JP2023506961A

JP2023506961A - ナノボディー交換クロマトグラフィー

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Publication number: JP2023506961A
Application number: JP2022537456A
Authority: JP
Inventors: ステヤエルト，ヤン; パルドン，エルス; ボールケーニヒ，アレクサンドル; ツェグ，トーマス; カリチュク，バレンティーナ; ド・ケイゼル，フェベ; フィッシャー，バティスト
Original assignee: フエー・イー・ベー・フエー・ゼツト・ウエー; フリエ・ウニベルシテイト・ブリユツセル
Priority date: 2019-12-20
Filing date: 2020-12-18
Publication date: 2023-02-20
Also published as: US20240027467A1; CA3165429A1; EP4077372A1; WO2021123360A1

Abstract

本発明は、アフィニティー精製の分野に関し、標的タンパク質について競合するタンパク質結合剤を、捕捉／溶出ツールとしての使用のために適用する手段及び方法を提供するが、この場合、溶出剤は、免疫グロブリン単一可変ドメイン（ＩＳＶＤ）を含み、捕捉結合剤を置換することが可能である。より具体的に述べると、ＩＳＶＤ含有タンパク質結合剤の置換効率は、解離速度定数（ｋｏｆｆ）が、捕捉剤と比較して等しい又は低い、その解離反応速度により駆動される。さらに、タンパク質結合剤は、複合混合物からのハイスループット精製において又は捕捉タンパク質複合体のために有効利用可能であり、これにより、標的タンパク質の構造解析、生化学的解析及び物理化学的解析を容易とする。

Description

本発明は、アフィニティー精製の分野に関し、標的タンパク質について競合するタンパク質結合剤を、捕捉／溶出ツールとしての使用のために適用する手段及び方法を提供するが、この場合、溶出剤は、免疫グロブリン単一可変ドメイン（ＩＳＶＤ）を含み、捕捉結合剤を置換することが可能である。より具体的に述べると、ＩＳＶＤ含有タンパク質結合剤の置換効率は、解離速度定数（ｋ_ｏｆｆ）が、捕捉剤と比較して等しい又は低い、その解離反応速度により駆動される。さらに、タンパク質結合剤は、複合混合物からのハイスループット精製において又は捕捉タンパク質複合体のために有効利用可能であり、これにより、標的タンパク質の構造解析、生化学的解析及び物理化学的解析を容易とする。

アフィニティーベースの技法としての、免疫精製は、化学的特性及び物理的特性に基づく、クロマトグラフィー法に優る、いくつかの利点を提示する。免疫精製は、タンパク質の精製を、複雑なマルチステップ手順から、単一ステッププロトコールへと簡略化し、費用及び時間を削減することができる。結果として、免疫精製は、収率を改善し、潜在的な生成物分解を制限しうる。しかしながら、従来の抗体により実施される免疫精製は、しばしば、精製される生成物を損ないかねない、極端な溶出条件を要求する。ＶＨＨなどの単一ドメイン抗体断片又はナノボディー（登録商標）（Ｎｂ）は、アフィニティークロマトグラフィー（ＡＣ）において使用され、異なる溶出条件において、かなり安定的であり、作製が容易であることから、免疫クロマトグラフィーにおいて、適切なツールとなっている（例えば、Ｖｅｒｈｅｅｓｅｎら、２００３）。ＶＨＨベースのアフィニティーカラムもまた、おそらく、それらがマトリックスへと結合される密度が高いために、長鎖の抗体構築物及び完全ＩｇＧと比較して、高収率を可能とする（Ａｌｉｐｒａｎｄｉら、２０１０）。ＶＨＨの、アフィニティー精製への適性は、市販品が開発され、一般に適用されている、多数のＶＨＨベースのアフィニティー樹脂、例えば、他の樹脂（例えば、Ｐａｂｓｔら、２０１６）の中において、ＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔ樹脂（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃａｐｔｕｒｅｓｅｌｅｃｔ．ｃｏｍ）、細胞ホモジネートからの、ＧＦＰ融合タンパク質の精製のための、Ｃｈｒｏｍｏｔｅｋｎａｎｏｔｒａｐ（Ｒｏｔｈｂａｕｅｒら、２００８；ＵＳ１０，１２５，１６６Ｂ２）により、さらに認知されている。ＮｂベースのＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔ樹脂（ＵＳ９５１８０８４Ｂ２；ＥＰ２５７６６０９Ｂ１）により検出されるＣ末端タグである、ＥＰＥＡタグと同等な技術である、Ｎａｎｏｔａｇ（商標）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｇｏｔｚｋｅら、２０１９）は、Ｎｂに結合したＡＬＦＡタグ付け標的タンパク質の溶出のための、高アフィニティーペプチドと組み合わされた、アルファ特異的Ｎｂを適用する新たなアルファペプチドタグベースの精製技術を開発した。

単一ドメイン抗体断片、ＶＨＨ又はナノボディーは、不溶性マトリックスへと化学的に接合させ、結合したタンパク質複合体は、タンパク質間の非共有結合的相互作用を破壊する条件下において溶出させることが多い。これに代わり、Ｐｌｅｉｎｅｒら（２０１５、ｅＬｉｆｅ；４：ｅ１１３４９）により、結合を加水分解して、ＶＨＨの、マトリックスからの脱離（結合した任意のタンパク質複合体と共に）を可能とし、これにより、ＶＨＨを含む、結合したタンパク質複合体を溶出させる酵素が使用されたことから、構造解析又は物理化学的特徴付けなど、さらなる研究が可能となっている。欠点は、試料中において、最適の酵素活性のための、ある特定の濃度酵素並びに特異的条件が要求されることである。さらに、使用されるプロテアーゼはまた、結合した標的タンパク質に対して有害でもあり、カラム又はマトリックスも、１回しか使用できない。競合的免疫アッセイなどにおいて、ナノボディーベースの資源を組み合わせる方法であって、顕著に異なる標的上のエピトープに結合するＮｂが組み合わされる方法もまた、ＥＬＩＳＡによるタンパク質検出における使用のために開示されている（Ｃａｌｊｏｎら、２０１５）。

代替的に、試料置換クロマトグラフィー（ＳＤＣ）において、試料は、カラムへと導入され、次いで、一定の置換液の注入により置換される。タンパク質及びペプチドの置換クロマトグラフィーは、通例、イオン交換モードにおいて実施されるが、疎水性相互作用モード及びアフィニティーモードもまた、使用されている。置換剤の、定常相に対するアフィニティーは、任意のフィード成分のアフィニティーより高くなければならない。マイクログラム量のタンパク質の、ヒト血漿からの有効な分離のための、小型の解析用カラムに組み込まれるＳＤＣは、分離されたタンパク質の、質量分析（ＭＳ）による後続の解析のための試料調製ステップとして適用されうる。しかしながら、逆相モード（ＲＰＣ）は依然として、微量不純物を除去するための、合成の後における標的ペプチドの分離のための基礎的な方法であり、ＭＳ解析の前における、タンパク質のタンパク質分解性消化物の分離のために最も一般に適用されるクロマトグラフィーステップである。しかし、タンパク質及びペプチドの、複合混合物からの効率的な精製のための、迅速、簡略、再現可能であり、費用効果的な方法の開発は、なおも難題である。クロマトグラフィーのための支持体及び装置は、さらに改善されているが、解析スケール及び調製スケールの両方における、タンパク質及びペプチドの複合混合物の分離のための、新たな、補完的方法の開発がなおも必要とされている。アフィニティーアッセイ又は免疫置換アッセイは、穏和な条件下において適用可能であり、精緻な抗体ベースのクロマトグラフィーツールとして記載されている。例えば、Ａｂｄｉｃｈｅら（２０１７）は、標的分子に対する、隣接するエピトープ又は最小重複するエピトープを有するモノクローナル抗体の「ウォーターフォール」機構を適用して、標的を置換し、特異的に溶出させている。置換のためにモノクローナル抗体を使用することの欠点は、それらが、エピトープの多様性が低い場合、互いを置換する代わりに交差遮断することであり、最適の置換を得るためには、重複しないエピトープ又は重複が最小限であるエピトープに対する、異なる会合反応速度により特徴づけられる、多数の、高度に特異的な、顕著に異なる抗体が要求される。

米国特許第１０１２５１６６号明細書米国特許第９５１８０８４号明細書欧州特許第２５７６６０９号明細書

Ｖｅｒｈｅｅｓｅｎら（２００３）、「Ｂｅｎｅｆｉｃｉａｌｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓｏｆｓｉｎｇｌｅ－ｄｏｍａｉｎａｎｔｉｂｏｄｙｆｒａｇｍｅｎｔｓｆｏｒａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｉｎｉｍｍｕｎｏａｆｆｉｎｉｔｙｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎａｎｄｉｍｍｕｎｏ－ｐｅｒｆｕｓｉｏｎｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ」、ＢｉｏｃｈｉｍＢｉｏｐｈｙｓＡｃｔａ、１６２４：２１～２８Ａｌｉｐｒａｎｄｉら（２０１０）、「Ｔｈｅａｖａｉｌａｂｉｌｉｔｙｏｆａｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔａｎｔｉ－ＳＮＡＰａｎｔｉｂｏｄｙｉｎＶＨＨｆｏｒｍａｔａｍｐｌｉｆｉｅｓｔｈｅａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｆｌｅｘｉｂｉｌｉｔｙｏｆＳＮＡＰ－ｔａｇｇｅｄｐｒｏｔｅｉｎｓ」、ＪＢｉｏｍｅｄＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌ、ＩＤ６５８９５４ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃａｐｔｕｒｅｓｅｌｅｃｔ．ｃｏｍＲｏｔｈｂａｕｅｒら（２００８）、「Ａｖｅｒｓａｔｉｌｅｎａｎｏｔｒａｐｆｏｒｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌａｎｄｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｓｔｕｄｉｅｓｗｉｔｈｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔｆｕｓｉｏｎｐｒｏｔｅｉｎｓ」、ＭｏｌＣｅｌｌＰｒｏｔｅｏｍｉｃｓ、７：２８２～２８９Ｇｏｔｚｋｅら（２０１９）、「ＴｈｅＡＬＦＡ－ｔａｇｉｓａｈｉｇｈｌｙｖｅｒｓａｔｉｌｅｔｏｏｌｆｏｒｎａｎｏｂｏｄｙ－ｂａｓｅｄｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」、Ｎａｔ．ｃｏｍｍｓ．、１０：４４０３．Ｐｌｅｉｎｅｒら（２０１５、ｅＬｉｆｅ；４：ｅ１１３４９．）Ｃａｌｊｏｎら（２０１５）、「ＤｅｓｃｒｉｐｔｉｏｎｏｆａＮａｎｏｂｏｄｙ－ｂａｓｅｄＣｏｍｐｅｔｉｔｉｖｅＩｍｍｕｎｏａｓｓａｙｔｏＤｅｔｅｃｔＴｓｅｔｓｅＦｌｙＥｘｐｏｓｕｒｅ」、ＰＬＯＳＮｅｇｌｅｃｔｅｄＴｒｏｐｉｃａｌＤｉｓｅａｓｅｓ、ｄｏｉ：１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｎｔｄ．０００３４５６Ａｂｄｉｃｈｅら（２０１７）、「ＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓＴａｒｇｅｔｉｎｇＣｌｏｓｅｌｙＡｄｊａｃｅｎｔｏｒＭｉｎｉｍａｌｌｙＯｖｅｒｌａｐｐｉｎｇＥｐｉｔｏｐｅｓＣａｎＤｉｓｐｌａｃｅＯｎｅＡｎｏｔｈｅｒ」、ＰＬＯＳＯＮＥ、ｄｏｉ：１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｏｎｅ．０１６９５３５

構造生物学、質量分析又はプロテオミクスなどの解析目的に適する条件下における、タンパク質又はタンパク質複合体の、複合混合物からの直接的な単離のための、簡潔、迅速、かつ容易なタンパク質精製のダウンスケーリングは、現行において、アフィニティー精製を使用して実現可能であるが、ハイスループットの目的には適さない。汎用結合剤を、特定の結合性部位又はエピトープにおいて適用する可能性も存在せず、各標的に対する顕著に異なる結合剤の決定が煩瑣となっているが、本当は、より汎用的な手法が所望されているのである。こうして、複合混合物に由来する、少量の標的タンパク質についての試験のための、直接的な解析を可能とする、簡潔、高純度、小スケールの精製法が必要とされている。

（発明の要旨）
本発明は、ナノボディーベースの置換又は競合ベースの交換クロマトグラフィーの新たな方法であって、標的タンパク質への結合について、おそらく、標的上の同じエピトープ又は重複が高度なエピトープと競合する、Ｎｂの対が、目的のタンパク質（又は本明細書において互換的に使用される、「標的タンパク質」）を、複合混合物から、単一ステップにおいて精製するのに使用される方法について記載する。精製法は、目的のタンパク質に対する競合結合剤の置換を可能とし、ナノボディー又は、そしてさらには免疫グロブリン単一可変ドメイン（ＩＳＶＤ）の抗原結合性ドメインを、置換剤として使用する場合、置換反応速度は、従来の抗体の抗原結合性ドメインについて予測される置換反応速度と比較して異なるという発見に基づく。さらに、それらの結合性領域が、コンフォメーションエピトープ及び深いクレフトに結合することが可能であること、それらの高安定性及び容易な製造可能性など、ＩＳＶＤベースの結合剤の他の利点は、本明細書において提示される方法を、ハイスループット解析のためのアフィニティー精製に適する方法として提示する。方法は、これにより、標識化される場合もあり、機能化される場合もあり、構造的解析又は生化学的解析のためのシャペロンとして使用される場合もある、高アフィニティーＮｂに結合した、少量の高度に純粋なタンパク質をもたらす。ナノボディー交換クロマトグラフィー（本明細書において、ＮＡＮＥＸと略記される）において、目的のタンパク質又は標的タンパク質は、ナノ捕捉剤又は捕捉剤と呼ばれる第１の（固定化）ナノボディーにより捕捉されるのに続き、標的タンパク質への結合について、捕捉剤と競合するが、効率的な置換及び溶出を確立するのに好適な解離反応速度特性を有する、ナノ剥離剤又は剥離剤と呼ばれる第２の可溶性ナノボディーへの結合を介して、結合したタンパク質の選択的溶出にかけられる。より具体的に述べると、反応速度は、ＩＳＶＤ含有剥離剤について、解離速度定数により決定され、捕捉剤（ｃａｐｔｕｒｉｎｇａｇｅｎｔ又はｔｒａｐｐｅｒ）と比較した、緩徐な解離速度（又は低いｋ_ｏｆｆ）及び／又は高アフィニティー（又は低いＫ_Ｄ）及び／又は高アビディティーを要求する。この工程は、生理学的条件における、剥離剤に結合した目的のタンパク質の極めて純粋な複合体の、定量的かつ迅速な溶出を結果としてもたらす。任意選択的に、ナノ剥離剤は、シャペロン、安定化剤又はＭｅｇａＢｏｄｙ（商標）として公知の抗原結合性キメラタンパク質として機能化される場合もあり、代替的に、後続の解析を容易とする、検出可能な標識又は特性を有する。

第１の態様において、本発明は、標的タンパク質を精製するための方法であって、
ａ）標的タンパク質のエピトープに特異的に結合する、第１のタンパク質結合剤を、標的タンパク質を含有する試料と接触させるステップ、
ｂ）第２のタンパク質結合剤が、標的タンパク質上の第１の結合剤を置きかえ、第１の結合剤を、標的タンパク質から放出するように、試料を、第１のタンパク質結合剤が存在する場合に、標的タンパク質への結合について競合する、第２のタンパク質結合剤と混合するステップ、及び
ｃ）標的タンパク質に結合した、第２のタンパク質結合剤を含有する混合物を溶出させるステップ
を含み、
少なくとも第２のタンパク質結合剤が、標的タンパク質に特異的に結合する免疫グロブリン単一可変ドメイン（ＩＳＶＤ）又はその機能的変異体を含み、この場合、第２のタンパク質結合剤の解離速度定数（又はｋ_ｏｆｆ値）が、第１のタンパク質結合剤と比較して、低い若しくは同一である又は解離速度が、第１のタンパク質結合剤と比較して、緩徐である、若しくは同じである方法に関する。第２のタンパク質結合剤は、同じである又は大部分において重複する、標的タンパク質上のエピトープへの結合を介して競合しうる。代替的に、第２の結合剤は、異なるエピトープ又は最小部分において重複するエピトープに結合しうるが、その解離速度定数により駆動される、標的タンパク質への結合について、アロステリックに、かつ／又は反応速度的に競合する。さらなる実施形態において、第２のタンパク質結合剤は、エピトープに対して、第１のタンパク質結合剤と比較して、高いアフィニティー、すなわち、低いＫ_Ｄ値を有する。より具体的に述べると、標的タンパク質のエピトープに対するＫ_Ｄ値は、第１のタンパク質結合剤について、低マイクロモル濃度～ナノモル濃度の範囲内にあり、第２のタンパク質結合剤について、低ナノモル濃度～ピコモル濃度の範囲内にある。好ましくは、相対アフィニティーは、第２のタンパク質結合剤についてのＫ_Ｄ値と比較して、少なくとも２倍又は好ましくは、少なくとも１０倍、２０倍又は１００倍である、第１のタンパク質結合剤についてのＫ_Ｄ値として規定される。

別の実施形態において、本明細書において記載される方法は、第２のタンパク質結合剤を添加する前に、ステップａ）の混合物を洗浄して、不純物を除去し、適切な緩衝液条件をもたらすステップを含む。

別の実施形態は、本明細書において記載される標的タンパク質を精製するための方法であって、第１のタンパク質結合剤及び第２のタンパク質結合剤のそれぞれの代わりに又はこれらに加えて、第３のタンパク質結合剤及び第４のタンパク質結合剤を使用して、ステップａ）～ｃ）を反復又は変更するステップをさらに含み、第３の結合剤及び第４の結合剤が、ステップａ）～ｃ）の、同じ標的タンパク質であるが、第１の結合剤及び第２の結合剤に結合するエピトープと異なるエピトープに特異的に結合する方法を開示する。タンデム精製法は、具体的に、高純度を得るための、複合試料からの精製に関する。任意選択的に、結合しなかったタンパク質又は過剰結合剤を除去するように、洗浄ステップが方法に含まれうる。

さらに、本明細書において開示される方法は、試料中に存在する標的タンパク質への結合について競合する、第１の結合剤及び第２の結合剤を使用し、結合剤は、標的タンパク質のタグ上のエピトープを、好ましくは、融合タンパク質の一部として、具体的に認識し、好ましくは、この場合、タグは、アフィニティータグ、エピトープタグ、レポータータグ又は別の合成のタグ及び／若しくは市販のタグを伴いうる。標的タンパク質のタグは、蛍光タンパク質の群（緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）又はｍＣｈｅｒｒｙなど）から選択される場合があり、本明細書においてさらに列挙される中でも、グルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、ＳＵＭＯ（ｓｍａｌｌｕｂｉｑｕｉｔｉｎ－ｌｉｋｅｍｏｄｉｆｉｅｒ）、ＳＭＴ３、Ｃ末端ペプチドＥＰＥＡでありうる。代替的に、タンパク質結合剤により認識される、標的タンパク質のエピトープは、天然タンパク質上若しくは内因性タンパク質上に存在する、特異的エピトープ又は天然において存在するタンパク質の、天然においてもたらされるエピトープを含む。さらに、エピトープはまた、ＰＴＭを認識するタンパク質結合剤が特異的に結合する、標的タンパク質上の翻訳後修飾（ＰＴＭ）によっても確立されうる。さらなる代替法は、標的タンパク質のエピトープが、ＭｅｇａＢｏｄｙ（商標）、すなわち、Ｓｔｅｙａｅｒｔら（ＷＯ２０１９／０８６５４８Ａ１）において規定されている、抗原結合性キメラタンパク質の足場タンパク質ドメイン上の、特異的結合性部位により規定される、本発明の方法に関する。好ましい実施形態において、エピトープは、ＷＯ２０１９／０８６５４８Ａ１において開示されているＨｏｐＱ由来の足場又はＹｇｊｋ由来の足場を含む抗原結合性キメラタンパク質の足場タンパク質ドメインに特異的である。

別の実施形態は、第２のタンパク質結合剤が、多価フォーマット又は多特異的フォーマットにおける、第１のタンパク質結合剤を含む方法に関する。本明細書において記載される方法は、標的タンパク質又は抗原への結合に十分である、ＦＲ１－ＣＤＲ１－ＦＲ２－ＣＤＲ２－ＦＲ３－ＣＤＲ３－ＦＲ４のフォーマットに従う、４つのフレームワーク領域（ＦＲ）及び３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を伴うドメインとしての本明細書において規定されるＩＳＶＤを含む、第２のタンパク質結合剤を含む。代替的に、本明細書において、ＩＳＶＤの機能的変異体が意図され、抗原に、ＩＳＶＤと同様に結合することが可能なＩＳＶＤ含有部分に関する。方法は、標的エピトープに特異的に結合し、これについて、第２の結合剤と競合するＩＳＶＤもまた含む、第１のタンパク質結合剤をさらに利用しうる。

本明細書において開示される方法は、第１のタンパク質結合剤及び第２のタンパク質結合剤への競合にさらに関し、標的への結合についての、第２の結合剤の解離速度は、第１の結合剤の解離速度と比較して緩徐であり、この場合、第１の結合剤は、ＩＳＶＤを含む、第２のタンパク質結合剤と比較した、突然変異体ＩＳＶＤを構成する又はこの逆が成り立ち、第１のＩＳＶＤを含む結合剤は、その結合性領域内又はパラトープ内の変更により引き起こされる、第２のＩＳＶＤを含む結合剤と比較した、急速な解離速度及び／又は低アフィニティー（又は高いＫ_Ｄ）を有する。

代替的実施形態は、第１の結合剤と、第２の結合剤とが、標的タンパク質に、最小において、０．０００１秒^－１以上のｋ_ｏｆｆにより特異的に結合する、同じＩＳＶＤ結合性部分を含む、本明細書において記載される方法を提供する。

さらなる実施形態は、タンパク質結合剤が、機能的部分又は検出可能な標識を含む、本明細書において記載される方法に関する。

具体的実施形態において、本明細書において記載される方法の、第１のタンパク質結合剤及び／又は第２のタンパク質結合剤は、機能化フォーマットにある、すなわち、エピトープへの結合のほかに、特定の機能を伴うフォーマットを有する。例えば、機能化フォーマットは、抗原結合性キメラタンパク質、特に、Ｓｔｅｙａｅｒｔら（ＷＯ２０１９／０８６５４８Ａ１）において開示されている、ＭｅｇａＢｏｄｙ（商標）を含みうる。本明細書において言及されるＭｅｇａＢｏｄｙは、ＩＳＶＤを介して、標的タンパク質のエピトープに特異的結合する、ＩＳＶＤ機能的変異体Ｄのフォーマットにある抗原結合性ドメインを含み、この場合、ＩＳＶＤの抗原結合性ドメインは、足場タンパク質ドメインへと、非可撓的に融合されている。好ましい実施形態において、足場タンパク質は、ＨｏｐＱタンパク質又はＹｇｊｋタンパク質を含む又はこれらに由来する。ＭｅｇａＢｏｄｙは、標的タンパク質のクライオＥＭ構造解析のその改善のための、新規のシャペロン型の結合剤としての機能をもたらすことが公知である。

ある実施形態は、第１のタンパク質結合剤が、表面上に固定化されており、第２のタンパク質結合剤が、溶液中にあり、これは、第２の結合剤が、適正な精製条件下において、可溶性であることを意味する、本明細書において記載される方法に関する。好ましくは、第１のタンパク質結合剤表面は、樹脂であり、適切な条件は、生理学的条件である。樹脂又はマトリックスは、調製のための精製に適する場合もあり、解析のための精製に適する場合もあり、後者は、好ましくは、数マイクロリットルという低容量を伴う。本発明の代替的態様は、実際に、表面上において、固定化形態にある、第１のタンパク質結合剤を含み、本明細書において記載される方法において、チップを使用するために、したがって、溶液と組み合わせて、本明細書の方法において記載される、第２のタンパク質結合剤をもたらすために準備される、チップ又はマイクロカラムに関する。

本発明の方法は、試料からの標的タンパク質又は分子の精製をもたらし、試料は、生物学的試料、複合混合物、細胞試料又はインビトロ試料でありうる。

別の態様は、本明細書において記載される方法における使用のための、第１のタンパク質結合剤及び第２のタンパク質結合剤を含むキットに関する。さらなる実施形態は、本発明に従う、第１のタンパク質結合剤及び第２のタンパク質結合剤を含み、第１の薬剤又は第２の薬剤が、表面上、マトリックス上若しくは樹脂上に存在する又はキットが、本明細書において記載されるマイクロチップを含むキットに関する。より具体的に述べると、キットは、標的タンパク質のタグへの結合について競合する、第１のタンパク質結合剤及び第２のタンパク質結合剤を含むことが可能であり、この場合、タグは、ＧＦＰ、ｍＣｈｅｒｒｙ、ＧＳＴ、ＳＭＴ３又はＥＰＥＡを含有するタグの群から選択され、薬剤は、配列番号１～６、１８若しくは１９、２０、２１、２３、２４、２６、２７若しくは２８又はこれらとの、少なくとも９０％の同一性を伴う配列又はＨｉｓタグ及び／又はＥＰＥＡタグを伴わず、任意選択的に、別の（小型の）タグを含む配列のうちのいずれかに描示されるタンパク質の群から選択される配列を含む。具体的な実施形態において、キットの、第１のタンパク質結合剤及び第２のタンパク質結合剤は、群から選択される、異なる配列を含む。別の特異的実施形態において、キットの、第１のタンパク質結合剤及び第２のタンパク質結合剤は、群から選択される、同じ配列を含むことが可能であり、Ｋ_Ｄは、０．１ｎＭ以上である。

別の態様は、本明細書の精製のための方法において開示される、第２のタンパク質結合剤又は第４のタンパク質結合剤及び標的タンパク質を含むタンパク質複合体に関する。特定の実施形態において、標的タンパク質は、ＧＦＰ、ｍＣｈｅｒｒｙ、ＧＳＴ、ＳＭＴ３又はＥＰＥＡの群から選択されうる。一実施形態において、タンパク質複合体は、結晶質でありうる。本明細書において規定されるタンパク質複合体は、標的タンパク質に結合した、１つ以上のさらなるタンパク質をさらに含みうる。さらなる複合体は、一過性の場合もあり、コンフォメーション特異的な場合もある、タンパク質間複合体又はタンパク質間相互作用の同定又は特徴付けにおける使用をもたらす。最後に、本明細書において開示されるタンパク質複合体は、構造解析、構造ベースの薬物デザイン、薬物発見、質量分析法による解析又は代替的な生化学的解析若しくは物理化学的解析のために有用でありうる。

本明細書において記載される、別の代替的態様は、第２の（又は第４の）タンパク質結合剤及び標的タンパク質により形成されるタンパク質複合体の原子分解における、高分解能の三次元構造表示に関する。本明細書において開示される結晶複合体について、１つの実施形態は、特に、単位格子パラメータ：ａ＝７４．４９７Å±５％、ｂ＝１０３．４５０Å±５％、ｃ＝２０９．７７４Å±５％、α＝９０．００°、β＝９０．００°、γ＝９０．００°を伴う空間群である、Ｐ２１２１２１内にある点において、特徴づけられる、ＧＦＰの結晶及びＧＦＰ特異的Ｎｂ結晶に関する。３Ｄ構造又は結晶は、本明細書において開示される、ＧＦＰに特異的なタンパク質結合剤のための結合性部位の特異的エピトープを開示し、結合性部位が、原子座標のサブセットからなり、この場合、結合性部位が、配列番号１６に描示される、ＧＦＰタンパク質のアミノ酸残基：ＰＲＯ８９、ＧＬＵ９０、ＧＬＵ１１１、ＬＹＳ１１３、ＰＨＥ１１４、ＧＬＵ１１５、ＧＬＹ１１６からなる実施形態を提示する。

記載される図面は、ごく概略的なものであり、非限定的なものである。図面において、要素の部分のサイズは、誇張されており、例示を目的として、縮尺通りには描かれていない場合がある。

