CN1972746A - 分离基质和纯化方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种分离基质，它由固定了配体的多孔支撑物构成，其中所述的配体包含至少一个磺酰胺，并且所述磺酰基中的R基包含芳香基。所述磺酰胺中的氮可以是仲胺或叔胺。本发明也涉及含有上述分离基质的层析柱，以及通过吸附于分离基质上来分离免疫球蛋白样化合物的方法。

Description

分离基质和纯化方法
技术领域
本发明涉及从液体中分离生物分子的领域，例如抗体纯化，更具体地涉及适合于纯化抗体的分离基质。本发明也包括含有新基质的层析柱以及分离抗体的方法。
背景技术
免疫系统由多种相互独立的细胞类型构成，这些类型共同地保护身体免受细菌、寄生虫、真菌、病毒感染及癌细胞生长的伤害。免疫系统的警卫是巨噬细胞，其不断在它们宿主的血液系统中流动。受感染或免疫刺激时，巨噬细胞通过吞噬已知为抗原的用外来分子所标记的入侵者来作出反应。由助手T细胞介导这个事件，经一系列复杂的连锁反应导致对B细胞的刺激。接着这些B细胞产生被称为抗体的蛋白质，其与外来入侵者结合。抗体与抗原结合事件标志着通过噬菌作用或激活补体系统破坏外来侵入者。存在五种不同种类的抗体或免疫球蛋白：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM。它们不但生理作用不同，结构也不同。从结构上说，已经被广泛研究的IgG抗体是特殊的免疫球蛋白，或许因为其在成熟免疫应答中起主要作用。
免疫球蛋白拥有的生物活性，如今已被开发用于人畜诊断、卫生保健和治疗不同的应用范围。事实上，最近几年，单克隆抗体和重组抗体构建已经成为当前临床试验研究和被FDA作为疗法和诊断许可最多的蛋白质种类。表达系统和生产策略互补，设计出纯化试验方案，以简单和成本有效的方式获得高纯抗体。
传统分离免疫球蛋白的方法基于选择性地可逆沉淀蛋白质片断，该片断由免疫球蛋白组成，在溶液里留下其它种蛋白质。典型的沉淀试剂是乙醇、聚乙二醇、感胶的(即抗离液盐，例如硫酸铵和磷酸钾)和辛酸。通常，这些析出方法得到非常不纯的产物，并且同时耗时耗力。此外，在原料中添加沉淀试剂使得难于将上清液用作其它目的，并产生处理的问题，特别是当论及大规模纯化免疫球蛋白时尤其涉及该问题。
离子交换层析法是另外熟知的蛋白质分离法，常用于免疫球蛋白的分离。但是，因为带电的离子交换配体会同所有带相反电荷的化合物反应，离子交换层析法的选择性可能要比其它层析分离法低。
蛋白质A和蛋白质G亲和层析法是免疫球蛋白分离和纯化的流行和普遍的方法，特别是单克隆抗体的分离，主要因为其使用简便，可获得高纯度。与离子交换、疏水作用、羟基磷灰石和/或胶体过滤步骤联合使用，尤其是基于蛋白质A的方法已经成为许多生物制药公司抗体纯化法的选择。然而，尽管它们被普遍应用，存在对有效解决常见问题不断增长的要求和需求，这些常见问题同基于蛋白质A的介质相关，例如成本、泄漏和pH值增加时的不稳定性。
疏水作用层析法(HIC)也是一种广泛记载的免疫球蛋白分离法。然而，疏水基质要求向原材料中加入感胶盐，以使免疫球蛋白有效凝结。通过连续的或阶式梯度降低感胶盐的浓度而从基质中释放结合的抗体。如果目标是高纯度产物，推荐将疏水层析与其它步骤联合。因此，该程序的缺点是必须在原材料中加入感胶盐类，这带来个比重问题，也增加了大规模使用者的成本。对于除细胞培养上清液外的其它原材料，如乳清、血浆、蛋黄，大规模应用时，在许多情况下禁止向原材料中添加感胶盐类，因为盐类消耗原材料而阻止了免疫球蛋白的任何可行的经济应用。大规模应用的另一个问题是数千升废料的处理。
J.Porath于1985年引入作为分离免疫球蛋白的新层析吸附法的亲硫吸附层析法(J.Porath等人；FEBS Letters，185卷，306页，1985)。在这篇论文里描述了与包含游离巯基的多种配体偶联二乙烯基砜活化的琼脂糖如何显示在0.5M硫酸钾即感胶盐的存在下与免疫球蛋白的特异性结合。假定来自二乙烯基砜间隔基的砜基和在配体中产生的硫醚是获得所描述的抗体结合的特异性和能力必需的结构。然而随后表明硫醚可以被氮或氧替代，如果配体进一步包含芳基(K.L.Knudsen等人，Analytical Biochemistry，201卷，170页，1992)。虽然描述用于亲硫吸附层析法的基质有良好表现，但是它也有个主要的缺点，即需要在原材料中添加感胶盐类来确保免疫球蛋白的有效结合，这是针对上述原因的问题。
