スケジュール中に徐々に増加させ得るか、又はスケジュール中に徐々に減少させ得る。さらに他の実施形態では、組換えウイルス製剤のいくつかの一連の投与を、間隔を置いて分離し得る（例えば、３日連続にわたりそれぞれ１回の投与、及び７日の間隔を置いてさらに３日連続にわたりそれぞれ１回の投与等）。
本明細書の発明的概念から逸脱することなく、既に記載されたもの以外にも多くの変形形態が可能であることは、当業者には明らかなはずである。したがって、本発明の主題は、添付の特許請求の範囲以外に制限されるものではない。さらに、本明細書及び特許請求の範囲の両方を解釈する際には、全ての用語は、文脈に沿った可能な限り広範な方法で解釈されるべきである。特に、用語「含む」及び「含むこと」は、非排他的な様式で要素、構成要素、又は工程を参照していると解釈されるべきであり、参照される要素、構成要素、又は工程が存在し得るか、利用され得るか、又は明示的に参照されない他の要素、構成要素、又は工程と組み合わされ得ることを示している。本明細書及び後続の特許請求の範囲全体で使用されるとおり、「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」の意味は、文脈が明らかにそうでないことを指示しない限り、複数の参照を含む。また、本明細書において使用されるとおり、「ｉｎ」の意味は、文脈が明らかにそうでないことを指示しない限り、「ｉｎ」及び「ｏｎ」を含む。本明細書の請求項が、Ａ、Ｂ、Ｃ、．．．．及びＮからなる群から選択されるもののうちの少なくとも１つを指す場合、本文は、Ａ＋Ｎ、又はＢ＋Ｎなどではなく、群から１つの要素のみを必要とするものと解釈されるべきである。
Claims (48)
- 組換えウイルスであって、
別個の抗体又は抗体断片をコードする発現ライブラリーのメンバーを含む組換え核酸を含み、
前記発現ライブラリーの前記メンバーは、
（１）ＶＨ－ＣＤＲ１／２サブライブラリー、（２）複数のＶＨ－ＣＤＲ３サブライブラリー、及び（３）ＶＬサブライブラリーを作製するか又は提供する工程であり、前記サブライブラリー（１）～（３）の各々は、複数のメンバーを含み、
前記サブライブラリーの各メンバーは、複数の縮重塩基位置を有する少なくとも１つのランダムカセットを含む、作製するか又は提供する工程、並びに
前記ＶＨ－ＣＤＲ１／２サブライブラリー、前記複数のＶＨ－ＣＤＲ３サブライブラリー、及び前記ＶＬサブライブラリーの少なくとも２つのメンバーの少なくとも一部を組み換えて、前記発現ライブラリー中の前記発現ライブラリーメンバーを形成する工程
により作製されている、組換えウイルス。 - 遺伝的に改変された低免疫原性ウイルスである請求項１に記載の組換えウイルス。
- 下記の遺伝子：Ｅ１Ａ、Ｅ１Ｂ、Ｅ２Ｂ、Ｅ３の少なくとも１つにおいて変異を有するヒトアデノウイルス血清型５である請求項２に記載の組換えウイルス。
- 前記ＶＨ－ＣＤＲ１／２サブライブラリーの前記複数のメンバーが、ＶＨ ＣＤＲ１の一部及びＶＨ ＣＤＲ２の一部の少なくとも一方に相当するランダムカセットを含む、請求項１～３のいずれか一項に記載の組換えウイルス。
- 前記ＶＨ－ＣＤＲ１／２サブライブラリーの複数のメンバーが、ＶＨ ＣＤＲ１の少なくとも一部及びＶＨ ＣＤＲ２の一部に相当する複数のランダムカセットを含む、請求項１～４のいずれか一項に記載の組換えウイルス。
- 前記ＶＨ－ＣＤＲ１／２サブライブラリーの複数のメンバーが、ＶＨ ＣＤＲ２の少なくとも一部に相当する複数のランダムカセットを含む、請求項４に記載の組換えウイルス。
- 前記ＶＨ－ＣＤＲ３サブライブラリーの複数のメンバーが、ＶＨ ＣＤＲ３の少なくとも一部に相当するランダムカセットを含む、請求項１～６のいずれか一項に記載の組換えウイルス。
- 前記ＶＨ－ＣＤＲ３サブライブラリーのメンバーの少なくとも２つのランダムカセットが、様々な長さのペプチドをコードする、請求項１～７のいずれか一項に記載の組換えウイルス。
- 前記ペプチドが、１０～２０個のアミノ酸の範囲の長さを有する、請求項８に記載の組換えウイルス。
- 前記サブライブラリーの前記複数のメンバーが、共通の配列を有する、請求項１～９のいずれか一項に記載の組換えウイルス。
- 前記ＶＬサブライブラリーの前記複数のメンバーが、ＶＬ ＣＤＲ３の一部でランダムカセットを含む、請求項１～１０のいずれか一項に記載の組換えウイルス。