ナノボディー交換クロマトグラフィー（ＮＡＮＥＸ）の原理についての概略表示を示す図である。１）目的のタンパク質（ＰＯＩ）は、特異的ナノボディー捕捉剤によりコーティングされたビーズ（グレーの球）上に保持され、２）ＰＯＩ上の重複エピトープに結合する、ナノボディー剥離剤（斜線を付した球）を使用して、溶出させる。ＨｉＴｒａｐＮＨＳ－ａｃｔｉｖａｔｅｄＳｅｐｈａｒｏｓｅＨＰカラム上の固定化された捕捉剤としてのＣＡ１５８１６を使用し、剥離剤としてのＣＡ１２７６０により溶出させる、細菌溶解物中にスパイクされたＧＦＰタグのアフィニティー精製を示す図である。ＨｉＴｒａｐＮＨＳ－ａｃｔｉｖａｔｅｄＳｅｐｈａｒｏｓｅＨＰカラム（１ｍＬ）上に固定化された中アフィニティーの捕捉剤であるＣＡ１５８１６を使用し、高アフィニティーの剥離剤であるＣＡ１２７６０を使用して溶出させる、ＧＦＰの、ＮＡＮＥＸによる精製である。２ｍｇの精製ＧＦＰを、細菌溶解物へとスパイクした。ＣＡ１５８１６－カラムを、１０ＣＶの緩衝液（１００ｍＭのＨｅｐｅｓｐＨ７．５、１５０ｍＭのＮａＣｌ）により、２回にわたり洗浄するのに続き、剥離剤を注入した。左パネル：手順についての簡単な記載である。中パネル：２８０ｎｍ及び４８８ｎｍにおける吸光度を示す、溶出クロマトグラムである。左側の高ピークは、剥離剤であるＣＡ１２７６０の注入時に溶出した。右ピークは、ｐＨ２．３における、２００ｍＭのグリシンによる再生時に溶出した。右パネル：分子量マーカー（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ製のＰａｇｅＲｕｌｅｒ（商標）ＰｒｅｓｔａｉｎｅｄＰｒｏｔｅｉｎＬａｄｄｅｒ；型番：２６６１６）による、異なる精製ステップについてのＳＤＳ－ＰＡＧＥである。ＧＦＰ・ＣＡ１２７６０タンパク質複合体のＸ線構造及びエピトープについての記載を示す図である。左：ＧＦＰ（表面表示）と複合体化した、ＣＡ１２７６０（リボン表示）の結晶構造である。中：ＧＦＰについての表面表示である。ＧＦＰ上のＣＡ１２７６０のエピトープを構成する残基を、ダークグレーにより着色し、標識化する。右：ＧＦＰ上のエピトープに結合するＣＡ１２７６０を構成する残基についてまとめる表である。低アフィニティーの捕捉剤（ＣＡ１５８１８、ＣＡ１５８１６、ＣＡ１５８６１）をデザインするのに、突然変異誘発（Ｔｈｒ５４、Ｖａｌ５５、Ｐｈｅ１０３）のために選択される、ＣＡ１２７６０Ｎｂ上の３つの残基を強調する、ＣＡ１２７６０・ＧＦＰ間インターフェースについての図である。ＧＦＰは、表面モードにおいて表される。ＣＡ１２７６０は、リボンモードにおいて表される。Ｔｈｒ５４、Ｖａｌ５５及びＰｈｅ１０３は、スティックとして表される。ＧＦＰの、剥離剤であるＣＡ１２７６０及び突然変異誘発（ＣＡ１５８１８、ＣＡ１５８１６、ＣＡ１５８６１）により、これから導出された捕捉剤との相互作用についての、反応速度による特徴付けを示す図である。ＧＦＰの、ナノボディーであるＣＡ１２７６０（配列番号１）、ＣＡ１５８１８（配列番号２）、ＣＡ１５８１６（配列番号３）及びＣＡ１５８６１（配列番号４）のそれぞれへの結合についてのリアルタイム反応速度解析である。ストレプトアビジンコーティングＯｃｔｅｔ（登録商標）バイオセンサーを使用して、ビオチニル化ナノボディー（１μｇ／ｍＬ）を捕捉した。いくつかのＧＦＰ濃度（１ｎＭ～５μＭの範囲）における結合等温線及び解離等温線は、ＯｃｔｅｔＲｅｄ（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＤｅｖｉｃｅｓ）上において解析した。全てのアッセイは、室温において、０．１％のＢＳＡ及び０．００５％のＴｗｅｅｎ２０を補充された、２５ｍＭのＨｅｐｅｓｐＨ７．５、１５０ｍＭのＮａＣｌ中において実施した。ＧＦＰの、剥離剤であるＣＡ１２７６０及び突然変異誘発（ＣＡ１５８１８、ＣＡ１５８１６、ＣＡ１５８６１）により、これから導出された捕捉剤との相互作用についての、反応速度による特徴付けを示す図である。ＧＦＰの、ナノボディーであるＣＡ１２７６０（配列番号１）、ＣＡ１５８１８（配列番号２）、ＣＡ１５８１６（配列番号３）及びＣＡ１５８６１（配列番号４）のそれぞれへの結合についてのリアルタイム反応速度解析である。ストレプトアビジンコーティングＯｃｔｅｔ（登録商標）バイオセンサーを使用して、ビオチニル化ナノボディー（１μｇ／ｍＬ）を捕捉した。いくつかのＧＦＰ濃度（１ｎＭ～５μＭの範囲）における結合等温線及び解離等温線は、ＯｃｔｅｔＲｅｄ（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＤｅｖｉｃｅｓ）上において解析した。全てのアッセイは、室温において、０．１％のＢＳＡ及び０．００５％のＴｗｅｅｎ２０を補充された、２５ｍＭのＨｅｐｅｓｐＨ７．５、１５０ｍＭのＮａＣｌ中において実施した。高アフィニティーのナノボディー（ＣＡ１２７６０）により捕捉されたＧＦＰ標的タンパク質は、同じエピトープに結合する低アフィニティーのナノボディー（ＣＡ１５８１８、ＣＡ１５８１６、ＣＡ１５８６１）による溶出が低度であることを示す図である。ＮＨＳ活性化アガロースビーズ及び剥離剤としてのＣＡ１２７６０、ＣＡ１５８１８、ＣＡ１５８１６、ＣＡ１５８６１上の固定化捕捉剤としての、ＣＡ１２７６０（高アフィニティーの捕捉剤）を使用する、ＧＦＰの、ＮＡＮＥＸによる精製である。５０μｌのＣＡ１２７６０アガロースビーズを、エッペンドルフ管内において、２００μｇのＧＦＰと混合し、洗浄し、１ｍＬの最終容量（１００ｍＭのＨｅｐｅｓｐＨ７．５、１５０ｍＭのＮａＣｌ）中に５３μＭ（８００μｇ／ｍＬ）の剥離剤と共にインキュベートした。ＧＦＰの溶出は、５つの異なる時点（０、１５、３０、６０、１２０分後）において、ビーズをスピンダウンし、４８８ｎｍにおける上清の吸光度を測定することによりモニタリングした。高アフィニティーのナノボディー（ＣＡ１５８１８）により捕捉されたＧＦＰ標的タンパク質は、同じエピトープに結合する低アフィニティーのナノボディー（ＣＡ１５８１８、ＣＡ１５８１６、ＣＡ１５８６１）による溶出が低度であることを示す図である。ＮＨＳ活性化アガロースビーズ及び剥離剤としてのＣＡ１２７６０、ＣＡ１５８１８、ＣＡ１５８１６、ＣＡ１５８６１上の固定化捕捉剤としての、ＣＡ１５８１８（中アフィニティーの捕捉剤）を使用する、ＧＦＰの、ＮＡＮＥＸによる精製である。５０μｌのＣＡ１２７６０アガロースビーズを、エッペンドルフ管内において、２００μｇのＧＦＰと混合し、洗浄し、１ｍＬの最終容量（１００ｍＭのＨｅｐｅｓｐＨ７．５、１５０ｍＭのＮａＣｌ）中に５３μＭ（８００μｇ／ｍＬ）の剥離剤と共にインキュベートした。ＧＦＰの溶出は、５つの異なる時点（０、１５、３０、６０、１２０分後）において、ビーズをスピンダウンし、４８８ｎｍにおける上清の吸光度を測定することによりモニタリングした。中アフィニティーのナノボディー（ＣＡ１５８１６）により捕捉されたＧＦＰ標的タンパク質は、同じエピトープに結合する低アフィニティーのナノボディー（ＣＡ１５８６１）による溶出は低度であるが、同じエピトープに結合する高アフィニティーのナノボディー（ＣＡ１２７６０、ＣＡ１５８１８、ＣＡ１５８１６）による溶出は、迅速かつ定量的であることを示す図である。ＮＨＳ活性化アガロースビーズ及び剥離剤としてのＣＡ１２７６０、ＣＡ１５８１８、ＣＡ１５８１６、ＣＡ１５８６１上の固定化捕捉剤としての、ＣＡ１５８１６（中アフィニティーの捕捉剤）を使用する、ＧＦＰの、ＮＡＮＥＸによる精製である。５０μｌのＣＡ１２７６０アガロースビーズを、エッペンドルフ管内において、２００μｇのＧＦＰと混合し、洗浄し、１ｍＬの最終容量（１００ｍＭのＨｅｐｅｓｐＨ７．５、１５０ｍＭのＮａＣｌ）中に５３μＭ（８００μｇ／ｍＬ）の剥離剤と共にインキュベートした。ＧＦＰの溶出は、５つの異なる時点（０、１５、３０、６０、１２０分後）において、ビーズをスピンダウンし、４８８ｎｍにおける上清の吸光度を測定することによりモニタリングした。低アフィニティーのナノボディー（ＣＡ１５８６１）により捕捉されたＧＦＰ標的タンパク質は、同じエピトープに結合するが、標的タンパク質に対する捕捉は弱い、高アフィニティーのナノボディー（ＣＡ１２７６０、ＣＡ１５８１８、ＣＡ１５８１６）による溶出は迅速かつ定量的であることを示す図である。ＮＨＳ活性化アガロースビーズ及び剥離剤としてのＣＡ１２７６０、ＣＡ１５８１８、ＣＡ１５８１６、ＣＡ１５８６１上の固定化捕捉剤としての、ＣＡ１５８６１（低アフィニティーの捕捉剤）を使用する、ＧＦＰの、ＮＡＮＥＸによる精製である。５０μｌのＣＡ１２７６０アガロースビーズを、エッペンドルフ管内において、２００μｇのＧＦＰと混合し、洗浄し、１ｍＬの最終容量（１００ｍＭのＨｅｐｅｓｐＨ７．５、１５０ｍＭのＮａＣｌ）中に５３μＭ（８００μｇ／ｍＬ）の剥離剤と共にインキュベートした。ＧＦＰの溶出は、５つの異なる時点（０、１５、３０、６０、１２０分後）において、ビーズをスピンダウンし、４８８ｎｍにおける上清の吸光度を測定することによりモニタリングした。ＮＡＮＥＸにおいて、高アフィニティーのナノボディー（ＣＡ１２７６０）により捕捉されたＧＦＰ標的タンパク質は、同じエピトープに結合する、低アフィニティーのナノボディー（ＣＡ１５８１８、ＣＡ１５８１６、ＣＡ１５８６１）による溶出が低度であることを示す図である。ＮＡＮＥＸによるＧＦＰの精製のために、ＣＡ１２７６０（高アフィニティーの捕捉剤）を、ＨｉＴｒａｐＮＨＳ－ａｃｔｉｖａｔｅｄＳｅｐｈａｒｏｓｅＨＰカラム（１ｍＬ）上の捕捉剤として固定化した。各実験のために、２ｍｇの精製ＧＦＰを、このＮＡＮＥＸカラムに注入した。ロードされたＣＡ１２７６０－カラムを、１０ＣＶの緩衝液（１００ｍＭのＨｅｐｅｓｐＨ７．５、１５０ｍＭのＮａＣｌ）により、２回にわたり洗浄するのに続き、カラムごとに、剥離剤であるＣＡ１２７６０、ＣＡ１５８１８、ＣＡ１５８１６、ＣＡ１５８６１のそれぞれを注入した。これらの異なる剥離剤による、ＧＦＰの溶出を、２８０ｎｍ及び４８８ｎｍにおける吸光度を追跡することによりモニタリングした。左側の高ピークは、それぞれの剥離剤（ＣＡ１２７６０、ＣＡ１５８１８、ＣＡ１５８１６、ＣＡ１５８６１）の注入時に溶出した。右ピークは、ｐＨ２．３における、２００ｍＭのグリシンによるカラムの再生時に溶出した。右パネル：分子量マーカー（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ製のＰａｇｅＲｕｌｅｒ（商標）ＰｒｅｓｔａｉｎｅｄＰｒｏｔｅｉｎＬａｄｄｅｒ；型番：２６６１６）による、異なる精製ステップについてのＳＤＳ－ＰＡＧＥである。ＮＡＮＥＸにおいて、高アフィニティーのナノボディー（ＣＡ１２７６０）により捕捉されたＧＦＰ標的タンパク質は、同じエピトープに結合する、低アフィニティーのナノボディー（ＣＡ１５８１８、ＣＡ１５８１６、ＣＡ１５８６１）による溶出が低度であることを示す図である。ＮＡＮＥＸによるＧＦＰの精製のために、ＣＡ１２７６０（高アフィニティーの捕捉剤）を、ＨｉＴｒａｐＮＨＳ－ａｃｔｉｖａｔｅｄＳｅｐｈａｒｏｓｅＨＰカラム（１ｍＬ）上の捕捉剤として固定化した。各実験のために、２ｍｇの精製ＧＦＰを、このＮＡＮＥＸカラムに注入した。ロードされたＣＡ１２７６０－カラムを、１０ＣＶの緩衝液（１００ｍＭのＨｅｐｅｓｐＨ７．５、１５０ｍＭのＮａＣｌ）により、２回にわたり洗浄するのに続き、カラムごとに、剥離剤であるＣＡ１２７６０、ＣＡ１５８１８、ＣＡ１５８１６、ＣＡ１５８６１のそれぞれを注入した。これらの異なる剥離剤による、ＧＦＰの溶出を、２８０ｎｍ及び４８８ｎｍにおける吸光度を追跡することによりモニタリングした。左側の高ピークは、それぞれの剥離剤（ＣＡ１２７６０、ＣＡ１５８１８、ＣＡ１５８１６、ＣＡ１５８６１）の注入時に溶出した。右ピークは、ｐＨ２．３における、２００ｍＭのグリシンによるカラムの再生時に溶出した。右パネル：分子量マーカー（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ製のＰａｇｅＲｕｌｅｒ（商標）ＰｒｅｓｔａｉｎｅｄＰｒｏｔｅｉｎＬａｄｄｅｒ；型番：２６６１６）による、異なる精製ステップについてのＳＤＳ－ＰＡＧＥである。ＮＡＮＥＸにおいて、高アフィニティーのナノボディー（ＣＡ１２７６０）により捕捉されたＧＦＰ標的タンパク質は、同じエピトープに結合する、低アフィニティーのナノボディー（ＣＡ１５８１８、ＣＡ１５８１６、ＣＡ１５８６１）による溶出が低度であることを示す図である。ＮＡＮＥＸによるＧＦＰの精製のために、ＣＡ１２７６０（高アフィニティーの捕捉剤）を、ＨｉＴｒａｐＮＨＳ－ａｃｔｉｖａｔｅｄＳｅｐｈａｒｏｓｅＨＰカラム（１ｍＬ）上の捕捉剤として固定化した。各実験のために、２ｍｇの精製ＧＦＰを、このＮＡＮＥＸカラムに注入した。ロードされたＣＡ１２７６０－カラムを、１０ＣＶの緩衝液（１００ｍＭのＨｅｐｅｓｐＨ７．５、１５０ｍＭのＮａＣｌ）により、２回にわたり洗浄するのに続き、カラムごとに、剥離剤であるＣＡ１２７６０、ＣＡ１５８１８、ＣＡ１５８１６、ＣＡ１５８６１のそれぞれを注入した。これらの異なる剥離剤による、ＧＦＰの溶出を、２８０ｎｍ及び４８８ｎｍにおける吸光度を追跡することによりモニタリングした。左側の高ピークは、それぞれの剥離剤（ＣＡ１２７６０、ＣＡ１５８１８、ＣＡ１５８１６、ＣＡ１５８６１）の注入時に溶出した。右ピークは、ｐＨ２．３における、２００ｍＭのグリシンによるカラムの再生時に溶出した。右パネル：分子量マーカー（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ製のＰａｇｅＲｕｌｅｒ（商標）ＰｒｅｓｔａｉｎｅｄＰｒｏｔｅｉｎＬａｄｄｅｒ；型番：２６６１６）による、異なる精製ステップについてのＳＤＳ－ＰＡＧＥである。ＮＡＮＥＸにおいて、中アフィニティーのナノボディー（ＣＡ１５８１６）により捕捉されたＧＦＰ標的タンパク質は、同じエピトープに結合する、低アフィニティーのナノボディー（ＣＡ１５８６１）による溶出は低度であるが、同じエピトープに結合する高アフィニティーのナノボディー（ＣＡ１２７６０、ＣＡ１５８１８、ＣＡ１５８１６）による溶出は、迅速かつ定量的であることを示す図である。ＮＡＮＥＸによるＧＦＰの精製のために、ＣＡ１５８１６（中アフィニティーの捕捉剤）を、ＨｉＴｒａｐＮＨＳ－ａｃｔｉｖａｔｅｄＳｅｐｈａｒｏｓｅＨＰカラム（１ｍＬ）上に固定化した。各実験のために、２ｍｇの精製ＧＦＰを、このＮＡＮＥＸカラムに注入した。ロードされたＣＡ１５８１６－カラムを、１０ＣＶの緩衝液（１００ｍＭのＨｅｐｅｓｐＨ７．５、１５０ｍＭのＮａＣｌ）により、２回にわたり洗浄するのに続き、それぞれの剥離剤（ＣＡ１２７６０、ＣＡ１５８１８、ＣＡ１５８１６、ＣＡ１５８６１）を注入した。これらの異なる剥離剤による、ＧＦＰの溶出を、２８０ｎｍ及び４８８ｎｍにおける吸光度を追跡することによりモニタリングした。左側の高ピークは、剥離剤（ＣＡ１２７６０、ＣＡ１５８１８、ＣＡ１５８１６、ＣＡ１５８６１）の注入時に溶出した。右ピークは、ｐＨ２．３における、２００ｍＭのグリシンによるカラムの再生時に溶出した。右パネル：分子量マーカー（ＰａｇｅＲｕｌｅｒ（商標）ＰｒｅｓｔａｉｎｅｄＰｒｏｔｅｉｎＬａｄｄｅｒ）による、異なる精製ステップについてのＳＤＳ－ＰＡＧＥである。ＮＡＮＥＸにおいて、中アフィニティーのナノボディー（ＣＡ１５８１６）により捕捉されたＧＦＰ標的タンパク質は、同じエピトープに結合する、低アフィニティーのナノボディー（ＣＡ１５８６１）による溶出は低度であるが、同じエピトープに結合する高アフィニティーのナノボディー（ＣＡ１２７６０、ＣＡ１５８１８、ＣＡ１５８１６）による溶出は、迅速かつ定量的であることを示す図である。ＮＡＮＥＸによるＧＦＰの精製のために、ＣＡ１５８１６（中アフィニティーの捕捉剤）を、ＨｉＴｒａｐＮＨＳ－ａｃｔｉｖａｔｅｄＳｅｐｈａｒｏｓｅＨＰカラム（１ｍＬ）上に固定化した。各実験のために、２ｍｇの精製ＧＦＰを、このＮＡＮＥＸカラムに注入した。ロードされたＣＡ１５８１６－カラムを、１０ＣＶの緩衝液（１００ｍＭのＨｅｐｅｓｐＨ７．５、１５０ｍＭのＮａＣｌ）により、２回にわたり洗浄するのに続き、それぞれの剥離剤（ＣＡ１２７６０、ＣＡ１５８１８、ＣＡ１５８１６、ＣＡ１５８６１）を注入した。これらの異なる剥離剤による、ＧＦＰの溶出を、２８０ｎｍ及び４８８ｎｍにおける吸光度を追跡することによりモニタリングした。左側の高ピークは、剥離剤（ＣＡ１２７６０、ＣＡ１５８１８、ＣＡ１５８１６、ＣＡ１５８６１）の注入時に溶出した。右ピークは、ｐＨ２．３における、２００ｍＭのグリシンによるカラムの再生時に溶出した。右パネル：分子量マーカー（ＰａｇｅＲｕｌｅｒ（商標）ＰｒｅｓｔａｉｎｅｄＰｒｏｔｅｉｎＬａｄｄｅｒ）による、異なる精製ステップについてのＳＤＳ－ＰＡＧＥである。ＮＡＮＥＸにおいて、中アフィニティーのナノボディー（ＣＡ１５８１６）により捕捉されたＧＦＰ標的タンパク質は、同じエピトープに結合する、低アフィニティーのナノボディー（ＣＡ１５８６１）による溶出は低度であるが、同じエピトープに結合する高アフィニティーのナノボディー（ＣＡ１２７６０、ＣＡ１５８１８、ＣＡ１５８１６）による溶出は、迅速かつ定量的であることを示す図である。ＮＡＮＥＸによるＧＦＰの精製のために、ＣＡ１５８１６（中アフィニティーの捕捉剤）を、ＨｉＴｒａｐＮＨＳ－ａｃｔｉｖａｔｅｄＳｅｐｈａｒｏｓｅＨＰカラム（１ｍＬ）上に固定化した。各実験のために、２ｍｇの精製ＧＦＰを、このＮＡＮＥＸカラムに注入した。ロードされたＣＡ１５８１６－カラムを、１０ＣＶの緩衝液（１００ｍＭのＨｅｐｅｓｐＨ７．５、１５０ｍＭのＮａＣｌ）により、２回にわたり洗浄するのに続き、それぞれの剥離剤（ＣＡ１２７６０、ＣＡ１５８１８、ＣＡ１５８１６、ＣＡ１５８６１）を注入した。これらの異なる剥離剤による、ＧＦＰの溶出を、２８０ｎｍ及び４８８ｎｍにおける吸光度を追跡することによりモニタリングした。左側の高ピークは、剥離剤（ＣＡ１２７６０、ＣＡ１５８１８、ＣＡ１５８１６、ＣＡ１５８６１）の注入時に溶出した。右ピークは、ｐＨ２．３における、２００ｍＭのグリシンによるカラムの再生時に溶出した。右パネル：分子量マーカー（ＰａｇｅＲｕｌｅｒ（商標）ＰｒｅｓｔａｉｎｅｄＰｒｏｔｅｉｎＬａｄｄｅｒ）による、異なる精製ステップについてのＳＤＳ－ＰＡＧＥである。ＮＡＮＥＸにおいて、低アフィニティーのナノボディー（ＣＡ１５８６１）により捕捉されたＧＦＰ標的タンパク質は、同じエピトープに結合するが、標的タンパク質に対する捕捉は弱い、高アフィニティーのナノボディー（ＣＡ１２７６０、ＣＡ１５８１８、ＣＡ１５８１６）による溶出が、迅速かつ定量的であることを示す図である。ナノボディー交換クロマトグラフィーによるＧＦＰの精製のために、ＣＡ１５８６１（低アフィニティーの捕捉剤）を、ＨｉＴｒａｐＮＨＳ－ａｃｔｉｖａｔｅｄＳｅｐｈａｒｏｓｅＨＰカラム（１ｍＬ）上の捕捉剤として固定化した。各実験のために、２ｍｇの精製ＧＦＰを、このＮＡＮＥＸカラムに注入した。ロードされたＣＡ１５８６１－カラムを、１０ＣＶの緩衝液（１００ｍＭのＨｅｐｅｓｐＨ７．５、１５０ｍＭのＮａＣｌ）により、２回にわたり洗浄するのに続き、それぞれの剥離剤（ＣＡ１２７６０、ＣＡ１５８１８、ＣＡ１５８１６、ＣＡ１５８６１）を注入した。これらの異なる剥離剤による、ＧＦＰの溶出を、２８０ｎｍ及び４８８ｎｍにおける吸光度を追跡することによりモニタリングした。左側の高ピークは、剥離剤（ＣＡ１２７６０、ＣＡ１５８１８、ＣＡ１５８１６、ＣＡ１５８６１）の注入時に溶出した。右ピークは、ｐＨ２．３における、２００ｍＭのグリシンによるカラムの再生時に溶出した。右パネル：分子量マーカー（ＰａｇｅＲｕｌｅｒ（商標）ＰｒｅｓｔａｉｎｅｄＰｒｏｔｅｉｎＬａｄｄｅｒ）による、異なる精製ステップについてのＳＤＳ－ＰＡＧＥである。ＮＡＮＥＸにおいて、低アフィニティーのナノボディー（ＣＡ１５８６１）により捕捉されたＧＦＰ標的タンパク質は、同じエピトープに結合するが、標的タンパク質に対する捕捉は弱い、高アフィニティーのナノボディー（ＣＡ１２７６０、ＣＡ１５８１８、ＣＡ１５８１６）による溶出が、迅速かつ定量的であることを示す図である。ナノボディー交換クロマトグラフィーによるＧＦＰの精製のために、ＣＡ１５８６１（低アフィニティーの捕捉剤）を、ＨｉＴｒａｐＮＨＳ－ａｃｔｉｖａｔｅｄＳｅｐｈａｒｏｓｅＨＰカラム（１ｍＬ）上の捕捉剤として固定化した。各実験のために、２ｍｇの精製ＧＦＰを、このＮＡＮＥＸカラムに注入した。ロードされたＣＡ１５８６１－カラムを、１０ＣＶの緩衝液（１００ｍＭのＨｅｐｅｓｐＨ７．５、１５０ｍＭのＮａＣｌ）により、２回にわたり洗浄するのに続き、それぞれの剥離剤（ＣＡ１２７６０、ＣＡ１５８１８、ＣＡ１５８１６、ＣＡ１５８６１）を注入した。これらの異なる剥離剤による、ＧＦＰの溶出を、２８０ｎｍ及び４８８ｎｍにおける吸光度を追跡することによりモニタリングした。左側の高ピークは、剥離剤（ＣＡ１２７６０、ＣＡ１５８１８、ＣＡ１５８１６、ＣＡ１５８６１）の注入時に溶出した。右ピークは、ｐＨ２．３における、２００ｍＭのグリシンによるカラムの再生時に溶出した。右パネル：分子量マーカー（ＰａｇｅＲｕｌｅｒ（商標）ＰｒｅｓｔａｉｎｅｄＰｒｏｔｅｉｎＬａｄｄｅｒ）による、異なる精製ステップについてのＳＤＳ－ＰＡＧＥである。ＮＡＮＥＸにおいて、低アフィニティーのナノボディー（ＣＡ１５８６１）により捕捉されたＧＦＰ標的タンパク質は、同じエピトープに結合するが、標的タンパク質に対する捕捉は弱い、高アフィニティーのナノボディー（ＣＡ１２７６０、ＣＡ１５８１８、ＣＡ１５８１６）による溶出が、迅速かつ定量的であることを示す図である。ナノボディー交換クロマトグラフィーによるＧＦＰの精製のために、ＣＡ１５８６１（低アフィニティーの捕捉剤）を、ＨｉＴｒａｐＮＨＳ－ａｃｔｉｖａｔｅｄＳｅｐｈａｒｏｓｅＨＰカラム（１ｍＬ）上の捕捉剤として固定化した。各実験のために、２ｍｇの精製ＧＦＰを、このＮＡＮＥＸカラムに注入した。ロードされたＣＡ１５８６１－カラムを、１０ＣＶの緩衝液（１００ｍＭのＨｅｐｅｓｐＨ７．５、１５０ｍＭのＮａＣｌ）により、２回にわたり洗浄するのに続き、それぞれの剥離剤（ＣＡ１２７６０、ＣＡ１５８１８、ＣＡ１５８１６、ＣＡ１５８６１）を注入した。これらの異なる剥離剤による、ＧＦＰの溶出を、２８０ｎｍ及び４８８ｎｍにおける吸光度を追跡することによりモニタリングした。左側の高ピークは、剥離剤（ＣＡ１２７６０、ＣＡ１５８１８、ＣＡ１５８１６、ＣＡ１５８６１）の注入時に溶出した。右ピークは、ｐＨ２．３における、２００ｍＭのグリシンによるカラムの再生時に溶出した。右パネル：分子量マーカー（ＰａｇｅＲｕｌｅｒ（商標）ＰｒｅｓｔａｉｎｅｄＰｒｏｔｅｉｎＬａｄｄｅｒ）による、異なる精製ステップについてのＳＤＳ－ＰＡＧＥである。中アフィニティーの捕捉剤であるＣＡ１５８１６及び高アフィニティーの剥離剤としての機能化ナノボディー（すなわち、ＭｅｇａＢｏｄｙＭｂ_{ＣＡ１２７６０} ^{ｃＨｏｐＱ}）であるＣＡ１５６２１を使用する、ＧＦＰの、ＮＡＮＥＸによる精製を示す図である。ＮＡＮＥＸによるＧＦＰの精製のために、ＣＡ１５８１６（中アフィニティーの捕捉剤）を、ＨｉＴｒａｐＮＨＳ－ａｃｔｉｖａｔｅｄＳｅｐｈａｒｏｓｅＨＰカラム（１ｍＬ）上の捕捉剤として固定化した。２ｍｇの精製ＧＦＰを、このＮＡＮＥＸカラムに注入した。ロードされたＣＡ１５８１６－カラムを、１０ＣＶの緩衝液（１００ｍＭのＨｅｐｅｓｐＨ７．５、１５０ｍＭのＮａＣｌ）により、２回にわたり洗浄するのに続き、機能化ナノボディー（ＭｅｇａＢｏｄｙＭｂ_{ＣＡ１２７６０} ^{ｃＨｏｐＱ}）の剥離剤であるＣＡ１５６２１を注入した。この剥離剤による、ＧＦＰの溶出を、２８０ｎｍ及び４８８ｎｍにおける吸光度を追跡することによりモニタリングした。左側の高ピークは、剥離剤（ＣＡ１５６２１）の注入時に溶出した。右ピークは、ｐＨ２．３における、２００ｍＭのグリシンによる再生時に溶出した。右パネル：分子量マーカー（ＰａｇｅＲｕｌｅｒ（商標）ＰｒｅｓｔａｉｎｅｄＰｒｏｔｅｉｎＬａｄｄｅｒ）による、異なる精製ステップについてのＳＤＳ－ＰＡＧＥである。中アフィニティーの捕捉剤であるＣＡ１５８１６及び高アフィニティーの剥離剤としての機能化ナノボディー（すなわち、ＭｅｇａＢｏｄｙＭｂ_{ＣＡ１２７６０} ^ＹｇｊＫ）であるＣＡ１５６１６を使用する、ＧＦＰの、ＮＡＮＥＸによる精製を示す図である。ＮＡＮＥＸクロマトグラフィーによるＧＦＰの精製のために、ＣＡ１５８１６（中アフィニティーの捕捉剤）を、ＨｉＴｒａｐＮＨＳ－ａｃｔｉｖａｔｅｄＳｅｐｈａｒｏｓｅＨＰカラム（１ｍＬ）上の捕捉剤として固定化した。２ｍｇの精製ＧＦＰを、このＮＡＮＥＸカラムに注入した。ロードされたＣＡ１５８１６－カラムを、１０ＣＶの緩衝液（１００ｍＭのＨｅｐｅｓｐＨ７．５、１５０ｍＭのＮａＣｌ）により、２回にわたり洗浄するのに続き、機能化ナノボディー（ＭｅｇａＢｏｄｙＭｂ_{ＣＡ１２７６０} ^ＹｇｊＫ）の剥離剤であるＣＡ１５６１６を注入した。この剥離剤による、ＧＦＰの溶出を、２８０ｎｍ及び４８８ｎｍにおける吸光度を追跡することによりモニタリングした。左側の高ピークは、剥離剤（ＣＡ１５６１６）の注入時に溶出した。右ピークは、ｐＨ２．３における、２００ｍＭのグリシンによる再生時に溶出した。右パネル：分子量マーカー（ＰａｇｅＲｕｌｅｒ（商標）ＰｒｅｓｔａｉｎｅｄＰｒｏｔｅｉｎＬａｄｄｅｒ）による、異なる精製ステップについてのＳＤＳ－ＰＡＧＥである。７５μＬのマイクロカラム上において、中アフィニティーの捕捉剤であるＣＡ１５８１６及び高アフィニティーの剥離剤としてのＣＡ１２７６０を使用する、ＧＦＰの、ＮＡＮＥＸによる精製を示す図である。ＮＡＮＥＸによるＧＦＰの精製のために、ＣＡ１５８１６（中アフィニティーの捕捉剤）を、ＮＨＳ活性化アガロースビーズ上の捕捉剤として固定化してカスタム製のマイクロカラムを調製した。０．１ｍｇの精製ＧＦＰを、このＮＡＮＥＸマイクロカラムに注入した。ロードされたＣＡ１５８１６－マイクロカラムを、５ｍＬの緩衝液（１００ｍＭのＨｅｐｅｓｐＨ７．５、１５０ｍＭのＮａＣｌ）により、２回にわたり洗浄するのに続き、剥離剤であるＣＡ１２７６０（高アフィニティー）を注入した。この剥離剤による、ＧＦＰの溶出を、２８０ｎｍ及び４８８ｎｍにおける吸光度を追跡することによりモニタリングした。左側の高ピークは、剥離剤（ＣＡ１２７６０）の注入時に溶出した。右ピークは、ｐＨ２．３における、２００ｍＭのグリシンによる再生時に溶出した。右パネル：分子量マーカー（ＰａｇｅＲｕｌｅｒ（商標）ＰｒｅｓｔａｉｎｅｄＰｒｏｔｅｉｎＬａｄｄｅｒ）による、異なる精製ステップについてのＳＤＳ－ＰＡＧＥである。中アフィニティーの捕捉剤としてのＥＰＥＡ特異的ナノボディー（ＣＡ４３７５）及び中アフィニティーの剥離剤としてのＣＡ４３７５を使用する、ＥＰＥＡタグ付けＧＦＰ（ＧＦＰ－ＥＰＥＡ）タンパク質の、ＮＡＮＥＸによる精製を示す図である。ＮＡＮＥＸによるＥＰＥＡタグ付けＧＦＰ（ＧＦＰ－ＥＰＥＡ）の精製のために、ＣＡ４３７５（中アフィニティーの捕捉剤）を、ＨｉＴｒａｐＮＨＳ－ａｃｔｉｖａｔｅｄＳｅｐｈａｒｏｓｅＨＰカラム（１ｍＬ）上の捕捉剤として固定化した。１ｍｇの精製ＥＰＥＡタグ付けＧＦＰ（ＧＦＰ－ＥＰＥＡ）タンパク質を、このＮＡＮＥＸカラムに注入した。ロードされたＣＡ４３７５－カラムを、１０ＣＶの緩衝液（１００ｍＭのＨｅｐｅｓｐＨ７．５、１５０ｍＭのＮａＣｌ）により、２回にわたり洗浄するのに続き、剥離剤であるＣＡ４３７５（中アフィニティーの剥離剤）を注入した。この剥離剤による、ＥＰＥＡタグ付けＧＦＰ（ＧＦＰ－ＥＰＥＡ）の溶出を、２８０ｎｍ及び４８８ｎｍにおける吸光度を追跡することによりモニタリングした。左側の高ピークは、剥離剤（ＣＡ４３７５）の注入時に溶出した。右ピークは、ｐＨ２．３における、２００ｍＭのグリシンによる再生時に溶出した。右パネル：分子量マーカー（ＰａｇｅＲｕｌｅｒ（商標）ＰｒｅｓｔａｉｎｅｄＰｒｏｔｅｉｎＬａｄｄｅｒ）による、異なる精製ステップについてのＳＤＳ－ＰＡＧＥである。中アフィニティーの捕捉剤としてのＥＰＥＡ特異的ナノボディー（ＣＡ４３７５）及び高アフィニティーの剥離剤としての二価ＣＡ４３７５を使用する、ＥＰＥＡタグ付けＧＦＰ（ＧＦＰ－ＥＰＥＡ）タンパク質の、ＮＡＮＥＸカラムによる精製を示す図である。ナノボディー交換クロマトグラフィーによるＥＰＥＡタグ付けＧＦＰ（ＧＦＰ－ＥＰＥＡ）タンパク質の精製のために、ＣＡ４３７５（中アフィニティーの捕捉剤）を、ＨｉＴｒａｐＮＨＳ－ａｃｔｉｖａｔｅｄＳｅｐｈａｒｏｓｅＨＰカラム（１ｍＬ）上の捕捉剤として固定化した。１ｍｇの精製ＥＰＥＡタグ付けＧＦＰ（ＧＦＰ－ＥＰＥＡ）タンパク質を、細菌溶解物へとスパイクし、このＮＡＮＥＸカラムに注入した。ロードされたＣＡ４３７５－カラムを、１０ＣＶの緩衝液（１００ｍＭのＨｅｐｅｓｐＨ７．５、１５０ｍＭのＮａＣｌ）により、２回にわたり洗浄するのに続き、二価の剥離剤であるＣＡ４３７５（高アフィニティーの剥離剤）を注入した。この剥離剤による、ＥＰＥＡタグ付けＧＦＰ（ＧＦＰ－ＥＰＥＡ）タンパク質の溶出を、２８０ｎｍ及び４８８ｎｍにおける吸光度を追跡することによりモニタリングした。左側の高ピークは、剥離剤（二価ＣＡ４３７５）の注入時に溶出した。右ピークは、ｐＨ２．３における、２００ｍＭのグリシンによる再生時に溶出した。右パネル：分子量マーカー（ＰａｇｅＲｕｌｅｒ（商標）ＰｒｅｓｔａｉｎｅｄＰｒｏｔｅｉｎＬａｄｄｅｒ）による、異なる精製ステップについてのＳＤＳ－ＰＡＧＥである。中アフィニティーの捕捉剤としてのシナプトジャニン特異的ナノボディー（ＣＡ１３０１６）及び高アフィニティーの剥離剤としてのＣＡ１３０８０を使用する、組換えヒトシナプトジャニンの、ＮＡＮＥＸカラムによる精製を示す図である。ナノボディー交換クロマトグラフィーによる組換えヒトシナプトジャニンの精製のために、ＣＡ１３０１６（中アフィニティーの捕捉剤）を、ＨｉＴｒａｐＮＨＳ－ａｃｔｉｖａｔｅｄＳｅｐｈａｒｏｓｅＨＰカラム（１ｍＬ）上の捕捉剤として固定化した。過剰発現された組換えヒトシナプトジャニンを含有する、１０ｍＬの細菌溶解物を、このＮＡＮＥＸカラムに注入した。ロードされたＣＡ１３０１６－カラムを、１０ＣＶの緩衝液（１００ｍＭのＨｅｐｅｓｐＨ７．５、１５０ｍＭのＮａＣｌ）により、２回にわたり洗浄するのに続き、剥離剤であるＣＡ１３０８０（高アフィニティーの剥離剤）を注入した。この剥離剤による、組換えヒトシナプトジャニンの溶出を、２８０ｎｍにおける吸光度を追跡することによりモニタリングした。左側の高ピークは、剥離剤（ＣＡ１３０８０）の注入時に溶出した。右ピークは、ｐＨ２．３における、２００ｍＭのグリシンの添加時に溶出した。右パネル：分子量マーカー（ＰａｇｅＲｕｌｅｒ（商標）ＰｒｅｓｔａｉｎｅｄＰｒｏｔｅｉｎＬａｄｄｅｒ）による、異なる精製ステップについてのＳＤＳ－ＰＡＧＥである。中アフィニティーの捕捉剤としての第ＩＸａ因子特異的ナノボディー（ＣＡ１１１３８）及び高アフィニティーの剥離剤としてのＣＡ１０３０４を使用する、組換えヒト凝固第ＩＸａ因子の、ＮＡＮＥＸカラムによる精製を示す図である。ＮＡＮＥＸによる組換えヒト凝固第ＩＸａ因子の精製のために、ＣＡ１１１３８（中アフィニティーの捕捉剤）を、ＨｉＴｒａｐＮＨＳ－ａｃｔｉｖａｔｅｄＳｅｐｈａｒｏｓｅＨＰカラム（１ｍＬ）上の捕捉剤として固定化した。Ｄｙｌｉｇｈｔ－６４７により蛍光標識化された、０．４ｍｇの精製組換えヒト凝固第ＩＸａ因子を、このＮＡＮＥＸカラムに注入した。ロードされたＣＡ１１１３８－カラムを、１０ＣＶの緩衝液（１００ｍＭのＨｅｐｅｓｐＨ７．５、１５０ｍＭのＮａＣｌ）により、２回にわたり洗浄するのに続き、剥離剤であるＣＡ１０３０４（高アフィニティーの剥離剤）を注入した。この剥離剤による、組換えヒト凝固第ＩＸａ因子の溶出を、２８０ｎｍ及び６５０ｎｍにおける吸光度を追跡することによりモニタリングした。左側の高ピークは、剥離剤（ＣＡ１０３０４）の注入時に溶出した。右ピークは、ｐＨ２．３における、２００ｍＭのグリシンの添加時に溶出した。右パネル：分子量マーカー（ＰａｇｅＲｕｌｅｒ（商標）ＰｒｅｓｔａｉｎｅｄＰｒｏｔｅｉｎＬａｄｄｅｒ）による、異なる精製ステップについてのＳＤＳ－ＰＡＧＥである。中アフィニティーの捕捉剤としての第ＩＸａ因子特異的ナノボディー（ＣＡ１０５０２）及び高アフィニティーの剥離剤としてのＣＡ１０３０９を使用する、組換えヒト凝固第ＩＸａ因子・ＣＡ１０３０４の、ＮＡＮＥＸカラムによる精製を示す図である。ＮＡＮＥＸによる組換えヒト凝固第ＩＸａ因子・ＣＡ１０３０４複合体の精製のために、ＣＡ１０５０２（中アフィニティーの捕捉剤）を、ＨｉＴｒａｐＮＨＳ－ａｃｔｉｖａｔｅｄＳｅｐｈａｒｏｓｅＨＰカラム（１ｍＬ）上の捕捉剤として固定化した。実施例１４による精製組換えヒト凝固第ＩＸａ因子・ＣＡ１０３０４を、このＮＡＮＥＸカラムに注入した。ロードされたＣＡ１０５０２－カラムを、１０ＣＶの緩衝液（１００ｍＭのＨｅｐｅｓｐＨ７．５、１５０ｍＭのＮａＣｌ）により、２回にわたり洗浄するのに続き、剥離剤であるＣＡ１０３０９（高アフィニティーの剥離剤）を注入した。この剥離剤による、組換えヒト凝固第ＩＸａ因子の溶出を、２８０ｎｍ及び６５０ｎｍにおける吸光度を追跡することによりモニタリングした。左側の高ピークは、剥離剤（ＣＡ１０３０９）の注入時に溶出した。右ピークは、ｐＨ２．３における、２００ｍＭのグリシンの添加時に溶出した。右パネル：分子量マーカー（ＰａｇｅＲｕｌｅｒ（商標）ＰｒｅｓｔａｉｎｅｄＰｒｏｔｅｉｎＬａｄｄｅｒ）による、異なる精製ステップについてのＳＤＳ－ＰＡＧＥである。タンデムナノボディー交換クロマトグラフィー（タンデムＮＡＮＥＸ）についての概略表示を示す図である。本実施例において、異なるアフィニティーマトリックスを含有する、２つのクロマトグラフィーカラムを接続した。タンデムＮＡＮＥＸはまた、異なるアフィニティーマトリックスを、単一のカラム内において混合することによっても実施されうる。このスキームは、２つの異なるエピトープについて、対として競合する、２つのナノボディー対を使用する、タンデムナノボディー交換クロマトグラフィー（タンデムＮＡＮＥＸ）の原理を示す。１）第１の精製ステップとして、目的のタンパク質（ＰＯＩ）を、特異的ナノボディー捕捉剤１（グレーの球へとカップリングさせたビーズ１）によりコーティングされたビーズ上に保持する。２）洗浄の後、ＰＯＩ上の捕捉剤１の重複エピトープに結合する、ナノボディー剥離剤１（斜線を付した球）を使用して、標的を溶出させる。結果として、ＰＯＩ・剥離剤１複合体が、別のエピトープに結合する捕捉剤２によりコーティングされたビーズ（黒色の球）上に保持される。３）捕捉剤２（剥離剤２、縦縞を付した球）と重複する剥離剤を使用して、ＰＯＩ・剥離剤１複合体を溶出させて、高度に精製された三元複合体としてのＰＯＩ・剥離剤１・剥離剤２を回収することができる。第１の捕捉剤としての、第ＩＸａ因子特異的ナノボディーであるＣＡ１１１３８及び第１の剥離剤としてのＣＡ１０３０４に続き、第２の捕捉剤としてのＣＡ１０５０２及び第２の剥離剤としての機能化ナノボディー（ＭｅｇａＢｏｄｙＭｂ_{ＣＡ１０３０９} ^ＹｇｊＫ）であるＣＡ１４２０８を使用する、組換えヒト凝固第ＩＸａ因子の、タンデムＮＡＮＥＸによる精製を示す図である。タンデムＮＡＮＥＸによる、組換えヒト凝固第ＩＸａ因子の精製のために、ＣＡ１１１３８（中アフィニティーの捕捉剤）を、ＨｉＴｒａｐＮＨＳ－ａｃｔｉｖａｔｅｄＳｅｐｈａｒｏｓｅＨＰカラム（１ｍＬ）上の捕捉剤１として固定化した、第１のＮＡＮＥＸカラムを、ＨｉＴｒａｐＮＨＳ－ａｃｔｉｖａｔｅｄＳｅｐｈａｒｏｓｅＨＰカラム（１ｍＬ）上の捕捉剤２として固定化されたＣＡ１０５０２（中アフィニティーの捕捉剤）からなる第２のＮＡＮＥＸカラムへと接続した。Ｄｙｌｉｇｈｔ－６４７により蛍光標識化された、０．４ｍｇの精製組換えヒト凝固第ＩＸａ因子を、いずれのＮＡＮＥＸカラムにも注入し、これを、１０ＣＶの緩衝液（１００ｍＭのＨｅｐｅｓｐＨ７．５、１５０ｍＭのＮａＣｌ）により、２回にわたり洗浄し、次いで、Ａｋｔａ－Ｐｕｒｅ（ＧＥ）ＦＬＰＣシステムへと接続した。剥離剤１であるＣＡ１０３０４（高アフィニティーの剥離剤）の注入に続き、同じ緩衝液５ｍＬにより洗浄ステップを行ってから、剥離剤２であるＣＡ１４２０８（高アフィニティーの剥離剤）の注入を行った。両方の剥離剤による、組換えヒト凝固第ＩＸａ因子の溶出を、２８０ｎｍ及び６５０ｎｍにおける吸光度を追跡することによりモニタリングした。左側のピークは、剥離剤１（ＣＡ１０３０４）の注入時に溶出した。右ピークは、剥離剤２（ＣＡ１４２０８）の注入時に溶出した。右パネル：分子量マーカー（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ製のＰａｇｅＲｕｌｅｒ（商標）ＰｒｅｓｔａｉｎｅｄＰｒｏｔｅｉｎＬａｄｄｅｒ；型番：２６６１６）による、異なる精製ステップについてのＳＤＳ－ＰＡＧＥである。捕捉剤としてのＣＡ１５８１６及び高アフィニティーの剥離剤としてのＣＡ１２７６０を使用する、酵母抽出物からの、ＲＰＰ１Ａ－ＧＦＰ融合タンパク質を含有する、酵母６０Ｓリボソームサブユニットの、ＮＡＮＥＸによる精製を示す図である。ＮＡＮＥＸによるＧＦＰ－ＲＰＰ１Ａタンパク質の精製のために、ＣＡ１５８１６（中アフィニティーの捕捉剤）を、ＨｉＴｒａｐＮＨＳ－ａｃｔｉｖａｔｅｄＳｅｐｈａｒｏｓｅＨＰカラム（１ｍＬ）上の捕捉剤として固定化した。２０ｍＬの清澄化酵母溶解物を、このＮＡＮＥＸカラムに注入した。ロードされたＣＡ１５８１６－カラムを、１０ＣＶの緩衝液（１００ｍＭのＨｅｐｅｓｐＨ７．５、１５０ｍＭのＮａＣｌ）により、２回にわたり洗浄するのに続き、高アフィニティー剥離剤（ＣＡ１２７６０）を注入した。この剥離剤による、ＧＦＰ－ＲＰＰ１Ａタンパク質の溶出を、２８０ｎｍ及び４８８ｎｍにおける吸光度を追跡することによりモニタリングした。左側の高ピークは、剥離剤（ＣＡ１２７６０）の注入時に溶出した。右ピークは、ｐＨ２．３における、２００ｍＭのグリシンの添加時に溶出した。右パネル：分子量マーカー（ＰａｇｅＲｕｌｅｒ（商標）ＰｒｅｓｔａｉｎｅｄＰｒｏｔｅｉｎＬａｄｄｅｒ）による、主溶出ピークの異なる画分についてのＳＤＳ－ＰＡＧＥである。ＮＡＮＥＸにより、酵母抽出物から精製された、ＧＦＰタグ付けＲＰＰ１Ａリボソームタンパク質を含有する酵母６０Ｓリボソームサブユニットの、ネガティブ染色電子顕微鏡法による視覚化を示す図である。染色のために、酵母クローンＧＦＰ＋３５：Ｇ８の溶解物に対するＮＡＮＥＸからの、３μｌの主要溶出ピーク（画分６、タンパク質濃度を、０．１ｍｇ／ｍＬとした）を、３０秒間にわたり、グロー放電グリッドへと適用し、酢酸ウラニル（２％ｗ／ｖ）中において、３０秒間にわたり洗浄してから、乾燥させた。画像は、拡大率を５０×とする、Ｊｅｏｌ１４００顕微鏡上において撮影した。ＧＦＰ・ＣＡ１６０４７タンパク質・ナノボディー複合体のＸ線構造及びエピトープについての記載を示す図である。Ａ．ＧＦＰ（表面表示）と複合体化した、ナノボディーであるＣＡ１６０４７（リボン表示）の結晶構造である。Ｂ．ＧＦＰについての表面表示である。ＧＦＰ上のＣＡ１６０４７のエピトープを構成する残基を、ダークグレーにより着色し、標識化する。Ｃ．ＧＦＰ上のエピトープに結合するＣＡ１６０４７を構成する残基についてまとめる表である。低アフィニティーの捕捉剤（ＣＡ１６６９５）をデザインするのに、突然変異誘発のために選択される、ナノボディーであるＣＡ１６０４７のＣＤＲ３内のＴｙｒ１１９を強調する、ＧＦＰ・ＣＡ１６０４７間インターフェースについての図である。ＧＦＰは、表面モードにおいて表される。ＣＡ１６０４７は、リボンモードにおいて表される。Ｔｙｒ１１９は、スティックとして表される。ＧＦＰの、剥離剤であるＣＡ１６０４７及び突然変異誘発（ＣＡ１６６９５）により、これから導出された捕捉剤との相互作用についての、反応速度による特徴付けを示す図である。ＧＦＰの、ナノボディーであるＣＡ１６０４７（配列番号１８）及びＣＡ１６６９５（配列番号１９）への結合及び解離についてのリアルタイム反応速度解析である。ストレプトアビジンコーティングＯｃｔｅｔ（登録商標）バイオセンサーを使用して、ビオチニル化ナノボディー（１μｇ／ｍＬ）を捕捉した。いくつかのＧＦＰ濃度（８ｎＭ～５００ｎＭの範囲）における結合等温線及び解離等温線は、ＯｃｔｅｔＲｅｄ（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＤｅｖｉｃｅｓ）上において解析した。全てのアッセイは、室温において、０．１％のＢＳＡ及び０．００５％のＴｗｅｅｎ２０を補充された、２５ｍＭのＨｅｐｅｓｐＨ７．５、１５０ｍＭのＮａＣｌ中において実施した。中アフィニティーの捕捉剤であるＣＡ１６６９５及び高アフィニティーの剥離剤としてのＣＡ１６０４７を使用する、ＧＦＰの、ＮＡＮＥＸによる精製を示す図である。ＮＡＮＥＸによるＧＦＰの精製のために、ＣＡ１６６９５（中アフィニティーの捕捉剤）を、ＨｉＴｒａｐＮＨＳ－ａｃｔｉｖａｔｅｄＳｅｐｈａｒｏｓｅＨＰカラム（１ｍＬ）上の捕捉剤として固定化した。２ｍｇの精製ＧＦＰを、このＮＡＮＥＸカラムに注入した。ロードされたＣＡ１６６９５－カラムを、１０ＣＶの緩衝液（１００ｍＭのＨｅｐｅｓｐＨ７．５、１５０ｍＭのＮａＣｌ）により、２回にわたり洗浄するのに続き、１ｍｇの剥離剤であるＣＡ１６０４７を注入した。（Ａ）この剥離剤による、ＧＦＰの溶出を、２８０ｎｍ及び４８８ｎｍにおける吸光度を追跡することによりモニタリングした。左側の高ピークは、剥離剤（ＣＡ１６０４７）の注入時に溶出した。右ピークは、ｐＨ２．３における、２００ｍＭのグリシンによる再生時に溶出した。（Ｂ）ブンシリョウマーカー（ＰａｇｅＲｕｌｅｒ（商標）ＰｒｅｓｔａｉｎｅｄＰｒｏｔｅｉｎＬａｄｄｅｒ）による、異なる精製画分についてのＳＤＳ－ＰＡＧＥである。ＧＳＴ・ＣＡ１６２３９タンパク質・ナノボディー複合体のＸ線構造及びエピトープについての記載を示す図である。Ａ．ＧＳＴ（表面表示）と複合体化した、ＣＡ１６２３９（リボン表示）の結晶構造である。Ｂ．ＧＳＴについての表面表示である。ＧＳＴ上のＣＡ１６２３９のエピトープを構成する残基を、ダークグレーにより着色し、標識化する。Ｃ．ＧＳＴ上のエピトープに結合するＣＡ１６２３９を構成する残基についてまとめる表である。低アフィニティーの捕捉剤（ＣＡ１６６９５）をデザインするのに、突然変異誘発のために選択される、ナノボディーであるＣＡ１６２３９のＣＤＲ３内の残基であるＴｙｒ１０９を強調する、ＧＳＴ・ＣＡ１６２３９間インターフェースについての図である。ＧＳＴは、表面モードにおいて表される。ＣＡ１６２３９は、リボンモードにおいて表される。Ｔｙｒ１０９は、スティックとして表される。ＧＳＴの、剥離剤であるＣＡ１６２３９及び突然変異誘発（ＣＡ１６２４０）により、これから導出された捕捉剤との相互作用についての、反応速度による特徴付けを示す図である。ＧＳＴの、ナノボディーであるＣＡ１６２３９（配列番号２０）及びＣＡ１６２４０（配列番号２１）への結合及び解離についてのリアルタイム反応速度解析である。ストレプトアビジンコーティングＯｃｔｅｔ（登録商標）バイオセンサーを使用して、ビオチニル化ナノボディー（１μｇ／ｍＬ）を捕捉した。いくつかのＧＳＴ濃度（６３ｎＭ～１６６７ｎＭの範囲）における結合等温線及び解離等温線は、ＯｃｔｅｔＲｅｄ（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＤｅｖｉｃｅｓ）上において解析した。全てのアッセイは、室温において、０．１％のＢＳＡ及び０．００５％のＴｗｅｅｎ２０を補充された、２５ｍＭのＨｅｐｅｓｐＨ７．５、１５０ｍＭのＮａＣｌ中において実施した。中アフィニティーの捕捉剤であるＣＡ１６２４０及び高アフィニティーの剥離剤としてのＣＡ１６２３９を使用する、ＧＳＴの、ＮＡＮＥＸによる精製を示す図である。ＮＡＮＥＸによるＧＳＴの精製のために、４ｍｇのＣＡ１６２４０（中アフィニティーの捕捉剤）を、ＨｉＴｒａｐＮＨＳ－ａｃｔｉｖａｔｅｄＳｅｐｈａｒｏｓｅＨＰカラム（１ｍＬ）上の捕捉剤として固定化した。２ｍｇの精製ＧＳＴを、このＮＡＮＥＸカラムに注入した。ロードされたＣＡ１６２４０－カラムを、１０ＣＶの緩衝液（１００ｍＭのＨｅｐｅｓｐＨ７．５、１５０ｍＭのＮａＣｌ）により、２回にわたり洗浄するのに続き、２ｍｇの剥離剤であるＣＡ１６２３９を注入した。Ａ．この剥離剤による、ＧＳＴの溶出を、２８０ｎｍにおける吸光度を追跡することによりモニタリングした。左側の高ピークは、剥離剤（ＣＡ１６２３９）の注入時に溶出した。右ピークは、ｐＨ２．３における、２００ｍＭのグリシンによる再生時に溶出した。Ｂ．分子量マーカー（ＰａｇｅＲｕｌｅｒ（商標）ＰｒｅｓｔａｉｎｅｄＰｒｏｔｅｉｎＬａｄｄｅｒ）による、異なる精製画分についてのＳＤＳ－ＰＡＧＥである。ＳＭＴ３・ＣＡ１５８３９タンパク質・ナノボディー複合体のＸ線構造及びエピトープについての記載を示す図である。Ａ．ＳＭＴ３（表面表示）と複合体化した、ＣＡ１５８３９（リボン表示）の結晶構造である。Ｂ．ＳＭＴ３についての表面表示である。ＳＭＴ３上のＣＡ１５８３９のエピトープを構成する残基を、ダークグレーにより着色し、標識化する。Ｃ．ＳＭＴ３上のエピトープに結合するＣＡ１５８３９を構成する残基についてまとめる表である。低アフィニティーの捕捉剤（ＣＡ１６６８７）をデザインするのに、突然変異誘発のために選択される、ナノボディーであるＣＡ１５８３９の表面上におけるＡｓｐ５０を強調する、ＳＭＴ３・ＣＡ１５８３９間インターフェースについての図である。ＳＭＴ３は、表面モードにおいて表される。ＣＡ１５８３９は、リボンモードにおいて表される。Ａｓｐ５０は、スティックとして表される。ＳＭＴ３の、剥離剤であるＣＡ１５８３９及び突然変異誘発（ＣＡ１６６８７）により、これから導出された捕捉剤との相互作用についての、反応速度による特徴付けを示す図である。ＳＭＴ３の、ナノボディーであるＣＡ１５８３９（配列番号２３）及びＣＡ１６６８７（配列番号２４）への結合及び解離についてのリアルタイム反応速度解析である。ストレプトアビジンコーティングＯｃｔｅｔ（登録商標）バイオセンサーを使用して、ビオチニル化ナノボディー（１μｇ／ｍＬ）を捕捉した。いくつかのＳＭＴ３濃度（１０ｎＭ～５００ｎＭの範囲）における結合等温線及び解離等温線は、ＯｃｔｅｔＲｅｄ（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＤｅｖｉｃｅｓ）上において解析した。全てのアッセイは、室温において、０．１％のＢＳＡ及び０．００５％のＴｗｅｅｎ２０を補充された、２５ｍＭのＨｅｐｅｓｐＨ７．５、１５０ｍＭのＮａＣｌ中において実施した。中アフィニティーの捕捉剤であるＣＡ１６６８７及び高アフィニティーの剥離剤としてのＣＡ１５８３９を使用する、ＳＭＴ３の、ＮＡＮＥＸによる精製を示す図である。ＮＡＮＥＸによるＳＭＴ３の精製のために、１ｍｇの精製ＣＡ１６６８７（中アフィニティーの捕捉剤）を、ＨｉＴｒａｐＮＨＳ－ａｃｔｉｖａｔｅｄＳｅｐｈａｒｏｓｅＨＰカラム（１ｍＬ）上の捕捉剤として固定化した。２ｍｇの精製ＳＭＴ３を、このＮＡＮＥＸカラムに注入した。ロードされたＣＡ１６６８７－カラムを、１０ＣＶの緩衝液（１００ｍＭのＨｅｐｅｓｐＨ７．５、１５０ｍＭのＮａＣｌ）により、２回にわたり洗浄するのに続き、２ｍｇの剥離剤であるＣＡ１５８３９を注入した。Ａ．この剥離剤による、ＳＭＴ３の溶出を、２８０ｎｍにおける吸光度を追跡することによりモニタリングした。左側の高ピークは、剥離剤（ＣＡ１５８３９）の注入時に溶出した。右ピークは、ｐＨ２．３における、２００ｍＭのグリシンによる再生時に溶出した。Ｂ．分子量マーカー（ＰａｇｅＲｕｌｅｒ（商標）ＰｒｅｓｔａｉｎｅｄＰｒｏｔｅｉｎＬａｄｄｅｒ）による、異なる精製画分についてのＳＤＳ－ＰＡＧＥである。バイオセンサー上の固定化ＣＡ１７３０２を使用するＢＬＩによる、ｍＣｈｅｒｒｙに特異的なＮｂについてのエピトープマッピングを示す図である。Ａ．エピトープマッピング実験についての概観である。ストレプトアビジンコーティングＯｃｔｅｔ（登録商標）バイオセンサーを使用して、ビオチニル化ＣＡ１７３０２（１μｇ／ｍＬ）（ｍＣｈｅｒｒｙに対して発見された、アフィニティーが最も高い捕捉剤）を捕捉した。結合しなかったビオチニル化ＣＡ１７３０２を、２回にわたる洗浄ステップ（緩衝液中における３０秒間）により、バイオセンサーから洗い落とすのに続き、５００ｎＭの異なる被験Ｎｂと共にプレインキュベートされた、１００ｎＭのｍＣｈｅｒｒｙを伴うインキュベーションを行った。会合速度及び解離速度は、それぞれ、３００秒間及び６００秒間にわたり決定した。Ｂ．ＯｃｔｅｔＲｅｄ（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＤｅｖｉｃｅｓ）上において解析された、陽性対照及び陰性対照並びに異なる被験Ｎｂについての結合等温線及び解離等温線である。ＣＡ１７３０２と、ｍＣｈｅｒｒｙとの間において形成された複合体が、固定化ＣＡ１６９６４に結合しないことは、これらのナノボディーが、重複エピトープに結合することを指し示す。全てのアッセイは、室温において、０．１％のＢＳＡ及び０．００５％のＴｗｅｅｎ２０を補充された、２５ｍＭのＨｅｐｅｓｐＨ７．５、１５０ｍＭのＮａＣｌ中において実施した。ｍＣｈｅｒｒｙの、剥離剤であるＣＡ１７３０２及び捕捉剤であるＣＡ１６９６４との相互作用についての、反応速度による特徴付けを示す図である。ｍＣｈｅｒｒｙの、ナノボディーであるＣＡ１７３０２（配列番号２７）及びＣＡ１６９６４（配列番号２６）への結合についてのリアルタイム反応速度解析である。ストレプトアビジンコーティングＯｃｔｅｔ（登録商標）バイオセンサーを使用して、ビオチニル化ナノボディー（１μｇ／ｍＬ）を捕捉した。いくつかのｍＣｈｅｒｒｙ濃度（８．２３ｎＭ～２２２ｎＭの範囲）における結合等温線及び解離等温線は、ＯｃｔｅｔＲｅｄ（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＤｅｖｉｃｅｓ）上において解析した。全てのアッセイは、室温において、０．１％のＢＳＡ及び０．００５％のＴｗｅｅｎ２０を補充された、２５ｍＭのＨｅｐｅｓｐＨ７．５、１５０ｍＭのＮａＣｌ中において実施した。ＨｉＴｒａｐＮＨＳ－ａｃｔｉｖａｔｅｄＳｅｐｈａｒｏｓｅＨＰカラム上の固定化された捕捉剤としてのＣＡ１６９６４を使用し、剥離剤としてのＣＡ１７３０２により溶出させる、ＦｍｌＨ－レクチン－ｍＣｈｅｒｒｙ－ｈｉｓのアフィニティー精製を示す図である。ＮＡＮＥＸによるｍＣｈｅｒｒｙの精製のために、１ｍｇのＣＡ１６９６４（中アフィニティーの捕捉剤）を、ＨｉＴｒａｐＮＨＳ－ａｃｔｉｖａｔｅｄＳｅｐｈａｒｏｓｅＨＰカラム（１ｍＬ）上の捕捉剤として固定化した。組換えＦｍｌＨ－レクチン－ｍＣｈｅｒｒｙ－ｈｉｓは、１ｍＭのＩＰＧＴを使用して、２８℃において、一晩にわたる誘導により、ＢＬ２１発現株内において発現させた。２Ｌの細菌ペレットを、５０ｍＬの再懸濁緩衝液（２５ｍＭのＨＥＰＥＳｐＨ７．５、１５０ｍＭのＮａＣｌ）中に溶解させ、遠心分離及び濾過により清澄化させた。次いで、この細菌溶解物を、手動により、ＮＡＮＥＸカラムに注入した。ロードされたＣＡ１６９６４－カラムを、手動において、１０ＣＶの緩衝液（１００ｍＭのＨｅｐｅｓｐＨ７．５、１５０ｍＭのＮａＣｌ）により２回にわたり洗浄してから、カラムを、ＡｋｔａＰｕｒｅへと回収し、次いで、これに続き、１ｍｇの剥離剤であるＣＡ１７３０２を注入した。（Ａ）この剥離剤による、ＦｍｌＨ－レクチン－ｍＣｈｅｒｒｙ－ｈｉｓの溶出を、２８０ｎｍにおける吸光度を追跡することによりモニタリングした。左側の高ピークは、剥離剤（ＣＡ１７３０２）の注入時に溶出した。右ピークは、ｐＨ２．３における、２００ｍＭのグリシンによる再生時に溶出した。（Ｂ）分子量マーカー（ＰａｇｅＲｕｌｅｒ（商標）ＰｒｅｓｔａｉｎｅｄＰｒｏｔｅｉｎＬａｄｄｅｒ）による、異なる精製画分についてのＳＤＳ－ＰＡＧＥである。アステリスク（^＊）：ＦｍｌＨ＿ｌｅｃｔｉｎ＿ｍＣｈｅｒｒｙ＿ｈｉｓタンパク質である。ｍＣｈｅｒｒｙの、剥離剤であるＣＡ１７３０２及び捕捉剤であるＣＡ１７３４１との相互作用についての、反応速度による特徴付けを示す図である。ｍＣｈｅｒｒｙの、ナノボディーであるＣＡ１７３０２（配列番号２７）及びＣＡ１７３４１（配列番号２８）への結合についてのリアルタイム反応速度解析である。ストレプトアビジンコーティングＯｃｔｅｔ（登録商標）バイオセンサーを使用して、ビオチニル化ナノボディー（１μｇ／ｍＬ）を捕捉した。いくつかのｍＣｈｅｒｒｙ濃度（８．２３ｎＭ～２２２ｎＭの範囲）における結合等温線及び解離等温線は、ＯｃｔｅｔＲｅｄ（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＤｅｖｉｃｅｓ）上において解析した。全てのアッセイは、室温において、０．１％のＢＳＡ及び０．００５％のＴｗｅｅｎ２０を補充された、２５ｍＭのＨｅｐｅｓｐＨ７．５、１５０ｍＭのＮａＣｌ中において実施した。ＨｉＴｒａｐＮＨＳ－ａｃｔｉｖａｔｅｄＳｅｐｈａｒｏｓｅＨＰカラム上の固定化された捕捉剤としてのＣＡ１７３４１を使用し、剥離剤としてのＣＡ１７３０２により溶出させる、ＦｍｌＨ－レクチン－ｍＣｈｅｒｒｙ－ｈｉｓのアフィニティー精製を示す図である。ＮＡＮＥＸによるｍＣｈｅｒｒｙの精製のために、１ｍｇのＣＡ１７３４１（中アフィニティーの捕捉剤）を、ＨｉＴｒａｐＮＨＳ－ａｃｔｉｖａｔｅｄＳｅｐｈａｒｏｓｅＨＰカラム（１ｍＬ）上の捕捉剤として固定化した。組換えＦｍｌＨ－レクチン－ｍＣｈｅｒｒｙ－ｈｉｓは、１ｍＭのＩＰＧＴを使用して、２８℃において、一晩にわたる誘導により、ＢＬ２１発現株内において発現させた。２Ｌの細菌ペレットを、５０ｍＬの再懸濁緩衝液（２５ｍＭのＨＥＰＥＳｐＨ７．５、１５０ｍＭのＮａＣｌ）中に溶解させ、遠心分離及び濾過により清澄化させた。次いで、この細菌溶解物を、手動により、ＮＡＮＥＸカラムに注入した。ロードされたＣＡ１７３４１－カラムを、手動において、１０ＣＶの緩衝液（１００ｍＭのＨｅｐｅｓｐＨ７．５、１５０ｍＭのＮａＣｌ）により２回にわたり洗浄してから、カラムを、ＡｋｔａＰｕｒｅへと回収し、次いで、これに続き、１ｍｇの剥離剤であるＣＡ１７３０２を注入した。（Ａ）この剥離剤による、ＦｍｌＨ－レクチン－ｍＣｈｅｒｒｙ－ｈｉｓの溶出を、２８０ｎｍにおける吸光度（タンパク質による吸光度）及び５８５ｎｍにおける吸光度（ｍＣｈｅｒｒｙによる吸光度）を追跡することによりモニタリングした。左側の高ピークは、剥離剤（ＣＡ１７３０２）の注入時に溶出した。右ピークは、ｐＨ２．３における、２００ｍＭのグリシンによる再生時に溶出した。（Ｂ）分子量マーカー（ＰａｇｅＲｕｌｅｒ（商標）ＰｒｅｓｔａｉｎｅｄＰｒｏｔｅｉｎＬａｄｄｅｒ）による、異なる精製画分についてのＳＤＳ－ＰＡＧＥである。アステリスク（^＊）：ＦｍｌＨ＿ｌｅｃｔｉｎ＿ｍＣｈｅｒｒｙ＿ｈｉｓタンパク質である。中アフィニティーの捕捉剤としての第ＩＸ因子特異的ナノボディー（ＣＡ１１１４３）及び剥離剤としてのＭｅｇａＢｏｄｙであるＣＡ１６３８３を使用する、ヒト血清からの、天然ヒト凝固第ＩＸ因子の、ＮＡＮＥＸによる精製を示す図である。ＮＡＮＥＸによる天然ヒト凝固第ＩＸ因子の精製のために、ＣＡ１１１４３（中アフィニティーの捕捉剤）を、ＨｉＴｒａｐＮＨＳ－ａｃｔｉｖａｔｅｄＳｅｐｈａｒｏｓｅＨＰカラム（１ｍＬ）上の捕捉剤として固定化した。クエン酸デキストロース（ＡＣＤ）抗凝固剤により処理された、３０ｍＬのヒト全血由来血漿を、再循環により、１２０分間にわたり、このＮＡＮＥＸカラム上にロードした。ロードされたＣＡ１１１４３－カラムを、１５ＣＶの緩衝液（２０ｍＭのＨｅｐｅｓ、ｐＨ８．０、１５０ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＣａＣｌ_２）により洗浄するのに続き、ＭｅｇａＢｏｄｙであるＣＡ１６３８３を注入した。（Ａ）この剥離剤による、天然ヒト凝固第ＩＸ因子の溶出を、２８０ｎｍにおける吸光度を追跡することによりモニタリングした。左側の高ピークは、剥離剤（ＣＡ１６３８３）の注入時に溶出した。右ピークは、ｐＨ２．３における、２００ｍＭのグリシンの添加時に溶出した。（Ｂ）代表的な精製画分についてのＳＤＳ－ＰＡＧＥである。（Ｃ）これらの画分についてのウェスタンブロットである。ＭＷ：分子量マーカー（ＰａｇｅＲｕｌｅｒ（商標）ＰｒｅｓｔａｉｎｅｄＰｒｏｔｅｉｎＬａｄｄｅｒ）であり；アステリスク（^＊）：市販の天然ヒト凝固第ＩＸ因子（対照として使用した）である。中アフィニティーの捕捉剤としての第ＩＸ因子特異的ナノボディー（ＣＡ１１１４３）及び剥離剤としてのＭｅｇａＢｏｄｙであるＣＡ１６３８３を使用する、ヒト血清からの、天然ヒト凝固第ＩＸ因子の、ＮＡＮＥＸによる精製を示す図である。ＮＡＮＥＸによる天然ヒト凝固第ＩＸ因子の精製のために、ＣＡ１１１４３（中アフィニティーの捕捉剤）を、ＨｉＴｒａｐＮＨＳ－ａｃｔｉｖａｔｅｄＳｅｐｈａｒｏｓｅＨＰカラム（１ｍＬ）上の捕捉剤として固定化した。クエン酸デキストロース（ＡＣＤ）抗凝固剤により処理された、３０ｍＬのヒト全血由来血漿を、再循環により、１２０分間にわたり、このＮＡＮＥＸカラム上にロードした。ロードされたＣＡ１１１４３－カラムを、１５ＣＶの緩衝液（２０ｍＭのＨｅｐｅｓ、ｐＨ８．０、１５０ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＣａＣｌ_２）により洗浄するのに続き、ＭｅｇａＢｏｄｙであるＣＡ１６３８３を注入した。（Ａ）この剥離剤による、天然ヒト凝固第ＩＸ因子の溶出を、２８０ｎｍにおける吸光度を追跡することによりモニタリングした。左側の高ピークは、剥離剤（ＣＡ１６３８３）の注入時に溶出した。右ピークは、ｐＨ２．３における、２００ｍＭのグリシンの添加時に溶出した。（Ｂ）代表的な精製画分についてのＳＤＳ－ＰＡＧＥである。（Ｃ）これらの画分についてのウェスタンブロットである。ＭＷ：分子量マーカー（ＰａｇｅＲｕｌｅｒ（商標）ＰｒｅｓｔａｉｎｅｄＰｒｏｔｅｉｎＬａｄｄｅｒ）であり；アステリスク（^＊）：市販の天然ヒト凝固第ＩＸ因子（対照として使用した）である。中アフィニティーの捕捉剤としてのＭｅｇａＢｏｄｙであるＣＡ１６３８８及び剥離剤としてのＭｅｇａＢｏｄｙであるＣＡ１６３８３を使用する、天然ヒト凝固第ＩＸ因子の、ＮＡＮＥＸによる精製を示す図である。ＮＡＮＥＸによる天然ヒト凝固第ＩＸ因子の精製のために、ＭｅｇａＢｏｄｙであるＣＡ１６３８８を、ＨｉＴｒａｐＮＨＳ－ａｃｔｉｖａｔｅｄＳｅｐｈａｒｏｓｅＨＰカラム（１ｍＬ）上の中アフィニティーの捕捉剤として固定化した。ＡＣＤ抗凝固剤により処理された、３０ｍＬのヒト全血由来血漿を、再循環により、６０分間にわたり、このＮＡＮＥＸカラム上にロードした。ロードされたＣＡ１６３８８－カラムを、１５ＣＶの緩衝液（２０ｍＭのＨｅｐｅｓ、ｐＨ８．０、１５０ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＣａＣｌ_２）により洗浄するのに続き、ＭｅｇａＢｏｄｙの剥離剤であるＣＡ１６３８３を注入した。（Ａ）この剥離剤による、天然ヒト凝固第ＩＸ因子の溶出を、２８０ｎｍにおける吸光度を追跡することによりモニタリングした。左側の高ピークは、剥離剤（ＣＡ１６３８３）の注入時に溶出した。右ピークは、ｐＨ２．３における、２００ｍＭのグリシンの添加時に溶出した。（Ｂ）代表的な精製画分についてのＳＤＳ－ＰＡＧＥである。（Ｃ）これらの画分についてのウェスタンブロットである。ＭＷ：分子量マーカー（ＰａｇｅＲｕｌｅｒ（商標）ＰｒｅｓｔａｉｎｅｄＰｒｏｔｅｉｎＬａｄｄｅｒであり；アステリスク（^＊）：市販の天然ヒト凝固第ＩＸ因子（対照として使用した）である。中アフィニティーの捕捉剤としてのＭｅｇａＢｏｄｙであるＣＡ１６３８８及び剥離剤としてのＭｅｇａＢｏｄｙであるＣＡ１６３８３を使用する、天然ヒト凝固第ＩＸ因子の、ＮＡＮＥＸによる精製を示す図である。ＮＡＮＥＸによる天然ヒト凝固第ＩＸ因子の精製のために、ＭｅｇａＢｏｄｙであるＣＡ１６３８８を、ＨｉＴｒａｐＮＨＳ－ａｃｔｉｖａｔｅｄＳｅｐｈａｒｏｓｅＨＰカラム（１ｍＬ）上の中アフィニティーの捕捉剤として固定化した。ＡＣＤ抗凝固剤により処理された、３０ｍＬのヒト全血由来血漿を、再循環により、６０分間にわたり、このＮＡＮＥＸカラム上にロードした。ロードされたＣＡ１６３８８－カラムを、１５ＣＶの緩衝液（２０ｍＭのＨｅｐｅｓ、ｐＨ８．０、１５０ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＣａＣｌ_２）により洗浄するのに続き、ＭｅｇａＢｏｄｙの剥離剤であるＣＡ１６３８３を注入した。（Ａ）この剥離剤による、天然ヒト凝固第ＩＸ因子の溶出を、２８０ｎｍにおける吸光度を追跡することによりモニタリングした。左側の高ピークは、剥離剤（ＣＡ１６３８３）の注入時に溶出した。右ピークは、ｐＨ２．３における、２００ｍＭのグリシンの添加時に溶出した。（Ｂ）代表的な精製画分についてのＳＤＳ－ＰＡＧＥである。（Ｃ）これらの画分についてのウェスタンブロットである。ＭＷ：分子量マーカー（ＰａｇｅＲｕｌｅｒ（商標）ＰｒｅｓｔａｉｎｅｄＰｒｏｔｅｉｎＬａｄｄｅｒであり；アステリスク（^＊）：市販の天然ヒト凝固第ＩＸ因子（対照として使用した）である。固定化捕捉剤としてのＮｂＣＡ１５８１６及びＮｂである剥離剤としてのＣＡ１２６７０を使用する、トランスフェクトされたヒトＨＥＫ２９３Ｔ細胞からの、分子シャペロンと複合体化した、ＧＦＰタグ付けグルココルチコイド受容体（ＧＦＰ－ＧＲ）の精製を示す図である。ＮＡＮＥＸによるＧＦＰ－ＧＲの精製のために、ＣＡ１５８１６（中アフィニティーの捕捉剤）を、ＨｉＴｒａｐＮＨＳ－ａｃｔｉｖａｔｅｄＳｅｐｈａｒｏｓｅＨＰカラム（１ｍＬ）上の捕捉剤として固定化した。１０ｍＬの溶解物を、このＮＡＮＥＸカラムに注入した。ロードされたＣＡ１５８１６－カラムを、１０ＣＶの緩衝液（１００ｍＭのＨｅｐｅｓｐＨ７．５、１５０ｍＭのＮａＣｌ）により、２回にわたり洗浄するのに続き、１ｍｇの剥離剤であるＣＡ１２６７０を注入した。（Ａ）この剥離剤による、ＧＦＰ－ＧＲの溶出を、２８０ｎｍ及び４８８ｎｍにおける吸光度を追跡することによりモニタリングした。左側の高ピークは、剥離剤（ＣＡ１２６７０）の注入時に溶出した。右ピークは、ｐＨ２．３における、２００ｍＭのグリシンによる再生時に溶出した。（Ｂ）分子量マーカー（ＰａｇｅＲｕｌｅｒ（商標）ＰｒｅｓｔａｉｎｅｄＰｒｏｔｅｉｎＬａｄｄｅｒ）による、異なる精製画分についてのＳＤＳ－ＰＡＧＥである。（Ｃ）左：高分子量（１２０ＫＤａ、９０ＫＤａ及び７０ＫＤａ）の３つのバンドは、クーマシー染色において、目視可能である。これらのバンドを、質量分析により解析し、ＧＦＰ－ＧＲ（１２０ＫＤａ）、ＨＳＰ９０（９０ＫＤａ）及びＨＳＰ７０（７０ＫＤａ）であることを確認した。右：市販の抗ヒトグルココルチコイド受容体抗体（抗ＧＲＧ－５、ＳａｎｔａＣｒｕｚ）を、一次抗体として使用するウェスタンブロットは、１２０ＫＤａにおけるバンドが、ＧＦＰ－ＧＲであることを確認した。固定化捕捉剤としてのＮｂＣＡ１５８１６及びＮｂである剥離剤としてのＣＡ１２６７０を使用する、トランスフェクトされたヒトＨＥＫ２９３Ｔ細胞からの、分子シャペロンと複合体化した、ＧＦＰタグ付けグルココルチコイド受容体（ＧＦＰ－ＧＲ）の精製を示す図である。ＮＡＮＥＸによるＧＦＰ－ＧＲの精製のために、ＣＡ１５８１６（中アフィニティーの捕捉剤）を、ＨｉＴｒａｐＮＨＳ－ａｃｔｉｖａｔｅｄＳｅｐｈａｒｏｓｅＨＰカラム（１ｍＬ）上の捕捉剤として固定化した。１０ｍＬの溶解物を、このＮＡＮＥＸカラムに注入した。ロードされたＣＡ１５８１６－カラムを、１０ＣＶの緩衝液（１００ｍＭのＨｅｐｅｓｐＨ７．５、１５０ｍＭのＮａＣｌ）により、２回にわたり洗浄するのに続き、１ｍｇの剥離剤であるＣＡ１２６７０を注入した。（Ａ）この剥離剤による、ＧＦＰ－ＧＲの溶出を、２８０ｎｍ及び４８８ｎｍにおける吸光度を追跡することによりモニタリングした。左側の高ピークは、剥離剤（ＣＡ１２６７０）の注入時に溶出した。右ピークは、ｐＨ２．３における、２００ｍＭのグリシンによる再生時に溶出した。（Ｂ）分子量マーカー（ＰａｇｅＲｕｌｅｒ（商標）ＰｒｅｓｔａｉｎｅｄＰｒｏｔｅｉｎＬａｄｄｅｒ）による、異なる精製画分についてのＳＤＳ－ＰＡＧＥである。（Ｃ）左：高分子量（１２０ＫＤａ、９０ＫＤａ及び７０ＫＤａ）の３つのバンドは、クーマシー染色において、目視可能である。これらのバンドを、質量分析により解析し、ＧＦＰ－ＧＲ（１２０ＫＤａ）、ＨＳＰ９０（９０ＫＤａ）及びＨＳＰ７０（７０ＫＤａ）であることを確認した。右：市販の抗ヒトグルココルチコイド受容体抗体（抗ＧＲＧ－５、ＳａｎｔａＣｒｕｚ）を、一次抗体として使用するウェスタンブロットは、１２０ＫＤａにおけるバンドが、ＧＦＰ－ＧＲであることを確認した。固定化捕捉剤としてのＮｂＣＡ１５８１６及びＮｂである剥離剤としてのＣＡ１２６７０を使用する、トランスフェクトされたヒトＨＥＫ２９３Ｔ細胞からの、分子シャペロンと複合体化した、ＧＦＰタグ付けアンドロゲン受容体（ＧＦＰ－ＡＲｂ）の、精製を示す図である。ＮＡＮＥＸによるＧＦＰ－ＡＲｂの精製のために、ＣＡ１５８１６（中アフィニティーの捕捉剤）を、ＨｉＴｒａｐＮＨＳ－ａｃｔｉｖａｔｅｄＳｅｐｈａｒｏｓｅＨＰカラム（１ｍＬ）上の捕捉剤として固定化した。１０ｍＬの溶解物を、このＮＡＮＥＸカラムに注入した。ロードされたＣＡ１５８１６－カラムを、１０ＣＶの緩衝液（１００ｍＭのＨｅｐｅｓｐＨ７．５、１５０ｍＭのＮａＣｌ）により、２回にわたり洗浄するのに続き、１ｍｇの剥離剤であるＣＡ１２６７０を注入した。（Ａ）この剥離剤による、ＧＦＰ－ＧＲの溶出を、２８０ｎｍ及び４８８ｎｍにおける吸光度を追跡することによりモニタリングした。左側の高ピークは、剥離剤（ＣＡ１２６７０）の注入時に溶出した。右ピークは、ｐＨ２．３における、２００ｍＭのグリシンによる再生時に溶出した。（Ｂ）分子量マーカー（ＰａｇｅＲｕｌｅｒ（商標）ＰｒｅｓｔａｉｎｅｄＰｒｏｔｅｉｎＬａｄｄｅｒ）による、異なる精製画分についてのＳＤＳ－ＰＡＧＥである。高分子量（１２８ＫＤａ、９０ＫＤａ及び７０ＫＤａ）の３つのバンドは、クーマシー染色において、目視可能である。これらのバンドを、質量分析により解析し、ＧＦＰ－ＡＲｂ（１２８ＫＤａ）、ＨＳＰ９０（９０ＫＤａ）及びＨＳＰ７０（７０ＫＤａ）であることを確認した。（Ｃ）市販の抗ＧＦＰ抗体（ＧＦＰモノクローナル抗体（Ｃ１６３）、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を、一次抗体として使用するウェスタンブロットは、１２８ＫＤａにおけるバンドが、ＧＦＰ－ＡＲｂであることを確認した。固定化捕捉剤としてのＮｂＣＡ１５８１６及びＮｂである剥離剤としてのＣＡ１２６７０を使用する、トランスフェクトされたヒトＨＥＫ２９３Ｔ細胞からの、分子シャペロンと複合体化した、ＧＦＰタグ付けアンドロゲン受容体（ＧＦＰ－ＡＲｂ）の、精製を示す図である。ＮＡＮＥＸによるＧＦＰ－ＡＲｂの精製のために、ＣＡ１５８１６（中アフィニティーの捕捉剤）を、ＨｉＴｒａｐＮＨＳ－ａｃｔｉｖａｔｅｄＳｅｐｈａｒｏｓｅＨＰカラム（１ｍＬ）上の捕捉剤として固定化した。１０ｍＬの溶解物を、このＮＡＮＥＸカラムに注入した。ロードされたＣＡ１５８１６－カラムを、１０ＣＶの緩衝液（１００ｍＭのＨｅｐｅｓｐＨ７．５、１５０ｍＭのＮａＣｌ）により、２回にわたり洗浄するのに続き、１ｍｇの剥離剤であるＣＡ１２６７０を注入した。（Ａ）この剥離剤による、ＧＦＰ－ＧＲの溶出を、２８０ｎｍ及び４８８ｎｍにおける吸光度を追跡することによりモニタリングした。左側の高ピークは、剥離剤（ＣＡ１２６７０）の注入時に溶出した。右ピークは、ｐＨ２．３における、２００ｍＭのグリシンによる再生時に溶出した。（Ｂ）分子量マーカー（ＰａｇｅＲｕｌｅｒ（商標）ＰｒｅｓｔａｉｎｅｄＰｒｏｔｅｉｎＬａｄｄｅｒ）による、異なる精製画分についてのＳＤＳ－ＰＡＧＥである。高分子量（１２８ＫＤａ、９０ＫＤａ及び７０ＫＤａ）の３つのバンドは、クーマシー染色において、目視可能である。これらのバンドを、質量分析により解析し、ＧＦＰ－ＡＲｂ（１２８ＫＤａ）、ＨＳＰ９０（９０ＫＤａ）及びＨＳＰ７０（７０ＫＤａ）であることを確認した。（Ｃ）市販の抗ＧＦＰ抗体（ＧＦＰモノクローナル抗体（Ｃ１６３）、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を、一次抗体として使用するウェスタンブロットは、１２８ＫＤａにおけるバンドが、ＧＦＰ－ＡＲｂであることを確認した。磁気ビーズを使用する、ハイスループットナノボディー交換クロマトグラフィーのために選び出された、１２のＧＦＰタグ付け酵母タンパク質についての情報を示す図である。このリストは、名称及び略号、酵母ＧＦＰクローンコレクションにおける参照番号（Ｈｕｈら、２００３）、ＧＦＰ融合タンパク質の分子量、細胞１つ当たりの分子数の推定値及び酵母培養物中において作製されるタンパク質の予測量を含む詳細情報を提示する。磁気トシル活性化Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）上の固定化捕捉剤としてのＮｂＣＡ１５８１６及び剥離剤としてのＮｂＣＡ１２７６０を使用する、酵母細胞溶解物からの、ＧＦＰ融合タンパク質の、ＮＡＮＥＸによる精製を示す図である。１２のＧＦＰ融合タンパク質を、酵母ＧＦＰクローンコレクション（Ｈｕｈら、２００３）に由来する、異なる酵母であるＳ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓａｅ）のクローンから発現させ、精製した。１ｍＬの培養物からの細胞ペレットを、透析用ＹｅａｓｔＰｒｏｔｅｉｎＥｘｔｒａｃｔｉｏｎＲｅａｇｅｎｔ（Ｙ－ＰＥＲ（商標）Ｐｌｕｓ）中において、１時間にわたり溶解させ、凍結－融解サイクルの後、スピニングした。９６ウェルフォーマットにおける磁気ビーズの操作に適する、ＫｉｎｇＦｉｓｈｅｒＦｌｅｘ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）装置を使用して、溶解物を加工した。製造元の指示書に従い、トシル活性化磁気Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）を、ビーズ１ｍｇ当たりの捕捉剤４０μｇの濃度において、捕捉剤であるＮｂＣＡ１５８１６とカップリングさせた。クローンごとに、溶液１ｍＬ当たり１００ｍｇのビーズ５μＬ（２０μｇのカップリング捕捉剤であるＣＡ１５８１６に対応する）を、使用した。精製ステップは、３０秒間にわたる、ビーズの前平衡化、３０分間にわたる、溶解物とのインキュベーション、１分間ずつ、３回にわたる洗浄及び濃度を０．５ｍｇ／ｍＬ（３３．３５ｕＭ）とする、４０μＬの剥離剤であるＮｂＣＡ１２７６０による、１５分間にわたる溶出を伴った。ＣＡ１５８１６－ビーズの試料を、溶出ステップの前に採取して、捕捉効率を追跡した。Ｃまでのパネルは、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ解析を表す：（Ａ）ＣＡ１５８１６－ビーズに結合したタンパク質である。（Ｂ）剥離剤であるＮｂＣＡ１２７６０を使用する、ＧＦＰ融合タンパク質の選択的溶出である。（Ｃ）溶出の後における、対応するＣＡ１５８１６－ビーズである。（Ｄ）一次抗体としてのマウス抗ＧＦＰモノクローナル抗体（Ｃ１６３、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）（Ｅ）二次抗体としてのヤギ抗マウスＩｇＧ－ＨＲＰコンジュゲート、及び（Ｆ）ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ（商標）ＷｅｓｔＡｔｔｏＵｌｔｉｍａｔｅＳｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙＳｕｂｓｔｒａｔｅｆｏｒｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅｄｅｔｅｃｔｉｏｎをそれぞれ使用して、ウェスタンブロット解析により、それらのそれぞれの分子量ごとに、異なるＧＦＰ融合タンパク質被験の存在を確認した。Ｍ＝分子量マーカー（ＰａｇｅＲｕｌｅｒ（商標）ＰｒｅｓｔａｉｎｅｄＰｒｏｔｅｉｎＬａｄｄｅｒ）である。磁気トシル活性化Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）上の固定化捕捉剤としてのＮｂＣＡ１５８１６及び剥離剤としてのＮｂＣＡ１２７６０を使用する、酵母細胞溶解物からの、ＧＦＰ融合タンパク質の、ＮＡＮＥＸによる精製を示す図である。１２のＧＦＰ融合タンパク質を、酵母ＧＦＰクローンコレクション（Ｈｕｈら、２００３）に由来する、異なる酵母であるＳ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓａｅ）のクローンから発現させ、精製した。１ｍＬの培養物からの細胞ペレットを、透析用ＹｅａｓｔＰｒｏｔｅｉｎＥｘｔｒａｃｔｉｏｎＲｅａｇｅｎｔ（Ｙ－ＰＥＲ（商標）Ｐｌｕｓ）中において、１時間にわたり溶解させ、凍結－融解サイクルの後、スピニングした。９６ウェルフォーマットにおける磁気ビーズの操作に適する、ＫｉｎｇＦｉｓｈｅｒＦｌｅｘ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）装置を使用して、溶解物を加工した。製造元の指示書に従い、トシル活性化磁気Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）を、ビーズ１ｍｇ当たりの捕捉剤４０μｇの濃度において、捕捉剤であるＮｂＣＡ１５８１６とカップリングさせた。クローンごとに、溶液１ｍＬ当たり１００ｍｇのビーズ５μＬ（２０μｇのカップリング捕捉剤であるＣＡ１５８１６に対応する）を、使用した。精製ステップは、３０秒間にわたる、ビーズの前平衡化、３０分間にわたる、溶解物とのインキュベーション、１分間ずつ、３回にわたる洗浄及び濃度を０．５ｍｇ／ｍＬ（３３．３５ｕＭ）とする、４０μＬの剥離剤であるＮｂＣＡ１２７６０による、１５分間にわたる溶出を伴った。ＣＡ１５８１６－ビーズの試料を、溶出ステップの前に採取して、捕捉効率を追跡した。Ｃまでのパネルは、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ解析を表す：（Ａ）ＣＡ１５８１６－ビーズに結合したタンパク質である。（Ｂ）剥離剤であるＮｂＣＡ１２７６０を使用する、ＧＦＰ融合タンパク質の選択的溶出である。（Ｃ）溶出の後における、対応するＣＡ１５８１６－ビーズである。（Ｄ）一次抗体としてのマウス抗ＧＦＰモノクローナル抗体（Ｃ１６３、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）（Ｅ）二次抗体としてのヤギ抗マウスＩｇＧ－ＨＲＰコンジュゲート、及び（Ｆ）ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ（商標）ＷｅｓｔＡｔｔｏＵｌｔｉｍａｔｅＳｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙＳｕｂｓｔｒａｔｅｆｏｒｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅｄｅｔｅｃｔｉｏｎをそれぞれ使用して、ウェスタンブロット解析により、それらのそれぞれの分子量ごとに、異なるＧＦＰ融合タンパク質被験の存在を確認した。Ｍ＝分子量マーカー（ＰａｇｅＲｕｌｅｒ（商標）ＰｒｅｓｔａｉｎｅｄＰｒｏｔｅｉｎＬａｄｄｅｒ）である。実施例２８において使用されたマイクロ流体チップについての詳細図である。全ての尺度は、ミリメートル（ｍｍ）単位である。実施例２８に記載される、マイクロ流体カラムの蛍光及びその溶出画分を示す図である。ＡからＦまでのパネル：倒立蛍光顕微鏡（オリンパス株式会社、ＩＸ７１ｍｏｄｅｌＩＸ７１Ｓ１Ｆ－３）を使用してモニタリングされる、ＮＡＮＥＸによる、ＧＦＰの精製のためのマイクロ流体チップ内に含有されるカラムからの蛍光画像である。下のパネル１．２．３．４．５．６．：青色光トランスイルミネーター（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を使用して、マイクロ流体デバイスから溶出させた、画分ａ．ｂ．ｃ．ｄ．ｅ．ｆ．を、目視により精査した。