由(J.Porath等人，Makromol.Chem.，Makromol.Symp.，17卷，359页，1988)和(A.Schwarz等人，Journal of Chromatography B，664卷，83-88页，1995)公开了其它与环氧基激活的偶联琼脂糖偶联的亲硫配体，例如2-巯基吡啶、2-巯基嘧啶和2-巯基噻唑啉。然而，所有这些亲和基质仍不具有充分的亲和力，来确保不添加感胶盐类时抗体的有效结合。US6,498,236(Upfront Chromatography)涉及免疫球蛋白的分离。该方法公开了包括将包含相反电荷的洗脱剂和含有免疫球蛋白的溶液与固相基质接触的步骤，其中至少一部分免疫球蛋白与固相基质结合，和用洗脱液接触固相基质以从固相基质中释放出免疫球蛋白。含有免疫球蛋白的溶液的其它特征在于在pH范围为2.0～10.0，相应于最高2.0的离子强度的总盐浓度，最高0.4M浓度的感胶盐。溶液中的洗涤剂据信抑制了基质与其它生物分子的粘附，可以用辛基硫酸盐、溴酚兰、磺酸辛烷、十二烷基硫酸钠、磺酸己烷来例证。液相基质用式子M-SP1-L来定义，其中M是指基质骨架，SP1是指包含一个或两个芳香或杂芳香部分的配体。
Liu等人(Yang Liu，Rui Zhao，Dihua Shangguan，Hongwu Zhang，Guoquan Liu：Novel sulphmethazine ligand used for one-steppurification of immunoglobulin G from human plasma，Journal ofChromatography B，792(2003)177-185)研究了磺胺甲唑(SMZ)与人IgG的亲和性。因此，公开了配体，其包含磺酰基，其中R基是杂环。根据这篇文章，SMZ被固定在单分散、无孔、交联的聚(甲基丙烯酸缩水甘油酯)珠上。珠子随后被用在高效亲和层析法来分离人血浆中的IgG。pH5.5时达最大吸附。珠子与其它蛋白质呈现最小的非特异性的相互作用。因此，配体能够吸附抗体，在吸附中使用缓冲液使配体同其它蛋白质的相互作用恰好被延缓。然而，众所周知，酯类化合物例如异丁烯酸酯在高pH下易于水解。因此，与蛋白质A和蛋白质G基质类似，所公开的分离基质将被期望在普遍使用的适当清洗程序(cip)中不稳定。US4,725,355(Terumo Kabushiki Kaisha)涉及一种体液纯化介质和设备，尤其涉及用于具有吸附固定装置的支撑物，用于去除致病物质，如体液中的血浆蛋白。根据US4,725,355，为了治疗病人时完成体外血液净化疗，优选更高效排除致病物，并降低血液中的不利影响至极小。根据US4,725,355提供的吸附剂包含至少一种磺胺类药物。根据US4,725,355磺胺药物中的吡咯环显示疏水特性，环中的杂原子具有单独的电子对，成为蛋白质受体。磺胺类药物中的硫胺部分具有氢结合能力。
因此，仍然需要纯化抗体或抗体结构物的可供选择的方法，以观察对纯度、安全、效力和成本效率的要求。
发明概述
本发明的一个目的是提供分离基质，其能够在低离子强度、中性pH值附近吸附抗体，可以通过如权利要求1中所述的分离基质实现该目的。
本发明的另一个目的是提供分离基质，它能够高效地选择性地吸附抗体。
本发明的特定目的是提供一种分离基质，其可以吸附抗体，允许其它蛋白质通过并没有任何实质的相互作用。
本发明的其它目的是提供制备抗体分离所需基质的方法，包含能吸附抗体的官能团，其通过亲硫性、疏水性或氢键作用吸附抗体，并且该方法易于改变配体结构。
本发明的另一个目的是提供一种方法，它通过吸附于分离基质从液相中分离抗体，本方法不需要添加任何洗涤剂即可完成吸附。
将在下面对本发明进一步的目的和优点进行详细描述。
附图简述
图1显示根据本发明的6个不同芳香硫胺类配体的说明性配体结构。
图2是显示根据本发明的IgG在原型配体上的吸附和解吸附的色谱图，如根据本发明的实施例部分实施例2。
图3是显示根据本发明的BSA在原型配体上的吸附和解吸附的色谱图，如根据本发明的实施例部分实施例3。
图4是显示根据本发明的RIB在原型配体上的吸附和解吸附的色谱图，如根据本发明的实施例部分实施例4。
图5是显示根据本发明的TRANSF在原型配体上的吸附和解吸附的色谱图，如根据本发明的实施例部分实施例5。
定义
术语“抗体”和“免疫球蛋白”在这里可以交换使用。
术语“配体”是指能与靶化合物相互作用的分子或化合物，例如抗体。
术语“间隔臂”此处是指将配体与分离基质的支撑物隔开的元件。
“伯胺”用公式RNH2定义，其中R表示一个有机基团。
“仲胺”用公式R2NH定义，其中R表示一个有机基团。
磺酰基用公式-S(＝O)2R定义，其中R表示一个有机基团。
术语“芳香基”是指一个基团，其π电子数目可以根据Huckels规则：(4n+2)计算，n是一个正整数或零。
术语“芳香磺酰胺”是指磺酰胺，其中R基包括一个或多个芳香基。
术语“双环”和“三环”分别指包含2个或3个环的残基。所述环可能是稠合环或分开的环。同样地，由更多数目环组成的残基可以用稠合环或分开的环构成。
术语“可质子化的”基团是指能添加一个氢原子的基团。
术语“亲和基”是指一对亲和物，以生物学上的“锁/钥”方式互相结合。例如众所周知的亲和对是酶和它们各自的受体、生物素和抗生物素蛋白、葡萄球菌表面蛋白抗原A/抗体。