- 前記組み換える工程が、前記ＶＨ－ＣＤＲ１／２サブライブラリーの前記メンバーの少なくとも一部と、前記複数のＶＨ－ＣＤＲ３サブライブラリーの１つとを単離し、合わせて融合させて、ＶＨドメインライブラリーにおけるＶＨドメインライブラリーメンバーを形成する工程であって、前記ＶＨドメインライブラリーは、複数のＶＨドメインライブラリーメンバーを含む、形成する工程を含む、請求項１～１１のいずれか一項に記載の組換えウイルス。
- 発現ライブラリーの前記メンバーが、前記ＶＬサブライブラリーの前記メンバーの少なくとも一部を単離し、前記ＶＬサブライブラリーの前記メンバーの一部と、前記ＶＨドメインライブラリーメンバーの１つとを融合させて、前記発現ライブラリーメンバーを形成することにより作製されている、請求項１２に記載の組換えウイルス。
- 前記組み換える工程が、前記ＶＨ－ＣＤＲ１／２サブライブラリーの前記メンバーの少なくとも一部と、前記複数のＶＨ－ＣＤＲ３サブライブラリーの１つとを単離し、合わせて融合させて、発現ライブラリーメンバーの第１の群を形成する工程を含む、請求項１～１３のいずれか一項に記載の組換えウイルス。
- 前記組換え核酸が、前記別個の抗体又は抗体断片の分泌を促進するシグナル伝達ペプチドをコードする核酸断片をさらに含む、請求項１～１４のいずれか一項に記載の組換えウイルス。
- 前記別個の抗体又は抗体断片が、ｓｃＦｖを含む、請求項１～１５のいずれか一項に記載の組換えウイルス。
- 前記発現ライブラリーメンバーをサブクローニングして、前記ｓｃＦｖを有するＩｇＧ１を構築する工程をさらに含む請求項１７に記載の組換えウイルス。
- 前記ランダムカセットが、配列番号１～配列番号２５から選択されるオリゴヌクレオチドを使用して作製されている、請求項１～１７のいずれか一項の組換えウイルス。
- （１）ＶＨ－ＣＤＲ１／２サブライブラリー、（２）複数のＶＨ－ＣＤＲ３サブライブラリー、及び（３）ＶＬサブライブラリーを作製又は提供する工程であって、前記サブライブラリー（１）～（３）の各々が複数のメンバーを含み；
前記サブライブラリーの各メンバーが、複数の縮重塩基位置を有する少なくとも１つのランダムカセットを含む工程；
前記ＶＨ－ＣＤＲ１／２サブライブラリー、前記複数のＶＨ－ＣＤＲ３サブライブラリー、及び前記ＶＬサブライブラリーの少なくとも２つのメンバーの少なくとも一部を組換えて、発現ライブラリー中の発現ライブラリーメンバーを形成する工程であって、前記発現ライブラリーが、複数の発現ライブラリーメンバーを含み、各発現ライブラリーメンバーが、別個の抗体又は抗体断片をコードする工程；及び
少なくとも１つの発現ライブラリーメンバーを含む組換えウイルスベクターを作製する工程
を含む、組換え抗体を作製する方法。 - 前記組換えウイルスベクターが、遺伝的に改変された低免疫原性ウイルスに由来する、請求項１９に記載の方法。
- 前記遺伝的に改変された低免疫原性ウイルスが、下記の遺伝子：Ｅ１Ａ、Ｅ１Ｂ、Ｅ２Ｂ、Ｅ３の少なくとも１つにおいて変異を有するヒトアデノウイルス血清型５である、請求項２０に記載の方法。
- 前記ＶＨ－ＣＤＲ１／２サブライブラリーの複数のメンバーが、ＶＨ ＣＤＲ１の一部及びＶＨ ＣＤＲ２の一部のうちの少なくとも１つに相当するランダムカセットを含む、請求項１９～２１のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ＶＨ－ＣＤＲ１／２サブライブラリーの複数のメンバーが、ＶＨ ＣＤＲ１の少なくとも一部及びＶＨ ＣＤＲ２の一部に相当する複数のランダムカセットを含む、請求項１９～２１のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ＶＨ－ＣＤＲ１／２サブライブラリーの複数のメンバーが、ＶＨ ＣＤＲ２の少なくとも一部に相当する複数のランダムカセットを含む、請求項２３に記載の方法。
- 前記ＶＨ－ＣＤＲ３サブライブラリーの複数のメンバーが、ＶＨ ＣＤＲ３の少なくとも一部に相当するランダムカセットを含む、請求項１９～２４のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ＶＨ－ＣＤＲ３サブライブラリーのメンバーの少なくとも２つのランダムカセットが、異なる長さを有するペプチドをコードする、請求項１９～２５のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ペプチドが、１０～２０個のアミノ酸の範囲の長さを有する、請求項２６に記載の方法。