本発明は、ある特定の図面を参照しながら、特定の実施形態について記載されるが、本発明は、これらに限定されず、特許請求の範囲だけにより限定される。特許請求の範囲内の、いかなる参照記号も、範囲を限定するものとしてみなされないものとする。当然ながら、全ての態様又は利点は、必ずしも、本発明のいかなる特定の実施形態に従っても達成されない場合があることが理解されるものとする。したがって、例えば、当業者は、本発明は、本明細書において教示又は示唆されうる他の態様又は利点を、必ずしも達成することなく、本明細書において教示される、１つの利点又は利点群を達成又は最適化する形において、実現又は実施される場合があることを認識する。本発明は、その特色及び利点と併せた、組織化及び操作法のいずれについても、付属の図面と共に読まれる場合に、以下の「発明を実施するための形態」を参照することにより最良に理解されうる。本発明の態様及び利点は、本明細書の下記において記載される実施形態から明らかとなり、これらを参照しながら解明される。本明細書を通して、「１つの実施形態」又は「実施形態」に対する言及は、実施形態との関連において記載される、特定の特色、構造又は特徴は、本発明の少なくとも１つの実施形態に含まれることを意味する。したがって、本明細書を通して、多様な箇所における、「一実施形態において」又は「ある実施形態において」という語句の出現は、必ずしも、全てが、同じ実施形態に言及するものではないが、同じ実施形態に言及する可能性もある。