术语“表面”当用于多孔支撑物语境时，既包含孔的表面又包括实际的外表面。
术语“洗脱液”使用其在这个领域的常用涵义，即用来从分离基质释放一种或多种化合物的具有适当pH值或离子强度的缓冲液。
发明详述
第一方面，本发明是分离基质，它由任选地经由间隔臂固定了配体的多孔支撑物构成，其中所述配体包括一个或多个磺酰胺并且磺酰基中的R基包括一个或多个芳香基。
在有利的实施方案中，本发明是由任选地经间隔臂固定了配体的多孔支撑物组成的分离基质，其中所述配体包括一个或多个磺酰胺，并且基本上不含可质子化的基团。在上下文中，术语“基本不含可质子化的基团”理解为没有这样的基团构成配体的一部分，并且因此与目标分子的相互作用在任意实质上的程度上不涉及可质子化的基团。
在一个实施方案中，所述的配体包括至少一个伯胺或仲胺。
分离基质可用来分离(例如纯化或分析)抗体和其它具有相同结合性质化合物，例如包含免疫球蛋白部分或抗体片段的融合蛋白。本发明人表明通过使用包含一个或多个磺酰胺的分离基质，能够以高容量和优异的选择性大规模纯化抗体。与上述讨论的US6,498,236相反，在与使用不带电配体的基质接触前，本发明不需要向包含抗体的液体中添加任何洗涤剂即可完成纯化。更进一步地，如下面实施例中显示的，本发明在同样条件下，三种不同类蛋白质不被吸附，而允许吸附免疫球蛋白。这种选择性使此处描述的芳香磺酰胺类配体在单克隆抗体的纯化上具有很大价值。
众所周知，磺酰胺类药物由胺构成，其中至少一个上述胺的R基是磺酰基。本发明人表明通过在配体中包括一种磺酰胺，其中磺酰R基是芳香基，本分离基质将会展示增强的结合性能。因此，在最优选的实施方案中，R基包括至少一个芳香基。
更进一步地，在一个实施方案中，磺酰基中R基是取代的或未取代的芳香族或杂芳香族基团，例如单或多芳香基。更具体而言，例如R基可能是单环、双环或三环。芳香残基的例子是苯基、苄基、苯甲酰基、萘基和甲苯磺酰基。杂芳族基团可包含一或多个杂原子N、O和S，例如作为实例的噻吩基、呋喃基和吡啶基。
在一个实施方案中，取代基是吸电子的。取代基可能是单个原子，例如卤素或碳原子；或基团如-N(O)2。另外，取代基可以为直链或支链碳链。
同样地，磺胺类配体可以包含进一步的取代基。本领域的技术人员将明白，取代基的性质可用来增强配体结合性能。然而，也可以理解的是应该选择好配体的性质和大小，特别是R基和它的取代基，以免抑制(例如通过位阻效应)与目标分子(如抗体)的结合。
在具体的实施方案中，除了芳香基外，磺酰基的R基包括一个或多个脂肪族基。
在本发明的分离基质的一个实施方案中，配体是磺酰基化的一元胺。在另一个实施方案中，配体是磺酰基化的多胺。这种磺酰基化的多胺可包含任意数目的胺，如2-10个。在例证性的实施方案中，每个多胺包含2-6个胺。在另一个实施方案中，配体包括多于一个磺酰基。这种其它的磺酰基可以是磺酰胺中R基的一部分；并或形成间隔臂的一部分，该间隔臂将配体与支撑物相连。
在本发明的分离基质的具体实施方案中，配体是固定在支撑物上的聚合物的重复单元。聚合物可以是任何合适的多胺，例如聚乙烯亚胺。在一个实施方案中，聚合物是聚乙烯胺。本领域熟练的技术人员将认识到，这种聚合物中的胺的含量可以被改变，例如以任意期望的次序包括伯胺和/或仲胺。因此，在一个实施方案中，聚合物具有两个或多个不同的配体基团。根据本领域标准方法，很容易从合适的单体生产聚合物。将聚合偶联到支撑物上的方法也是众所周知，本领域技术人员易于完成，例如通过原位聚合作用或接枝聚合物，例如参见PCT/SE02/02159(Ihre等人)。该实施方案的优点是，能易于优化分离基质的性质，例如通过改变聚合物的长度、分支等等。可选择地，通过磺酰基中的硫将聚合物与支撑物偶联。
然而，根据本发明的分离基质也可包含与别的官能团结合的一个或多个芳香磺酰胺配体。因此，在一个实施方案中，分离基质的配体是多元配体，在某种意义上它们能够用两个或多个官能团与目标相互作用。附加的或第二官能团可以被容易地引入，例如经由在磺酰胺上引入不同的取代基，或通过间隔臂，或通过烷化磺酰胺中的氮原子，或只是通过在上述磺酰胺基质上引入新配体(两个或多个不同配体结构)的随机方法引入。例如附加的官能团选自芳基、杂环和脂肪族基团、含氢键供体和受体的基团、可带电荷的官能团如胺或酸基、聚羟基化的基团如葡聚糖、聚乙二醇衍生物、包含氟原子的基团。
因此，在一个实施方案中，本分离基质由多孔支撑物构成，在该支撑物上已经固定了包括一个或多个芳香磺酰胺基团和离子交换基团。因此，该实施方案可以被表示为基于磺酰胺的离子交换分离基质。
在另一个实施方案中，分离基质是基于多元磺酰胺的分离基质，其包含与至少一个附加的官能团结合的一个或多个芳香磺酰胺，该官能团选自疏水相互作用层析(HIC)基团、离子交换基团、亲和基团和螯合金属的基团。在一个实施方案中，配体的芳香磺酰胺可以是可质子化的或不可质子化的。