- 前記ＶＬサブライブラリーの前記複数のメンバーが、ＶＬ ＣＤＲ３の一部でランダムカセットを含む、請求項１９～２７のいずれか一項に記載の方法。
- 前記サブライブラリーの前記複数のメンバーが、共通の配列を有する、請求項１９～２８のいずれか一項に記載の方法。
- 前記発現ライブラリーメンバーの各々が、複数の前記ランダムカセットを含む、請求項１９～２９のいずれか一項に記載の方法。
- 組み換える工程が、前記ＶＨ－ＣＤＲ１／２サブライブラリーのメンバーの少なくとも一部及び前記複数のＶＨ－ＣＤＲ３サブライブラリーの１つを単離し、合わせて融合して、ＶＨドメインライブラリーにおけるＶＨドメインライブラリーメンバーを形成する工程を含み、前記ＶＨドメインライブラリーが、複数のＶＨドメインライブラリーメンバーを含む、請求項１９～３０のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ＶＬサブライブラリーのメンバーの少なくとも一部を単離し、前記ＶＬサブライブラリーのメンバーの一部を前記ＶＨドメインライブラリーの１つと融合して、前記発現ライブラリーメンバーを形成する工程をさらに含む、請求項３１に記載の方法。
- 前記ＶＬサブライブラリーのメンバーの一部が、リンカーをコードする配列を介して結合される、請求項３２に記載の方法。
- 前記リンカーが、グリシンリッチペプチドである、請求項３３に記載の方法。
- 組み換える工程が、前記ＶＨ－ＣＤＲ１／２サブライブラリーのメンバーの少なくとも一部及び前記複数のＶＨ－ＣＤＲ３サブライブラリーの１つを単離し、合わせて融合して、発現ライブラリーメンバーの第１の群を形成する工程を含む、請求項１９～３４のいずれか一項に記載の方法。
- 発現ライブラリーメンバーの第２の群であって、前記第２の群が、前記ＶＬサブライブラリーのメンバーの少なくとも一部を含む前記第２の群をさらに含む、請求項３５に記載の方法。
- 前記別個の抗体又は抗体断片が、ｓｃＦｖを含む、請求項１９～３６のいずれか一項に記載の方法。
- 前記発現ライブラリーメンバーをサブクローニングして、前記ｓｃＦｖを有するＩｇＧ１を構築する工程をさらに含む請求項３７に記載の方法。
- 前記第１の群及び第２の群の各々からそれぞれ１つのメンバーをサブクローニングして、組換えＶＨ及びＶＬドメインを有するＩｇＧ１を形成する工程をさらに含む請求項３６に記載の方法。
- 以下：リガンドに対する親和性、ｐＨ感受性、及び種間交差反応性のうちの少なくとも１つに基づいて前記発現ライブラリーメンバーのサブセットを選択する工程をさらに含む、請求項１９～３９のいずれか一項に記載の方法。
- ５０ｎＭ未満のＫｄで前記リガンドに結合するｓｃＦｖをコードする前記発現ライブラリーメンバーのサブセットを選択する工程をさらに含む、請求項４０に記載の方法。
- 前記ランダムカセットが、配列番号１～配列番号２５から選択されるオリゴヌクレオチドを使用して作製される、請求項１９～４１のいずれか一項に記載の方法。
- 前記発現ライブラリーメンバーをｍＲＮＡ断片に転写する工程、及び
前記ｍＲＮＡ断片の３’末端でピューロマイシン分子を結合する工程
をさらに含む請求項１９～４２のいずれか一項に記載の方法。 - 前記組換えウイルスベクターを有する組換えウイルスと、哺乳類細胞とを接触させる工程をさらに含む請求項１９～４３のいずれか一項に記載の方法。
- 前記接触させる工程が、哺乳類に前記組換えウイルスを投与する工程を含む、請求項１９～４４のいずれか一項に記載の方法。
- 前記哺乳類細胞が、腫瘍を有する患者の自家細胞であり、前記接触させる工程が、エキソビボで前記自家細胞と前記哺乳類細胞とを共インキュベートする工程を含む、請求項１～４５のいずれか一項に記載の方法。
- 癌ネオエピトープに対する治療用組換え抗体を作製するための請求項１～１８のいずれか一項に記載の組成物の使用。
- 抗原に対して１００ｎＭ以下の親和性を有する高親和性バインダーを単離する方法であって、
請求項１９～４６のいずれか一項に記載の方法によって構築された組成物に前記抗原を接触させる工程を含む、方法。
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