定義
単数形の名詞に言及する場合に、不定冠詞又は定冠詞、例えば、「ある（ａ）」又は「ある（ａｎ）」、「その」が使用される場合、これは、何らかの別の事柄が具体的に言明されない限りにおいて、この名詞の複数形を含む。本記載及び特許請求の範囲において、「～を含むこと」という用語が使用される場合、これは、他の要素又はステップを除外しない。さらに、本記載及び特許請求の範囲において、「第１の」、「第２の」、「第３の」などの用語が、同様の要素を識別するために使用されるが、必ずしも、継起的順序又は時間的順序について記載するために使用されるわけではない。このようにして使用される用語は、適切な状況下において互換的であり、本明細書において記載される、本発明の実施形態は、本明細書において記載又は例示される配列以外の順序における操作が可能であることが理解されるものとする。以下の用語又は定義は、本発明の理解の一助とするためだけに提示される。本明細書において具体的に規定されない限りにおいて、本明細書において使用される全ての用語は、それらが、本発明の技術分野の当業者に対して有する意味と同じ意味を有する。実施者は、当技術分野の定義及び用語について、特に、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、「ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ」、４版、ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＰｒｅｓｓ、Ｐｌａｉｎｓｖｉｅｗ、ＮｅｗＹｏｒｋ（２０１２）；及びＡｕｓｕｂｅｌら、「ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ」、（増刊１１４号）、ＪｏｈｎＷｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、ＮｅｗＹｏｒｋ（２０１６）へと方向付けられる。そうでないことが規定されない限りにおいて、本明細書において使用される、全ての技術用語及び学術用語は、当業者（例えば、分子的生物学、生化学、構造的生物学及び／又は数理生物学）により一般に理解される意味と同じ意味を有する。

本明細書においてさらに、「タンパク質」、「ポリペプチド」及び「ペプチド」という用語は、アミノ酸残基のポリマー並びにこれらの変異体及び合成類似体を指すように、互換的に使用される。例えば、トリプシン消化の後における、その元のタンパク質に由来する、部分的アミノ酸配列もまた、「ペプチド」と称される場合がある。したがって、これらの用語は、１つ以上のアミノ酸残基が、対応する天然に存在するアミノ酸の化学的類似体など、合成の天然に存在しないアミノ酸であるアミノ酸ポリマーのほか、天然に存在するアミノ酸ポリマーに適用される。この用語はまた、とりわけ、当技術分野において公知の、グリコシル化、リン酸化、ユビキチン化、スモイル化及びアセチル化など、ポリペプチドの翻訳後修飾も含む。アミノ酸の配列及び修飾に基づき、ポリペプチドの原子量又は分子量は、（キロ）ダルトン（ｋＤａ）単位において表される。「単離」又は「精製」とは、その天然状態において通常それに随伴する成分を、実質的に含有しない又は本質的に含有しない材料を意味する。例えば、「単離ポリペプチド」又は「精製ポリペプチド」とは、天然に存在する状態においてそれに隣接する分子から精製されたポリペプチド、例えば、ポリペプチドと隣接する作製用宿主など、試料中又は混合物中に存在する分子から除去された、本明細書において同定及び開示される抗体又はナノボディーを指す。単離タンパク質又は単離ペプチドは、アミノ酸の化学合成により作出される場合もあり、組換え作製又は複合試料からの精製により作出される場合もある。

タンパク質の「相同体」、「複数の相同体」は、問題の非修飾タンパク質と比べて、アミノ酸の置換、欠失及び／又は挿入を有し、かつ、それらが由来する非修飾タンパク質と同様の生物学的機能的活性を有する、ペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチド、タンパク質及び酵素を包含する。本明細書において使用される、「アミノ酸同一性」という用語は、配列が、比較ウィンドウにわたり、アミノ酸の一対一対応ベースにおいて同一である程度を指す。したがって、「配列同一性の百分率」は、比較ウィンドウにわたり、最適にアライメントされた、２つの配列を比較し、両方の配列において、同一なアミノ酸残基（例えば、本明細書においてまた、１文字コードにおいても指し示される、Ａｌａ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｇｌｙ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｃｙｓ及びＭｅｔ）が生じる位置の数を決定して、マッチした位置の数をもたらし、マッチした位置の数を、比較ウィンドウにおける位置の総数（すなわち、ウィンドウのサイズ）により除し、結果に、１００を乗じて、配列同一性の百分率をもたらすことにより計算される。本明細書において使用される、「置換」又は「突然変異」又は「変異体」は、１つ以上のアミノ酸又はヌクレオチドそれぞれの、親タンパク質又はその断片のアミノ酸配列又はヌクレオチド配列と比較して異なる、アミノ酸又はヌクレオチドによる置きかえから生じる。タンパク質又はその断片は、タンパク質の活性に対して、実質的な作用を及ぼさない、保存的アミノ酸置換を有しうることが理解される。

「～に結合すること」とは、直接的なものであれ、間接的なものであれ、任意の相互作用を意味する。直接的相互作用は、結合パートナーの間の接触を含意する。間接的相互作用は、相互作用パートナーが、２つを超える分子の複合体内において相互作用する、任意の相互作用を意味する。相互作用は、１つ以上の架橋分子を一助として、完全に間接的な場合もあり、部分的に間接的な場合もあり、この場合、パートナーの間に、なおも直接的な接触が存在し、これらが、１つ以上の分子の、さらなる相互作用により安定化される。本明細書において使用される、「～に特異的に結合する」という用語は、特異的標的タンパク質又は特異的標的の構成要素又は分子を認識するが、試料中の他の分子を実質的に認識したり、これらに実質的に結合したりしない結合性ドメインを意味する。特異的結合は、排他的結合を意味しない。しかし、特異的結合は、タンパク質が、それらの結合剤のうちの１つ以上に対するアフィニティーを、ある程度増大させている、又はこれらに対する優先性を有することを意味する。本明細書において使用される、「アフィニティー」という用語は、一般に、リガンド、化学的、タンパク質又はペプチドが、単一のタンパク質単量体による平衡を、それらの結合により形成される複合体の存在へとシフトさせるように、別の（標的）タンパク質又はペプチドに結合する程度を指す。アフィニティーとは、単一分子の、そのリガンドへの結合の強度である。アフィニティーは、典型的に、二分子間相互作用の強度を査定し、これらの順位をランク付けするのに使用される、平衡解離定数（Ｋ_Ｄ）により測定され、報告される。抗体の、その抗原への結合は、可逆的過程であり、結合反応速度は、試薬の濃度に比例する。平衡において、［抗体］－［抗原］間複合体形成の速度は、その構成要素である、［抗体］＋［抗原］への解離速度と等しい。反応速度定数の測定は、平衡定数又はアフィニティー定数（１／Ｋ_Ｄ）を規定するのに使用されうる。手短に述べると、Ｋ_Ｄ値が小さいほど、抗体の、その標的に対するアフィニティーは大きくなる。反応の両方向についての速度定数は、以下の通りに称される：会合反応速度定数（Ｋ_ｏｎ）は、「オン速度」（Ｋ_ｏｎ）を計算するのに使用される反応項であり、抗体が、その標的に、どのくらい急速に結合するのかを特徴付けるのに使用される定数である。逆に、解離反応速度定数（Ｋ_ｏｆｆ）は、「オフ速度」（Ｋ_ｏｆｆ）を計算するのに使用される反応項であり、抗体が、その標的から、どのくらい急速に解離するのかを特徴付けるのに使用される定数である。本明細書に示される測定値において、傾きが平坦であるほど、オフ速度は緩徐である又は抗体の結合は強い。逆に、急激な降下は、オフ速度が急速であり、抗体の結合が弱いことを指し示す。実験により測定されたオフ速度及びオン速度の比（Ｋ_ｏｆｆ／Ｋ_ｏｎ）は、Ｋ_Ｄ値を計算するのに使用される。当業者に、オン速度及びオフ速度を測定し、それについてＫ_Ｄ（下記及び実施例を参照されたい）を計算するための、いくつかの決定法が公知であり、これらは、したがって、標準誤差を考慮に入れ、使用されるアッセイに依存しない値として検討される。

本明細書において使用される、「タンパク質複合体」又は「複合体」又は「アセンブルされたタンパク質」という用語とは、高分子のうちの少なくとも１つがタンパク質である、２つ以上の会合高分子の群を指す。本明細書において使用される、タンパク質複合体は、典型的に、生理学的条件下において形成されうる、高分子の会合体を指す。タンパク質複合体の個々のメンバーは、非共有結合的相互作用により連結される。タンパク質複合体は、タンパク質だけによる、非共有結合的相互作用体、例えば、２つのタンパク質、３つのタンパク質、４つのタンパク質などによる、非共有結合的相互作用体、より具体的に述べると、タンパク質結合剤と、任意選択的に、他のタンパク質又は化合物をそれに結合させた、標的タンパク質との複合体でありうるので、タンパク質間複合体と称されうる。

「結合剤」は、別の分子に結合することが可能な分子に関し、この場合、結合は、好ましくは、規定された結合性部位、ポケット又はエピトープを認識する、特異的結合である。結合剤は、任意の性質又は種類の結合剤であることが可能であり、その由来に依存しない。結合剤は、化学合成される場合もあり、天然に存在する場合もあり、組換えにより作製され（かつ、精製される）場合もあるほか、デザインされ、合成により作製される場合もある。よって、結合剤は、低分子、化学物質、ペプチド、ポリペプチド、抗体又はとりわけ、ペプチド模倣体、抗体の模倣体、活性断片、化学的誘導体など、これらの任意の誘導体でありうる。好ましくは、結合剤は、本明細書において記載される方法におけるタンパク質結合剤である。「結合性ポケット」又は「結合性部位」という用語は、その形状及び電荷の結果として、別の化学的実体、化合物、タンパク質、ペプチド、抗体、ＩＳＶＤ又はＮｂと、優先的に会合する、分子又は分子複合体の領域を指す。「ポケット」という用語は、クレフト、チャネル又は部位を含むがこれらに限定されない。本明細書において互換的に使用される、「結合性ポケット／部位／エピトープの部分」又は「重複エピトープ」という用語は、結合性ポケット又は結合性部位又はエピトープを規定するアミノ酸残基の全てに満たないアミノ酸残基を指す。例えば、残基の部分は、リガンドへの結合において役割を果たす、鍵となる残基の場合もあり、空間的に関連し、結合性ポケットの三次元コンパートメントを規定する残基の場合もある。残基は、一次配列において、連続的な場合もあり、非連続的な場合もある。抗体類縁分子について、本明細書において互換的に使用される結合性部位について記載するのに、「エピトープ」という用語もまた使用される。本明細書において使用される、「隣接する」結合性部位又は「最小部分において重複する」結合性部位とは、それぞれ、「重複しない（が、近接部位に結合する）アミノ酸」又は結合性アミノ酸残基内における、最大約３０％の重複を指す。「エピトープ」とは、細胞の外側において、アクセス可能なエピトープ又は結合性部位である、標的タンパク質分子上の結合性部位又は結合性ポケットを構成する、ポリペプチドの抗原決定基を指す。エピトープは、エピトープに固有な、空間的コンフォメーション内の３つのアミノ酸を含みうる。一般に、エピトープは、少なくとも４、５、６、７つのこのようなアミノ酸からなり、より通例において、少なくとも８、９、１０つのこのようなアミノ酸からなる。当技術分野において、アミノ酸の空間コンフォメーションを決定する方法が公知であり、例えば、Ｘ線結晶構造解析、多次元核磁気共鳴、クライオＥＭ水素－重水素交換（ＨＤＸ）－ＭＳ並びにクロスリンキング質量分析（ＸＬ－ＭＳ）、エピトープビニング又は、それほど使用されないが、中性子散乱、Ｘ線自由電子レーザー（ＸＦＥＬ）又は小角中性子散乱（ＳＡＮＳ）及び小角Ｘ線散乱（ＳＡＸＳ）技術もまたを含む。本明細書において使用される、「コンフォメーションエピトープ」は、フォールディングしたポリペプチドの三次元コンフォメーションに固有な空間コンフォメーション内のアミノ酸を含むエピトープを指す。一般に、コンフォメーションエピトープは、直鎖状配列内において不連続であるが、タンパク質のフォールディング構造内において一体となるアミノ酸からなる。しかし、コンフォメーションエピトープはまた、フォールディングしたポリペプチドの三次元コンフォメーションに固有な（かつ、変性状態において存在しない）コンフォメーションを採る、アミノ酸の直鎖状配列からなる場合もある。タンパク質複合体内において、コンフォメーションエピトープは、１つ以上のポリペプチドの直鎖状配列内において不連続であるが、フォールディングする異なるポリペプチドのフォールディング時に、それらが固有な四次構造において会合すると一体となるアミノ酸からなる。同様に、コンフォメーションエピトープはまた、一体となり、四次構造に固有なコンフォメーションを採る、１つ以上のポリペプチドの、アミノ酸の直鎖状配列からなる場合もある。タンパク質の「コンフォメーション」又は「コンフォメーション状態」という用語は、一般に、タンパク質が、任意の瞬間に採りうる、ある範囲の構造を指す。当業者は、コンフォメーション又はコンフォメーション状態の決定基が、タンパク質のアミノ酸配列（修飾アミノ酸を含む）に反映される、タンパク質の一次構造及びタンパク質を取り巻く環境を含むことを認識する。タンパク質のコンフォメーション又はコンフォメーション状態はまた、構造的特色など、タンパク質の二次構造（例えば、とりわけ、αヘリックス、βシート）、三次構造（例えば、ポリペプチド鎖の三次元フォールディング）及び四次構造（例えば、ポリペプチド鎖の、他のタンパク質サブユニットとの相互作用）にも関する。とりわけ、リガンドの結合、リン酸化、硫酸化、グリコシル化、ユビキチン化など又は疎水性基の接合など、ポリペプチド鎖に対する、翻訳後修飾及び他の修飾は、タンパク質のコンフォメーションに影響を与えうる。さらに、とりわけ、周囲溶液の温度、ｐＨ値、塩濃度、イオン強度及び浸透圧並びに他のタンパク質及び補因子との相互作用などの環境因子又は環境条件は、タンパク質のコンフォメーション及び結合特性に影響を及ぼしうる。タンパク質のコンフォメーション状態は、他の方法の中において、活性又は別の分子への結合についての機能アッセイにより決定される場合もあり、Ｘ線結晶構造解析、ＮＭＲ又はスピン標識化など、物理的方法により決定される場合もある。タンパク質のコンフォメーション及びコンフォメーション状態の一般的な議論については、Ｃａｎｔｏｒ及びＳｃｈｉｍｍｅｌ、「ＢｉｏｐｈｙｓｉｃａｌＣｈｅｍｉｓｔｒｙ」、Ｉ部：「ＴｈｅＣｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎｏｆＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＭａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ」、Ｗ．Ｈ．ＦｒｅｅｍａｎａｎｄＣｏｍｐａｎｙ、１９８０；並びにＣｒｅｉｇｈｔｏｎ、「Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：ＳｔｒｕｃｔｕｒｅｓａｎｄＭｏｌｅｃｕｌａｒＰｒｏｐｅｒｔｉｅｓ」、Ｗ．Ｈ．ＦｒｅｅｍａｎａｎｄＣｏｍｐａｎｙ、１９９３が参照される。

本明細書において使用される、「抗体」、「抗体断片」及び「活性の抗体断片」という用語は、抗原又は標的タンパク質エピトープに特異的に結合することが可能な、免疫グロブリン（Ｉｇ）ドメイン又は抗原結合性ドメインを含むタンパク質を指す。「抗体」は、さらに、天然供給源又は組換え供給源に由来する、無傷の免疫グロブリンである場合があり、無傷の免疫グロブリンの免疫反応性部分でありうる。抗体は、典型的に、免疫グロブリン分子の四量体である。「活性の抗体断片」という用語は、それ自体、抗原決定基又はエピトープに対する高アフィニティーを有し、このような特異性の一因となる、１つ以上のＣＤＲを含有する、任意の抗体又は抗体様構造の部分を指す。非限定例は、免疫グロブリンドメイン、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ）’２、ｓｃＦｖ、重鎖－軽鎖二量体、免疫グロブリン単一可変ドメイン（ＩＳＶＤ）、ナノボディー、ドメイン抗体及び完全軽鎖又は完全重鎖などの単鎖構造を含む。本発明に照らした、断片の「活性」のためのさらなる要件は、断片が、標的エピトープに特異的に結合することが可能であることである。「免疫グロブリン（Ｉｇ）ドメイン」、又はより具体的に、「免疫グロブリン可変ドメイン」（「ＩＶＤ」と略記される）という用語は、当技術分野及び本明細書の下記において、それぞれ、「フレームワーク領域１」又は「ＦＲ１」；「フレームワーク領域２」又は「ＦＲ２」；「フレームワーク領域３」又は「ＦＲ３」及び「フレームワーク領域４」又は「ＦＲ４」と称される、４つの「フレームワーク領域」であって、当技術分野及び本明細書の下記において、それぞれ、「相補性決定領域１」又は「ＣＤＲ１」；「相補性決定領域２」又は「ＣＤＲ２」及び「相補性決定領域３」又は「ＣＤＲ３」と称される、３つの「相補性決定領域」又は「ＣＤＲ」により中断されるフレームワーク領域から本質的になる免疫グロブリンドメインを意味する。したがって、免疫グロブリン可変ドメインの一般構造又は配列は、以下：ＦＲ１－ＣＤＲ１－ＦＲ２－ＣＤＲ２－ＦＲ３－ＣＤＲ３－ＦＲ４の通りに指し示されうる。抗原結合性部位を保有することにより、抗体へと、抗原に対する特異性を付与するのは、免疫グロブリン可変ドメイン（ＩＶＤ）である。典型的に、モノクローナル抗体など、従来の免疫グロブリンにおいて、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）と、軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）とは、相互作用して、抗原結合性部位を形成する。この場合に、ＶＨ及びＶＬの両方の相補性決定領域（ＣＤＲ）は、抗原結合性部位に寄与する、すなわち、合計６つのＣＤＲが、抗原結合性部位の形成に関与する。上記の定義を念頭に置くと、従来の４鎖抗体（当技術分野において公知の、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ又はＩｇＥ分子など）又はこのような従来の４鎖抗体に由来する、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、ジスルフィド連結されたＦｖ断片などのＦｖ断片若しくはｓｃＦｖ断片若しくはダイアボディー（全ての当技術分野において公知である）の抗原結合性ドメインは、軽鎖可変ドメイン及び重鎖可変ドメインなど、（会合した）免疫グロブリンドメインの対により、すなわち、一体となって、それぞれの抗原のエピトープに結合する、免疫グロブリンドメインのＶＨ－ＶＬ対により、抗原のそれぞれのエピトープに結合する。本明細書において使用される、免疫グロブリン単一可変ドメイン（ＩＳＶＤ）とは、ＦＲ１－ＣＤＲ１－ＦＲ２－ＣＤＲ２－ＦＲ３－ＣＤＲ３－ＦＲ４のフォーマットに従う、４つのフレームワーク領域（ＦＲ）及び３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含むアミノ酸配列、抗原又はエピトープへの結合に十分なタンパク質ドメインを含有し、これにより、その標的エピトープとの相互作用のために、３つのＣＤＲループ領域だけを要求するアミノ酸配列を伴うタンパク質を指す。本明細書において記載されるＩＳＶＤの「活性断片」は、この断片が由来するＩＳＶＤと同一又は同様の形において、エピトープに特異的に結合するのに十分な、ＩＳＶＤの部分として規定される。本発明の「免疫グロブリンドメイン」はまた、「単一可変ドメイン」及び「単一ドメイン抗体」という用語と同義である、「免疫グロブリン単一可変ドメイン」（「ＩＳＶＤ」と略記される）も指し、抗原結合性部位が、単一の免疫グロブリンドメイン上に存在し、これにより形成される分子を規定する。これは、免疫グロブリン単一可変ドメインを、２つの免疫グロブリンドメイン、特に、２つの可変ドメインが、相互作用して、抗原結合性部位を形成する、「従来の」免疫グロブリン又はこれらの断片とは別に定める。免疫グロブリン単一可変ドメインの結合性部位は、単一のＶＨ／ＶＨＨドメイン又はＶＬドメインにより形成される。よって、免疫グロブリン単一可変ドメインの抗原結合性部位は、３つ以下のＣＤＲにより形成される。このように、単一可変ドメインは、単一の抗原結合性単位（すなわち、単一の抗原結合性ドメインが、別の可変ドメインと相互作用して、機能的抗原結合性単位を形成する必要がないように、単一可変ドメインから本質的になる、機能的抗原結合性単位）を形成することが可能である限りにおいて、軽鎖可変ドメイン配列（例えば、ＶＬ－配列）又はその適切な断片の場合もあり、重鎖可変ドメイン配列（例えば、ＶＨ－配列又はＶＨＨ配列）又はその適切な断片の場合もある。

特に、免疫グロブリン単一可変ドメインは、ナノボディー（本明細書において規定される）又はその適切な断片でありうる。注：Ｎａｎｏｂｏｄｙ（登録商標）、Ｎａｎｏｂｏｄｉｅｓ（登録商標）及びＮａｎｏｃｌｏｎｅ（登録商標）とは、ＡｂｌｙｎｘＮ．Ｖ．（ＳａｎｏｆｉＣｏｍｐａｎｙ）の登録商標である。ナノボディーの一般的記載については、さらなる下記の記載並びに、例えば、ＷＯ２００８／０２００７９において記載されている先行技術など、本明細書において引用される先行技術が参照される。ＶＨＨ、ＶＨＨドメイン、ＶＨＨ抗体断片及びＶＨＨ抗体としてもまた公知の「ＶＨＨドメイン」は、元来、「重鎖抗体」（すなわち、「軽鎖を欠いた抗体」；Ｈａｍｅｒｓ－Ｃａｓｔｅｒｍａｎら（１９９３）、Ｎａｔｕｒｅ、３６３：４４６～４４８）の、抗原結合性免疫グロブリン（Ｉｇ）（可変）ドメインとして記載されている。「ＶＨＨドメイン」という用語は、これらの可変ドメインを、従来の４鎖抗体内に存在する重鎖可変ドメイン（本明細書において、「ＶＨドメイン」と称される）及び従来の４鎖抗体内に存在する軽鎖可変ドメイン（本明細書において、「ＶＬドメイン」と称される）と識別するために選び出されている。ＶＨＨ及びナノボディーのさらなる記載について、Ｍｕｙｌｄｅｒｍａｎｓによる総説論文（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、７４：２７７～３０２、２００１における総説）並びに一般的背景技術として言及される、以下の特許出願：ＶｒｉｊｅＵｎｉｖｅｒｓｉｔｅｉｔＢｒｕｓｓｅｌによるＷＯ９４／０４６７８、ＷＯ９５／０４０７９及びＷＯ９６／３４１０３；ＵｎｉｌｅｖｅｒによるＷＯ９４／２５５９１、ＷＯ９９／３７６８１、ＷＯ００／４０９６８、ＷＯ００／４３５０７、ＷＯ００／６５０５７、ＷＯ０１／４０３１０、ＷＯ０１／４４３０１、ＥＰ１１３４２３１及びＷＯ０２／４８１９３；ＶｌａａｍｓＩｎｓｔｉｔｕｕｔｖｏｏｒＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅ（ＶＩＢ）によるＷＯ９７／４９８０５、ＷＯ０１／２１８１７、ＷＯ０３／０３５６９４、ＷＯ０３／０５４０１６及びＷＯ０３／０５５５２７；ＡｌｇｏｎｏｍｉｃｓＮ．Ｖ．及びＡｂｌｙｎｘＮ．Ｖ．によるＷＯ０３／０５０５３１；ＮａｔｉｏｎａｌＲｅｓｅａｒｃｈＣｏｕｎｃｉｌｏｆＣａｎａｄａによるＷＯ０１／９０１９０；ＩｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓによるＷＯ０３／０２５０２０（＝ＥＰ１４３３７９３）；ＡｂｌｙｎｘＮ．Ｖ．によるＷＯ０４／０４１８６７、ＷＯ０４／０４１８６２、ＷＯ０４／０４１８６５、ＷＯ０４／０４１８６３、ＷＯ０４／０６２５５１、ＷＯ０５／０４４８５８、ＷＯ０６／４０１５３、ＷＯ０６／０７９３７２、ＷＯ０６／１２２７８６、ＷＯ０６／１２２７８７及びＷＯ０６／１２２８２５並びにＡｂｌｙｎｘＮ．Ｖ．によるさらなる特許出願公開が参照される。これらの参考文献において記載される通り、ナノボディー（特に、ＶＨＨ配列及び部分ヒト化ナノボディー）は、特に、フレームワーク配列のうちの１つ以上における、１つ以上の「ホールマーク残基」の存在により特徴づけられうる。ナノボディーのヒト化及び／又はラクダ化並びに他の修飾、部分又は断片、誘導体又は「ナノボディー融合体」、多価構築物又は多特異的構築物（リンカー配列の一部の非限定例を含む）並びにナノボディーの半減期を延長する、異なる修飾並びにこれらの調製物を含むナノボディーについてのさらなる記載は、例えば、ＷＯ０８／１０１９８５及びＷＯ０８／１４２１６４において見出されうる。ナノボディーは、全長抗体の結合アフィニティー及び結合特異性を完全に保持する、最小の抗原結合性断片を形成する。Ｎｂは、標的抗原の隠れた凹部へと侵入することを可能とする、例外的に長い相補性決定領域３（ＣＤＲ３）ループ及び凸状パラトープを保有する。ドメイン抗体及びナノボディー（登録商標）（ＶＨＨドメインを含む）などの免疫グロブリン単一可変ドメインは、ヒト化にかけられうる、すなわち、最近縁のヒト生殖細胞系列配列との配列同一性の程度を増大させうる。特に、ナノボディー（登録商標）（ＶＨＨドメインを含む）などのヒト化免疫グロブリン単一可変ドメインは、ヒト化置換（本明細書において、さらに規定される）である、かつ／又はこれに対応する、少なくとも１つのアミノ酸残基（及び、特に、少なくとも１つのフレームワーク残基）が存在する、免疫グロブリン単一可変ドメインでありうる。さらに、ヒト細胞又は動物細胞において存在する、既存の抗体への結合が低減されたポリペプチド（例えば、ＷＯ２０１２／１７５７４１及びＷＯ２０１５／１７３３２５が参照される）を作出するように、例えば、位置：１１、１３、１４、１５、４０、４１、４２、８２、８２ａ、８２ｂ、８３、８４、８５、８７、８８、８９、１０３又は１０８のうちの少なくとも１つにおいて、さらなる適切な突然変異、特に、置換が導入される場合がある。本発明のアミノ酸配列及び／又はＶＨＨは、１つ以上のホールマーク残基（本明細書において規定される）若しくは１つ以上の他のフレームワーク残基（すなわち、非ホールマーク残基）又はこれらの任意の適切な組合せなど、任意のフレームワーク残基において、適切にヒト化されうる。本発明のアミノ酸配列、ＶＨＨ又はポリペプチドを発現させるのに使用される宿主生物に応じて、このような欠失及び／又は置換はまた、当業者の能力の範囲内にある通り、翻訳後修飾（１つ以上のグリコシル化部位など）のための１つ以上の部位が除去されるような形においてもデザインされうる。代替的に、例えば、部位特異的ＰＥＧ化又はビオチニル化又はフルオロフォアなど、標識の接合を可能とする、官能基の接合のための、１つ以上の部位（本明細書において記載される）を導入するように、置換又は挿入が、デザインされうる。

本明細書において使用される、「～を決定すること」、「～を測定すること」、「～を評価すること」、「～を同定すること」、「～をスクリーニングすること」及び「～についてアッセイすること」という用語は、互換的に使用され、定量的決定及び定性的決定の両方を含む。

発明の詳細な説明
本発明は、アフィニティークロマトグラフィーによるタンパク質の精製に関する。特に、標的上のエピトープに特異的に競合的に結合する、標的特異的タンパク質結合剤の対が、相補的反応速度的文脈において使用される。その標的への結合において競合的であるが、非重複エピトープ又は異なるエピトープにおける結合性部位を有する結合剤のこのような対は、アフィニティー置換において、一過性のサンドイッチ複合体を介して、規定された用量反応関係及び反応速度関係内において作用すると見られている。しかし、第２の結合剤と同じエピトープ又は重複エピトープを有する、第１のタンパク質結合剤（捕捉剤）の対が使用される場合、交差遮断が生じうるのか、置換が生じうるのかは、結合の性質に依存する。ＩＳＶＤ、又はより具体的に、Ｎｂを置換剤として使用して、本発明者らは、標的タンパク質上の同じエピトープをターゲティングする対が、ある特定の反応速度要件下において組み合わされた場合であってもなお、より具体的に、解離速度定数が、第２のタンパク質結合剤より、第１のタンパク質結合剤について高い場合、且つ置換剤又は剥離剤として公知の、第２のタンパク質結合剤が、ＩＳＶＤ特異的結合性又はナノボディー特異的結合性を含む場合、置換は、効率的に確立されることを見出した。このため、置換剤として使用されるＩＳＶＤ結合剤について、ｋ_ｏｆｆは、置換効率を駆動すると考えられる。この精製技術は、標的の競合的溶出のための、ＩＳＶＤを含む、第２のタンパク質結合剤と比較して、高いオフ速度（又はｋ_ｏｆｆ値）及び／又は低アフィニティーを伴う、固定化タンパク質結合剤（捕捉剤）が使用され、これにより、第２のタンパク質結合剤は、標的タンパク質に対する、低いオフ速度及び／又は高アフィニティーを伴う場合に、最適に機能することが示されている。実際、当技術分野により、ＩＳＶＤ及びナノボディーを含む抗体又は抗体ドメインは、それらが、類似のエピトープ又は重複エピトープと相互作用する場合に、それらの標的への結合について競合することが公知である。純粋に、競合的性質に基づき、競合が、溶出画分中において、満足の行く精製タンパク質の収率を得ることを可能とすることを期して、標的を精製するための結合（又は捕捉）及び溶出（又は剥離）のためのナノボディーなど、同じ結合剤を使用しうる。したがって、このような「同等」競合（すなわち、低過ぎないｋ_ｏｆｆ又は高過ぎないアフィニティー；下記を参照されたい）を可能とする解離速度を伴う結合剤は、同じ結合剤又はＮｂを、捕捉剤及び剥離剤として使用して溶出される、ある特定の量のタンパク質を結果としてもたらす。しかし、この場合、精製は、同等に競合する捕捉剤は、固定化された表面に結合したタンパク質の一部を保持し、溶出収率は、最適未満となるので、最適の結果をもたらさない。ハイスループット適用において所望される、捕捉剤の、標的への結合を競合により完全に消失させることが可能な結合剤を探索する当業者は、同じエピトープに対する、従来の抗体結合剤は、大半が、置換反応を遮断する（例えば、Ａｂｄｉｃｈｅら、２０１７において、モノクローナル抗体について裏付けられている）ことを見出し、むしろ、競合によるエピトープのこのような遮断を回避するように、捕捉剤と比較して、隣接エピトープ又は最小部分において重複するエピトープに結合する抗体などのタンパク質結合剤が使用される。第２のタンパク質結合剤として、第１のタンパク質結合剤と同じエピトープ、実質的に同じエピトープ又は大型の重複エピトープに結合するＩＳＶＤの使用であって、ＩＳＶＤを含む、第２のタンパク質結合剤が、低い解離速度定数（ｋ_ｏｆｆ）を有する、使用は、ＩＳＶＤが、第１のタンパク質結合剤を、効率的に置換することが可能であり、これにより、同じ標的タンパク質のエピトープへの結合を競合により消失させ、標的タンパク質の、高収率における溶出を可能とすることを示した。よって、本発明は、ＩＳＶＤを含む、第２のタンパク質結合剤の、標的とのタンパク質複合体の、高度に純粋な溶出（実施例において示される）を結果としてもたらす、「ＩＳＶＤベースの置換」、又はより特定すると、本明細書において互換的に使用される、「ナノボディー交換」若しくは「ナノボディー交換クロマトグラフィー」若しくは「ＮＡＮＥＸ」に関する。エピトープが重複しない、又は最小部分において重複する標的上の置換に、結合対が使用される場合であってもなお、捕捉剤と溶出剤とのｋ_ｏｆｆの差違により駆動される置換反応速度に従い、置換反応であるＩＳＶＤの結合性は、機能すると考えられる。

ＮＡＮＥＸによる精製を使用する場合、溶出複合体はしたがって剥離剤又は置換剤を含有し、これは、さらに機能化されている、すなわち、溶出されるタンパク質複合体に特異的機能をもたらす、ＩＳＶＤを含む第２のタンパク質結合剤（剥離剤又は、ナノボディーの場合、ナノ剥離剤と呼ばれる）の適用を可能とするという利点を有する。このような機能化は、タンパク質複合体の視覚化（蛍光又は薬剤標識化を介する）に関する場合もあり、他の例の中において、機能化複合体内の標的を溶出させる、シャペロンタンパク質又はアダプタータンパク質（例えば、ＭｅｇａＢｏｄｙを含むがこれに限定されない）としての機能に関する場合もある。さらに、溶出ステップ及び再生手順に続き、ビーズ、カラム又は樹脂など、任意の種類の表面でありうるアフィニティーマトリックスが、次の、アフィニティー精製サイクルのために準備され、スクリーニングプラットフォームなどのハイスループットプラットフォーム、チップ又はマイクロ流体セットアップ若しくはマイクロ流体デバイスにおいて使用されうる。

ＮＡＮＥＸ又はナノボディー交換クロマトグラフィーと呼ばれる、この次世代アフィニティー精製技術を使用することにより、解析のための精製並びにスクリーニングアッセイ及び構造ベースの薬物デザイン並びに新規の化合物の発見並びに構造ベースのスクリーニングなど、ハイスループットプラットフォーム又はスクリーニング適用における飛躍が見通されうる。実際、標的を、活性コンフォメーションなど、機能的コンフォメーションにおいて安定化させるための、抗原又は標的のコンフォメーション選択的認識を伴うタンパク質結合剤、より具体的に、アゴニスト、部分的アゴニスト又はバイアス化アゴニストのコンフォメーションが選択されうる。バイオテクノロジーにおける、このような技術の急速な進歩により、本発明は、新規の治療薬スクリーニングの効率及び潜在的可能性並びにスループットの増大及びプロテオミクスの潜在的可能性、ＭＳベースの解析法及び他の解析法に影響を与えることが見通される。

第１の態様は、試料中に存在する標的タンパク質のための精製工程であって、
ａ）標的タンパク質上のエピトープに特異的に結合する、第１のタンパク質結合剤を、標的タンパク質を含有する試料と混合するステップ、
ｂ）標的タンパク質への結合について、第１の結合剤による結合と競合する、第２のタンパク質結合剤を添加するステップ、並びに
ｃ）標的タンパク質及び第２のタンパク質結合剤を含むタンパク質複合体の溶出ステップ、
を含み、
標的タンパク質の、第１のタンパク質結合剤から、第２のタンパク質結合剤への交換時又は置換時に、溶出されたタンパク質複合体が、標的タンパク質及び第２のタンパク質結合剤を含み、第２のタンパク質結合剤が、その標的タンパク質のエピトープに特異的に結合しているＩＳＶＤ又はその機能的変異体を含み、解離速度（又は本明細書において互換的に使用される、「解離速度定数」又は「ｋ_ｏｆｆ」）が、第２のタンパク質結合剤について、第１のタンパク質結合剤のｋ_ｏｆｆと比較して、緩徐又は等しい（又はｋ_ｏｆｆが、第１のタンパク質結合剤のｋ_ｏｆｆ以下である）
工程に関する。さらなる適用において、方法はまた、第２のタンパク質結合剤の添加の前に、洗浄ステップも含みうる。

ＩＳＶＤの「機能的変異体」という用語は、変異体が、その配列又は組成において異なりうるが、ＩＳＶＤと同じ結合性領域による、標的タンパク質への結合において、その機能性を保持するように、本明細書において、標的タンパク質への結合について、ＩＳＶＤの結合性領域又はパラトープと同一な、結合性領域又はパラトープを含有する、任意のポリペプチドと規定される。特に、このＩＳＶＤのパラトープ又は結合性領域は、極めてしばしば、少なくともＣＤＲ３領域、好ましくは、３つのＣＤＲ及び、場合によって、また、ＦＲ領域の一部も含む。

「標的への結合について競合すること」についての特色は、同じエピトープについて競合することと解釈される場合もあり、また、反応速度的に、又はアロステリックになど、異なる形において競合することを意味する場合もある。こうして、一実施形態において、剥離剤は、最小部分において重複するエピトープ又は隣接するエピトープをターゲティングすることにより、結合について競合する場合もあり、代替的に、剥離剤は、なお、標的上のアロステリック部位に結合し、標的のコンフォメーション変化を誘導することにより、捕捉剤と標的との相互作用を破壊する場合もある。

競合的結合剤は、例えば、とりわけ、競合ＥＬＩＳＡ、ａｌｐｈａｌｉｓａ、Ｏｃｔｅｔによる測定又はバイオレイヤー干渉法（ＢＬＩ）、ＳＰＲＢｉａｃｏｒｅ、マイクロスケール熱泳動（ＭＳＴ）であるがこれらに限定されない、当技術分野において公知の、いくつかの方法を使用して確立されうる。

より具体的に述べると、精製法において効率的な置換を得るために、例えば、隣接するエピトープに結合することにより、又は置換を強いるコンフォメーション変化を誘導するアロステリック部位に結合することにより、最小部分において重複するエピトープ又は非重複エピトープへの結合を介して、標的について競合する結合対と対比して、同じエピトープ又は大部分において重複するエピトープへの結合を介して、標的について競合する結合対について、要件の差違が検討されうる。ＩＳＶＤ含有剥離剤が、類似するエピトープに結合する、第１の種類の対を使用する置換反応は、ｋ_ｏｆｆの差違により駆動され、よって、捕捉剤より高いアフィニティーを伴う剥離剤もまた、結果としてもたらすことが多い、捕捉剤と比較して低いｋ_ｏｆｆ値を伴う置換剤を要求する。このように、本明細書において、置換は、会合速度定数により駆動されない。

ＩＳＶＤ含有剥離剤が、異なるエピトープ又は最小部分において重複するエピトープに結合する、第２の種類の対を使用する置換反応もまた、ｋ_ｏｆｆ又はアフィニティーの差違により駆動されるが、より穏和な差違を可能とし、例えば、置換を可能とするのに、わずか２倍の差違により駆動されることが示される。具体的な実施形態において、結合剤は、それが異なる置換反応速度を要求するので、モノクローナル抗体又は従来の抗体ではない。

精製法において、本明細書において、「同じ」エピトープを有する結合剤は、結合剤と相互作用する標的タンパク質のアミノ酸残基が同一である結合剤として規定され、この場合、結合剤「と相互作用すること」又は結合剤「と接触した」は、エピトープにおける、結合剤の、標的タンパク質との結合時において、残基（又は原子）から、３Å未満に近接することとして記載される。本明細書において記載される、「実質的に同じ」エピトープ又は「大部分において重複する」エピトープという用語は、両方のエピトープの、同一なアミノ酸残基の数が、エピトープの全アミノ酸残基又は最大数のアミノ酸残基のうちの、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％又は少なくとも９９％であることを指す。最も好ましくは、「実質的に同じ」エピトープとは、両方のエピトープの、同一なアミノ酸残基の数が、エピトープの最大数のアミノ酸残基のうちの、少なくとも８５～９９％であることを指す。最も好ましくは、「大部分において重複する」エピトープとは、両方のエピトープの、同一なアミノ酸残基の数が、エピトープの最大数のアミノ酸残基のうちの、少なくとも５０～８４％であることを指す。さらに、精製法は、第１の結合剤又は捕捉剤が、第２の結合剤と比較して、高い解離速度又は低い若しくは等しいアフィニティーを有する場合並びにこの逆の場合である、第２の結合剤が、エピトープに対して、第１の結合剤と比較して、低い解離速度及び／又は同じアフィニティー若しくは高いアフィニティーを有する場合において、最適の結果をもたらす。当技術分野における最新の知見から、解離速度定数（又はオフ速度若しくはｋ_ｏｆｆ）と、会合速度定数（又はオン速度若しくはｋ_ｏｎ）とは、Ｋ_Ｄ＝ｋ_ｏｆｆ／ｋ_ｏｎ［式中、Ｋ_Ｄは、上記の定義においてもまた、詳細に記載された通り、結合剤の、その標的に対するアフィニティーと逆相関する、解離定数として規定される］として相互に関連する。したがって、解離定数Ｋ_Ｄ値が、低い場合、アフィニティーは、高い（ｋ_ｏｎが同じである場合）。代替的に、ｋ_ｏｎが高い場合、Ｋ_Ｄは、低く、アフィニティーは、高い（ｋ_ｏｆｆが同じである場合）。

こうして、本発明の精製法のために、本明細書において記載されるタンパク質結合剤は、同じエピトープ、実質的に同じエピトープ又は大部分において重複するエピトープに対する、ｋ_ｏｆｆ及び／又はアフィニティー（又はＫ_Ｄ）が、比較的異なる。本明細書において記載される方法は、より具体的に、標的タンパク質の、同じエピトープ、実質的に同じエピトープ又は大部分において重複するエピトープに対する、第２の結合剤のｋ_ｏｆｆが、第１の結合剤のｋ_ｏｆｆより低いことに言及し、本明細書において、「低い」とは、少なくとも２分の１、５分の１又は１０分の１若しくは少なくとも３０分の１又は少なくとも１００分の１若しくは少なくとも２００分の１、少なくとも３００分の１、少なくとも４００分の１若しくは少なくとも５００分の１である値を指す。より好ましくは、第２の結合剤のｋ_ｏｆｆ値は、第１のタンパク質結合剤についてのｋ_ｏｆｆ値と比較して、少なくとも２分の１～少なくとも１０分の１又は少なくとも５分の１～少なくとも２０分の１又は少なくとも１０分の１～少なくとも３０分の１又は少なくとも１００分の１の範囲内にある。

同様に、標的タンパク質のエピトープに対する、第２の結合剤のアフィニティーは、第１の結合剤のアフィニティー以上であることが可能であり、この場合、「高アフィニティー」とは、第２のタンパク質結合剤の「Ｋ_Ｄ値」が、少なくとも２分の１若しくは少なくとも５分の１、１０分の１、２０分の１若しくは１００分の１である又は第１のタンパク質結合剤についてのＫ_Ｄ値と比較して、少なくとも２分の１～少なくとも２０００分の１の範囲にあるＫ_Ｄ値であることを指す。