本发明的分离基质的多孔支持物可以是任何合适的材料的。在一个实施方案中，支持物由交联的碳水化合物材料构成，例如由琼脂糖、琼脂、纤维素、葡聚糖、壳聚糖、魔芋糖、角叉菜聚糖、凝胶糖、藻酸盐等。支撑物易于用标准方法制备，例如由反相悬浮凝胶制备(SHjerten：Biochim Biophys Acta 79(2)，393-398(1964))。作为选择，载体是商业上可获得的产品，如SepharoseTM FF(AmershamBiosciences AB，Uppsala，瑞典)。因此，在本发明基质的一个实施方案中，支撑物是交联的多糖。在一个具体的实施方案中，所述多糖是琼脂糖。这种碳水化合物在配体的固定化之前通常是烯丙基化的。简而言之，烯丙基化可以采用烯丙基缩水甘油醚、烯丙基溴或任何其它合适活化剂按照标准的方法实现。
在可替代的实施方案里，本发明的分离基质的多孔支撑物由交联的合成聚合物构成，例如由苯乙烯或苯乙烯衍生物、二乙烯基苯、丙烯酰胺、丙烯酸酯、甲基丙烯酸酯、乙烯基酯类、乙烯基酰胺等等构成。按照标准方法由这样的聚合物构成的支撑物易于被制备，参见例如“Styrene based polymer supports developed by suspensionpolymerization”(R Arshady：Chimica e L′Industria 70(9)，70-75(1988))。作为选择，商用可获得产品，例如SourceTM(AmershamBiosciences AB，Uppsala，瑞典)可以根据本发明对其表面进行改性。然而，在该实施方案中，优选改良载体表面来增加其亲水性，通常转化大部分暴露的残余双键为羟基。
在一个实施方案中，配体被固定到增量剂中或涂层聚合物层中，存在于多孔支撑物的表面上。这种增量剂，也称为“可弯曲臂”，可以是有机或合成聚合物。因此，例如支撑物可以被葡聚糖包被，给支撑物提供亲水性，按照本领域常用方法将配体固定在该支撑物上。
本发明的分离基质可以呈任何合适的形态，如层析基质，例如呈基本上球粒或整块的形式、过滤膜、碎片、面、毛细管或类似物。因此，本发明也包含填充了如上述分离基质的层析柱。在优选的实施方案中，层析柱由任意常规的物质制成，例如由生物相容性塑料，如聚丙烯或玻璃制成。层析柱可以具有适合实验室规模或大规模纯化抗体时的尺寸。在具体的实施方案中，给根据本发明的层析柱提供了路厄氏接头、管状连接器和半球形螺母。因此，本发明也包含由层析柱、至少一种缓冲剂和在单独隔间中的用于纯化抗体的书面说明构成的试剂盒，其中该层析柱填充有上述的分离基质。在具体的实施方案中，本试剂盒也包括路厄氏接头、管状连接器和圆形螺母。
第二方面，本发明涉及制备用于分离抗体的基质的方法，本方法经由它们的胺或经由它们的磺酰基的硫将磺酰胺固定于多孔支撑物上的第一步。在具体的实施方案中，通过将胺或多胺固定于多孔支撑物，并随后磺酰化所述的胺，来制备磺酰胺配体。多孔支撑物可以是如上述的，并可以使用任意标准的用于固定的方法，参见例如ImmobilizedAffinity Ligand Techniques，Hermanson等人，Greg T.Hermanson，A.Krishna Mallia和Paul K.Smith，Academic Press，INC，1992。固定芳香化合物的具体公开内容，参见上文讨论的US6,498,26(层析前沿)。然而，本领域熟练的技术人员将理解，根据配体性质，可以通过直接在支撑物上固定磺酰胺类物质来同样制备一些分离基质。此外，本领域熟练技术人员将会理解，配体密度可用来或多或少地补偿配体的疏水性。换句话说，如果选择一种高疏水性的配体，可能因表现出太高疏水性而不允许轻易解吸所吸附的抗体，它需要在支撑物上用稍微低一些的密度而不是更低的疏水性来补偿。然而，这是一种常见的众所周知的情况，熟练的技术人员可容易地适当调节配体密度使其适于例行检验。
第三方面，本发明是一种从液体中纯化抗体的方法，该方法包括下述步骤：
(a)提供包含至少一种抗体的液体；
(b)使所述液体与分离基质接触，该基质包含一个或多个磺酰胺基团来在基质上吸附一种或多种抗体；并且，任选地
(c)让洗脱剂通过所述基质以释放一种或多种抗体；以及
(d)从洗脱剂的馏分中回收至少一种抗体。
在本文中，可以理解术语“抗体”也包括抗体片断和任何融合蛋白，融合蛋白包括抗体或抗体片断。因此，本方法用来分离任意的免疫球蛋白样分子，其具有与抗体结合的性质。例如包含抗体的液体可以是来源于生产抗体的细胞培养物或发酵肉汤，期望从中纯化一种或多种所期望抗体。作为选择，液体也可是血液或血浆，期望从中移去一种或多种抗体来获得在某方面来说纯净的液体。因此，在本方法的一个实施方案中，步骤(a)中提供的液体也包含除抗体外的一种或多种别的蛋白质。如下列试验部分所示，一般来说，本方法允许在低离子强度下选择性地吸附抗体。出乎意料地，本发明人发现使用含一个或多个磺酰胺基团的多孔分离基质能吸附抗体，而除抗体外不吸附其它蛋白质。因此，本方法能提供高收率的纯抗体制剂。本领域技术人员用例行试验能易于选择每一磺酰胺配体结构的最佳条件，下述试验部分会予以讨论。例如，本领域公知，可以通过改变凝胶性质来优化分离基质的特性；在这种情况下，改变磺酰胺中的R基团、或取代度即支撑物上配体密度。也可根据每种配体来优化吸附缓冲液中的盐浓度。因此，在本发明的一个实施方式中，在大约0.25M Na2SO4盐浓度下提供步骤(b)的吸附。在具体的实方案中，配体包括单胺，步骤(b)在盐浓度大约为0.5M Na2SO4下进行。