好ましい実施形態において、本明細書において記載される精製法は、標的タンパク質のエピトープに対して、１ｍＭ～約１ナノモル濃度のＫ_Ｄ値を伴う、第１の結合剤を開示し、任意選択的に、標的の、実質的に同じエピトープ又は大部分において重複するエピトープに対して、１ナノモル濃度以下の、任意選択的に、１ピコモル濃度までの低いＫ_Ｄ値を伴う、第２のタンパク質結合剤を開示する。より好ましくは、第１の結合剤は、ナノモル濃度～マイクロモル濃度の範囲（すなわち、１０^－９～１０^－３）のＫ_Ｄを有し、第２の結合剤は、フェムトモル濃度からマイクロモル濃度の範囲（すなわち、１０^－１２～１０^－６）のＫ_Ｄ値を有し、最も好ましくは、第１の結合剤と、第２の結合剤との相対差が、少なくとも２倍の間である。一実施形態において、第１のタンパク質結合剤についてのＫ_Ｄ値は、置換剤のＫ_Ｄの少なくとも２倍であり、これは、とりわけ、置換剤が、同じエピトープ又は大部分において重複するエピトープに結合する場合における、ｋ_ｏｆｆ値の差違により駆動される差違である。

本発明の方法は、溶液中にあり、溶出条件下において、可溶性である、第２のタンパク質結合剤を含む。溶出条件は、好ましくは、当業者に公知の生理学的条件に関する。本明細書において使用される、「可溶性」という用語は、タンパク質結合剤が、機能的形態にあるという事実を指し、タンパク質結合剤が、エピトープに対するそのアフィニティーについて予測される範囲内において、その標的に特異的に結合することが可能であることを意味する。精製法は、目的の試料と混合するための溶質中に、遊離のタンパク質結合剤として存在する場合もあり、標識化タンパク質結合剤として存在する場合もあり、共有結合的に結合したタンパク質結合剤として存在する場合もある、第１のタンパク質結合剤を含む。第１の結合剤は、例えば、アガロースビーズ又は磁気ビーズでありうるビーズへとカップリングされる場合もあり、より具体的に、調製並びに解析のための精製スケールに適しうる、より特定すると、１ｍＬを下回るカラム容量なお又はマイクロモル未満の容量のオーダーのマイクロカラムでありうる、アフィニティーカラムとして充填された表面上又はマトリックス上に存在する場合もあり、なお、マイクロ流体技術を使用するチップ上に提示される場合もある。第１のタンパク質結合剤は、好ましくは、本発明の方法のために、固定化され、この場合、第１のタンパク質結合剤は、共有結合的手段又は他のカップリング手段を介して、表面上に固定化されうる。最も好ましくは、第１のタンパク質結合剤は、固体支持体上又は樹脂上に固定化される。本明細書において互換的に使用される、「樹脂」又は「アフィニティー樹脂」とは、ＩＳＶＤ又は他のタンパク質結合剤など、生体分子の固定化のための、活性化アフィニティークロマトグラフィー支持体である。具体的な実施形態において、第１のタンパク質結合剤は、ＩＳＶＤを含み、当技術分野の公知のカップリング法（実施例を参照されたい）を使用して、樹脂へとカップリングされる。

本明細書において記載される精製法は、任意選択的に、固定化された、第１のタンパク質結合剤を、ステップａ）における試料と混合するステップを含み、この場合、試料は、第１のタンパク質結合剤に特異的に結合する標的タンパク質を含む。具体的な実施形態において、試料は、生物学的試料、生検試料、細胞含有試料若しくは組織含有試料、細胞溶解物、細胞混合物又は複合混合物、非特異的成分を含む溶媒若しくは溶解物に関しうる。他の実施形態は、合成化合物又は非天然化合物を含有する試料、複合試料又は他のインビトロ試料に関する。

試料の性質に応じて、本発明の方法のステップａ）の後における、任意選択的なカラムの洗浄は、中性条件又は極めて穏和条件又は、これとは逆に、過酷な条件を要求する場合もあり、結合しなかった任意の豊富な成分を除去するための反復を要求する場合もある。試料の性質及び試料中に存在する標的タンパク質の量並びに本発明の方法のステップａ）又はｂ）に従う、第１のタンパク質結合剤に応じて、第２のタンパク質結合剤を使用する、ステップｃ）における溶出は、反復される場合もあり、標的タンパク質の完全な溶出を可能とするように、大容量の溶出を要求する場合もある。本明細書において提示される方法は、溶出時に、生理学的条件を使用し、任意選択的に、穏和な再生ステップを含むことから、アフィニティーカラム（すなわち、樹脂上に固定化された、第１のタンパク質結合剤）が、さらなる試料からの、さらなる精製のために、再使用可能である利点を有する。

本発明の方法のステップｃ）の溶出液が、本明細書において記載される方法の精製ステップの後において得られる溶出液より高度の純度を要求する場合、さらなる精製ステップが好ましく、この場合、いずれもが、同じ標的タンパク質のエピトープに結合し、エピトープが、第１のタンパク質結合剤及び第２のタンパク質結合剤が結合するエピトープと重複しない、隣接する、又は異なる、第３のタンパク質結合剤及び第４のタンパク質結合剤を使用して、本明細書において記載される精製法の同じステップが反復される。標的タンパク質のタンデム精製のための方法は、
ａ）標的タンパク質のエピトープに特異的に結合する、第１のタンパク質結合剤を、標的タンパク質を含有する試料と混合するステップ、
ｂ）標的タンパク質について、第１の結合剤と競合して、標的タンパク質に特異的に結合することにより第１の結合剤を標的タンパク質から剥離させる第２のタンパク質結合剤を添加するステップ、
ｃ）標的タンパク質に結合した、第２のタンパク質結合剤を含む溶出複合体を回収するステップ、及び
ｄ）第１のタンパク質結合剤及び第２のタンパク質結合剤の代わりに、それぞれ、第３のタンパク質結合剤及び第４のタンパク質結合剤を使用して、ステップａ）～ｃ）を反復するステップであって、第３の結合剤及び第４の結合剤が、第１の結合剤及び第２の結合剤のためのエピトープと比較して異なる、標的タンパク質のエピトープに特異的に結合するステップ
を含み、
この場合、第２のタンパク質結合剤（及び／又は第４のタンパク質結合剤）が、エピトープに特異的に結合する免疫グロブリン単一可変ドメイン（ＩＳＶＤ）又はその活性断片を含み、第２のタンパク質結合剤及び第４のタンパク質結合剤の解離速度定数（ｋ_ｏｆｆ値）が、それぞれ、第１のタンパク質結合剤及び第３のタンパク質結合剤のｋ_ｏｆｆ値と比較して、低い又は等しい。

実際、このようなタンデムＮＡＮＥＸアフィニティー精製法は、ＴＡＰタグを使用する、古典的タンデムアフィニティー精製（ＴＡＰ）もまた、目的とされるので、１つを超える標的タンパク質を含むタンパク質複合体をまとめて精製するのにも適する。実際、第３のタンパク質結合剤及び第４のタンパク質結合剤により認識されるエピトープはまた、第１の結合剤及び第２の結合剤に結合する標的タンパク質と異なる標的タンパク質上にも存在しうるが、これは、第１の標的タンパク質と、第２の標的タンパク質との間において形成される複合体を捕捉し、精製することを可能とし、さらに、１ステップ型の精製ステップが十分でない場合に、高度な複合マトリックスから、このようなタンパク質間相互作用を精製するためのエピトープでもある。このタンデムアフィニティー精製法が、当技術分野において公知のＴＡＰ方法に優る利点は、精製は、酵素による切断（タグの）を要求せず、溶出液中に、プロテアーゼが残存しないことである。この方法のさらなる利点は、濃縮ステップ又はある特定の緩衝液条件に対する透析の必要が存在せず、過剰量の第２のタンパク質結合剤又は剥離剤Ｎｂが、タンデム法の第２のステップにおいて除去されうることを含む。代替的に、第１の結合剤及び第３の結合剤が、いずれも、同じカラム上又は樹脂上にカップリングされ、第２の結合剤及び第４の結合剤を、剥離剤として、同時に又は後続して使用して、任意選択的に、合間の洗浄ステップを可能とする、ある種のマルチプレックス反応として、タンデムを実行する、タンデムＮＡＮＥＸも、想定されうる。

最後に、本明細書において記載される精製法は、好ましくは、捕捉剤／剥離剤対を適用し、この場合、タンパク質結合剤は、いずれも、この種類のタンパク質結合剤は、高度に特異的であり、Ｅ．コリー（Ｅ．ｃｏｌｉ）／ピキア属（Ｐｉｃｈｉａ）における発現が良好であり、高（熱）安定性であることの有利な特性を有し、結合アフィニティーの塩／ｐＨ忍容性についての選択が可能であり、全てが、本明細書において記載される、単一可変ドメインを介して、それらの標的に結合し、このクラスのＩＳＶＤ含有剥離剤について、同様の置換反応速度を適用することを可能とするので、ＩＳＶＤ又はより具体的に、ＶＨＨ、なお又は、より具体的に、ナノボディーを含む。

別の実施形態は、本明細書において開示される、標的タンパク質を精製する方法であって、第２の（又は第４の）タンパク質結合剤が、標識又は検出可能な標識を含む方法に関する。「検出可能な標識」又は「標識化すること」という用語は、本明細書において記載される、単離又は精製された（ポリ）ペプチド又は複合体の、検出、視覚化及び／又は単離、さらなる精製及び／又は固定化を可能とする、検出可能な標識又は検出可能なタグを指し、これらの目的のための、当技術分野において公知の任意の標識／タグを含むことが意図される。特に、蛍光タンパク質（例えば、ＧＦＰ、ＹＦＰ、ＲＦＰなど）及び蛍光染料（例えば、ＦＩＴＣ、ＴＲＩＴＣ、クマリン及びシアニン）などの蛍光標識又は蛍光タグ（すなわち、蛍光色素／フルオロフォア）；ルシフェラーゼなどの発光標識又は発光タグ；及び（他の）酵素標識（例えば、ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、ベータ－ガラクトシダーゼ、ウレアーゼ又はグルコースオキシダーゼ）が好ましい。また、キチン結合性タンパク質（ＣＢＰ）、マルトース結合性タンパク質（ＭＢＰ）、グルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、ポリ（Ｈｉｓ）（例えば、６×Ｈｉｓ又はＨｉｓ６）、Ｓｔｒｅｐ－ｔａｇ（登録商標）、Ｓｔｒｅｐ－ｔａｇＩＩ（登録商標）及びＴｗｉｎ－Ｓｔｒｅｐ－ｔａｇ（登録商標）などのアフィニティータグ；チオレドキシン（ＴＲＸ）、ポリ（ＮＡＮＰ）及びＳＵＭＯなどの可溶化タグ；ＦＬＡＧタグなどのクロマトグラフィータグ；Ｖ５タグ、ｍｙｃタグ及びＨＡタグなどのエピトープタグも含まれる。また、前出の標識又はタグのうちのいずれかの組合せも含まれる。第２のタンパク質結合剤（又は第４のタンパク質結合剤）は、例えば、半減期伸長モジュールに融合又はコンジュゲートされる場合もあり、半減期伸長モジュール自体として機能する場合もある。このようなモジュールは、当業者に公知であり、例えば、アルブミン、アルブミン結合性ドメイン、免疫グロブリンのＦｃ領域／ドメイン、免疫グロブリン結合性ドメイン、ＦｃＲｎ結合性モチーフ及びポリマーを含む。特に、好ましいポリマーは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ヒドロキシエチルデンプン（ＨＥＳ）、ヒアルロン酸、ポリシアル酸及びＰＥＧ模倣体ペプチド配列を含む。単離された（ポリ）ペプチドの凝集を防止する修飾もまた、当業者に公知であり、例えば、１つ以上の疎水性アミノ酸、好ましくは、表面に露出された疎水性アミノ酸の、１つ以上の親水性アミノ酸による置換を含む。

さらなる実施形態において、異なる種類の標的タンパク質上のエピトープであって、例えば、融合タンパク質上に存在するものとしてのタグを構成する場合もあり、これを含む場合もあるエピトープに特異的に結合するタンパク質結合剤について記載される。本明細書におけるタグの例は、一般に使用されるポリヒスチジン（Ｈｉｓ）などのアフィニティータグ、グルタチオントランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、マルトース結合性タンパク質（ＭＢＰ）、カルモジュリン結合性ペプチド（ＣＢＰ）、インテイン－キチン結合性ドメイン（インテイン－ＣＢＤ）、ストレプトアビジン／ビオチンベースのタグ、Ｈｉｓ－ＰａｔｃｈＴｈｉｏＦｕｓｉｏｎ（チオレドキシンベースの）、ＥＰＥＡ（ＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔＣ－ｔａｇ；ＵＳ９５１８０８４Ｂ２）、ユビキチン又はＳＵＭＯ（ｓｍａｌｌｕｂｉｑｕｉｔｉｎ－ｌｉｋｅｍｏｄｉｆｉｅｒ）、酵母ＳＵＭＯ又はＳＭＴ３又はＨａｌｏタグを含むがこれらに限定されない。さらに、タグは、ＨＡ、ＦＬＡＧ若しくはｃＭｙｃなどのエピトープタグなお又は後者は、アフィニティー精製にそれほど好ましくないが、ＨＲＰ、若しくはアルカリホスファターゼなどのレポータータグを構成しうる。多数の非限定例は、例えば、Ｋｉｍｐｌｅら（２０１５、表９．９．１）において提示されている。

代替的に、本明細書において記載される精製のための方法のタンパク質結合剤は、天然タンパク質、天然に存在するタンパク質及び／又は内因性タンパク質のエピトープに特異的に結合し、タグとの融合を要求しない。別の代替的なタンパク質結合剤は、エピトープが、組換えにより作製された外因性タンパク質上に存在し、タグを要求しないタンパク質結合剤である。このようなタンパク質結合剤対が、同じ標的について競合するために、競合結合剤の対をもたらすように、スクリーニングし、選択することもでき、タンパク質結合剤の高アフィニティー／低アフィニティー対を目的としてデザインすることもできる。実際、標的に結合した剥離剤又は第２のタンパク質結合剤の３Ｄ構造の使用は、アフィニティーの低減又は高いｋ_ｏｆｆを結果としてもたらす、タンパク質結合剤の結合性部位内の突然変異をデザインし、これにより、適合性の捕捉剤又は第１のタンパク質結合剤をもたらすことを可能とする。このほか、構造情報を要求しない、より簡潔な方法はまた、配列が知られれば、単一の結合剤に基づき、対を決定することも可能とする。実施例において、ｍＣｈｅｒｒｙ標的タンパク質について、非限定的な形において示される通り、異なる結合剤についてのスクリーニングに基づき、ＢＬＩを使用するエピトープマッピングにより、それらの競合性が解析される又は代替的に、ナノモル濃度の結合剤又は剥離剤の配列に基づき、結合反応速度の規定において、最も重要であることが公知であるＣＤＲ３領域内において、アラニン突然変異スキャンを使用して、低い解離速度定数を伴う新たな対が、ＮＡＮＥＸ法において、捕捉剤として機能することの同定が可能であった。このようにして、単に、単一又は複数の突然変異を導入することにより、同じエピトープに、異なるｋ_ｏｆｆ又はアフィニティーにより結合するタンパク質結合剤の対が得られる。

第２のタンパク質結合剤だけでなく、また、第１のタンパク質結合剤も（かつ、任意選択的に、第３のタンパク質結合剤及び第４のタンパク質結合剤も）、ＩＳＶＤを含む方法に関する、具体的実施形態において、「一価」フォーマットは、捕捉剤（第１の結合剤又は第３の結合剤）として使用される場合があり、多価フォーマットは、一価形態と比較して、高いアビディティーを有し、高いｋ_ｏｆｆを伴う結果として、最適の溶出収率及び標的タンパク質純度ももたらす（実施例１２を参照されたい）ので、「多価」フォーマットは、剥離剤（第２の結合剤又は第４の結合剤）として、組合せにおいて使用されうる。本明細書における「一価フォーマット」という用語が、１つの抗原決定基だけを認識しうる、本明細書において使用されるＩＳＶＤを指すのに対し、「多価」フォーマットという用語は、二価フォーマット、三価フォーマット又は四価フォーマットなど（であるがこれらに限定されない）、１つを超える抗原決定基を認識しうる、本明細書において使用されるＩＳＶＤを指す。さらに、多価剥離剤の代わりに、剥離剤が、同じ抗原決定基に結合する、同一な構成要素と、異なる場合があり、標的タンパク質上の、同じエピトープ又は別のエピトープに結合する場合もあり、代替的に、第１の標的タンパク質と複合体化した、別の標的タンパク質上のエピトープに結合する場合もある、少なくとも１つ以上の構成要素の結合とを含みうる、マルチパラトープ又は多特異的剥離剤もまた想定されうる。

さらなる実施形態において、標的タンパク質を精製するための方法は、ＭｅｇａＢｏｄｙを、第１のタンパク質結合剤及び／又は第２のタンパク質結合剤として適用する。本明細書において使用されるＭｅｇａＢｏｄｙという用語は、本明細書においてまた、抗原結合性キメラタンパク質とも呼ばれる、Ｓｔｅｙａｅｒｔら（ＷＯ２０１９／０８６５４８Ａ１）において開示されている、新規の融合タンパク質を指し、ドメインの表面においてアクセス可能である又は露出された１つ以上のアミノ酸部位において抗原結合性ドメインへとカップリングされ、抗原結合性ドメインのトポロジーの中断を結果としてもたらす足場タンパク質へと接続された抗原結合性ドメインを含む融合タンパク質を指す。抗原結合性キメラタンパク質は、それが、足場タンパク質に融合されていない抗原結合性ドメインと比較して、その抗原結合性機能性を保持する点において、さらに特徴づけられる。本明細書において記載されるＭｅｇａＢｏｄｙは、抗原結合性ドメインが、ＩＳＶＤドメインのアクセス可能な表面（ＣＤＲを除くβターン又はループ）において、足場タンパク質に融合される又は接続され、抗原結合性ドメインのトポロジーの中断を結果としてもたらし、その抗原結合機能性、すなわち、特異的なエピトープ認識を保持する免疫グロブリン単一可変ドメイン（ＩＳＶＤ）又はナノボディーを含む特定のＭｅｇａＢｏｄｙ又は抗原結合性キメラタンパク質に関する。具体的な実施形態において、第２のタンパク質結合剤は、ベータ－ストランドＡと、ＩＳＶＤのＢ（ＩＭＧＴの用語法に従い規定され、ＷＯ２０１９／０８６５４８Ａ１に規定されている）とを接続する、第１のベータ－ターンにおける足場タンパク質の挿入を介して足場タンパク質へと接続されたＩＳＶＤを含むＭｅｇａＢｏｄｙ又は抗原結合性キメラタンパク質に関する。なおより具体的実施形態において、本明細書において使用される足場タンパク質は、足場の融合が、ＩＳＶＤのトポロジーを中断するが、その全体的３Ｄ構造も、そのエピトープ結合特異性も中断しない、ＨｏｐＱ足場タンパク質又はＹｇｊｋ足場タンパク質である。本明細書において使用される、「ＨｏｐＱ」足場又は「ＨｏｐＱ由来」足場は、また、ｃＨｏｐＱ又はｃ７ＨｏｐＱ（また、ＷＯ２０１９／０８６５４８Ａ１も参照されたい）とも呼ばれる、ヘリコバクター・ピロリ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒｐｙｌｏｒｉ）株Ｇ２７の１型ＨｏｐＱ（ＰｒｏｔｅｉｎＤａｔａｂａｓｅ：ＰＤＢ５ＬＰ２）のアドヘシンドメイン又はその循環置換タンパク質のタンパク質足場に関する。本明細書において使用される、「Ｙｇｊｋ」足場又は「Ｙｇｊｋ由来」足場は、また、ｃＹｇｊｋ（また、ＷＯ２０１９／０８６５４８Ａ１も参照されたい）とも呼ばれる、エシェリキア・コリー（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）Ｋ１２ＹｇｊＫ（ＰＤＢ３Ｗ７Ｓ）又はそのタンパク質をコードする循環置換遺伝子のタンパク質足場に関する。

第２のタンパク質結合剤が、そのＩＳＶＤの抗原結合性ドメインを介して、標的タンパク質のエピトープに特異的結合するＭｅｇａＢｏｄｙである方法に関する、ある実施形態は、ＭｅｇａＢｏｄｙに結合した標的タンパク質の溶出を結果としてもたらす。Ｓｔｅｙａｅｒｔら（ＷＯ２０１９／０８６５４８Ａ１）並びにＬａｖｅｒｔｙら（２０１９）、Ｍａｓｉｕｌｉｓら（２０１９）及びＵｃｈａｎｓｋｉら（２０１９）において開示されている通り、これらの例示的なＭｅｇａＢｏｄｙは、クライオＥＭ解析における構造的分解能の改善のための、新種のナノボディーベースのシャペロンとして作用する。こうして、本明細書において記載されるＭｅｇａＢｏｄｙを、第２のタンパク質結合剤又は第４のタンパク質結合剤、すなわち、剥離剤として適用する精製法は、クライオＥＭ解析又は他の構造的解析のための、複合体試料の、簡潔な調製及び精製に有利である。ＭｅｇａＢｏｄｙ内に含まれるＩＳＶＤのｋ_ｏｆｆは、同じエピトープ、実質的に同じエピトープ又は大部分において重複するエピトープに結合する、別のタンパク質結合剤を構成する、第１のタンパク質結合剤のｋ_ｏｆｆより低い。

実際、具体的実施形態は、標的タンパク質を精製するための方法であって、ａ）標的タンパク質のエピトープに特異的結合するＩＳＶＤを含む、第１のタンパク質結合剤を、標的タンパク質を含有する試料と混合するのに続き、任意選択的に、ステップａ）の混合物を洗浄して、結合しなかった試料成分を除去するステップ及びｂ）第１の結合剤と同じである、又は大部分において重複する、標的タンパク質のエピトープを認識して、標的タンパク質に特異的に結合することにより第１の結合剤を標的タンパク質から剥離させる第２のタンパク質結合剤を添加するステップ及びｃ）第２のタンパク質結合剤に結合した標的タンパク質を含む溶出液を回収するステップであって、第２のタンパク質結合剤が、第１のタンパク質結合剤と同じエピトープ、実質的に同じエピトープ又は大部分において重複するエピトープに特異的に結合するＩＳＶＤを含む、本明細書において記載されるＭｅｇａＢｏｄｙを含み、ＭｅｇａＢｏｄｙの解離速度定数（ｋ_ｏｆｆ値）が、低く、そのアフィニティーが、第１のＩＳＶＤを含む結合剤と比較して、等しい又は高いステップを含む方法に関する。具体的な実施形態において、第１の結合剤のＩＳＶＤは、ＭｅｇａＢｏｄｙ内に含まれるＩＳＶＤの、突然変異体のＩＳＶＤである。精製法は、最終的に、例えば、構造生物学及び物理化学的特徴付け又は解析的研究における使用のための、複合細胞試料又は少量の試料混合物からの、単一ステップの精製を提供する。

別の実施形態は、第１のタンパク質結合剤及び第２のタンパク質結合剤により認識されるエピトープが、ＭｅｇａＢｏｄｙ内に含まれる足場タンパク質上に存在するタンパク質結合性部位又はエピトープに関する、本明細書において記載される標的タンパク質の精製法に関する。ＭｅｇａＢｏｄｙは、好ましくは、ＨｏｐＱタンパク質又はＹｇｊｋタンパク質に由来する足場タンパク質、よって、方法のタンパク質結合剤に特異的に結合するエピトープを含有するＨｏｐＱタンパク質足場又はＹｇｊｋタンパク質足場を使用して構築されうる。本明細書において開示される又はＳｔｅｙａｅｒｔら（ＷＯ２０１９／０８６５４８Ａ１）において開示される又は他の場所において記載されうるＭｅｇａＢｏｄｙ上に存在する足場タンパク質エピトープに特異的に結合するタンパク質結合剤の対は、精製法が、ＭｅｇａＢｏｄｙに結合した標的タンパク質を、複合混合物から捕捉又はスカベンジするのに適用されうるという、さらなる利点を有する。

さらに、ＨｏｐＱ足場タンパク質又はＹｇｊｋ足場タンパク質のエピトープに特異的に結合するタンパク質結合剤が、他のタンパク質と融合された場合に又は他の融合フォーマットを介して、ＭｅｇａＢｏｄｙ融合体のほかに、なお、ＨｏｐＱ及びＹｇｊｋにも結合する場合、ＨｏｐＱ特異的タンパク質結合剤及び／又はＹｇｊｋ特異的タンパク質結合剤の対は、本明細書において論じられるタグの場合と同様の形において、ＨｏｐＱベースの融合タンパク質又はＹｇｊｋベースの融合タンパク質の精製を要求する、さらなる適用のための方法において使用されうる。

併せて、本明細書において提示される方法は、例えば、マイクロ流体チップ上において、方法をさらに小型化して、質量分析及び構造解析における、ＨＴＰ解析のための適用を可能とするように、内因性（しばしば、少量において存在する）タンパク質及び単離するのが困難なタンパク質の解析のための万全のツールボックス並びにタグ付けされたタンパク質のための解析ツールを可能とする、結合剤の対自体を構成する、本発明の別の態様をさらにもたらす。こうして、本発明の第２の態様は、標的タンパク質を精製するための方法の、第１のタンパク質結合剤及び第２のタンパク質結合剤を含み、第２のタンパク質結合剤が、ＩＳＶＤ又はその機能的変異体を含み、第２のタンパク質結合剤の解離速度定数が、第１の結合剤と比較して等しい又は低く、標的タンパク質について競合するキットに関する。キットは、可溶化させる、洗浄する若しくは溶出させるための緩衝液又は樹脂をさらに含みうる。さらに、精製法を実施する指示書又はプロトコールも、キット内に備えられうる。キットの、第１のタンパク質結合剤及び第２のタンパク質結合剤は、第２のタンパク質結合剤が、低い解離速度又は、代替的に、高アフィニティーを伴うタンパク質結合剤として規定される、タンパク質結合剤に関する。２つを超えるタンパク質結合剤が、キット内に存在する場合、これらの複数のタンパク質結合剤は、同じエピトープ、実質的に同じエピトープ若しくは大部分において重複するエピトープ又は異なるエピトープに特異的に結合する場合もあり、かつ／又は、とりわけ、第１の結合剤／第３の結合剤と、フォーマット（ＩＳＶＤを含むフォーマット及び／又はその機能的変異体であるフォーマット）及び抗体、ペプチドにおいて異なる場合もある。代替的に、本明細書において記載される、標的タンパク質の精製法のための、複数のタンパク質結合剤を含むキットは、タンパク質又はタンパク質複合体の混合物の精製を可能とするように、異なるエピトープなお又は異なるタンパク質（例えば、タンパク質複合体の）に結合するタンパク質結合剤を含みうる。しかし、複数のタンパク質結合剤は、それらを、本明細書において記載される精製法又はタンデム精製法において使用することを可能とするように、少なくとも、本明細書において記載される対において存在するものとする。別の実施形態において、結合剤を含むキットは、ビーズなどの固体構造上、樹脂上又はチップ内に存在する、固定化フォーマットにおいて、第１の結合剤又は捕捉剤を含みうる。

具体的な実施形態において、キットは、ＧＦＰタグ付けタンパク質の精製法における使用のための、第１のタンパク質結合剤及び第２のタンパク質結合剤を含み、この場合、タンパク質結合剤は、配列番号１～６、１８又は１９の群（又はｈｉｓ－ＥＰＥＡタグを伴わない、これらの配列のうちのいずれかを含む）又はこれらとの少なくとも７０％又は少なくとも８０％又は少なくとも９０％又は少なくとも９５％又は少なくとも９９％の同一性を有する、相同なアミノ酸配列を伴う配列から選択され、ＩＳＶＤのＫＤが、０．１ｎＭを下回る場合、又はより具体的に、配列番号１が選択される場合、第１の結合剤と、第２の結合剤とは、選択された配列内において同一であってはならない。同様に、キットは、本明細書において記載される方法における使用のための、他のタンパク質結合剤を含むことが可能であり、この場合、薬剤は、本明細書において例示され、記載される、ＧＳＴ、ＥＰＥＡ、ｍＣｈｅｒｒｙ、ユビキチン、ＳＭＴ３又は他のタグなど、タンパク質のための市販のタグを、特異的に認識した。

別の実施形態は、精製又は解析の目的のための、並びに、例えば、結合剤が、薬物化可能なコンフォメーションについてスクリーニングされるスクリーニングアッセイにおける使用のための、本明細書において記載される方法のためのキットの使用に関する。

本発明のさらなる態様は、標的タンパク質へと結合した、精製法の、第２の（又は第４の）タンパク質結合剤を含むタンパク質複合体に関する。タンパク質複合体は、目的のタンパク質複合体を含有する試料を、さらなる解析のために用意する、本明細書において記載される方法の溶出ステップｃ）（又はｄ）におけるｃ）の反復）において用意される。実際、標的タンパク質と複合体化して溶出された、（第２又は第４の）タンパク質結合剤は、高分解能の構造解析に要求される安定化シャペロンをもたらすことも可能であり、かつ／又はある特定の標的タンパク質コンフォメーションに対する安定化効果をもたらすことも可能であり、かつ／又は原子分解クライオＥＭ顕微鏡法によるイメージングに要求される、タンパク質質量の増大をもたらすことも可能であり、例えば、標識化されたタンパク質結合剤が使用された場合に、目視により検出可能な複合体をもたらすことも可能であり、質量分析など、代替的な適用をもたらすことも可能であるが、本明細書において提示される例に限定されない。本明細書において記載される方法のステップｃ）（又はｄ）におけるｃ）の反復）の溶出画分は、少なくとも、タンパク質複合体をもたらすが、また、さらなる緩衝液成分、残存不純物及び／又は溶出液へと添加されて、タンパク質複合体に適する解析条件をもたらす成分も含有しうる。さらに、目的の標的タンパク質及び置換剤を含む複合体はまた、ＮＡＮＥＸによる精製を介して、試料から単離される、タンパク質間複合体の部分として、標的タンパク質へと結合した、さらなるタンパク質も含有しうる。

具体的実施形態は、第２のタンパク質結合剤又は第４のタンパク質結合剤により認識され、これらに結合している標的タンパク質のエピトープが、とりわけ、本明細書において列挙される、ＧＦＰ、ｍＣｈｅｒｒｙ、ＧＳＴ、ＥＰＥＡ、ＳＭＴ３のリストから選択されるタグを含む、又はこれらのタグからなるタンパク質であるタンパク質複合体に関する。よって、タンパク質複合体は、群から選択されるタグを含む、又はこれらを構成する、第２の（又は第４の）タンパク質結合剤及び標的タンパク質を含む。さらに、タンパク質複合体は、結晶複合体又は結晶でありうる。

さらなる態様は、本明細書において記載されるタンパク質複合体の、構造解析、構造ベースの薬物デザイン、薬物発見、質量分析のための使用に関するが、また、診断ツールとしての使用又はインビボイメージングのための使用にも関する。実際、複合混合物中に存在する、希少タンパク質についての定量的質量分析は、シグナル対ノイズ比が低いために、しばしば、困難であり不確かである。こうして、本明細書において記載される精製法は、このような標的タンパク質の、ＭＳプロファイリング又は相互作用するタンパク質パートナーの同定のための、高度に純粋な解析用試料をもたらすのに有利でありうる。

さらに、本明細書において記載されるタンパク質複合体は、複合体の原子分解における三次元構造表示を、好ましくは、クライオＥＭ構造解析により得られる分解能を０．１～３Åの間とする高分解能においてもたらしうる。代替的実施形態において、本明細書において記載される結晶質タンパク質複合体は、具体的に、ＧＦＰ特異的ナノボディー及びＧＦＰである標的タンパク質の結晶に関する場合があり、この場合、ＧＦＰ特異的ナノボディーは、配列番号１又はこれとの、少なくとも９０％、少なくとも９５％若しくは少なくとも９９％の同一性を伴う配列に描示され、ＧＦＰタンパク質は、配列番号１６又はこれとの、少なくとも９０％、少なくとも９５％若しくは少なくとも９９％の同一性を伴う配列に描示され、結晶は、結晶格子定数が、ａ＝７４．４９７Å±５％、ｂ＝１０３．４５０Å±５％、ｃ＝２０９．７７４Å±５％、α＝９０．００°、β＝９０．００°、γ＝９０．００°（空間群：Ｐ２１２１２１）であることにより特徴づけられる。

配列番号１に描示されるＮｂの結合性部位又はＧＦＰタンパク質上のエピトープが、原子座標のサブセットと相互作用し、これらからなる結晶構造から、配列番号１６のアミノ酸残基番号：ＰＲＯ８９、ＧＬＵ９０、ＧＬＵ１１１、ＬＹＳ１１３、ＰＨＥ１１４、ＧＬＵ１１５、ＧＬＹ１１６からなる結合性部位がもたらされる。

結晶についての３Ｄ構造的表示により決定される結合性部位又はエピトープは、さらに、タンパク質複合体内に存在するタンパク質結合剤又はＩＳＶＤと比較して、それらのアフィニティーを低減する又はそれらのｋ_ｏｆｆを増大させる、突然変異体のＩＳＶＤなど、突然変異体のタンパク質結合剤をデザインし、作出することを可能としうる。複合体内に存在するタンパク質結合剤と、少なくとも１つのアミノ酸において異なる、このような突然変異体をデザインするために、当業者は、本明細書において規定される、標的タンパク質上のエピトープに対する、高いｋ_ｏｆｆ及び／又は低アフィニティーを得るように、当技術分野において利用可能な、（コンピュータ支援）方法に依拠する。本明細書において記載されるタンパク質複合体についての３Ｄ構造を使用して、当業者は、コンピュータ支援法を使用して、その結合性ドメインの３Ｄ構造から、結合剤内の突然変異を創出することが可能であり、当業者に、突然変異させられた結合性ドメインのモデルの、三次元モデル上の重合せを提示することをさらに可能とし、当業者に、突然変異させられた結合性ドメインが、標的タンパク質に対する、高いｋ_ｏｆｆ及び／又は低アフィニティーを結果としてもたらすのかどうかについて評価することを最後に可能とする。本明細書の実施例１及び２において提示される通り、ＧＦＰ結合剤も、同様にデザインされる。

最後に、構造ベースの薬物デザイン、薬物発見及び構造ベースの薬物スクリーニングにおける使用のための、本発明の方法及び手段の適用もまた、本明細書に包含される。構造ベースの薬物デザインの反復工程は、しばしば、最適化されたリード化合物が、フェーズＩ臨床試験へと移行する前に、複数のサイクルを経る。第１のサイクルは、標的タンパク質又は核酸のクローニング、精製及び３つの主要な方法：Ｘ線結晶構造解析、ＮＭＲ又は相同性モデル化のうちの１つによる構造決定を含む。コンピュータアルゴリズムを使用して、データベースによる化合物又は化合物の断片が、構造のうちの、選択された領域へと配置される。本発明の精製法及びＩＳＶＤベースのタンパク質結合剤を使用して、標的の、ある特定の構造的コンフォメーションを、精製し、固定しかつ／又は安定化させうる。選択された化合物は、それらの標的部位との立体相互作用及び静電相互作用に基づき、評定及びランク付けされ、最良の化合物は、生化学的アッセイにより調べられる。第２のサイクルにおいて、インビトロにおいて、少なくともマイクロモル濃度の阻害を伴う化合物である、第１のサイクルによる有望なリード化合物と複合体化した標的についての構造決定は、効力を増大させるように最適化されうる、化合物上の部位を明らかにする。本発明の精製タンパク質複合体は、ある特定のコンフォメーション状態にある標的についての構造解析を容易とするので、この点においてもまた関与しうる。さらなるサイクルは、最適化されたリード化合物の合成、新たな標的：リード化合物間複合体の構造決定及びリード化合物のさらなる最適化を含む。いくつかのサイクルにわたる薬物デザイン工程の後、最適化化合物は、通例、結合の顕著な改善を示し、しばしば、標的に対する特異性を示す。リード化合物へとさらに開発される、ヒットリード化合物をスクリーニングするライブラリーのために、構造活性相関解析のための構造情報並びに医薬品化学が不可欠である。ナノボディー又はＭｅｇａＢｏｄｙを使用する、提示された標的についての選択は、主にコンフォメーションエピトープに対する結合剤を明らかにするため、ナノボディー又はＭｅｇａＢｏｄｙなどのＩＳＶＤを含む、本明細書において記載されるタンパク質結合剤の適用は、適正にフォールディングされた標的タンパク質についての平均的イメージだけが含まれるという、薬物発見法のためのさらなる利点をもたらす。特に好ましい実施形態に従い、コンフォメーション選択的化合物を同定する、上記に記載された方法は、リガンド結合アッセイ又は競合アッセイ、なおより好ましくは、放射性リガンド結合アッセイ又は競合アッセイにより実施される。最も好ましくは、コンフォメーション選択的化合物を同定する、上記に記載された方法は、比較アッセイ、より具体的に、比較リガンド競合アッセイ、なおより具体的に、比較放射性リガンド競合アッセイにおいて実施される。被験化合物は、任意の小型の化学化合物又はタンパク質、糖、核酸若しくは脂質などの高分子でありうる。典型的に、被験化合物は、小型の化学化合物、ペプチド、抗体又はこれらの断片である。一部の場合に、被験化合物は、被験化合物のライブラリーでありうることが理解される。特に、アゴニスト、アンタゴニスト又はインバースアゴニスト及び／又はモジュレーターなどの治療用化合物のためのハイスループットスクリーニングアッセイは、本発明の一部を形成する。このようなライブラリーを調製し、スクリーニングするための方法は、当業者に公知である。被験化合物は、任意選択的に、検出可能な標識へと、共有結合的に連結される場合もあり、非共有結合的に連結される場合もある。適切な検出可能な標識及びそれらを接合させ、使用し、検出するための技法は、当業者に明らかであり、分光的手段、光化学的手段、生化学的手段、免疫化学的手段、電気的手段、光学的手段又は化学的手段により検出可能な、任意の組成物を含むがこれらに限定されない。このような標識を検出する手段は、当業者に周知である。したがって、例えば、放射性標識は、撮影フィルム又はシンチレーションカウンターを使用して検出される場合があり、蛍光マーカーは、発光照度を検出する光検出器を使用して検出されうる。酵素標識は、典型的に、酵素に、基質を供給し、基質上における酵素の作用により生成される、反応生成物を検出することにより検出され、比色標識は、着色された標識を、単に視覚化することにより検出される。上記のスクリーニング法のうちのいずれかにおいて使用される被験化合物は、ポリペプチド、ペプチド、低分子、天然の生成物、ペプチド模倣体、核酸、脂質、リポペプチド、炭水化物、Ｆａｂ、Ｆａｂ’及びＦ（ａｂ’）２、Ｆｄ、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、単鎖抗体、ジスルフィド連結されたＦｖ（ｄｓＦｖ）及びＶＬドメイン又はＶＨドメインを含む断片、重鎖抗体（ｈｃＡｂ）、単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）、ミニボディー、ラクダ科動物重鎖抗体に由来する可変ドメイン（ＶＨＨ又はナノボディー）、サメ抗体に由来する新規の抗原受容体の可変ドメイン（ＶＮＡＲ）など、抗体又はこれに由来する任意の断片、本明細書の前出において規定された、アルファボディー、プロテインＡ、プロテインＧ、ＤＡＲＰｉｎｓ（ｄｅｓｉｇｎｅｄａｎｋｙｒｉｎ－ｒｅｐｅａｔｄｏｍａｉｎｓ）、フィブロネクチン種類ＩＩＩリピート、アンチカリン、ノッチン、操作ＣＨ２ドメイン（ナノ抗体）を含むタンパク質足場を含む群から選択される。好ましい一実施形態において、ハイスループットスクリーニング法は、多数の、潜在的な治療用リガンドを含有する、コンビナトリアルの化学物質ライブラリー又はペプチドライブラリーを伴う。次いで、所望される特徴的活性を提示するライブラリーメンバー（特定の化学分子種又は化学的サブクラス）を同定するように、このような「コンビナトリアルライブラリー」又は「化合物ライブラリー」が、本明細書において記載される、１つ以上のアッセイにおいてスクリーニングされる。「化合物ライブラリー」とは、通例、ハイスループットスクリーニングにおいて最終的に使用される、保存された化学物質のコレクションである。「コンビナトリアルライブラリー」とは、多数の化学的「構成要素」を組み合わせることによる、化学合成又は生物学的合成により作出される、多様な化学化合物のコレクションである。コンビナトリアルライブラリーの調製及びスクリーニングは、当業者に周知である。このようにして同定された化合物は、従来の「リード化合物」として用いられる場合もあり、これら自体が、潜在的治療剤又は実際の治療剤として使用される場合もある。

本明細書において、本開示に従う方法、試料及びバイオマーカー生成物について、特定の実施形態、具体的構成並びに材料及び／又は分子が論じられてきたが、本発明の範囲から逸脱しない限りにおいて形態及び詳細の、多様な変化又は改変がなされうることが理解されるものとする。以下の実施例は、特定の実施形態を、より例示するために提示されるものであり、本出願を限定するものとは考えられないものとする。本出願は、特許請求の範囲だけにより限定される。

一般的序説
ナノボディー交換クロマトグラフィー（ＮＡＮＥＸ）は、本明細書において初めて記載され、交換クロマトグラフィーにおいて、標的タンパク質への結合について競合し、ＩＳＶＤ含有置換剤を使用する結合剤のために、本明細書において具体的に開発された、アフィニティー置換クロマトグラフィーの原理に基づく。図１は、目的のタンパク質（又は本明細書において互換的に使用される標的タンパク質）に対する結合剤としてのナノボディーの使用による、競合的アフィニティー交換の原理を図示する。目的のタンパク質は、まず、任意選択的に、固定化されうる捕捉剤抗原結合性タンパク質又は、特に、ナノボディーにより捕捉されるのに続き、洗浄ステップにかけられ、その後、置換剤又は剥離剤として作用し、標的タンパク質のエピトープを認識するその免疫グロブリン単一可変ドメインを介して抗原に特異的に結合する第２の結合剤を含有する溶出緩衝液の添加により、目的のタンパク質の特異的な溶出にかけられる。溶出された複合体は、第１の結合剤又は捕捉剤との反応速度的な競合を介して得られ、本明細書において示される通り、結合した第１のＮｂと、同じエピトープ若しくは大部分において重複するエピトープに結合することにより競合する又はアロステリックな差違若しくは反応速度的差違を介して、最小部分において重複するエピトープなお若しくは異なるエピトープにおいて、標的に結合することにより競合する剥離剤を適用することを可能とする。ＩＳＶＤ又はその機能的変異体を、置換剤として使用するための、主な反応速度的要件は、好ましくは、捕捉剤のｋ_ｏｆｆより低い解離速度定数（ｋ_ｏｆｆ）に関する。これは、しばしば、剥離剤について、捕捉剤と比較した高アフィニティーを結果としてもたらす。用量依存性もまた、捕捉及び剥離のために、同じ結合剤が使用され、したがって反応についてのｋ_ｏｆｆ値が等しい場合であってもなお、置換を可能とするが、これは、解離速度定数（ｋ_ｏｆｆ）が、良好な捕捉及び剥離を可能とする２時間未満の半減期を結果としてもたらす少なくとも０．０００１秒^－１である場合に限り、比較的効率的な反応をもたらす。より具体的に述べると、ｋ_ｏｆｆはまた、０．０００１秒^－１より低いことも可能であり、置換を結果としてもたらすが、解離半減期が長く、したがって、それほど好適ではない。具体的な実施形態において、ｋ_ｏｆｆは、少なくとも０．００００５又は０．００００１秒^－１でありうる。別の実施形態において、ｋ_ｏｆｆは、０．０００１～約０．０５秒^－１の範囲でありうる。

一般に、第１の結合剤が、標的に結合する混合物／カラムへの、この第２の競合的Ｎｂの添加のために、第１のＮｂへの標的の結合は、攪乱させられ、標的タンパク質は、第２のタンパク質結合剤又はＮｂに対する競合的結合を介して、第１のタンパク質結合剤又はＮｂから放出される結果として、目的のタンパク質の溶出をもたらす。モノクローナル抗体など、他の抗体について示される通り、エピトープが、大部分において重複する場合、競合は、第２の結合剤のエピトープに対する、第１の結合剤の遮断をもたらしうると予測することができるが、標的に対するＩＳＶＤ駆動性置換についての反応速度機構は、異なることが示された。さらに、本発明者らは、ｋ_ｏｆｆにより規定される、捕捉のための結合剤と、剥離のための結合剤との、最適の反応速度比が、ロバストかつ精緻な置換法及び精製法をもたらすことを示した。さらに、この新規の技術は、複合混合物から出発する場合であってもなお、迅速な単一の精製ステップの中において、高度な回収及び純度をもたらす、穏和な精製条件を可能とする。さらに、方法は、適用される結合剤の、高いアフィニティー及び特異性のために、極めて小さな試料サイズに対しても、適用可能である。

実施例は、ＮＡＮＥＸ技術の開発、適用及び最適化のための裏付けを提示し、ここでは、いくつかの態様が、強調されている。本明細書において言及される通り、結合剤は、実施例の大部分を通して、本明細書において提示される配列番号を介して連関させられる、特異的Ｎｂクローンについての配列情報に関する「ＣＡ」番号付けにより、本明細書において描示されるＩＳＶＤ又はナノボディーに関する。本明細書に与えられる実施例は、限定的なものではなく、当業者が、ＮＡＮＥＸ技術を、多目的に適用することを可能とするように、分離可能な方式を提示する。

概観として、実施例は、まず、周知の、容易に追跡可能な標的タンパク質である、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）をターゲティングすることによりなされる、概念の実証を提示するが、ここでは、より具体的に、最適の方法をデザインするための、Ｎｂのサブセットが作出された。特に、実施例１及び２において、ＧＦＰに結合した高（低ピコモル濃度）アフィニティーＮｂの結晶構造に基づき、パラトープ残基の突然変異により、多数の捕捉剤／剥離剤対合Ｎｂをデザインし、作製し、精製し、反応速度定数を決定するように、ＢＬＩにより解析した。実施例１～６において、ＧＦＰ上の同じエピトープを、異なる反応速度定数によりターゲティングする、これらのＮｂ結合剤を、いくつかの組合せにおいて、それらの相対的な置換可能性について調べたが、これは、標的の同じエピトープをターゲティングする結合対を、置換のために使用しうるが、ただし、主に、ｋ_ｏｆｆ値の相対差により指定される、ある特定の反応速度制限を伴うと結論することを可能とする。適切な捕捉剤／剥離剤対を作出する、別の方途は、剥離剤のアビディティーの、標的と比較した増大に関する。これは、剥離剤が、二価ＩＳＶＤであり、捕捉剤が、ＧＦＰタンパク質に融合されたＥＰＥＡタグをターゲティングする一価ＩＳＶＤである、実施例１２において示されている。

同じエピトープについて競合するＮｂ対を使用するほかに、反応速度的エピトープであるが、部分的に重複するに過ぎない（又は大部分において重複しない）エピトープである標的について競合するナノボディー結合対もまた、実施例１５において、第ＩＸ因子などについて、置換を可能とすることが裏付けられている。

実施例９、１０及び１６において示される通り、剥離剤として使用可能である、なお又は実施例２４において示される通り、捕捉剤としても使用可能である、ＧＦＰをターゲティングするＭｅｇａＢｏｄｙの場合と同様であり、本明細書に示される通り、純粋なＮｂに加え、機能化形態など、ＩＳＶＤの機能的変異体も、捕捉剤又は剥離剤として使用されうる。

本明細書において、ＧＦＰについての実施例１～１０及び１８、ＥＰＥＡについての実施例１２、ＧＳＴについての実施例１９、ＳＭＴ３についての実施例２０並びにｍＣｈｅｒｒｙについての実施例２１及び２２において示される通り、市販のタグをターゲティングするさらなる捕捉剤／剥離剤対も開発された。結合剤／標的間複合体の構造情報に基づき、対をデザインし、作出するほかに、実施例２１及び２２はまた、適切な対を得るのに、より簡潔ツールが利用可能であることも裏付ける。

さらに、標的タンパク質は、ＮＡＮＥＸのためのタグを要求せず、シナプトジャニンについての実施例１３、第ＩＸ因子についての実施例１４、１５、１６、並びに２３及び２４において示された通り、天然エピトープ又は内因的に提示された特異的エピトープにおいてもまた、認識されうる。

ＮＡＮＥＸを使用する精製は、また、ＰＰＩ複合体を同定し、精製することも可能とするので、タンパク質間相互作用（ＰＰＩ）の分野において、別の適用も裏付けられている。これは、ＧＦＰ捕捉剤／剥離剤対により精製された、ｅＧＦＰ－ＧＲ（グルココルチコイド受容体）（実施例２５）及びｅＧＦＰ－ＡＲｂ（アンドロゲン受容体）（実施例２６）について示され、これらの核内受容体と共に、複合体を形成することが公知のＨＳＰタンパク質の共精製を明らかにした。

ＮＡＮＥＸを適用するためのキット及び生成物をデザインする可能性について、本発明者らは、溶液中において、剥離剤をさらに適用するように、捕捉剤を固定化する、いくつかの方途を裏付けた。例えば、実施例１～５において、アガロースビーズを使用して、捕捉剤を固定化し、実施例２７において、磁気ビーズを使用した。さらに、例えば、実施例６～１０において、捕捉剤であるＮｂの固定化は、樹脂へのカップリング及びカラム内の充填により得た。システムを小型化するために、実施例１１において、マイクロカラムを適用し、実施例２８において、マイクロチップの試作品について調べた。

最後に、本明細書において、例えば、細菌溶解物（例えば、実施例１及びさらなる実施例における）、酵母抽出物（例えば、実施例１７、２７における）、ヒト血漿（実施例２３及び２４における）及びＨＥＫ細胞溶解物（実施例２５、２６における）、全ての複合混合物は、ＮＡＮＥＸを使用して、１ステップの精製選択肢をもたらすので、精製のために使用されうる試料の多様性は、実施例から明らかである。さらに、第２の精製ステップが所望される場合、ＮＡＮＥＸを、逐次的に使用しかつ／又は複数の捕捉剤／剥離剤対を使用するタンデム精製も、同様になされる（例えば、実施例１６）。

［実施例１］ＨｉＴｒａｐＮＨＳ－ａｃｔｉｖａｔｅｄＳｅｐｈａｒｏｓｅＨＰカラム上の固定化捕捉剤としてのＮｂＣＡ１５８１６及び剥離剤としてのＮｂＣＡ１２７６０を使用するＮＡＮＥＸクロマトグラフィーによる、細菌溶解物中にスパイクされたＧＦＰタンパク質の精製
タンパク質が、ナノボディー交換クロマトグラフィー（ＮＡＮＥＸ）により精製されうることを概念実証するために、本発明者らは、ＧＦＰ上の、実質的に同じエピトープ又は大部分において重複するエピトープに結合する、２つのナノボディーを選択し、これらのナノボディーを使用して、図１に従い、ＧＦＰタンパク質を精製した。

まず、本発明者らは、剥離剤として使用されるように、標準的な手順（Ｐａｒｄｏｎら、２０１４）に従い、ＧＦＰに対する高アフィニティーのナノボディーを選択した。ＣＡ１２７６０を、低ピコモル濃度のアフィニティーにより、ＧＦＰタンパク質に結合するナノボディーとして選択した。バイオレイヤー干渉（ＢＬＩ）アッセイは、アフィニティー（Ｋ_Ｄ）が、４０ｐＭであり、ｋ_ｏｎが、２．５６×１０^５（Ｍ^－１×秒^－１）であり、ｋ_ｏｆｆが、０．０３２×１０^－３（秒^－１）であることを同定した。ＮＡＮＥＸクロマトグラフィーを実施するために、本発明者らは、次に、部位指向突然変異誘発により、捕捉剤として、固相上に固定化される、ＧＦＰ上の、実質的に同じエピトープ又は大部分において重複するエピトープに結合するナノボディーをデザインした。ＮＡＮＥＸを、標的を競合的に溶出させるのに使用される剥離剤であるナノボディーと比較して、低アフィニティー及び／又は高いオフ速度を有し、反対に、標的のタンパク質に対する、高アフィニティー及び／又は低いオフ速度を有する、固定化捕捉剤であるナノボディーと共に使用する場合に、最大の溶出を得ることができた。ＧＦＰ・ＣＡ１２７６０タンパク質複合体の構造（図３、実施例２）に基づき、本発明者らは、ＣＡ１２７６０の、低アフィニティー及び高いオフ速度を伴う操作変化形としてのＣＡ１５８１６をデザインした。実際、ＣＡ１５８１６は、そのアフィニティーを、ＣＡ１２７６０と比較して低下させるように、パラトープ内に含有される２つの残基の突然変異（Ｔ５４Ａ、Ｖ５５Ａ）によりデザインした。

ＢＬＩアッセイは、ＧＦＰのエピトープに対する、ＣＡ１５８１６のアフィニティー（Ｋ_Ｄ）が、２．７ｎＭであり、ｋ_ｏｎが、８．３５×１０^５（Ｍ^－１×秒^－１）であり、ｋ_ｏｆｆが、２．２５×１０^－３（秒^－１）であることを同定した。１ｍｇ（６６．６７ナノモル）のＣＡ１５８１６Ｎｂを、供給元の推奨に従い、ＨｉＴｒａｐＮＨＳ－ａｃｔｉｖａｔｅｄＳｅｐｈａｒｏｓｅＨＰカラム（ＧＥ）上に固定化した。１０ｍＬの細菌溶解物（ＬＢ中において増殖させた、０．５ＬのＥ．コリー培養物の細胞ペレットと同等である）を、２ｍｇのＧＦＰと共にスパイクした。スパイクされた溶解物を、シリンジを使用して、ＣＡ１５８１６カラム上にロードし、これを、１０ｍＬ（１０カラム容量（ＣＶ））の緩衝液（１００ｍＭのＨｅｐｅｓｐＨ７．５、１５０ｍＭのＮａＣｌ）により、２回にわたり洗浄した。次いで、８ＣＶの溶出緩衝液（１００ｍＭのＨｅｐｅｓｐＨ７．５、１５０ｍＭのＮａＣｌ、６６．６７μＭの剥離剤Ｎｂ（１ｍｇ／ｍＬ））中の剥離剤を、０．１ｍＬ／分の流量において使用する溶出のために、カラムを、ＡｋｔａｐｕｒｅＦＰＬＣシステム（ＧＥ）に接続した。溶出物は、５００μｌの画分中に回収し、主溶出ピークは、ＳＤＳ／ＰＡＧＥゲルにより解析した（図２）。カラムの再生は、ｐＨ２．３における、８ＣＶの２００ｍＭグリシン緩衝液により得た。

２８０ｎｍ（タンパク質による吸光）及び４８８ｎｍ（ＧＦＰフルオロフォアによる吸光）における吸光度を測定することにより、剥離剤としてのＣＡ１２７６０により、そのカラムから溶出される、ＨｉＴｒａｐＮＨＳ－ａｃｔｉｖａｔｅｄＳｅｐｈａｒｏｓｅＨＰカラム上の固定化捕捉剤としてのＣＡ１５８１６を使用する、ＧＦＰタンパク質の精製をモニタリングした。溶出プロファイルから、本発明者らは、洗浄が、不純物の大半を除去するために十分であり、溶出画分２及び３が、剥離剤Ｎｂ及び、主ピーク内に検出されるＧＦＰタンパク質を含有したと結論することができる。２８０ｎｍにおける、小さなピークは、再生緩衝液により洗い落とされたカラム上に残存する試料（又はＧＦＰタンパク質）の量を表す。

同じエピトープに対する結合剤を使用する、ナノボディー交換クロマトグラフィー（ＮＡＮＥＸ）は、固定化ナノボディー（捕捉剤）が、高いオフ速度及び／又は低アフィニティーを有する一方、標的を競合的に溶出させるのに使用されるナノボディー（剥離剤）は、標的タンパク質に対する、低いオフ速度及び／又は高アフィニティーを有する結果として、最適の収率及び純度をもたらすことを要求する。この原理を実証するために、本発明者らは、実施例２～８において、同じＧＦＰのエピトープをターゲティングするが、アフィニティー及びオフ速度（ｋ_ｏｆｆ）が様々である、異なる捕捉剤－剥離剤対によるＮＡＮＥＸ実験を実施した。

［実施例２］ＮＨＳ活性化アガロースビーズ上の固定化捕捉剤としてのＮｂＣＡ１２７６０及び剥離剤としてのＮｂであるＣＡ１２７６０、ＣＡ１５８１８、ＣＡ１５８１６、ＣＡ１５８６１のそれぞれを使用する、ＧＦＰタンパク質の精製
本実施例において、本発明者らは、高アフィニティーの捕捉剤を、低アフィニティーの剥離剤と、好都合に組み合わせられないことを示す。

本実施例は、ＧＦＰに、低ピコモル濃度のアフィニティーにより特異的に結合するナノボディーである、捕捉剤としてのＣＡ１２７６０（配列番号１）を使用する、ＧＦＰのアフィニティー精製について記載する。ＢＬＩアッセイは、アフィニティー（Ｋ_Ｄ）が、４０ｐＭであり、ｋ_ｏｎが、２．５６×１０^５（Ｍ^－１×秒^－１）であり、ｋ_ｏｆｆが、０．０３２×１０^－３（秒^－１）であることを同定した。

ＧＦＰ・ＣＡ１２７６０のエピトープ及びパラトープを同定するために、本発明者らは、Ｘ線結晶構造解析により、この複合体の構造を解明した（図３）。ＧＦＰ（配列番号１６に描示される）及びＧＦＰ－ナノボディー（配列番号１）を含む結晶は、以下の格子定数：ａ＝７４．４９７Å±５％、ｂ＝１０３．４５０Å±５％、ｃ＝２０９．７７４Å±５％、α＝９０°、β＝９０°、γ＝９０°を伴う空間群であるＰ２１２１２１内にある。この結晶は、本明細書において、ＮｂＣＡ１２７６０と共に水素結合下にあり、配列番号１６のアミノ酸Ｐｒｏ８９、Ｇｌｕ９０、Ｇｌｕ１１１、Ｌｙｓ１１３、Ｐｈｅ１１４、Ｇｌｕ１１５及びＧｌｙ１１６として同定される、ＧＦＰタンパク質のアミノ酸残基（配列番号１６）により形成されるものとして規定される、結合性部位を、さらに描出することを可能とした。ＧＦＰ・ＣＡ１２７６０の構造に基づき、本発明者らは、ＣＡ１２７６０のアフィニティーを低下させるために、ＧＦＰ特異的ＮｂであるＣＡ１２７６０のパラトープ領域内において突然変異させられる、３つの鍵となる残基（Ｔｈｒ５４、Ｖａｌ５５、Ｐｈｅ１０３）を同定した（図４）。

・ＣＡ１５８１８Ｎｂは、そのアフィニティーを、ＣＡ１２７６０と比較して低下させるように、１つの残基（Ｆ１０３Ａ）を突然変異させている。ＢＬＩアッセイは、ＣＡ１５８１８のアフィニティー（Ｋ_Ｄ）が、１．５ｎＭであり、ｋ_ｏｎが、３．８７×１０^５（Ｍ^－１×秒^－１）であり、ｋ_ｏｆｆが、０．２９×１０^－３（秒^－１）であることを同定した（図５及び表１）。

・ＣＡ１５８１６は、ＧＦＰ・ＣＡ１２７６０の構造に基づきデザインし、２つの残基（Ｔ５４Ａ、Ｖ５５Ａ）を、そのアフィニティーを、ＣＡ１２７６０と比較して低下させるように突然変異させる。ＢＬＩアッセイは、ＣＡ１５８１６のアフィニティー（Ｋ_Ｄ）が、２．７ｎＭであり、ｋ_ｏｎが、８．３５×１０^５（Ｍ^－１×秒^－１）であり、ｋ_ｏｆｆが、２．２５×１０^－３（秒^－１）であることを同定した。

・ＣＡ１５８６１は、ＧＦＰ・ＣＡ１２７６０の構造に基づきデザインし、３つの残基（Ｔ５４Ａ、Ｖ５５Ａ、Ｆ１０３）を、そのアフィニティーを、ＣＡ１２７６０と比較して低下させるように突然変異させる。ＢＬＩアッセイは、ＣＡ１５８６１のアフィニティー（Ｋ_Ｄ）が、１１１ｎＭであり、ｋ_ｏｎが、２８．８５×１０５（Ｍ^－１×秒^－１）であり、ｋ_ｏｆｆが、４５．８×１０^－３（秒^－１）であることを同定した。

半減期は、ｋ_ｏｆｆ（ｔ_１／２＝ｌｎ２／ｋ_ｏｆｆ）の関数において規定され、半減期比は、本明細書において、ｗｔＮｂ並びにＫ_Ｄ比と比べて規定される。

ＧＦＰを精製するために、本発明者らは、供給元の推奨に従い、４ｍｇの捕捉剤であるＮｂＣＡ１２７６０を、５００μｌのＮＨＳ活性化アガロースビーズ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）上に、共有結合的に固定化した。２００μｇ（７．６９ナノモル）の精製ＧＦＰを、１００ｍＭのＨｅｐｅｓ緩衝液ｐＨ７．５、１５０ｍＭのＮａＣｌ中に、１ｍＬの最終容量において、５０μｌのＣＡ１２７６０Ｎｂカップリングアガロースビーズ上にロードした。ＧＦＰタンパク質を、このアフィニティーマトリックスから特異的に溶出させるために、本発明者らは、剥離剤としてのＣＡ１２７６０、ＣＡ１５８１８（配列番号２）、ＣＡ１５８１６（配列番号３）、ＣＡ１５８６１（配列番号４）を使用した。

ＮＨＳ活性化アガロースビーズ上の固定化捕捉剤としてのＣＡ１２７６０及び剥離剤としてのＣＡ１２７６０、ＣＡ１５８１８、ＣＡ１５８１６、ＣＡ１５８６１を使用する、ＧＦＰの精製を、溶出緩衝液（１００ｍＭのＨｅｐｅｓｐＨ７．５、１５０ｍＭのＮａＣｌ、５３μＭの剥離剤Ｎｂ（８００μｇ／ｍＬ））中において実施し、５つの異なる時点（０、１５、３０、６０、１２０分後）において、４８８ｎｍにおける吸光度（ＧＦＰ蛍光タンパク質の量を指し示す）を測定することにより、モニタリングした（図６）。溶出時におけるＧＦＰフルオロフォアの吸光度プロファイルから、本発明者らは、ピコモル濃度のアフィニティーを伴う、高アフィニティーの捕捉剤であるＮｂを、剥離剤としての同じＮｂと組み合わせて使用すること又は低アフィニティーのＮｂ（捕捉剤と比較して）を、剥離剤として使用することが、ビーズからの、ＧＦＰタンパク質の、迅速かつ定量的な溶出をもたらさないと結論することができる。

［実施例３］ＮＨＳ活性化アガロースビーズ上の固定化捕捉剤としてのＮｂＣＡ１５８１８及び剥離剤としてのＮｂであるＣＡ１２７６０、ＣＡ１５８１８、ＣＡ１５８１６、ＣＡ１５８６１を使用する、ＧＦＰの精製
本実施例において、中アフィニティーの捕捉剤を、高アフィニティーの剥離剤及び低アフィニティーの剥離剤のそれぞれと組み合わせた。

本実施例は、捕捉剤としてのＣＡ１５８１８（実施例２及び表１を参照されたい）を使用する、ＧＦＰタンパク質のアフィニティー精製について記載する。ＧＦＰを精製するために、本発明者らは、供給元の推奨に従い、４ｍｇの捕捉剤であるＣＡ１５８１８を、５００μｌのＮＨＳ活性化アガロースビーズ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）上に、共有結合的に固定化した。２００μｇ（７．６９ナノモル）の精製ＧＦＰを、１００ｍＭのＨｅｐｅｓ緩衝液ｐＨ７．５、１５０ｍＭのＮａＣｌ中に、１ｍＬの最終容量において、５０μｌのＣＡ１５８１８Ｎｂカップリングアガロースビーズ上にロードした。ＧＦＰを、このアフィニティーマトリックスから特異的に溶出させるために、本発明者らは、剥離剤としてのＣＡ１２７６０、ＣＡ１５８１８、ＣＡ１５８１６、ＣＡ１５８６１（表１を参照されたい）を使用した。

ＮＨＳ活性化アガロースビーズ上の固定化捕捉剤としてのＮｂＣＡ１５８１８及び剥離剤としてのＣＡ１２７６０、ＣＡ１５８１８、ＣＡ１５８１６、ＣＡ１５８６１を使用する、ＧＦＰタンパク質の精製を、溶出緩衝液（１００ｍＭのＨｅｐｅｓｐＨ７．５、１５０ｍＭのＮａＣｌ、５３μＭの剥離剤Ｎｂ（８００μｇ／ｍＬ））中において実施し、５つの異なる時点（０、１５、３０、６０、１２０分後）において、４８８ｎｍにおける吸光度を測定することにより、モニタリングした（図７）。溶出についての、ＧＦＰフルオロフォアの吸光度プロファイルから、本発明者らは、ナノモル濃度のアフィニティーを伴う捕捉剤であるＮｂを、捕捉剤（ＣＡ１２７６０Ｎｂ）の約３５倍のアフィニティーを伴う、ピコモル濃度の剥離剤であるＮｂと組み合わせて使用することが、ＧＦＰの、実施例２における結果と比較した、良好な溶出を可能とすると結論することができる。さらに、本発明者らは、実施例２と同様に、剥離剤であるＮｂより高アフィニティーを伴う捕捉剤であるＮｂの使用が、ビーズからの、ＧＦＰタンパク質の、迅速かつ定量的な溶出をもたらさないことを確認する。

［実施例４］ＮＨＳ活性化アガロースビーズ上の固定化捕捉剤としてのＮｂＣＡ１５８１６及び剥離剤としてのＮｂであるＣＡ１２７６０、ＣＡ１５８１８、ＣＡ１５８１６、ＣＡ１５８６１を使用する、ＧＦＰタンパク質の精製
本実施例において、本発明者らは、低アフィニティーの捕捉剤を、高アフィニティーの剥離剤及び低アフィニティーの剥離剤のそれぞれと組み合わせた。

本実施例は、捕捉剤としてのＣＡ１５８１６Ｎｂ（実施例２及び表１を参照されたい）を使用する、ＧＦＰのアフィニティー精製について記載する。ＧＦＰを精製するために、本発明者らは、供給元の推奨に従い、４ｍｇの捕捉剤であるＣＡ１５８１６Ｎｂを、５００μｌのＮＨＳ活性化アガロースビーズ上に、共有結合的に固定化した。２００μｇ（７．６９ナノモル）の精製ＧＦＰを、１００ｍＭのＨｅｐｅｓ緩衝液ｐＨ７．５、１５０ｍＭのＮａＣｌ中に、１ｍＬの最終容量において、５０μｌのＣＡ１５８１６Ｎｂカップリングアガロースビーズ上にロードした。ＧＦＰタンパク質を、このアフィニティーマトリックスから特異的に溶出させるために、本発明者らは、剥離剤としてのＮｂである、ＣＡ１２７６０、ＣＡ１５８１８、ＣＡ１５８１６及びＣＡ１５８６１（実施例２、表１を参照されたい）を使用した。ＮＨＳ活性化アガロースビーズ上の固定化捕捉剤としてのＣＡ１５８１６Ｎｂ及び剥離剤としてのＮｂである、ＣＡ１２７６０、ＣＡ１５８１８、ＣＡ１５８１６、ＣＡ１５８６１を使用する、ＧＦＰの精製を、溶出緩衝液（１００ｍＭのＨｅｐｅｓｐＨ７．５、１５０ｍＭのＮａＣｌ、５３μＭの剥離剤Ｎｂ（８００μｇ／ｍＬ））中において実施し、５つの異なる時点（０、１５、３０、６０、１２０分後）において、４８８ｎｍにおける吸光度を測定することにより、モニタリングした（図８）。溶出についての、ＧＦＰフルオロフォアの吸光度プロファイルから、本発明者らは、ナノモル濃度のアフィニティーを伴う捕捉剤であるＮｂ（ＣＡ１５８１６）を、捕捉剤の約２００倍のアフィニティーを伴う、ピコモル濃度の剥離剤であるＮｂ（ＣＡ１２７６０）と組み合わせて使用することが、カラムからの、ＧＦＰの、迅速かつ定量的な溶出を可能とすると結論することができる。さらに、わずかに２倍という、わずかに高アフィニティーのＮｂ（ＣＡ１５８１８）又は等しいアフィニティーのＮｂ（ＣＡ１５８１６）によるビーズの剥離が、ＧＦＰのほぼ完全な溶出を可能とするのに対し、捕捉剤と比較して約１００分の１の低アフィニティーを伴う剥離剤Ｎｂの使用は、ＧＦＰタンパク質の回収又は溶出を可能としない。

［実施例５］ＮＨＳ活性化アガロースビーズ上の固定化捕捉剤としてのＮｂＣＡ１５８６１及び剥離剤としてのＮｂであるＣＡ１２７６０、ＣＡ１５８１８、ＣＡ１５８１６、ＣＡ１５８６１を使用する、ＧＦＰタンパク質の精製
本実施例において、本発明者らは、低アフィニティーの捕捉剤を、高アフィニティー剥離剤のそれぞれと組み合わせた。

本実施例は、捕捉剤としてのＣＡ１５８６１Ｎｂ（実施例２及び表１を参照されたい）を使用する、ＧＦＰのアフィニティー精製について記載する。ＧＦＰを精製するために、本発明者らは、供給元の推奨に従い、４ｍｇの捕捉剤であるＣＡ１５８６１Ｎｂを、５００μｌのＮＨＳ活性化アガロースビーズ上に、共有結合的に固定化した。２００μｇ（７．６９ナノモル）の精製ＧＦＰタンパク質を、１００ｍＭのＨｅｐｅｓ緩衝液ｐＨ７．５、１５０ｍＭのＮａＣｌ中に、１ｍＬの最終容量において、５０μｌのＣＡ１５８６１Ｎｂカップリングアガロースビーズ上にロードした。ＧＦＰを、このアフィニティーマトリックスから特異的に溶出させるために、本発明者らは、剥離剤としてのＮｂである、ＣＡ１２７６０、ＣＡ１５８１８、ＣＡ１５８１６及びＣＡ１５８６１（実施例２及び表１を参照されたい）を使用した。ＮＨＳ活性化アガロースビーズ上の固定化捕捉剤としてのＣＡ１５８６１及び剥離剤としてのＣＡ１２７６０、ＣＡ１５８１８、ＣＡ１５８１６、ＣＡ１５８６１を使用する、ＧＦＰの精製を、溶出緩衝液（１００ｍＭのＨｅｐｅｓｐＨ７．５、１５０ｍＭのＮａＣｌ、５３μＭの剥離剤Ｎｂ（８００μｇ／ｍＬ））中において実施し、５つの異なる時点（０、１５、３０、６０、１２０分後）において、４８８ｎｍにおける吸光度を測定することにより、モニタリングした（図９）。本発明者らは、捕捉剤であるＮｂ（ＣＡ１５８６１）のアフィニティー（マイクロモル濃度範囲）が、ビーズ上のＧＦＰを捕捉するのに、低過ぎると結論することができる。

［実施例６］ＨｉＴｒａｐＮＨＳ－ａｃｔｉｖａｔｅｄＳｅｐｈａｒｏｓｅＨＰカラム上の固定化捕捉剤としてのＮｂＣＡ１２７６０及び剥離剤としてのＮｂであるＣＡ１２７６０、ＣＡ１５８１８、ＣＡ１５８１６、ＣＡ１５８６１を使用する、ナノボディー交換クロマトグラフィーによる、ＧＦＰタンパク質の精製
本実施例において、本発明者らは、ＦＰＬＣ（ＡｋｔａＰｕｒｅ－ＧＥ）システムへと接続された、１ｍＬのカラム（１ｍＬＣＶ）を使用する、ＨｉＴｒａｐＮＨＳ－ａｃｔｉｖａｔｅｄＳｅｐｈａｒｏｓｅＨＰビーズへとカップリングされた、ＣＡ１２７６０Ｎｂ（実施例２及び表１を参照されたい）を使用する、ＧＦＰのアフィニティー精製のために、高アフィニティーの捕捉剤を、低アフィニティーの剥離剤（実施例２と類似するが、あらかじめ充填されたカラム内に含有されるビーズ上に固定化された捕捉剤を使用する）と組み合わせた。ＧＦＰを、このアフィニティーマトリックスから特異的に溶出させるために、本発明者らは、剥離剤としてのＣＡ１２７６０、ＣＡ１５８１８、ＣＡ１５８１６、ＣＡ１５８６１のそれぞれ（実施例２及び表１を参照されたい）を使用した。１ｍｇ（６６．６７ナノモル）のＣＡ１２７６０を、供給元の推奨に従い、１ｍＬのカラム（ＧＥ）内にあらかじめ充填された、ＨｉＴｒａｐＮＨＳ－ａｃｔｉｖａｔｅｄＳｅｐｈａｒｏｓｅＨＰビーズ上に固定化した。２ｍｇ（７６．９２ナノモル）のＧＦＰを、注入ループを介して、ＣＡ１２７６０ｎｂカップリングカラム上にロードした。１０ＣＶの１００ｍＭＨｅｐｅｓ洗浄緩衝液ｐＨ７．５、１５０ｍＭＮａＣｌを、カラム上に通して、結合しなかった材料を除去した。溶出は、８ＣＶの溶出緩衝液（１００ｍＭのＨｅｐｅｓ緩衝液ｐＨ７．５、１５０ｍＭのＮａＣｌ、６６．６７μＭの剥離剤Ｎｂ（１ｍｇ／ｍＬ））を、０．１ｍＬ／分の流量において使用して実施した。溶出ピークは、５００μｌの画分中に回収し、ＳＤＳ／ＰＡＧＥゲル中において解析した（図１０）。カラムの再生は、８ＣＶの２００ｍＭグリシン緩衝液ｐＨ２．３により得た。

２８０ｎｍ（タンパク質による吸光）及び４８８ｎｍ（ＧＦＰフルオロフォアによる吸光）における吸光度を測定することにより、ＨｉＴｒａｐＮＨＳ－ａｃｔｉｖａｔｅｄＳｅｐｈａｒｏｓｅＨＰカラム上の固定化捕捉剤としてのＣＡ１２７６０及び剥離剤としてのＮｂである、ＣＡ１２７６０、ＣＡ１５８１８、ＣＡ１５８１６、ＣＡ１５８６１を使用する、ＧＦＰタンパク質の精製をモニタリングした（図１０）。溶出時におけるＧＦＰフルオロフォアの吸光度プロファイル及び溶出画分についてのＳＤＳ－ＰＡＧＥ解析から、本発明者らは、ピコモル濃度のアフィニティーを伴う捕捉剤であるＮｂを、剥離剤である同じＮｂと組み合わせて使用すること又は低アフィニティーのＮｂ（捕捉剤と比較して）を、剥離剤として使用することが、カラムからの、ＧＦＰの、迅速かつ定量的な溶出をもたらさないのに対し、再生ステップ時に溶出されるピークは、大半のＧＦＰタンパク質が、カラム上になおも存在し、低ｐＨを使用する場合に限り、溶出されることを指し示す（低いｐＨは、４８８ｎｍにおける、ＧＦＰのフルオロフォアの吸光を消失させる）と結論することができる。

［実施例７］ＨｉＴｒａｐＮＨＳ－ａｃｔｉｖａｔｅｄＳｅｐｈａｒｏｓｅＨＰカラム上の固定化捕捉剤としてのＮｂＣＡ１５８１６及び剥離剤としてのＮｂであるＣＡ１２７６０、ＣＡ１５８１８、ＣＡ１５８１６、ＣＡ１５８６１を使用する、ナノボディー交換クロマトグラフィーによる、ＧＦＰタンパク質の精製
本実施例において、本発明者らは、ＦＰＬＣ（ＡｋｔａＰｕｒｅ－ＧＥ）システムへと接続された、１ｍＬのカラム（ＧＥ）内にあらかじめ充填された、ＨｉＴｒａｐＮＨＳ－ａｃｔｉｖａｔｅｄＳｅｐｈａｒｏｓｅＨＰビーズへとカップリングされた、ＣＡ１５８１６Ｎｂ（実施例２、表１を参照されたい）による、ＧＦＰのアフィニティー精製のために、低アフィニティーの捕捉剤を、高アフィニティーの剥離剤及び低アフィニティーの剥離剤（実施例４と類似するが、あらかじめ充填されたカラム内に含有されるビーズ上に固定化された捕捉剤を使用する）と組み合わせた。ＧＦＰを、このアフィニティーマトリックスから特異的に溶出させるために、本発明者らは、剥離剤としてのＣＡ１２７６０、ＣＡ１５８１８、ＣＡ１５８１６、ＣＡ１５８６１のそれぞれ（実施例２、表１を参照されたい）を使用した。１ｍｇ（６６．６７ナノモル）のＣＡ１５８１６Ｎｂを、供給元の推奨に従い、１ｍＬのカラム（１ｍＬＣＶ）（ＧＥ）内にあらかじめ充填された、ＨｉＴｒａｐＮＨＳ－ａｃｔｉｖａｔｅｄＳｅｐｈａｒｏｓｅＨＰビーズ上に固定化した。２ｍｇ（７６．９２ナノモル）のＧＦＰタンパク質を、注入ループを介して、ＣＡ１５８１６Ｎｂカップリングカラム上にロードした。１０ＣＶの洗浄緩衝液（１００ｍＭのＨｅｐｅｓｐＨ７．５、１５０ｍＭのＮａＣｌ）を、カラム上に通すのに続き、８ＣＶの溶出緩衝液（１００ｍＭのＨｅｐｅｓｐＨ７．５、１５０ｍＭのＮａＣｌ、６６．６７μＭの剥離剤Ｎｂ（１ｍｇ／ｍＬ））を、０．１ｍＬ／分の流量において使用して、結合しなかった材料を除去した。溶出ピークは、５００μｌの画分中に回収し、ＳＤＳ／ＰＡＧＥゲル中において解析した（図１１）。カラムの再生は、８ＣＶの２００ｍＭグリシン緩衝液ｐＨ２．３により得た。

２８０ｎｍ（タンパク質による吸光）及び４８８ｎｍ（ＧＦＰフルオロフォアによる吸光）における吸光度を測定することにより、ＨｉＴｒａｐＮＨＳ－ａｃｔｉｖａｔｅｄＳｅｐｈａｒｏｓｅＨＰカラム上の固定化捕捉剤としてのＣＡ１５８１６及び剥離剤としてのＮｂである、ＣＡ１２７６０、ＣＡ１５８１８、ＣＡ１５８１６、ＣＡ１５８６１を使用する、ＧＦＰタンパク質の精製をモニタリングした（図１１）。溶出時におけるＧＦＰフルオロフォアの吸光度プロファイル及び溶出画分についてのＳＤＳ－ＰＡＧＥ解析から、本発明者らは、カラムの再生時に溶出されるタンパク質は残存しないので、ナノモル濃度のアフィニティーを伴う捕捉剤であるＮｂ（ＣＡ１５８１６）を、捕捉剤の約２００倍のアフィニティーを伴う、ピコモル濃度の剥離剤であるＮｂ（ＣＡ１２７６０）と組み合わせて使用することが、カラムからの、ＧＦＰの、迅速かつ定量的な溶出を可能とすると結論することができる。さらに、再生時における２８０ｎｍのピークは、極めて低いので、わずかに２倍という、わずかに高アフィニティーのＮｂ（ＣＡ１５８１８）又は等しいアフィニティーのＮｂ（ＣＡ１５８１６）によるカラムの剥離が、ＧＦＰのほぼ完全な溶出も可能とするのに対し、捕捉剤と比較して約１００分の１の低アフィニティーである剥離剤Ｎｂ（ＣＡ１５８６１）の使用は、ＧＦＰタンパク質の回収又は溶出を可能としない。

［実施例８］ＨｉＴｒａｐＮＨＳ－ａｃｔｉｖａｔｅｄＳｅｐｈａｒｏｓｅＨＰカラム上の固定化捕捉剤としてのＮｂＣＡ１５８６１及び剥離剤としてのＮｂであるＣＡ１２７６０、ＣＡ１５８１８、ＣＡ１５８１６、ＣＡ１５８６１を使用する、ナノボディー交換クロマトグラフィーによる、ＧＦＰタンパク質の精製
本実施例において、本発明者らは、ＦＰＬＣ（ＡｋｔａＰｕｒｅ－ＧＥ）システムへと接続された、１ｍＬのカラム（実施例２、表１を参照されたい）を使用する、ＨｉＴｒａｐＮＨＳ－ａｃｔｉｖａｔｅｄＳｅｐｈａｒｏｓｅＨＰビーズへとカップリングされたＣＡ１５８６１Ｎｂを使用する、ＧＦＰのアフィニティー精製のために、低アフィニティーの捕捉剤を、高アフィニティー剥離剤（実施例５と類似するが、あらかじめ充填されたカラム内に含有されるビーズ上に固定化された捕捉剤を使用する）と組み合わせた。ＧＦＰを、このアフィニティーマトリックスから特異的に溶出させるために、本発明者らは、剥離剤としてのＮｂであるＣＡ１２７６０、ＣＡ１５８１８、ＣＡ１５８１６及びＣＡ１５８６１のそれぞれ（表１）を使用した。１ｍｇ（６６．６７ナノモル）のＣＡ１５８６１を、供給元の推奨に従い、１ｍＬのカラム（１ｍＬＣＶ；ＧＥ）内にあらかじめ充填された、ＨｉＴｒａｐＮＨＳ－ａｃｔｉｖａｔｅｄＳｅｐｈａｒｏｓｅＨＰビーズ上に固定化した。２ｍｇ（７６．９２ナノモル）のＧＦＰを、注入ループを介して、ＣＡ１５８６１カラム上にロードした。１０ＣＶの洗浄緩衝液（１００ｍＭのＨｅｐｅｓｐＨ７．５、１５０ｍＭのＮａＣｌ）を、カラム上に通すのに続き、８ＣＶの溶出緩衝液（１００ｍＭのＨｅｐｅｓｐＨ７．５、１５０ｍＭのＮａＣｌ、６６．６７μＭの剥離剤Ｎｂ（１ｍｇ／ｍＬ））を、０．１ｍＬ／分の流量において使用して、結合しなかった材料を除去した。溶出ピークは、５００μｌの画分中に回収し、ＳＤＳ／ＰＡＧＥゲル中において解析した（図１２）。カラムの再生は、８ＣＶの２００ｍＭグリシン緩衝液ｐＨ２．３により得た。２８０ｎｍ及び４８８ｎｍにおける吸光度を測定することにより、ＨｉＴｒａｐＮＨＳ－ａｃｔｉｖａｔｅｄＳｅｐｈａｒｏｓｅＨＰカラム上の固定化捕捉剤としてのＣＡ１５８６１Ｎｂ及び剥離剤としてのＮｂである、ＣＡ１２７６０、ＣＡ１５８１８、ＣＡ１５８１６、ＣＡ１５８６１を使用する、ＧＦＰの精製をモニタリングした（図１２）。溶出時におけるＧＦＰフルオロフォアの吸光度プロファイル及び溶出画分についてのＳＤＳ－ＰＡＧＥ解析から、本発明者らは、ナノモル濃度～マイクロモル濃度のアフィニティーを伴う捕捉剤であるＮｂ（ＣＡ１５８６１）を、高アフィニティーの剥離剤であるＮｂと組み合わせて使用することが、ＧＦＰタンパク質の回収又は溶出を可能とすると結論することができる。捕捉剤が、極めて低アフィニティーであることを考慮すると、おそらく、カラムへとロードされる全てのＧＦＰが保持されたわけではないために、収率は、ある程度低くなる。