本发明方法可用呈任何合适的形态的分离基质，例如层析基质，如呈基本上球形颗粒或整块的形式，过滤器或滤过膜，碎片或其类似物。因此，在有利的实施方案中，以层析柱形式来提供步骤(b)的分离基质。
步骤(b)的分离基质的支撑物和配体可以是上述基质中的任何一种。
如上所述，本发明意外地证明，使用根据本发明制作的新分离基质，在中性pH值下能高度选择性地吸附抗体。因此，在一个实施方案中，步骤(b)在PH6.5-8.3，例如7.2-7.6，如约7.4下进行。
吸附到层析柱上的抗体能通过标准的洗脱被轻易地释放，如通过使用离子强度逐渐降低的洗脱液。因此，在一个实施方式中，步骤(c)是一个梯度洗脱过程，通过在分离基质中添加盐浓度逐渐降低的洗脱液进行，更优选通过让所述洗脱液通过基质。梯度可以是任何形状的，如线性的或阶梯状的。其它洗脱方案也很有用，如在洗脱液中添加一种竞争性结合剂、在洗脱液中添加一种替代基质中吸附的抗体的化合物，例如酒精、盐等等，或提供温度的变化等等。
作为选择，步骤(c)可通过调整PH值而完成，例如降低或升高pH值。pH值的调整可与上述盐梯度组合，如上面讨论的。在具体实施方案中，步骤(b)在pH值高于中性时完成，步骤(c)是通过添加逐渐降低的pH值的洗脱液进行的梯度洗提。
本方法可用于回收任意种类的单克隆或多克隆抗体，如来源于哺乳动物宿主的抗体，例如老鼠、啮齿类、灵长类和人类；或培养的细胞如杂交瘤细胞。在一个实施方案中，在步骤(d)中回收的抗体是人或人源化抗体。抗体可以是任何种类，即选自IgA、IgD、IgE、IgG和IgM。在具体实施方案中，在步骤(d)中回收的抗体是免疫球蛋白G(IgG)。本发明也包含纯化上文提及的任何抗体的片断以及包含这些抗体的融合蛋白。分离或纯化的目标分子在医学领域用作抗体药物，例如个性化的药物，为每个需要的个体设计特异性的药物。
本方法允许定量地吸附抗体。因此，在一个实施方案中，本方法包含上述定义的方法和附加的步骤(f)，步骤(f)通过分光光度法测定抗体的量。这样的方法和可使用的设备为本领域技术人员公知。本方法在分析程序时也有用，可以作为诊断领域的工具。
附图详述
图1显示了根据本发明六种不同的芳香磺酰胺的示例性配体结构。
图2显示了根据本发明IgG在原型配体上的吸附和解吸附的层析图，如试验部分的实施例2中所描述的。在280nm处的紫外吸收曲线(蓝线)表示IgG样品被吸附(缓冲液A3)，以及使用缓冲液B1洗脱23-26ml。缓冲液A3＝20mM磷酸盐缓冲液(pH7.4)与0.50MNa2SO4；缓冲液B1＝100mM醋酸盐缓冲液(pH4.0)。
图3显示了根据本发明BSA在原型配体中的吸附和解吸附的层析图，如试验部分的实施例3中所描述。在280nm处的紫外吸收曲线(蓝线)表示BSA样品没有被吸附，以及使用缓冲液A3洗脱7.5-9ml。缓冲液A3＝20mM磷酸盐缓冲液(pH7.40)与0.50M Na2SO4；缓冲液B1＝100mM醋酸盐缓冲液(pH4.0)。
图4显示了根据本发明RIB在原型配体中的吸附和解吸附的层析图，如试验部分的实施例4中所描述的。在280nm处的紫外吸收曲线(蓝线)表示RIB样品没有被吸附，以及使用缓冲液A3洗脱7.5-9ml。缓冲液A3＝20mM磷酸盐缓冲液(pH7.4)与0.50M Na2SO4；缓冲液B1＝100mM醋酸盐缓冲液(pH4.0)。
图5显示了根据本发明TRANSF在原型配体中的吸附和解吸附的层析图，如试验部分的实施例5中所描述的。在280nm处的紫外吸收曲线(蓝线)表示TRANSF样品没有被吸附，以及使用缓冲液A3洗脱7.5-9ml。缓冲液缓冲液A3＝20mM磷酸盐缓冲液(pH7.4)与0.50M Na2SO4；缓冲液B1＝100mM醋酸盐缓冲液(pH4.0)。
实验部分
本发明实施例仅仅用于说明，不应将其理解为对本发明范围的限制，其由附加的权利要求书来定义。本说明书中下面及别处给出的所有参考文献在此引入作为参考。
实施例1：磺酰胺分离基质的制备
下面提供的是根据本发明制备多种分离基质，其磺酰部分的R基包括芳香族基团。
概要
基质容积是指澄清床的容积。
以克计的基质重量是指吸干后的净重。可以理解这些基质仍是水溶剂化的物质。
对于大规模反应，搅拌是指悬浮的马达驱动的搅拌器，因为使用磁力棒搅拌器会迅速地破坏珠子。小规模的反应(最多20ml或g凝胶)在封闭的烧瓶中进行，搅拌是指使用摇动工作台。