［実施例９］ＨｉＴｒａｐＮＨＳ－ａｃｔｉｖａｔｅｄＳｅｐｈａｒｏｓｅＨＰカラム上の固定化された捕捉剤としてのＮｂＣＡ１５８１６を使用し、剥離剤としてのＣＡ１５６２１ＭｅｇａＢｏｄｙＭｂ_{ＣＡ１２７６０Ｎｂ} ^{ｃＨｏｐＱ}により溶出させるＮＡＮＥＸクロマトグラフィーによる、細菌溶解物中にスパイクされたＧＦＰタンパク質の精製
ＮＡＮＥＸの、１つ主要な利点は、剥離剤が、機能化複合体内の標的を溶出させるように、機能化された又は操作されたナノボディー（例えば、イメージングのために蛍光標識化され、検出のためにビオチンカップリングされたＭｅｇａＢｏｄｙ）でありうることである。これらの選択肢を検証するために、本発明者らは、ナノボディー交換クロマトグラフィー（ＮＡＮＥＸ）により、ＧＦＰを、細菌溶解物から精製し、ＧＦＰを、ＧＦＰ・ＭｅｇａＢｏｄｙ複合体として溶出させた。実施例９は、ＣＡ１５８１６Ｎｂ（表１を参照されたい）とカップリングされ、ＦＰＬＣ（ＡｋｔａＰｕｒｅ－ＧＥ）システムへと接続された、ＨｉＴｒａｐＮＨＳ－ａｃｔｉｖａｔｅｄＳｅｐｈａｒｏｓｅＨＰカラムを使用する、細菌溶解物中にスパイクされたＧＦＰタンパク質のアフィニティー精製について記載する。ＧＦＰタンパク質を、このアフィニティーマトリックスから特異的に溶出させるために、本発明者らは、剥離剤としてのＣＡ１５６２１Ｍｂを使用した。ＣＡ１５６２１は、ＭｅｇａＢｏｄｙ又は本明細書において記載される、抗原結合性キメラタンパク質であり、ＷＯ２０１９／０８６５４８Ａ１において開示されている融合体を伴い、特に、Ｍｂ_{ＣＡ１２７６０Ｎｂ} ^{ｃＨｏｐＱ}は、ＧＦＰ特異的Ｎｂである、ＣＡ１２７６０の、ｃＨｏｐＱ足場との非可撓性融合体から構成される。

詳細に述べると、本実施例において記載される、５８ｋＤａのＭｅｇａＢｏｄｙは、単一ドメイン型免疫グロブリンの部分と、ｃＨｏｐＱ足場タンパク質の部分とからコンカテネートされたキメラポリペプチドである。本実施例において、使用される免疫グロブリンドメインは、配列番号１に描示される、ＧＦＰ結合性ナノボディーである。足場タンパク質は、ＨｏｐＱ（Ｊａｖａｈｅｒｉら、２０１６）と呼ばれる、ヘリコバクター・ピロリ株Ｇ２７（ＰＤＢ：５ＬＰ２、配列番号１７）のアドヘシンドメインである。ｃＨｏｐＱと呼ばれる、ＨｏｐＱの循環置換変異体の創出を可能とするように、ＨｏｐＱのＮ末端とＣ末端とを接続したが、この場合、配列の切断は、この配列内の別の位置において行った。Ｍｂ_{ＮｂＣＡ１２７６０} ^{ｃＨｏｐＱ}構築物をデザインするために、ペプチド結合による順序を踏まえ、全ての部分を、以下：抗ＧＦＰナノボディーのβストランドＡ（配列番号１の残基１～１３）、ＨｏｐＱのＣ末端部分（配列番号１７の残基１９２～４１４）、足場タンパク質の循環置換変異体であるｃＨｏｐＱをもたらすように、ＨｏｐＱのＣ末端と、Ｎ末端とを接続する短鎖ペプチドリンカー、ＨｏｐＱのＮ末端部分（配列番号１７の残基１４～１８６）、ＧＦＰ結合性ナノボディー（配列番号１の残基１６～１２６）のβストランドＢ～Ｇ、６×Ｈｉｓタグの通りに、アミノ末端（Ｎ末端）から、カルボキシ末端（Ｃ末端）へと、互いと接続した。

カップリングのために、１ｍｇ（６６．６７ナノモル）のＣＡ１５８１６Ｎｂを、供給元の推奨に従い、ＨｉＴｒａｐＮＨＳ－ａｃｔｉｖａｔｅｄＳｅｐｈａｒｏｓｅＨＰカラム（１ｍＬ；ＧＥ）上に固定化した。１０ｍＬの細菌溶解物（ＬＢ中において増殖させた、０．５ＬのＥ．コリー培養物の細胞ペレットと同等である）を、２ｍｇのＧＦＰタンパク質と共にスパイクした。溶解物を、シリンジを使用して、ＣＡ１５８１６Ｎｂカップリングカラム上にロードし、これを、１０ＣＶの洗浄緩衝液（１００ｍＭのＨｅｐｅｓｐＨ７．５、１５０ｍＭのＮａＣｌ）により、２回にわたり洗浄した。次いで、カラムを、Ａｋｔａｓｙｓｔｅｍ（ＧＥ）に接続するのに続き、０．１ｍＬ／分の流量における、８ＣＶの溶出緩衝液（１００ｍＭのＨｅｐｅｓｐＨ７．５、１５０ｍＭのＮａＣｌ、６８．１８μＭの剥離剤（４．５ｍｇ／ｍＬ））による溶出を行った。溶出ピークは、５００μｌの画分中に回収し、ＳＤＳ／ＰＡＧＥゲル中において解析した（図１３）。カラムの再生は、８ＣＶの２００ｍＭグリシン緩衝液、ｐＨ２．３により得た。２８０ｎｍ（タンパク質による吸光）及び４８８ｎｍ（ＧＦＰフルオロフォアによる吸光）における吸光度を測定することにより、ＨｉＴｒａｐＮＨＳ－ａｃｔｉｖａｔｅｄＳｅｐｈａｒｏｓｅＨＰカラム上の固定化捕捉剤としてのＣＡ１５８１６Ｎｂ及び剥離剤としてのＣＡ１５６２１Ｍｂ_{ＣＡ１２７６０Ｎｂ} ^{ｃＨｏｐＱ}を使用する、ＧＦＰの精製をモニタリングした（図１３）。溶出時におけるＧＦＰフルオロフォアの吸光度プロファイル及び溶出画分についてのＳＤＳ－ＰＡＧＥ解析から、本発明者らは、捕捉剤であるＮｂ（ＣＡ１５８１６）を、ＭｅｇａＢｏｄｙとしての、その機能化形態にある、高アフィニティーの剥離剤であるＮｂと組み合わせて使用したところ、洗浄が、不純物の大半を除去するために十分であり、溶出画分２及び３が、主ピーク内に検出されるＧＦＰタンパク質と複合体化した剥離剤Ｍｂを含有したと結論することができる。こうして、本発明者らは、ここから、Ｍｂが、ＮＡＮＥＸにおいて、剥離剤として、その親ＮｂであるＣＡ１２７６０と比較して、同様に良好に働いて、定量的に、かつ迅速にＧＦＰを溶出させると結論することができる。

［実施例１０］ＨｉＴｒａｐＮＨＳ－ａｃｔｉｖａｔｅｄＳｅｐｈａｒｏｓｅＨＰカラム上の固定化された捕捉剤としてのＮｂＣＡ１５８１６を使用し、剥離剤としてのＣＡ１５６１６ＭｅｇａＢｏｄｙＭｂ_{ＣＡ１２７６０Ｎｂ} ^Ｙｇｊｋにより溶出させるナノボディー交換クロマトグラフィーによる、細菌溶解物中にスパイクされたＧＦＰの精製
実施例１０は、さらに、ＣＡ１５８１６Ｎｂ（表１を参照されたい）とカップリングされ、ＦＰＬＣ（ＡｋｔａＰｕｒｅ－ＧＥ）システムへと接続された、ＨｉＴｒａｐＮＨＳ－ａｃｔｉｖａｔｅｄＳｅｐｈａｒｏｓｅＨＰカラムを使用する、細菌溶解物中にスパイクされたＧＦＰタンパク質のアフィニティー精製について記載し、剥離剤としてのＣＡ１５８１６Ｍｂを使用して、特異的に溶出させた。ＣＡ１５８１６は、ＭｅｇａＢｏｄｙ又は本明細書において記載される、抗原結合性キメラタンパク質であり、ＷＯ２０１９／０８６５４８Ａ１において開示されている融合体を伴い、特に、Ｍｂ_{ＣＡ１２７６０Ｎｂ} ^Ｙｇｊｋは、ＧＦＰ特異的Ｎｂである、ＣＡ１２７６０の、Ｙｇｊｋ足場との非可撓性融合体から構成される。

詳細に述べると、１００ｋＤａのＭｅｇａＢｏｄｙは、単一ドメイン型免疫グロブリンの部分と、短鎖ポリペプチドリンカーにより連結された足場タンパク質の部分とからコンカテネートされたキメラポリペプチドである。使用される免疫グロブリンは、配列番号１に描示される、ＧＦＰ結合性ナノボディーである。使用される、代替的足場タンパク質は、Ｅ．コリーの、８６ｋＤＡのペリプラズムタンパク質（ＰＤＢ：３Ｗ７Ｓ、配列番号３２）である、ＹｇｊＫであった。ペプチド結合による順序を踏まえ、全ての部分を、以下：抗ＧＦＰナノボディーのβストランドＡ（配列番号１の残基１～１２）、組成がランダムである、１又は２アミノ酸のペプチドリンカー、ＹｇｊＫのＣ末端部分（配列番号３２の残基４６４～７６０）、足場タンパク質の循環置換変異体をもたらすように、ＹｇｊＫのＣ末端と、Ｎ末端とを接続する短鎖ペプチドリンカー、ＹｇｊＫのＮ末端部分（配列番号３２の残基１～４６１）、組成がランダムである、１又は２アミノ酸のペプチドリンカー、抗ＧＦＰナノボディー（配列番号１の残基１７～１２６）のβストランドＢ～Ｇ、６×Ｈｉｓタグの通りに、アミノ末端から、カルボキシ末端へと、互いと接続した。

カップリングのために、１ｍｇ（６６．６７ナノモル）のＣＡ１５８１６を、供給元の推奨に従い、ＨｉＴｒａｐＮＨＳ－ａｃｔｉｖａｔｅｄＳｅｐｈａｒｏｓｅＨＰカラム（１ｍＬＣＶ；ＧＥ）上に固定化した。１０ｍＬの細菌溶解物（ＬＢ中において増殖させた、０．５ＬのＥ．コリー培養物の細胞ペレットと同等である）を、２ｍｇのＧＦＰと共にスパイクした。溶解物を、シリンジを使用して、ＣＡ１５８１６Ｎｂカップリングカラム上にロードし、これを、１０ＣＶの洗浄緩衝液（１００ｍＭのＨｅｐｅｓｐＨ７．５、１５０ｍＭのＮａＣｌ）により、２回にわたり洗浄した。次いで、カラムを、Ａｋｔａｓｙｓｔｅｍ（ＧＥ）に接続するのに続き、０．１ｍＬ／分の流量における、８ＣＶの溶出緩衝液（１００ｍＭのＨｅｐｅｓｐＨ７．５、１５０ｍＭのＮａＣｌ、４８．５４μＭの剥離剤（５ｍｇ／ｍＬ））による溶出を行った。溶出ピークは、５００μｌの画分中に回収し、ＳＤＳ／ＰＡＧＥゲル中において解析した（図１４）。カラムの再生は、８ＣＶの２００ｍＭグリシン緩衝液、ｐＨ２．３により得た。２８０ｎｍ（タンパク質による吸光）及び４８８ｎｍ（ＧＦＰフルオロフォアによる吸光）における吸光度を測定することにより、ＨｉＴｒａｐＮＨＳ－ａｃｔｉｖａｔｅｄＳｅｐｈａｒｏｓｅＨＰカラム上の固定化捕捉剤としてのＣＡ１５８１６Ｎｂ及び剥離剤としてのＣＡ１５６１６Ｍｂ_{ＣＡ１２７６０Ｎｂ} ^Ｙｇｊｋを使用する、ＧＦＰの精製をモニタリングした（図１４）。溶出時におけるＧＦＰフルオロフォアの吸光度プロファイル及び溶出画分についてのＳＤＳ－ＰＡＧＥ解析から、本発明者らは、捕捉剤であるＮｂ（ＣＡ１５８１６）を、ＭｅｇａＢｏｄｙとしての、その機能化形態にある、高アフィニティーの剥離剤であるＮｂと組み合わせて使用したところ、洗浄が、不純物の大半を除去するために十分であり、溶出画分２及び３が、主ピーク内に検出されるＧＦＰタンパク質と複合体化した剥離剤Ｍｂを含有したと結論することができる。こうして、本発明者らは、ここから、Ｍｂが、ＮＡＮＥＸにおいて、剥離剤として、その親ＮｂであるＣＡ１２７６０と比較して、同様に良好に働いて、定量的に、かつ迅速にＧＦＰを溶出させると結論することができる。

［実施例１１］剥離剤としてのＮｂＣＡ１２７６０を使用する、カスタム製の７５μＬのマイクロカラム内において適用するための、ＮＨＳ活性化アガロースビーズ上の固定化された捕捉剤としてのＮｂＣＡ１５８１６を使用する、ナノボディー交換クロマトグラフィーによる、ＧＦＰタンパク質の精製
本実施例は、ＦＰＬＣ（ＡｋｔａＰｕｒｅ－ＧＥ）システムへと接続された、アフィニティーマイクロカラム上における、ＧＦＰタンパク質のアフィニティー精製について記載する。本発明者らは、４ｍｇの捕捉剤であるＣＡ１５８１６Ｎｂ（表１を参照されたい）を、５００μｌのＮＨＳ活性化アガロースビーズ上に、共有結合的に固定化した。７５μｌのアガロースビーズを、一般的な実験装置へと接続されうる、市販の部品を使用する、カスタム製のマイクロカラムへと充填した（図１５）。本実施例において、ＣＡ１２７６０Ｎｂを、剥離剤として使用した（表１）。０．１ｍｇ（３．８５ナノモル）のＧＦＰ試料を、５００μｌの注入ループを介して、ＣＡ１５８１６Ｎｂカップリングマイクロカラム（７５μｌのＣＶ）上にロードした。５ｍＬ（６６ＣＶ）の洗浄緩衝液（１００ｍＭのＨｅｐｅｓｐＨ７．５、１５０ｍＭのＮａＣｌ）に続き、０．１ｍＬ／分の流量における、１０６ＣＶ（８ｍＬ）の溶出緩衝液（１００ｍＭのＨｅｐｅｓｐＨ７．５、１５０ｍＭのＮａＣｌ、容量を５００μｌとする、１３．３３μＭの剥離剤Ｎｂ（０．２ｍｇ／ｍＬ））を、カラム上に通して、結合しなかった材料を除去した。溶出ピークは、５００μｌの画分中に回収し、ＳＤＳ／ＰＡＧＥゲル中において解析した（図１５）。カラムの再生は、１０６ＣＶの２００ｍＭグリシン緩衝液、ｐＨ２．３により得た。２８０ｎｍ（タンパク質による吸光）及び４８８ｎｍ（ＧＦＰフルオロフォアによる吸光）における吸光度を測定することにより、カスタム製のマイクロカラム上の固定化捕捉剤としてのＣＡ１５８１６Ｎｂ及び剥離剤としてのＣＡ１２７６０を使用する、ＧＦＰの精製をモニタリングした（図１５）。

大型カラムの使用（実施例７、図１１を参照されたい）と同等に、ＧＦＰタンパク質は、このマイクロカラムからも、迅速に、かつ、定量的に溶出された。

［実施例１２］ＨｉＴｒａｐＮＨＳ－ａｃｔｉｖａｔｅｄＳｅｐｈａｒｏｓｅＨＰカラム上の固定化された捕捉剤としてのシヌクレイン２特異的ＮｂＣＡ４３７５を使用し、剥離剤としての、それぞれ、一価形態及び二価形態としてのＮｂＣＡ４３７５により溶出させるナノボディー交換クロマトグラフィーによる、ＧＦＰ－ＥＰＥＡタンパク質の精製
ナノボディー交換クロマトグラフィー（ＮＡＮＥＸ）は、固定化ナノボディー（捕捉剤）が、低アフィニティー及び／又は高いオフ速度を有する一方、標的を競合的に溶出させるのに使用されるナノボディー（剥離剤）は、標的タンパク質に対する、高アフィニティー及び／又は低いオフ速度を有する結果として、最適の収率及び純度をもたらすことを要求することを実証するために、本発明者らは、アフィニティー及びオフ速度が様々である、異なる捕捉剤－剥離剤対によるＮＡＮＥＸ実験を実施した。本明細書において、本発明者らはまた、捕捉剤としてのＥＰＥＡタグ特異的Ｎｂ及び剥離剤としての、一価形及び二価形にある、同じＥＰＥＡ特異的Ｎｂについても記載する。本実施例は、ＧＦＰ－ＥＰＥＡタンパク質のアフィニティー精製について記載する。ＣＡ４３７５（配列番号７）は、ヒトアルファ－シヌクレイン（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｐ３７８４０）に対して選択された、Ｃ末端の直鎖状エピトープ（ＥＰＥＡ）に結合するナノボディーである。ＣＡ４３９４（配列番号８）は、ヒトアルファ－シヌクレイン（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｐ３７８４０）に対して選択された、Ｃ末端の直鎖状エピトープ（ＥＰＥＡ）に結合するＣＡ４３７５Ｎｂの二価フォーマットである。

ＢＬＩアッセイは、ＣＡ４３７５のアフィニティー（Ｋ_Ｄ）が、６０ｎＭであり、ｋ_ｏｎが、６．１６×１０^５（Ｍ^－１×秒^－１）であり、ｋ_ｏｆｆが、０．３２４×１０^－３（秒^－１）であることを同定した。１ｍｇ（６９．８９ナノモル）のＣＡ４３７５一価Ｎｂを、供給元の推奨に従い、ＨｉＴｒａｐＮＨＳ－ａｃｔｉｖａｔｅｄＳｅｐｈａｒｏｓｅＨＰカラム（１ｍＬＣＶ；ＧＥ）上に固定化した。１０ｍＬの細菌溶解物（０．５Ｌの培養物）を、２ｍｇのＧＦＰ（７６．９２ナノモル）と共にスパイクした。溶解物を、シリンジを使用して、ＣＡ４３７５Ｎｂカップリングカラム上にロードし、次いで、これを、１０ＣＶの緩衝液（１００ｍＭのＨｅｐｅｓｐＨ７．５、１５０ｍＭのＮａＣｌ）により、２回にわたり洗浄した。次いで、カラムを、Ａｋｔａｓｙｓｔｅｍ（ＧＥ）に接続するのに続き、０．１ｍＬ／分の流量における、８ＣＶの溶出緩衝液（２５ｍＭのＨＥＰＥＳｐＨ７．５、１５０ｍＭのＮａＣｌ、剥離剤であるＣＡ４３７５の濃度を、６９．９３μＭ（１ｍｇ／ｍＬ）とし、ＣＡ４３９４について、３３．５７μＭの（０．９５ｍｇ／ｍＬ）とする）による溶出を行った。溶出ピークは、５００μｌの画分中に回収し、ＳＤＳ／ＰＡＧＥゲル中において解析した（図１６及び図１７）。カラムの再生は、８ＣＶの２００ｍＭグリシン緩衝液、ｐＨ２．３により得た。

２８０ｎｍ及び４８８ｎｍにおける吸光度を測定することにより、ＨｉＴｒａｐＮＨＳ－ａｃｔｉｖａｔｅｄＳｅｐｈａｒｏｓｅＨＰカラム上の固定化捕捉剤としての一価ＮｂであるＣＡ４３７５及び剥離剤としての二価ＣＡ４３９４を使用する、ＧＦＰ－ＥＰＥＡの精製をモニタリングした（図１６及び図１７）。溶出時におけるＧＦＰフルオロフォアの吸光度プロファイル及び溶出画分についてのＳＤＳ－ＰＡＧＥ解析から、本発明者らは、一価捕捉剤であるＮｂ（ＣＡ４３７５）を、剥離剤としての、同じであるが、二価であるＮｂ（ＣＡ４３９４）と組み合わせて使用したところ、洗浄が、不純物の大半を除去するために十分であり、溶出画分２～５が、剥離剤Ｎｂ及び、主ピーク内に検出される、（一部の）ＧＦＰ－ＥＰＥＡタンパク質を含有したと結論することができる。

これに対し、一価のＮｂを、剥離剤として使用したところ、本発明者らは、一価のＮｂは、少量のＧＦＰ－ＥＰＥＡタンパク質の溶出を可能とするのに過ぎないことを見出した。したがって、多価剥離剤は、高い（見かけの）アフィニティー（アビディティー効果による）を有し、強力な剥離剤として作用すると考えられる。

［実施例１３］ＨｉＴｒａｐＮＨＳ－ａｃｔｉｖａｔｅｄＳｅｐｈａｒｏｓｅＨＰカラム上の固定化捕捉剤としてのＮｂＣＡ１３０１６を使用し、剥離剤としてのシナプトジャニン特異的ＮｂＣＡ１３０８０を使用するＮＡＮＥＸによる、組換えヒトシナプトジャニンタンパク質の精製
本実施例において、本発明者らは、低アフィニティーのシナプトジャニン特異的Ｎｂが、シナプトジャニンを、細胞又は細胞抽出物から単離するのに、剥離剤としての、同じエピトープについて競合する、非類縁、高アフィニティーのシナプトジャニン特異的Ｎｂと組み合わせた捕捉剤として使用されうることをさらに裏付ける。本実施例は、ＮＡＮＥＸクロマトグラフィーによる、Ｅ．コリー細胞抽出物中の組換えヒトシナプトジャニン１（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｏ４３４２６のアミノ酸５２８～８７３）の精製について記載する。ＣＡ１３０１６Ｎｂ（配列番号８）及びＣＡ１３０８０Ｎｂ（配列番号９）は、ヒトシナプトジャニン１（５２８～８７３）に対して選択されたナノボディーである。

・ＢＬＩアッセイは、ＣＡ１３０１６のアフィニティー（Ｋ_Ｄ）が、１．０６μＭであり、ｋ_ｏｎが、３．８×１０^４（Ｍ^－１×秒^－１）であり、Ｋ_ｏｆｆが、５×１０^－２（秒^－１）であることを同定した。

・ＢＬＩアッセイは、ＣＡ１３０８０のアフィニティー（Ｋ_Ｄ）が、３．２ｎＭであり、ｋ_ｏｎが、１．８×１０^５（Ｍ^－１×秒^－１）であり、Ｋ_ｏｆｆが、４×１０^－３（秒^－１）であることを同定した。

ＣＡ１３０１６Ｎｂと、ＣＡ１３０８０Ｎｂとは、異なるＣＤＲを有するが、ヒトシナプトジャニン１上の同じエピトープに結合しており、互いに排他的である。１ｍｇ（６６．５７ナノモル）のＣＡ１３０１６Ｎｂを、供給元の推奨に従い、ＨｉＴｒａｐＮＨＳ－ａｃｔｉｖａｔｅｄＳｅｐｈａｒｏｓｅＨＰカラム（１ｍＬＣＶ；ＧＥ）上に固定化した。

組換えヒトシナプトジャニン１（５２８～８７３）は、発現株であるＢＬ２１（ＤＥ３）－Ｔ１^Ｒを形質転換するｐＥＴ２８ａ発現ベクターを使用して発現させ、細胞を、ＯＤ_６００＝０．６となるまで、ＴＢ培地中において増殖させ、１ｍＭのＩＰＴＧにより、２０度において、一晩にわたり誘導した。細胞は、遠心分離により回収し、２５ｍＭのＨｅｐｅｓ（ｐＨ７．５）、３００ｍＭのＮａＣｌ、１０％のグリセロール、５ｍＭのＭｇＣｌ２、１ｍＭのＤＴＴ（ＤＮアーゼ及びタンパク質阻害剤を補充した）中に再懸濁させてから、細胞破砕機を使用する溶解を行った。粗抽出物を、遠心分離により清澄化させ、上清を回収し、濾過した（０．４５μｍのフィルター）。シリンジを使用して、１０ｍＬの溶解物（ＬＢ中において増殖させた、０．６ＬのＥ．コリー培養物の細胞ペレットと同等である）を、ＣＡ１３０１６Ｎｂによりコーティングされた、ＨｉＴｒａｐＮＨＳ－ａｃｔｉｖａｔｅｄＳｅｐｈａｒｏｓｅＨＰカラムにロードし、フロースルーを回収した。シリンジを使用して、２５ｍＭのＨｅｐｅｓ（ｐＨ７．５）、３００ｍＭのＮａＣｌ、１０％のグリセロール、５ｍＭのＭｇＣｌ２、１ｍＭのＤＴＴ（２回にわたり実施した）を使用する、１０ｍＬの洗浄緩衝液による洗浄を実施し、これを回収した。次いで、溶出のために、アフィニティーカラムを、ＦＰＬＣ（ＡｋｔａＰｕｒｅ－ＧＥ）システムへと接続した。

溶出条件（２５ｍＭのＨｅｐｅｓ（ｐＨ７．５）、３００ｍＭのＮａＣｌ、１０％のグリセロール、５ｍＭのＭｇＣｌ２、１ｍＭのＤＴＴ、容量１ｍＬ、剥離剤（ＣＡ１３０８０）の濃度：６６．９７μＭ（１ｍｇ／ｍＬ）、流量０．１ｍＬ／分）。その後、８ｍＬ（８ＣＶ）の溶出緩衝液を、８ｍＬ（８ＣＶ）の再生緩衝液（２００ｍＭのグリシン、ｐＨ２．３）に交換する。

２８０ｎｍにおける吸光度を測定することにより、ＨｉＴｒａｐＮＨＳ－ａｃｔｉｖａｔｅｄＳｅｐｈａｒｏｓｅＨＰカラム上の固定化捕捉剤としてのＣＡ１３０１６Ｎｂ及び剥離剤としてのＣＡ１３０８０Ｎｂを使用する、組換えヒトシナプトジャニン１（５２８～８７３）の精製をモニタリングした。溶出ピークは、５００μｌの画分中に回収し、ＳＤＳ／ＰＡＧＥゲル中において解析した（図１８）。溶出クロマトグラムについての吸光度プロファイル及び溶出画分についてのＳＤＳ－ＰＡＧＥ解析から、本発明者らは、マイクロモル濃度のアフィニティーを伴う捕捉剤であるＮｂ（ＣＡ１３０１６）を、高アフィニティーの剥離剤であるＮｂ（ＣＡ１３０８０）と組み合わせて使用したところ、洗浄が、不純物の大半を除去するために十分であり、溶出画分２及び３が、剥離剤Ｎｂ及び、主ピーク内に検出される、ヒトシナプトジャニン（シナプトジャニン二量体はまた、ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル上においても目視可能である）を含有したと結論することができる。こうして、本発明者らは、ここから、重複するエピトープに結合する、アフィニティーが異なるＮｂ対の使用が、細菌溶解物から、過剰発現された組換えタンパク質を精製することが可能であると結論することができる。

［実施例１４］ＨｉＴｒａｐＮＨＳ－ａｃｔｉｖａｔｅｄＳｅｐｈａｒｏｓｅＨＰカラム上の固定化された捕捉剤としてのＮｂＣＡ１１１３８を使用し、剥離剤としてのＮｂＣＡ１０３０４により溶出させるＮＡＮＥＸによる、組換えヒト凝固第ＩＸａ因子の精製
さらなる概念実証のために、本発明者らは、組換えヒト凝固第ＩＸａ因子特異的捕捉剤により、ＮＡＮＥＸ実験を実施し、高アフィニティーの剥離剤により、第ＩＸａ因子を溶出させた。本実施例は、Ｅ．コリーにおいて発現された組換えヒト凝固第ＩＸａ因子（軽鎖残基：１３４～１９１、重鎖残基：２２７～４６１、Ｕｎｉｐｒｏｔ受託番号であるＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｐ００７４０）に対する、ナノボディー交換クロマトグラフィーについて記載する。ＣＡ１１１３８（配列番号１１）及びＣＡ１０３０４（配列番号１２）は、ヒト凝固第ＩＸａ因子に対して選択されたナノボディーである。

・ＢＬＩアッセイは、ＣＡ１１１３８のアフィニティー（Ｋ_Ｄ）が、１４１ｎＭであり、ｋ_ｏｎが、３．４×１０^４（Ｍ^－１×秒^－１）であり、ｋ_ｏｆｆが、４．２×１０^－３（秒^－１）であることを同定した。

・ＢＬＩアッセイは、ＣＡ１０３０４のアフィニティー（Ｋ_Ｄ）が、４６ｎＭであり、ｋ_ｏｎが、８．８×１０^４（Ｍ^－１×秒^－１）であり、ｋ_ｏｆｆが、３．５×１０^－３（秒^－１）であることを同定した。

ＣＡ１１１３８と、ＣＡ１０３０４とは、異なるＣＤＲを有するが、ヒト凝固第ＩＸａ因子上の同じエピトープに、ごく部分的に結合しており、互いに排他的である。１ｍｇ（６７．２５ナノモル）のＣＡ１１１３８を、供給元の推奨に従い、ＨｉＴｒａｐＮＨＳ－ａｃｔｉｖａｔｅｄＳｅｐｈａｒｏｓｅＨＰカラム（ＧＥ）上に固定化した。ヒト凝固第ＩＸａ因子は、６５０ｎｍにおける吸光度を測定することにより、精製に従うように、Ｄｙｌｉｇｈｔ－６４７を使用して蛍光標識化した。蛍光標識化された（Ｄｙｌｉｇｈｔ－６４７）、０．４ｍｇのヒト凝固第ＩＸａ因子を、注入ループを介して、ＣＡ１１１３８カラム上にロードした。１０ｍＬ（１０ＣＶ）の緩衝液（２０ｍＭのＨｅｐｅｓｐＨ７．５、１５０ｍＭのＮａＣｌ、２．５ｍＭのＣａＣｌ２）を、カラム上に通して、結合しなかった材料を洗浄した。溶出条件（２０ｍＭのＨｅｐｅｓｐＨ７．５、１５０ｍＭのＮａＣｌ、２．５ｍＭのＣａＣｌ２、容量１ｍＬ、ＣＡ１０３０４剥離剤の濃度：４６８．７μＭ（７ｍｇ／ｍＬ）、流量０．１ｍＬ／分）。その後、８ｍＬ（８ＣＶ）の溶出緩衝液を、８ｍｌ（８ＣＶ）の再生緩衝液（２００ｍＭのグリシン、ｐＨ２．３）に交換する。２８０ｎｍ及び６５０ｎｍにおける吸光度を測定することにより、ＨｉＴｒａｐＮＨＳ－ａｃｔｉｖａｔｅｄＳｅｐｈａｒｏｓｅＨＰカラム上の固定化捕捉剤としてのＣＡ１１１３８及び剥離剤としてのＣＡ１０３０４を使用する、ヒト凝固第ＩＸａ因子の精製をモニタリングした。溶出ピークは、５００μＬの画分中に回収し、ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル中において解析した（図１９）。溶出クロマトグラムについての吸光度プロファイル及び溶出画分についてのＳＤＳ－ＰＡＧＥ解析から、本発明者らは、捕捉剤であるＮｂ（ＣＡ１１１３８）を、高アフィニティーの剥離剤であるＮｂ（ＣＡ１０３０４）と組み合わせて使用したところ、洗浄が、不純物の大半を除去するために十分であり、溶出画分２、３及び４が、剥離剤及び、主ピーク内に検出される、ヒト凝固第ＩＸａ因子を含有したと結論することができる。こうして、本発明者らは、ここから、部分的に重複するエピトープに結合する、アフィニティーが異なる、競合Ｎｂ対の使用が、ヒト凝固第ＩＸａ因子を精製することが可能であると結論することができる。

［実施例１５］ＨｉＴｒａｐＮＨＳ－ａｃｔｉｖａｔｅｄＳｅｐｈａｒｏｓｅＨＰカラム上の固定化された捕捉剤としてのＣＡ１０５０２を使用し、剥離剤としてのＣＡ１０３０９により溶出させるＮＡＮＥＸによる、組換えヒト凝固第ＩＸａ因子・ＣＡ１０３０４複合体の精製
二重ＮＡＮＥＸを使用する逐次的精製が可能であることを、さらに実証するために、本発明者らは、実施例１４の結合剤と比較して、異なるエピトープに結合する、捕捉剤及び剥離剤の異なる対を使用する、別のＮＡＮＥＸ精製のために、実施例１４により溶出された組換えヒト凝固第ＩＸａ因子・ＣＡ１０３０４複合体によるＮＡＮＥＸ実験を実施した。

ＣＡ１０５０２（配列番号１３）及びＣＡ１０３０９（配列番号１４）は、ヒト凝固第ＩＸａ因子に対して選択されたナノボディーである。ＢＬＩアッセイは、ＣＡ１０５０２のアフィニティー（Ｋ_Ｄ）が、７４ｎＭであり、ｋ_ｏｎが、７．０×１０^４（Ｍ^－１×秒^－１）であり、Ｋ_ｏｆｆが、４．０×１０^－３（秒^－１）であることを同定した。ＢＬＩアッセイは、ＣＡ１０３０９のアフィニティー（Ｋ_Ｄ）が、２１ｎＭであり、ｋ_ｏｎが、６．２×１０^４（Ｍ^－１×秒^－１）であり、Ｋ_ｏｆｆが、７．３×１０^－４（秒^－１）であることを同定した。ＣＡ１０５０２と、ＣＡ１０３０９とは、異なるＣＤＲを有するが、ヒト凝固第ＩＸａ因子上の同じエピトープに、部分的に結合しており、互いに排他的である。

１ｍｇ（７３．３３ナノモル）のＣＡ１０５０２を、供給元の推奨に従い、ＨｉＴｒａｐＮＨＳ－ａｃｔｉｖａｔｅｄＳｅｐｈａｒｏｓｅＨＰカラム（ＧＥ）上に固定化した。ヒト凝固第ＩＸａ因子は、６５０ｎｍにおける吸光度を測定することにより、精製に従うように、Ｄｙｌｉｇｈｔ－６４７を使用して蛍光標識化した。２ｍＬの、実施例１４により溶出された組換えヒト凝固第ＩＸａ因子（Ｄｙｌｉｇｈｔ－６４７）・ＣＡ１０３０４複合体を、注入ループを介して、ＣＡ１０５０２カラム上にロードした。１０ｍＬ（１０ＣＶ）の緩衝液（２０ｍＭのＨｅｐｅｓｐＨ７．５、１５０ｍＭのＮａＣｌ、２．５ｍＭのＣａＣｌ２）を、カラム上に通して、結合しなかった材料を洗浄した。

溶出条件（２０ｍＭのＨｅｐｅｓｐＨ７．５、１５０ｍＭのＮａＣｌ、２．５ｍＭのＣａＣｌ２、容量１ｍＬ、ＣＡ１０３０９剥離剤の濃度：５２．４２μＭ（０．７５ｍｇ／ｍＬ）、流量０．１ｍＬ／分）。その後、８ｍＬ（８ＣＶ）の溶出緩衝液を、８ｍＬ（８ＣＶ）の再生緩衝液（２００ｍＭのグリシン、ｐＨ２．３）に交換する。２８０ｎｍ及び６５０ｎｍにおける吸光度を測定することにより、ＨｉＴｒａｐＮＨＳ－ａｃｔｉｖａｔｅｄＳｅｐｈａｒｏｓｅＨＰカラム上の固定化捕捉剤としてのＣＡ１０５０２及び剥離剤としてのＣＡ１０３０９を使用する、ヒト凝固第ＩＸａ因子・ＣＡ１０３０４複合体の精製をモニタリングした。溶出ピークは、５００μｌの画分中に回収し、ＳＤＳ／ＰＡＧＥゲル中において解析した（図２０）。溶出クロマトグラムについての吸光度プロファイル及び溶出画分についてのＳＤＳ－ＰＡＧＥ解析から、本発明者らは、捕捉剤であるＮｂ（ＣＡ１０５０２）を、高アフィニティーの剥離剤であるＮｂ（ＣＡ１０３０９）と組み合わせて使用したところ、洗浄が、不純物の大半及び過剰量の剥離剤Ｎｂ（実施例１４において使用されたＣＡ１０３０４）を除去するために十分であり、溶出画分２、３及び４が、剥離剤の両方（ＣＡ１０３０９及びＣＡ１０３０４）及び、主ピーク内に検出される、ヒト凝固第ＩＸａ因子を含有したと結論することができる。１０ＣＶの溶出の後の、２８０ｎｍ及び６５０ｎｍにおける、小さなピークは、再生緩衝液により洗い落とされたカラム上に残存する試料の量を表す。

こうして、本発明者らは、ここから、最小限において、又は部分的に重複するエピトープに結合する、アフィニティーが異なるＮｂ対の使用が、ＣＡ１０３０４と複合体化したヒト凝固第ＩＸａ因子を精製することが可能であると結論することができる。

［実施例１６］ＨｉＴｒａｐＮＨＳ－ａｃｔｉｖａｔｅｄＳｅｐｈａｒｏｓｅＨＰカラム上の固定化された捕捉剤としてのＣＡ１１１３８及びＣＡ１０５０２を使用し、剥離剤としてのＣＡ１０３０４及びＣＡ１４２０８により溶出させるタンデムナノボディー交換クロマトグラフィーによる、組換えヒト凝固第ＩＸａ因子の精製
タンパク質が、タンデムナノボディー交換クロマトグラフィー（タンデムＮＡＮＥＸ）により精製されうることを概念実証するために、本発明者らは、図２１に記載されたスキームに従い、ヒト凝固第ＩＸａ因子上の、２つの異なるエピトープについて、対として競合する、２つのナノボディー対を選択した。

タンデムＮＡＮＥＸを実施するために、本発明者らは、第１のカラム（実施例１４において使用された、ＣＡ１１１３８カラム）を、第２のカラム（実施例１５において使用された、ＣＡ１０５０２カラム）へと接続した。

第１のＮＡＮＥＸ対は、捕捉剤１としてのＣＡ１１１３８及び剥離剤１としてのＣＡ１０３０４から構成され、第２のＮＡＮＥＸ対は、捕捉剤２としてのＣＡ１０５０２及び剥離剤２としてのＣＡ１４２０８（配列番号１５）から構成される。ＣＡ１４２０８は、ＭｅｇａＢｏｄｙを作出するための、ＹｇｊＫ足場上に作製されたＣＡ１０３０９に由来する機能化ナノボディーである。ヒト凝固第ＩＸａ因子は、６５０ｎｍにおける吸光度を測定することにより、精製に従うように、Ｄｙｌｉｇｈｔ－６４７を使用して蛍光標識化した。

蛍光標識化された（Ｄｙｌｉｇｈｔ－６４７）、０．４ｍｇのヒト凝固第ＩＸａ因子を、カラムに注入した。５ｍＬ（２．５ＣＶ）の緩衝液（２０ｍＭのＨｅｐｅｓｐＨ７．５、１５０ｍＭのＮａＣｌ、２．５ｍＭのＣａＣｌ２）を、カラム上に通して、結合しなかった材料を洗浄した。２００μＭの剥離剤１（ＣＡ１０３０４）を、緩衝液によりあらかじめすすがれた、１．５ｍＬのループから注入するのに続き、５ｍＬ（２．５ＣＶ）の緩衝液を注入した。次いで、２４μＭの剥離剤２（ＣＡ１４２０８）を、カラム上に注入するのに続き、１０ｍＬ（５ＣＶ）の緩衝液を注入した。次に、１０ｍＬの再生緩衝液（２００ｍＭのグリシン、ｐＨ２．３）を適用して、カラムから、全てのタンパク質を除去した。タンデムＮＡＮＥＸは、２８０ｎｍ及び６５０ｎｍにおける吸光度を測定することによりモニタリングした。溶出ピークは、５００μＬの画分中に回収し、ＳＤＳ／ＰＡＧＥゲル中において解析した（図２２）。溶出画分についてのＳＤＳ－ＰＡＧＥ解析から、本発明者らは、第ＩＸａ因子が、ＮｂＣＡ１０３０４及びＮｂＣＡ１４２０８を、剥離剤として、段階的に使用する場合に、図２１に従い、第１のカラム（実施例１４において使用された、ＣＡ１１１３８カラム）を、第２のカラム（実施例１５において使用された、ＣＡ１０５０２カラム）へと接続することにより、タンデムＮＡＮＥＸを使用して精製されうると結論することができる。

［実施例１７］固定化捕捉剤としてのＮｂＣＡ１５８１６及び剥離剤としてのＮｂＣＡ１２７６０を使用するＮＡＮＥＸクロマトグラフィーによる、酵母抽出物からの、ＲＰＰ１Ａ－ＧＦＰ融合タンパク質を含有する、酵母６０Ｓリボソームサブユニットの精製
ナノボディー交換クロマトグラフィー（ＮＡＮＥＸ）は、固定化ナノボディー（捕捉剤）が、低アフィニティー及び／又は高いオフ速度を有する一方、標的を競合的に溶出させるのに使用されるナノボディー（剥離剤）は、標的タンパク質に対する、高アフィニティー及び／又は低いオフ速度を有する結果として、最適の収率及び純度をもたらす場合、迅速かつ定量的に働くことを実証するために、本発明者らは、ＮＡＮＥＸにより、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）抽出物に由来する、そのカルボキシ末端に融合されたＧＦＰを含有するサッカロマイセス・セレビシエ６０Ｓ酸性リボソームタンパク質Ｐ１アルファ（ＲＰＰ１Ａ、ＹＤＬ０８１Ｃ、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｐ０５３１８）を精製した。酵母クローン（参照番号：ＧＦＰ＋３５：Ｇ８、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＹｅａｓｔＧＦＰＣｌｏｎｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ；Ｈｕｇｈら、２００３）は、Ｃ末端において、エクオレア・ビクトリア（Ａｅｑｕｏｒｅａｖｉｃｔｏｒｉａ）ＧＦＰ（Ｓ６５Ｔ）タグ（Ｔｓｉｅｎ、１９９８）を含有する全長ＯＲＦを発現する、Ｓ．セレビシエ酵母株コレクションに由来する。ＧＦＰ融合タンパク質は、相同組換えを介して、酵母染色体へと組み込まれ、内因性プロモーターを使用して発現される（Ｈｕｈら、２００３）。