常规方法用来分析官能度、测定烯丙基化程度、或珠子上离子交换基团的取代程度。这些方法最终通过对凝胶，特别是对于硫原子进行附加的元素分析而得到补充。
根据本发明制备分离基质的一种方法在下面举例说明，从交联琼脂糖凝胶开始(SepharoseTM 6 FF，Amersham Biosciences，Uppsala，Sweden)。对于每一步，都有具体描述。
A.在基质上引入烯丙基
将SepharoseTM用烯丙基缩水甘油基醚修饰，如下：
1)将200ml的SepharoseTM 6 FF与0.2g NaBH4、24g Na2SO4、8g的50％NaOH水溶液和40ml水混合。在50℃搅拌混合物1小时。加入烯丙基缩水甘油基醚(100ml)，另外在50℃强力搅拌悬浮液18小时。然后连续加入5M AcOH中和到pH7，过滤混合物，依次相继地用1L乙醇、2L蒸馏水、400ml 0.2M乙酸和500ml蒸馏水连续洗涤凝胶。
滴定得到每ml凝胶0.124mmol的烯丙基取代度。
2)将225ml的SepharoseTM 6FF与0.22g NaBH4、7.2g的50％NaOH水溶液和110ml水混合。在30℃搅拌混合物1小时。加入烯丙基缩水甘油基醚(61.8ml)，另外在30℃强力搅拌悬浮液17小时。然后连续地添加5M AcOH中和到pH7，过滤混合物，接着用1L乙醇、2L蒸馏水、400ml 0.2M乙酸、500ml蒸馏水连续地洗涤凝胶。滴定得到每ml凝胶0.042mmol的烯丙基取代度。
B.在基质上引入胺基团
可直接经由胺基团的N原子将胺基引到基质上。通过在碱性条件下烯丙基的溴化和亲核取代来实现与基质的结合。
通过溴化作用活化烯丙基SepharoseTM
向100ml的经如上所述的烯丙基化后(0.042或0.124mmol烯丙基每ml去水凝胶)的SepharoseTM6 FF、4g AcONa和100ml蒸馏水的搅拌的悬浮液中添加溴，直到获得持续的黄色。然后添加甲酸钠直到悬浮液完全被脱色。过滤反应混合物，用500ml蒸馏水洗涤凝胶。然后将活化的凝胶直接转移至反应器中，进一步与合适的配体反应。
二乙撑三胺SepharosTM
将30g数量的溴活化的凝胶(0.124mmol烯丙基基团/每ml沥干的凝胶)转移至反应烧瓶中，该烧瓶中含有二乙撑三胺(24ml)和水(10ml)，加入少量6M HCL调节pH至12。在50℃下搅拌反应20小时。过滤反应混合物后，依次用3×30ml蒸馏水、3×30ml 0.5M HCl水溶液洗涤，最后用3×30ml蒸馏水洗涤凝胶。得到所得的二乙撑三胺SepharosTM凝胶，每ml凝胶0.158mmol胺的取代度。
胺-SepharosTM
1)将33g数量的溴活化的凝胶(0.124mmol烯丙基基团/每ml沥干的凝胶)转移至反应烧瓶中，烧瓶中含有叠氮化钠(2g)的水溶液(10ml)，通过添加几滴50％NaOH水溶液将反应瓶调节到pH12.3。在50℃下搅拌反应20小时。过滤反应混合物，依次用3×60ml蒸馏水和3×30ml DMF洗涤凝胶。然后将沥干后的凝胶以DTE(4.5g)和DBU(3.75ml)在DMF(22ml)中的溶液处理，在室温下搅拌混合物18小时。过滤反应后的混合物，依次用3×30ml DMF、3×30ml乙醇，最后3×30ml的蒸馏水连续洗涤凝胶。
得到的胺-SepharosTM凝胶，每ml凝胶0.083mmol胺取代度。
2)6g数量的溴活性的凝胶(0.042mmol烯丙基基团/每ml沥干的凝胶)转移至反应烧瓶中，烧瓶中含有叠氮化钠(84mg)的水溶液(3ml)，该溶液已通过添加几滴50％NaOH水溶液而被调整至pH12.2。在50℃搅拌反应17小时。过滤反应混合物后，依次用3×20ml蒸馏水和3×10ml DMF洗涤凝胶。然后将沥干后的凝胶以DTE(0.86g)和DBU(0.8ml)在DMF(5ml)中的溶液处理，在室温下搅拌混合物18小时。过滤反应混合物后，依次用3×10ml DMF、3×10ml乙醇，最后用3×10ml蒸馏水洗涤凝胶。
得到的胺-SepharosTM凝胶，每ml凝胶0.026mmol胺基团的取代度。
C.用芳基磺酰氯衍生物将胺基团衍化
一般方法
5g数量的胺偶联的凝胶用10ml 0.2M NaOH溶液、3×10ml乙醇、然后用3×10ml DCM(二氯甲烷)洗涤。把凝胶转移入烧瓶中，并加入DCM(2ml)和3.3当量的DIPEA，搅拌混合物5分钟。在滴加3当量的芳基磺酰氯后，用DCM(3ml)溶解，在室温下搅拌反应混合物18小时。过滤反应混合物后，依次用3×10ml DCM，3×10ml乙醇、3×10ml蒸馏水、3×10ml 0.5M HCl，最后3×10ml蒸馏水洗涤凝胶。
N，N’，N”-三(五氟代苯磺酰基)二亚乙基三胺SepharosTM
依据一般程序，将二亚乙基三胺SepharosTM凝胶(0.158mmol胺/每ml凝胶)以五氟代苯磺酰氯(335μl)处理，产生标题的原型物，在图1中用L1A表示。
N，N’，N”-三(4-硝基苯磺酰基)二亚乙基三胺SepharosTM
依据一般程序，将二亚乙基三胺SepharosTM凝胶(0.158mmol氨/每ml凝胶)以4-硝基苯磺酰氯(540mg)处理，产生标题的原型物，在图1中用L1B表示。
N，N’，N”-三(p-甲苯磺酰)二亚乙基三胺SepharosTM
依据一般程序，将二亚乙基三胺SepharosTM凝胶(0.158mmol氨/每ml凝胶)对-甲苯磺酰氯(460mg)处理，产生标题原型物，在图1中用L1C表示。
五氟代苯磺酰胺-SepharosTM
依据一般程序，将胺-SepharosTM凝胶(0.083mmol胺/每ml凝胶)以五氟代苯磺酰氯(290mg)处理，产生标题的原型物，在图1中用L2A表示。
4-硝基苯磺酰胺SepharosTM
依据一般程序，将胺-SepharosTM凝胶(0.083mmol胺/每ml凝胶)以4-硝基苯磺酰氯(290mg)处理，产生标题的原型物，在图1中用L2B表示。
p-甲苯磺酰胺SepharosTM
1)依据一般程序，将胺-SepharosTM凝胶(0.026mmol胺/每ml凝胶)以p-甲苯磺酰氯(207mg)处理，产生标题的原型物(低取代)，在试验部分中用L2Ca表示。
2)依据一般程序，将胺-SepharosTM凝胶(0.083mmol胺每ml凝胶)以对-甲苯磺酰氯(207mg)处理，产生标题的原型物(高取代)，在试验部分中用L2Cb表示。
实施例2-5：层析评估
原料和方法(普通)
为了测试根据本发明芳香磺酰胺配体是否吸附人免疫球蛋白(IgG)，在不同条件下测试了IgG和三种不同蛋白质的吸光系数。另外，也测试了一种单克隆抗体。测试方法的原理是将蛋白质(15μl)注射入HR5/5柱，该柱包含固定在SepharosTM 6 Fast Flow上的磺酰胺配体，以含有盐和缓冲成分的缓冲液A平衡过。然后将15ml缓冲液A泵过层析柱，接着施加5ml从缓冲液A到缓冲液B的线性梯度，缓冲液B包括缓冲成分而不含盐(参见下述UNICORN法)。然后在280、254和215nm处检验层析剖面图。
为了评价吸附的样品数量和从层析柱洗脱的样品数量，将与应用于层析柱同样数量的样品也直接注入检测器中并对响应进行积分。
实验
使用三种不同的吸附缓冲液(缓冲液A#)和两种不同的解吸附缓冲液(缓冲液B#)：
缓冲液A1：20mM磷酸盐缓冲液(pH7.4)+0.25M NaCl
缓冲液A2：20mM磷酸盐缓冲液(pH7.4)+0.25M Na2SO4
缓冲液A3：20mM磷酸盐缓冲液(pH7.4)+0.50M Na2SO4
缓冲液B1：100mM醋酸盐缓冲液(pH4.0)
缓冲液B2：100mM醋酸盐缓冲液(pH4.0)+20％(v/v)异丙醇
样品
使用的样品是牛血清白蛋白(BSA)、核糖核酸酶A(RIB A)、转铁球蛋白(TRANSF)和人免疫球蛋白(IgG，微克，Pfizer)。用浓度为15mg/ml的缓冲液A溶解蛋白质，每次只能在层析柱中使用一种蛋白。含有配体L2C的介质也被制造，配体浓度已经被调整为26μmol/mL(L2Ca)和16μmol/mL(L2Cb)。
仪器
设备(Amersham Biosciences，Uppsala，Sweden)
LC系统：AKT ATM Explorer 10 XT
软件：UNICORNTM
注射环：Superloop 15 μl
柱：HR 5/5
设备参数
流速：0.5ml/min
检测器单元：10mm
波长：280、254和215nm
UNICORN方法
主要方法：
mL
0.00基础闭合容积，1.00{ml}，任何
0.00柱位置位置1旁路
0.00紫外自动归零
0.00波长280{nm}254{nm}215{nm}
1.00波长280{nm}254{nm}215{nm}
1.10部分注射(1)#于小瓶，10#INJVOL1{μl}，无，无空气直接注入样品至检测器
1.10紫外自动归零
4.00柱位置(位置2)
7.00部分注射(1)#于小瓶2，10#INJVO2{μl}，无，无空气直接注入样品至检测器
22.00梯度100{％B}，2.00{基础}，用缓冲液B洗脱
27.00梯度100{％B}，0.00{基础}
27.10梯度0{％B}，1{基础}，用缓冲液A洗脱
31.00梯度0{％B}，0{基础}
36.00梯度0{％B}，0{基础}
36.10方法结束
实施例2：IgG吸附于L2Ca
为了证明芳香磺酰胺是否吸附免疫球蛋白，将人IgG应用于1ml层析柱(HR5/5)，将其用根据本发明的新分离基质填充。在该实施例中，依照主要方法检测IgG在低配体密度原型L2C的变体上的吸附和解吸附，这里用L2Ca表示。用上述实施例1描述方法制备L2Ca，配体密度是26μmol/mL。
用缓冲液A3(20mM磷酸盐缓冲液，pH7.4和0.50M Na2SO4)检测IgG的吸收。当使用缓冲液A3时，发现IgG吸附到L2Ca。如图2所示，吸附到L2Ca上的IgG能被易于洗脱23-26ml，使用没有添加盐的100mM醋酸缓冲液(pH4.0)。吸附IgG，使用缓冲液A3作为流动相，导致当使用解吸附缓冲液B1时，吸附的IgG的回收率大约为100％。
实施例3-5：蛋白质吸附于L2Ca
在下面的例子中，采用芳香磺酰胺配体L2Ca检验以下述物质的相互作用：牛血清白蛋白(BSA)、核糖核酸酶A(RIB A)转铁蛋白(TRANSF)。
配体最重要的一个特性是其选择性，该配体以纯化单克隆抗体为目标。因此，除了IgG外，也研究了在上述IgG吸附的使用条件下蛋白质牛血清白蛋白(BSA)、核糖核酸酶A(RIB A)、转铁蛋白(TRANSF)的吸附。
实施例3：牛血清白蛋白(BSA)
在该实施例中，依照主要方法检验了BSA在按上文所述制备的(26μmol/mL)L2Ca上的吸附和解吸附。如图3所示，在280nm处的紫外吸收曲线(蓝线)表明BSA样品不被吸附，使用洗脱液A3洗脱7.5-9mL。洗脱液A3＝20mM磷酸盐洗脱液(pH7.4)+0.5M Na2SO4，洗脱液B1＝100mM醋酸盐洗脱液(pH4.0)。
实施例4：核糖核酸酶A(RIB A)
在该实施例中，依照主要方法检验了RIB在按上文所述制备的(26μmol/mL)L2Ca上的吸附和解吸附。如图4所示，在280nm处的紫外吸收曲线(蓝线)表明RIB样品不被吸附，使用洗脱液A3洗脱7.5-9mL。洗脱液A3＝20mM磷酸盐洗脱液(pH7.4)+0.5M Na2SO4，洗脱液B1＝100mM醋酸盐洗脱液(pH4.0)。
实施例5：转铁蛋白(TRANSF)
在该实施例中，依照主要方法检验了TRANSF在按上文所述制备的(26μmol/mL)L2Ca上的吸附和解吸附。如图5所示，在280nm处的紫外吸收曲线(蓝线)表明TRANSF样品不被吸附，使用洗脱液A3洗脱7.5-9mL。洗脱液A3＝20mM磷酸盐洗脱液(pH7.4)+0.5MNa2SO4，洗脱液B1＝100mM醋酸盐洗脱液(pH4.0)。

Claims (22)

1.一种分离基质，它由任选地经间隔臂固定了配体的多孔支撑物构成，其中所述配体包含一或多个芳香磺酰胺并且基本上不含可质子化基团。
2.如权利要求1所述的基质，其中磺酰胺的氮是伯胺或仲胺。
3.如权利要求1或2所述的基质，其中所述配体是一元胺。
4.如上述任意一项权利要求所述的基质，其中所述配体是多胺。
5.如权利要求4所述，其中每个多胺包括2至6个胺。
6.如上述任意一项权利要求所述的基质，其中所述配体作为固定于支撑物上的聚合物的重复单元存在。
7.如权利要求6所述的基质，其中所述聚合物是聚乙烯亚胺。
8.如权利要求6或7所述的基质，其中所述聚合物显示了两个或更多个不同的配体基团。
9.如上述任意一项权利要求所述的基质，其中所述支撑物是交联的多糖。
10.填充了权利要求1-9中任意一项所定义的分离基质的层析柱。
11.制备用于纯化抗体基质的方法，该方法包含通过胺中的N或通过磺酰基中的S将磺酰胺固定于多孔支撑物上的第一步。
12.一种从液体中分离抗体的方法，该方法包括下列步骤：
(a)提供包含至少一种抗体的液体；
(b)将所述的液体与包含一个或多个磺酰胺基的分离基质接触，以吸附一或多个抗体至基质；并且，任选地
(c)将洗脱剂通过上述基质，以释放一种或多种抗体；以及
(d)从洗脱剂馏分中回收至少一种抗体。
13.如权利要求12所述的方法，其中在步骤(a)中提供的液体也包含一种或多种其它蛋白质。
14.如权利要求12或13所述的方法，其中在层析柱中包含步骤(b)中的分离基质。
15.如权利要求12-14中任意一项所述的方法，其中步骤(b)中的分离基质如权利要求1-9的任意一项中所定义。
16.如权利要求15所述的方法，其中步骤(b)在接近中性的pH，如pH 7.2-7.6，优选约pH 7.4下进行。
17.如权利要求12-16中任意一项所述的方法，其中步骤(c)是梯度洗脱，通过向分离基质中添加盐浓度递减的洗脱液而进行。
18.如权利要求12-17中任意一项所述的方法，其中步骤(b)在pH中性或高于中性下完成，并且步骤(c)是通过添加pH递降的洗脱液而完成的梯度洗脱过程。
19.如权利要求12-18中任意一项所述的方法，其中在步骤(d)中回收的抗体是人或人源化抗体。
20.如权利要求12-19中任意一项所述的方法，其中在步骤(d)中回收的抗体是免疫球蛋白G(IgG)。
21.如权利要求12-20中任意一项所述的方法，其中所述抗体是单克隆抗体。
22.测定抗体量的方法，该方法包含如步骤12-20中任意一项定义的方法以及另外的通过分光光度法测定抗体的量的步骤(f)。
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