１ｍｇ（６６．６７ナノモル）のＣＡ１５８１６Ｎｂを、供給元の推奨に従い、ＨｉＴｒａｐＮＨＳ－ａｃｔｉｖａｔｅｄＳｅｐｈａｒｏｓｅＨＰカラム（ＧＥ）上に固定化した。２０ｍＬの清澄化酵母溶解物（ＹＰＤ中において増殖させた、酵母クローンＧＦＰ＋３５：Ｇ８の、６Ｌの培養物の細胞ペレットと同等である）を、シリンジを使用して、ＣＡ１５８１６カラム上にロードし、これを、１０ｍＬ（１０カラム容量（ＣＶ））の緩衝液（１００ｍＭのＨｅｐｅｓｐＨ７．５、１５０ｍＭのＮａＣｌ）により、２回にわたり洗浄した。次いで、８ＣＶの溶出緩衝液（１００ｍＭのＨｅｐｅｓｐＨ７．５、１５０ｍＭのＮａＣｌ、６６．６７μＭの剥離剤であるＮｂＣＡ１２７６０（１ｍｇ／ｍＬ））中の剥離剤を、０．１ｍＬ／分の流量において使用する溶出のために、カラムを、ＡｋｔａｐｕｒｅＦＰＬＣシステム（ＧＥ）に接続した。溶出物は、１００μｌの画分中に回収し、主溶出ピークを、ＳＤＳ／ＰＡＧＥゲルにより解析した（図２３）。カラムの再生は、ｐＨ２．３における、８ＣＶの２００ｍＭグリシン緩衝液により得た。

２８０ｎｍ（タンパク質による吸光）及び４８８ｎｍ（ＧＦＰフルオロフォアによる吸光）における吸光度を測定することにより、ＨｉＴｒａｐＮＨＳ－ａｃｔｉｖａｔｅｄＳｅｐｈａｒｏｓｅＨＰカラム上の固定化捕捉剤としてのＣＡ１５８１６及び剥離剤としてのＣＡ１２７６０を使用する、ＲＰＰ１Ａ－ＧＦＰの精製をモニタリングした（図２３）。溶出時におけるＧＦＰフルオロフォアの吸光度プロファイル及び溶出画分についてのＳＤＳ－ＰＡＧＥ解析から、本発明者らは、ＮＡＮＥＸにおいて、酵母溶解物から、ＲＰＰ１Ａ－ＧＦＰを精製するのに、ＣＡ１５８１６を、剥離剤としてのＣＡ１２７６０と組み合わせた捕捉剤として使用しうると結論することができる。さらに、溶出画分２～１１は、主ピーク内に検出される、ＲＰＰ１Ａ－ＧＦＰ及び酵母リボソームの他の成分と複合体化した剥離剤Ｎｂを含有した。実際、本発明者らは、溶出ピークの画分６を、ネガティブ染色電子顕微鏡法において解析し（図２４）、酵母の６０リボソームサブユニットに対応する、大型の単一粒子を観察した。したがって、本発明者らは、本実施例から、ＮＡＮＥＸが、多タンパク質複合体の構成タンパク質のうちの１つの中に含有される重複エピトープに結合する、アフィニティーが異なるＮｂの対（実施例１及び１１においてもまた使用された、ＣＡ１５８１６及びＣＡ１２７６０）を使用することにより、細胞溶解物から、（内因性）タンパク質複合体を精製するのに使用されうると結論することができる。

［実施例１８］ＨｉＴｒａｐＮＨＳ－ａｃｔｉｖａｔｅｄＳｅｐｈａｒｏｓｅＨＰ上の固定化捕捉剤としてのＮｂＣＡ１６６９５及び剥離剤としてのＮｂＣＡ１６０４７を使用する、ＧＦＰの精製
ＮＡＮＥＸのために、剥離剤は、捕捉剤と標的との間の相互作用を破壊して、捕捉剤を置換することが必要である。これは、標的上の、捕捉剤と同じエピトープ又は重複エピトープに、但し高アフィニティー又は低いｋ_ｏｆｆで結合する（高アフィニティー）剥離剤について達成されうる。

標的上のエピトープに競合的に結合する、任意の剥離剤－捕捉剤対が、原則として、ＮＡＮＥＸに使用されうることをさらに裏付けるために、本発明者らはまた、実施例１（ＮｂＣＡ１２７６０、ＮｂＣＡ１５８１６）と比較して、ＧＦＰ上の異なるエピトープに競合的に結合する剥離剤－捕捉剤対（ＮｂＣＡ１６０４７、ＮｂＣＡ１６６９５）も同定した。

本実施例は、ナノモル濃度のアフィニティーの捕捉剤としてのＣＡ１６６９５（配列番号１９）及びナノモル濃度の低アフィニティーの剥離剤としてのＣＡ１６０４７（配列番号１８）を使用する、組換えＧＦＰのアフィニティー精製について記載する。

ＧＦＰ・ＣＡ１６０４７複合体内のエピトープ及びパラトープを同定するために、本発明者らは、Ｘ線結晶構造解析により、この複合体の構造を解明した（図２５及び２６）。ＧＦＰ（配列番号１６に描示される）及びＧＦＰ－ナノボディー（配列番号１８）を含む複合体は、以下の格子定数：ａ＝１２６．９１Å±５％、ｂ＝５０．３５Å±５％、ｃ＝８３．１３Å±５％、α＝９０°、β＝１３０．４５°、γ＝９０°を伴う空間群であるＣ１２１内に結晶化されている。結晶構造は、本明細書において、ＮｂＣＡ１６０４７と共に水素結合を作り出す、ＧＦＰタンパク質の全てのアミノ酸残基（配列番号１６）により形成されるものとして規定される、剥離剤－捕捉剤対の、エピトープへの結合を、さらに描出することを可能とした。このエピトープは、配列番号１６のアミノ酸Ｔｙｒ１５１、Ｌｙｓ１５６、Ｌｙｓ１５８、Ｌｙｓ１６２、Ｖａｌ１６３、Ａｓｎ１６４、Ｌｙｓ１６６、Ａｓｐ１８０、Ｔｙｒ１８２を含む。ＧＦＰ・ＣＡ１６０４７の結晶構造に基づき、本発明者らはまた、ＣＡ１６０４７のアフィニティーを低下させることを目的として突然変異させられる、ＧＦＰ特異的Ｎｂ（Ｔｙｒ１１９）のパラトープ内の１つの鍵となる結合残基も同定した（図２７）。

ＧＦＰ・ＣＡ１６０４７の構造に基づき、剥離剤（ＣＡ１６０４７）のＴｙｒ１１９を、Ｐｈｅ（Ｔｙｒ１１９ｐｈｅ）へと突然変異させて、ＣＡ１６６９５と称される捕捉剤を作製した。

・ＢＬＩアッセイは、ＣＡ１６０４７のアフィニティー（Ｋ_Ｄ）が、６．１５ｎＭであり、ｋ_ｏｎが、２．３×１０^４（Ｍ^－１×秒^－１）であり、Ｋ_ｏｆｆが、９．８×１０^－４（秒^－１）であることを同定した（図２７）。

・ＢＬＩアッセイは、ＣＡ１６６９５のアフィニティー（Ｋ_Ｄ）が、８．５３ｎＭであり、ｋ_ｏｎが、２．０×１０^５（Ｍ^－１×秒^－１）であり、Ｋ_ｏｆｆが、１．７×１０^－３（秒^－１）であることを同定した（図２７）。

次に、本発明者らは、剥離剤－捕捉剤対としてのＣＡ１６０４７及びＮｂＣＡ１６６９５を使用する、ナノボディー交換クロマトグラフィー（ＮＡＮＥＸ）により、ＧＦＰを精製し、ＧＦＰを、ＧＦＰ・ナノボディー複合体として溶出させた。ＦＰＬＣ（ＡｋｔａＰｕｒｅ－ＧＥ）システムへと接続された、ＨｉＴｒａｐＮＨＳ－ａｃｔｉｖａｔｅｄＳｅｐｈａｒｏｓｅＨＰカラムへとカップリングされた、ＮｂＣＡ１６６９５を使用して、ＧＦＰタンパク質のアフィニティー精製を実施した。ＧＦＰタンパク質を、このアフィニティーマトリックスから特異的に溶出させるために、本発明者らは、剥離剤としてのＣＡ１６０４７Ｎｂを使用した。

カップリングのために、１ｍｇ（６６．１３ナノモル）のＣＡ１６６９５Ｎｂを、供給元の推奨に従い、市販のＨｉＴｒａｐＮＨＳ－ａｃｔｉｖａｔｅｄＳｅｐｈａｒｏｓｅＨＰカラム（１ｍＬ；ＧＥ）上に固定化した。２ｍｇのＧＦＰを、シリンジを使用して、ＣＡ１６６９５Ｎｂカップリングカラム上にロードした。カラムを、１０ＣＶの洗浄緩衝液（１００ｍＭのＨｅｐｅｓｐＨ７．５、１５０ｍＭのＮａＣｌ）により、２回にわたり洗浄した。次いで、カラムを、Ａｋｔａｓｙｓｔｅｍ（ＧＥ）へと接続した。ＧＦＰを、０．１ｍＬ／分の流量において、６６．０６μＭの剥離剤であるＮｂＣＡ１６０４７（１ｍｇ／ｍＬ）を含有する８ＣＶの溶出緩衝液（１００ｍＭのＨｅｐｅｓｐＨ７．５、１５０ｍＭのＮａＣｌ）により溶出させた。２８０ｎｍ（タンパク質による吸光）及び４８８ｎｍ（ＧＦＰフルオロフォアによる吸光）における吸光度を測定することにより、ＨｉＴｒａｐＮＨＳ－ａｃｔｉｖａｔｅｄＳｅｐｈａｒｏｓｅＨＰカラム上の固定化捕捉剤としてのＣＡ１６６９５Ｎｂ及び剥離剤としてのＣＡ１６０４７を使用する、ＧＦＰの精製をモニタリングした（図２８）。溶出ピークは、５００μｌの画分中に回収し、ＳＤＳ／ＰＡＧＥゲル中において解析した（図２８）。カラムは、ｐＨ２．３における、８ＣＶの２００ｍＭグリシン緩衝液により再生させた。溶出時におけるＧＦＰフルオロフォアの吸光度プロファイル及び溶出画分についてのＳＤＳ－ＰＡＧＥ解析から、本発明者らは、捕捉剤であるＮｂ（ＣＡ１６６９５）を、高アフィニティーの剥離剤であるＮｂ（ＣＡ１６０４７）と組み合わせて使用することが、ＧＦＰタンパク質の精製を可能とすると結論づける。溶出画分３～９が、主ピーク内に検出される、ＧＦＰタンパク質と複合体化した剥離剤Ｎｂを含有したことは、このＮｂ対（捕捉剤としてのＣＡ１６６９５及び剥離剤としてのＣＡ１６０４７）が、ＮＡＮＥＸによる、ＧＦＰ及びＧＦＰタグ付けタンパク質の、定量的かつ迅速な精製を可能とすることを示す。

［実施例１９］ＨｉＴｒａｐＮＨＳ－ａｃｔｉｖａｔｅｄＳｅｐｈａｒｏｓｅＨＰカラム上の固定化捕捉剤としてのＮｂＣＡ１６２４０及び剥離剤としてのＮｂＣＡ１６２３９を使用する、ＧＳＴタンパク質の精製
グルタチオンＳ－トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）は、しばしば、ＧＳＴ融合タンパク質を含有するタンパク質を分離及び精製するための、ＧＳＴタグとして使用される。本実施例は、ＧＳＴに、ナノモル濃度の低アフィニティーにより特異的に結合するナノボディーである、捕捉剤としてのＣＡ１６２４０（配列番号２１）及びナノモル濃度の低アフィニティーの剥離剤としてのＣＡ１６２３９（配列番号２０）を使用する、ＧＳＴのアフィニティー精製について記載する。

ＧＳＴ・ＣＡ１６２３９間相互作用内のエピトープ及びパラトープを同定するために、本発明者らは、Ｘ線結晶構造解析により、この複合体の構造を解明した（図２９及び３０）。ＧＳＴ（配列番号２２に描示される）及びＧＳＴ－ナノボディー（配列番号２０）を含む結晶は、以下の格子定数：ａ＝６９．８６６Å±５％、ｂ＝７２．４５１Å±５％、ｃ＝７９．７１０Å±５％、α＝９０°、β＝９３．６１°、γ＝９０°を伴う空間群であるＣ１２１内にある。この結晶構造は、本明細書において、ＮｂＣＡ１６２３９と共に水素結合を作り出す、ＧＳＴタンパク質（配列番号２２）のアミノ酸残基により形成されるものとして規定されるエピトープを、さらに描出することを可能とした。このエピトープは、配列番号２２のアミノ酸Ａｓｐ１６０、Ｔｙｒ１６４、Ｐｒｏ１６７、Ｌｅｕ１７０、Ａｓｐ１７１、Ｌｙｓ１８１、Ｇｌｕ１８４、Ｈｉｓ２１５を含む。ＧＳＴ・ＣＡ１６２３９の結晶構造に基づき、本発明者らはまた、ＣＡ１６２３９のアフィニティーを低下させることを目的として突然変異させられる、ＧＳＴ特異的Ｎｂのパラトープ領域内の１つの鍵となる残基（Ｔｙｒ１０９）も同定した（図３０）。

ＧＳＴ・ＣＡ１６２３９の構造に基づき、剥離剤（ＣＡ１６２３９）の１つの残基（Ｙ１０９）を、アラニン（Ｙ１０９Ａ）へと突然変異させて、ＣＡ１６２４０と称される捕捉剤を作製した。

・ＢＬＩアッセイは、ＣＡ１６２３９のアフィニティー（Ｋ_Ｄ）が、４．９ｎＭであり、ｋ_ｏｎが、７．２×１０^５（Ｍ^－１×秒^－１）であり、Ｋ_ｏｆｆが、３．１×１０^－３（秒^－１）であることを同定した（図３１）。

・ＢＬＩアッセイは、ＣＡ１６２４０のアフィニティー（Ｋ_Ｄ）が、６５９ｎＭであり、ｋ_ｏｎが、５．１×１０^５（Ｍ^－１×秒^－１）であり、Ｋ_ｏｆｆが、２．５×１０^－１（秒^－１）であることを同定した（図３１）。

次に、本発明者らは、剥離剤－捕捉剤対としてのＣＡ１６２３９及びＣＡ１６２４０を使用する、ナノボディー交換クロマトグラフィー（ＮＡＮＥＸ）により、ＧＳＴを精製し、ＧＳＴを、ＧＳＴ・ナノボディー複合体として溶出させた。ＦＰＬＣ（ＡｋｔａＰｕｒｅ－ＧＥ）システムへと接続された、ＨｉＴｒａｐＮＨＳ－ａｃｔｉｖａｔｅｄＳｅｐｈａｒｏｓｅＨＰカラムｃへとカップリングされた、ＮｂＣＡ１６２４０を使用して、ＧＳＴタンパク質のアフィニティー精製を実施した。ＧＦＰタンパク質を、このアフィニティーマトリックスから特異的に溶出させるために、本発明者らは、剥離剤としてのＣＡ１６２３９Ｎｂを使用した。

カップリングのために、５ｍｇ（３２６．５ナノモル）のＣＡ１６２４０Ｎｂを、供給元の推奨に従い、市販のＨｉＴｒａｐＮＨＳ－ａｃｔｉｖａｔｅｄＳｅｐｈａｒｏｓｅＨＰカラム（１ｍＬ；ＧＥ）上に固定化した。２ｍｇのＧＳＴタンパク質を、シリンジを使用して、ＣＡ１６２４０Ｎｂカップリングカラム上にロードし、これを、１０ＣＶの洗浄緩衝液（１００ｍＭのＨｅｐｅｓｐＨ７．５、１５０ｍＭのＮａＣｌ）により、２回にわたり洗浄した。次いで、カラムを、Ａｋｔａｓｙｓｔｅｍ（ＧＥ）に接続するのに続き、０．１ｍＬ／分の流量における、１２９．８２μＭの剥離剤であるＮｂＣＡ１６２３９（２ｍｇ／ｍＬ）を含有する、８ＣＶの溶出緩衝液（１００ｍＭのＨｅｐｅｓｐＨ７．５、１５０ｍＭのＮａＣｌ）による溶出を行った。２８０ｎｍにおける吸光度（タンパク質による吸光）を測定することにより、ＨｉＴｒａｐＮＨＳ－ａｃｔｉｖａｔｅｄＳｅｐｈａｒｏｓｅＨＰカラム上の固定化捕捉剤としてのＣＡ１６２４０Ｎｂ及び剥離剤としてのＣＡ１６２３９を使用する、ＧＳＴの精製をモニタリングした（図３２）。溶出ピークは、５００μｌの画分中に回収し、ＳＤＳ／ＰＡＧＥゲル中において解析した（図３２）。カラムの再生は、８ＣＶの２００ｍＭグリシン緩衝液、ｐＨ２．３により得た。吸光度プロファイル及び溶出画分についてのＳＤＳ－ＰＡＧＥ解析から、本発明者らは、捕捉剤であるＮｂ（ＣＡ１６２４０）を、はるかに低いｋ_ｏｆｆを伴うが、ほぼ等しいｋ_ｏｎを伴う、高アフィニティーの剥離剤であるＮｂ（ＣＡ１６２３９）と組み合わせて使用することが、ＧＳＴタンパク質の精製を可能とすると結論づける。溶出画分３～７が、主ピーク内に検出される、ＧＳＴタンパク質と複合体化した剥離剤Ｎｂを含有したことは、このＮｂ対（捕捉剤としてのＣＡ１６２４０及び剥離剤としてのＣＡ１６２３９）が、ＮＡＮＥＸによる、ＧＳＴ又はＧＳＴタグ付けタンパク質の、定量的かつ迅速な精製を可能とすることを示す。

［実施例２０］ＨｉＴｒａｐＮＨＳ－ａｃｔｉｖａｔｅｄＳｅｐｈａｒｏｓｅＨＰカラム上の固定化捕捉剤としてのＮｂＣＡ１６６８７及び剥離剤としてのＮｂＣＡ１５８３９を使用する、ＳＭＴ３タンパク質の精製
ユビキチン様タンパク質ＳＭＴ３（は、酵母ＳＵＭＯタンパク質である、ｓｍｔ３である）は、しばしば、ｓｍｔ３融合タンパク質を含有するタンパク質を分離及び精製するｓｍｔ３タグとして使用される。

本実施例は、ＳＭＴ３に、ナノモル濃度の低アフィニティーにより特異的に結合するナノボディーである、捕捉剤としてのＣＡ１６６８７（配列番号２４）及びナノモル濃度の低アフィニティーの剥離剤としてのＣＡ１５８３９（配列番号２５）を使用する、ＳＭＴ３のアフィニティー精製について記載する。

ＳＭＴ３・ＣＡ１５８３９間相互作用内のエピトープ及びパラトープを同定するために、本発明者らは、Ｘ線結晶構造解析により、この複合体の構造を解明した（図３３及び３４）。ＳＭＴ３（配列番号２５に描示される）及びＳＭＴ３－ナノボディー（配列番号２３）を含む結晶は、以下の格子定数：ａ＝４５．７１Å±５％、ｂ＝９０．６６Å±５％、ｃ＝５７．７５Å±５％、α＝９０°、β＝１１２．３６°、γ＝９０°を伴う空間群であるＰ１２１１内にある。この結晶構造は、本明細書において、ＮｂＣＡ１５８３９と共に水素結合を作り出す、ＳＭＴ３タンパク質のアミノ酸残基により形成されるものとして規定されるエピトープを、さらに描出することを可能とした。このエピトープは、配列番号２５のアミノ酸Ｈｉｓ２１、Ａｓｎ２３、Ｐｈｅ３４、Ｌｙｓ３６、Ｌｙｓ３８、Ａｒｇ４５、Ａｓｎ８４を含む。

ＳＭＴ３・ＣＡ１５８３９の構造に基づき、本発明者らはまた、ＣＡ１５８３９のアフィニティーを低下させることを目的として突然変異させられる、ＳＭＴ３特異的Ｎｂのパラトープ内の１つの鍵となる残基（Ａｓｐ５０）も同定した（図３４）。

ＳＭＴ３・ＣＡ１５８３９の構造に基づき、剥離剤（ＣＡ１５８３９）の１つの残基（Ａｓｐ５０）を、アラニン（Ｄ５０Ａ）へと突然変異させて、ＣＡ１６６８７と称され
る捕捉剤を作製した。

・ＢＬＩアッセイは、ＣＡ１５８３９のアフィニティー（ＫＤ）が、６．７ｎＭであり、ｋ_ｏｎが、３．２×１０５（Ｍ^－１×秒^－１）であり、Ｋ_ｏｆｆが、２．１×１０^－３（秒^－１）であることを同定した（図３５）。

・ＢＬＩアッセイは、ＣＡ１６６８７のアフィニティー（ＫＤ）が、２９ｎＭであり、ｋ_ｏｎが、３．９×１０５（Ｍ^－１×秒^－１）であり、Ｋ_ｏｆｆが、８．０×１０^－３（秒^－１）であることを同定した（図３５）。

次に、本発明者らは、剥離剤－捕捉剤対としてのＣＡ１５８３９及びＣＡ１６６８７を使用する、ナノボディー交換クロマトグラフィー（ＮＡＮＥＸ）により、ＳＭＴ３を精製し、ＳＭＴ３を、ＳＭＴ３・ナノボディー複合体として溶出させた。ＦＰＬＣ（ＡｋｔａＰｕｒｅ－ＧＥ）システムへと接続された、ＨｉＴｒａｐＮＨＳ－ａｃｔｉｖａｔｅｄＳｅｐｈａｒｏｓｅＨＰカラムへとカップリングされた、ＮｂＣＡ１６６８７を使用して、ＳＭＴ３タンパク質のアフィニティー精製を実施した。ＳＭＴ３タンパク質を、このアフィニティーマトリックスから特異的に溶出させるために、本発明者らは、剥離剤としてのＣＡ１５８３９Ｎｂを使用した。

カップリングのために、１ｍｇ（６９．５８ナノモル）のＣＡ１６６８７Ｎｂを、供給元の推奨に従い、ＨｉＴｒａｐＮＨＳ－ａｃｔｉｖａｔｅｄＳｅｐｈａｒｏｓｅＨＰカラム（１ｍＬ；ＧＥ）上に固定化した。２ｍｇのＳＭＴ３タンパク質を、シリンジを使用して、ＣＡ１６６８７Ｎｂカップリングカラム上にロードし、これを、１０ＣＶの洗浄緩衝液（１００ｍＭのＨｅｐｅｓｐＨ７．５、１５０ｍＭのＮａＣｌ）により、２回にわたり洗浄した。次いで、カラムを、Ａｋｔａｓｙｓｔｅｍ（ＧＥ）に接続するのに続き、０．１ｍＬ／分の流量における、１３８．７３μＭの剥離剤であるＮｂＣＡ１５８３９（２ｍｇ／ｍＬ）を含有する、８ＣＶの溶出緩衝液（１００ｍＭのＨｅｐｅｓｐＨ７．５、１５０ｍＭのＮａＣｌ）による溶出を行った。２８０ｎｍにおける吸光度（タンパク質による吸光）を測定することにより、ＨｉＴｒａｐＮＨＳ－ａｃｔｉｖａｔｅｄＳｅｐｈａｒｏｓｅＨＰカラム上の固定化捕捉剤としてのＣＡ１６６８７Ｎｂ及び剥離剤としてのＣＡ１５８３９を使用する、ＳＭＴ３の精製をモニタリングした（図３６）。溶出ピークは、５００μｌの画分中に回収し、ＳＤＳ／ＰＡＧＥゲル中において解析した（図３６）。カラムの再生は、８ＣＶの２００ｍＭグリシン緩衝液、ｐＨ２．３により得た。吸光度プロファイル及び溶出画分についてのＳＤＳ－ＰＡＧＥ解析から、本発明者らは、捕捉剤であるＮｂ（ＣＡ１６６８７）を、低いｋ_ｏｆｆを伴うが、ほぼ等しいｋ_ｏｎを伴う、高アフィニティーの剥離剤であるＮｂ（ＣＡ１５８３９）と組み合わせて使用することが、ＳＭＴ３タンパク質の精製を可能とすると結論することができる。溶出画分３～８が、主ピーク内に検出される、ＳＭＴ３タンパク質と複合体化した剥離剤Ｎｂを含有したことは、このＮｂ対（捕捉剤としてのＣＡ１６６８７及び剥離剤としてのＣＡ１５８３９）が、ＮＡＮＥＸによる、ＳＭＴ３及びＳＭＴ３タグ付けタンパク質の、定量的かつ迅速な精製を可能とすることを示す。したがって、ＳＭＴ３－ＮＡＮＥＸ対は、翻訳後修飾されたタンパク質を、酵母から特異的に精製するのに使用されうる。

［実施例２１］ＨｉＴｒａｐＮＨＳ－ａｃｔｉｖａｔｅｄＳｅｐｈａｒｏｓｅＨＰカラム上の固定化捕捉剤としてのＮｂＣＡ１６９６４及び剥離剤としてのＮｂＣＡ１７３０２を使用する、ｍＣｈｅｒｒｙ－融合タンパク質の精製
ｍＣｈｅｒｒｙは、アネモネである、ディスコソーマ・セア（Ｄｉｓｃｏｓｏｍａｓｅａ）のＤｓＲｅｄに由来する、単量体の赤色蛍光タンパク質のｍＦｒｕｉｔｓファミリーのメンバーである。ＧＦＰと同様に、ｍＣｈｅｒｒｙは、しばしば、細胞内のタンパク質にタグ付けするのに使用されるので、蛍光分光法及び蛍光顕微鏡法を使用して研究されうる。本実施例は、ｍＣｈｅｒｒｙに、ナノモル濃度の低アフィニティーにより特異的に結合するナノボディーである、捕捉剤としてのＮｂＣＡ１６９６４（配列番号２６）及びナノモル濃度の低アフィニティーの剥離剤としてのＮｂＣＡ１７３０２（配列番号２７）を使用する、ｍＣｈｅｒｒｙ－融合タンパク質のアフィニティー精製について記載する。

ＮｂであるＣＡ１６９６４及びＣＡ１７３０２は、ｍＣｈｅｒｒｙによるラマの免疫化により作出され、標準的な手順に従う、この抗原に対するファージディスプレイにより選択された、異なる配列ファミリーに由来する、２つの非類縁のナノボディーである（Ｐａｒｄｏｎ、２０１４）。ＢＬＩを使用するエピトープマッピングは、ＣＡ１７３０２と、ＣＡ１６９６４とは、ｍＣｈｅｒｒｙ上の重複エピトープについて競合し、この蛍光タンパク質に、互いに排他的な形で結合することを指し示した（図３７）。いずれのＮｂも、ＢＬＩにより、さらに特徴づけた（図３８）ところ、以下の値を得た。

・ＢＬＩアッセイは、ＣＡ１７３０２のアフィニティー（Ｋ_Ｄ）が、１．７ｎＭであり、ｋ_ｏｎが、６．２×１０^５（Ｍ^－１×秒^－１）であり、Ｋ_ｏｆｆが、１×１０^－３（秒^－１）であることを同定した（図３８）。

・ＢＬＩアッセイは、ＣＡ１６９６４のアフィニティー（Ｋ_Ｄ）が、６．５３ｎＭであり、ｋ_ｏｎが、６．９４×１０^５（Ｍ^－１×秒^－１）であり、Ｋ_ｏｆｆが、４．４×１０^－３（秒^－１）であることを同定した（図３８）。

次に、本発明者らは、剥離剤－捕捉剤対としてのＮｂＣＡ１７３０２及びＮｂＣＡ１６９６４を使用する、ナノボディー交換クロマトグラフィー（ＮＡＮＥＸ）により、ｍＣｈｅｒｒｙ、尿路病原性Ｅ．コリー株に由来するＦｍｌＨレクチン及び短鎖Ｈｉｓタグを含有する融合タンパク質である、ＦｍｌＨ＿ｌｅｃｔｉｎ＿ｍＣｈｅｒｒｙ＿ｈｉｓ（配列番号２９）を精製して、ＦｍｌＨ＿ｌｅｃｔｉｎ＿ｍＣｈｅｒｒｙ＿ｈｉｓ・ナノボディー複合体を溶出させた。アフィニティー精製は、ＦＰＬＣ（ＡｋｔａＰｕｒｅ－ＧＥ）システムへと接続された、ＨｉＴｒａｐＮＨＳ－ａｃｔｉｖａｔｅｄＳｅｐｈａｒｏｓｅＨＰへとカップリングされた、ＮｂＣＡ１６９６４を使用して実施した。ＦｍｌＨ＿ｌｅｃｔｉｎ＿ｍＣｈｅｒｒｙ＿ｈｉｓ融合タンパク質を、このアフィニティーマトリックスから特異的に溶出させるために、本発明者らは、剥離剤としてのＣＡ１７３０２Ｎｂを使用した。

カップリングのために、１ｍｇ（６８ナノモル）のＣＡ１６９６４Ｎｂを、供給元の推奨に従い、ＨｉＴｒａｐＮＨＳ－ａｃｔｉｖａｔｅｄＳｅｐｈａｒｏｓｅＨＰカラム（１ｍＬ；ＧＥ）上に固定化した。５０ｍＬの溶解物（過剰発現された組換えＦｍｌＨ＿ｌｅｃｔｉｎ＿ｍＣｈｅｒｒｙ＿ｈｉｓの、２Ｌの細菌培養物に由来する）を、シリンジを使用して、ＣＡ１６９６４Ｎｂカップリングカラム上にロードし、１０ＣＶの洗浄緩衝液（１００ｍＭのＨｅｐｅｓｐＨ７．５、１５０ｍＭのＮａＣｌ）により、２回にわたり洗浄した。次いで、カラムを、Ａｋｔａｓｙｓｔｅｍ（ＧＥ）に接続するのに続き、０．１ｍＬ／分の流量における、６５．５μＭの剥離剤であるＮｂＣＡ１７３０２（１ｍｇ／ｍＬ）を含有する、８ＣＶの溶出緩衝液（１００ｍＭのＨｅｐｅｓｐＨ７．５、１５０ｍＭのＮａＣｌ）による溶出を行った。２８０ｎｍにおける吸光度（タンパク質による吸光）を測定することにより、固定化捕捉剤としてのＣＡ１６９６４Ｎｂ及び剥離剤としてのＣＡ１７３０２を使用する、ＦｍｌＨ＿ｌｅｃｔｉｎ＿ｍＣｈｅｒｒｙ＿ｈｉｓの精製をモニタリングした（図３９）。溶出ピークは、５００μｌの画分中に回収し、ＳＤＳ／ＰＡＧＥゲル中において解析した（図３９）。カラムの再生は、８ＣＶの２００ｍＭグリシン緩衝液、ｐＨ２．３により得た。溶出クロマトグラム及び溶出画分についてのＳＤＳ－ＰＡＧＥ解析から、本発明者らは、捕捉剤であるＮｂ（ＣＡ１６９６４）を、低いｋ_ｏｆｆを伴うが、ほぼ等しいｋ_ｏｎを伴う、高アフィニティーの剥離剤であるＮｂ（ＣＡ１７３０２）と組み合わせて使用することが、ＦｍｌＨ＿ｌｅｃｔｉｎ＿ｍＣｈｅｒｒｙ＿ｈｉｓタンパク質の精製を可能とすると結論することができる。溶出画分４～８が、主ピーク内に検出される、ＦｍｌＨ＿ｌｅｃｔｉｎ＿ｍＣｈｅｒｒｙ＿ｈｉｓ融合タンパク質と複合体化した剥離剤Ｎｂを含有したことは、このＮｂ対（捕捉剤としてのＣＡ１６９６４及び剥離剤としてのＣＡ１７３０２）が、ＮＡＮＥＸによる、ｍＣｈｅｒｒｙ融合タンパク質の、定量的かつ迅速な精製を可能とすることを示す。

［実施例２２］ＨｉＴｒａｐＮＨＳ－ａｃｔｉｖａｔｅｄＳｅｐｈａｒｏｓｅＨＰカラム上の固定化捕捉剤としてのＮｂＣＡ１７３４１及び剥離剤としてのＮｂＣＡ１７３０２を使用する、ｍＣｈｅｒｒｙ－融合タンパク質の精製
本実施例は、ｍＣｈｅｒｒｙに、ナノモル濃度の低アフィニティーにより特異的に結合するナノボディーである、捕捉剤としてのＮｂＣＡ１７３４１（配列番号２８）及びナノモル濃度の低アフィニティーの剥離剤としてのＮｂＣＡ１７３０２（配列番号２７）を使用する、ＦｍｌＨ＿ｌｅｃｔｉｎ＿ｍＣｈｅｒｒｙ＿ｈｉｓ融合タンパク質のアフィニティー精製について記載する。

ＮｂＣＡ１７３４１は、ＮｂＣＡ１７３０２から出発して、ＮｂＣＡ１７３０２のＣＤＲ３に対して、アラニンスキャンを実施することにより得た。Ｉｌｅ１０１の、アラニンへの突然変異は、Ｎｂ・抗原間相互作用についての、事前の構造情報を伴わずに、剥離剤を、捕捉剤へと転換することを可能とした。ＣＡ１７３４１を、ＢＬＩにより、さらに特徴づけた（図４０）ところ、以下の値を得た。

・ＢＬＩアッセイは、ＣＡ１７３０２のアフィニティー（Ｋ_Ｄ）が、１．７ｎＭであり、ｋ_ｏｎが、６．２×１０^５（Ｍ^－１×秒^－１）であり、Ｋ_ｏｆｆが、１×１０^－３（秒^－１）であることを同定した（図４０）。

・ＢＬＩアッセイは、ＣＡ１７３４１のアフィニティー（Ｋ_Ｄ）が、４．１ｎＭであり、ｋ_ｏｎが、６×１０^５（Ｍ^－１×秒^－１）であり、Ｋ_ｏｆｆが、２．３×１０^－３（秒^－１）であることを同定した（図４０）。

次に、本発明者らは、剥離剤－捕捉剤対としてのＮｂＣＡ１７３４１及びＮｂＣＡ１７３０２を使用する、ナノボディー交換クロマトグラフィー（ＮＡＮＥＸ）により、ＦｍｌＨ＿ｌｅｃｔｉｎ＿ｍＣｈｅｒｒｙ＿ｈｉｓ融合タンパク質を精製し、標的を、ＦｍｌＨ＿ｌｅｃｔｉｎ＿ｍＣｈｅｒｒｙ＿ｈｉｓ・ナノボディー複合体として溶出させた。アフィニティー精製は、ＦＰＬＣ（ＡｋｔａＰｕｒｅ－ＧＥ）システムへと接続された、ＨｉＴｒａｐＮＨＳ－ａｃｔｉｖａｔｅｄＳｅｐｈａｒｏｓｅＨＰカラム上に固定化された、ＮｂＣＡ１７３４１により実施した。ＦｍｌＨ＿ｌｅｃｔｉｎ＿ｍＣｈｅｒｒｙ＿ｈｉｓ融合タンパク質を、このアフィニティーマトリックスから特異的に溶出させるために、本発明者らは、剥離剤としてのＣＡ１７３０２Ｎｂを使用した。

カップリングのために、１ｍｇ（６５．６９ナノモル）のＣＡ１７３４１Ｎｂを、供給元の推奨に従い、ＨｉＴｒａｐＮＨＳ－ａｃｔｉｖａｔｅｄＳｅｐｈａｒｏｓｅＨＰカラム（１ｍＬ；ＧＥ）上に固定化した。５０ｍＬの細胞溶解物（ＦｍｌＨ＿ｌｅｃｔｉｎ＿ｍＣｈｅｒｒｙ＿ｈｉｓ融合タンパク質を過剰発現するＥ．コリーの、２Ｌの培養物から採取された）を、ＣＡ１６９６４Ｎｂカップリングカラム上にロードした。カラムを、１０ＣＶの洗浄緩衝液（１００ｍＭのＨｅｐｅｓｐＨ７．５、１５０ｍＭのＮａＣｌ）により、２回にわたり洗浄し、Ａｋｔａｓｙｓｔｅｍ（ＧＥ）に接続した。次に、０．１ｍＬ／分の流量において、６５．５μＭの剥離剤であるＮｂＣＡ１７３０２（１ｍｇ／ｍＬ）を含有する、８ＣＶの溶出緩衝液（１００ｍＭのＨｅｐｅｓｐＨ７．５、１５０ｍＭのＮａＣｌ）により、このカラムから、融合タンパク質を溶出させた。２８０ｎｍにおける吸光度（タンパク質による吸光）及び５８５ｎｍにおける吸光度（ｍＣｈｅｒｒｙによる吸光）を測定することにより、ＨｉＴｒａｐＮＨＳ－ａｃｔｉｖａｔｅｄＳｅｐｈａｒｏｓｅＨＰカラム上の固定化捕捉剤としてのＣＡ１７３４１Ｎｂ及び剥離剤としてのＣＡ１７３０２を使用する、ＦｍｌＨ＿ｌｅｃｔｉｎ＿ｍＣｈｅｒｒｙ＿ｈｉｓの精製をモニタリングした（図４１）。溶出ピークは、５００μｌの画分中に回収し、ＳＤＳ／ＰＡＧＥゲル中において解析した（図４１）。カラムの再生は、８ＣＶの２００ｍＭグリシン緩衝液、ｐＨ２．３により得た。溶出画分についてのＳＤＳ－ＰＡＧＥ解析から、本発明者らは、捕捉剤であるＮｂ（ＣＡ１７３４１）を、高アフィニティーの剥離剤であるＮｂ（ＣＡ１７３０２）と組み合わせて使用することが、ＦｍｌＨ＿ｌｅｃｔｉｎ＿ｍＣｈｅｒｒｙ＿ｈｉｓタンパク質の精製を可能とすると結論することができる。溶出画分４～８が、主ピーク内に検出される、ＦｍｌＨ＿ｌｅｃｔｉｎ＿ｍＣｈｅｒｒｙ＿ｈｉｓ融合タンパク質と複合体化した剥離剤Ｎｂを含有したことは、このＮｂ対（捕捉剤としてのＣＡ１７３４１及び剥離剤としてのＣＡ１７３０２）が、ＮＡＮＥＸによる、ｍＣｈｅｒｒｙ融合タンパク質の、迅速かつ定量的な精製を可能とすることを指し示す。本実施例はまた、ＣＤＲ３についての簡単なアラニンスキャンが、構造情報を必要とせずに、剥離剤を、捕捉剤へと転換する、迅速かつ容易な方法であることも示す。

［実施例２３］ＨｉＴｒａｐＮＨＳ－ａｃｔｉｖａｔｅｄＳｅｐｈａｒｏｓｅＨＰ上の固定化捕捉剤としてのＮｂＣＡ１１１４３及び剥離剤としてのＭｅｇａＢｏｄｙであるＣＡ１６３８３（ＮｂＣＡ１４２０８に由来する、操作抗原結合性タンパク質）を使用する、天然ヒト凝固第ＩＸ因子の精製
ナノボディー交換クロマトグラフィー（ＮＡＮＥＸ）の概念は、剥離剤及び／又は捕捉剤のそれぞれとしてのナノボディーの使用に限定されない。実際、標的の同じエピトープへの結合について競合する、任意のタンパク質対：抗体、メガボディー、ダルピン、合成結合性タンパク質、・・・が、ＮＡＮＥＸの原理に従い、この標的を精製するのに使用されうる。本実施例において、本発明者らは、あるナノボディーが、ＮＡＮＥＸの原理に従い、ヒト凝固第ＩＸ因子を精製するのに、ＭｅｇａＢｏｄｙと組み合わせて使用されうることを示す。ＭｅｇａＢｏｄｙは、既に記載されている通り、完全な抗原結合特異性及びアフィニティーを保持しながら、それらの分子量を増大させるように、ナノボディーを、選択されたタンパク質足場へとグラフトすることにより得られる、操作抗原結合性タンパク質である。本実施例は、本発明者らが、剥離剤としてのＮｂＣＡ１４２０８に由来するＭｅｇａＢｏｄｙ（ＣＡ１６３８３）を使用したことを除き、実施例１６と同様である。このようにして、クライオＥＭによる構造の特徴付けの準備ができた、ＭｅｇａＢｏｄｙと複合体化させたヒト血漿から、天然ヒト凝固第ＩＸ因子を精製するのに、本発明者らは、ＮＡＮＥＸを使用して、天然のタンパク質を、その天然の供給源（ヒト血液）から精製した。

より具体的に、本実施例は、捕捉剤としての固定化ナノボディーであるＣＡ１１１４３（配列番号３１）及び剥離剤としてのＭｅｇａＢｏｄｙであるＣＡ１６３８３（配列番号３０）を使用する、ＡＣＤ抗凝固剤により処理されたヒト全血由来血漿からの、ヒト凝固第ＩＸ因子のアフィニティー精製について記載する。

カップリングのために、３．７ｍｇ（２５０．９７ナノモル）のＣＡ１１１４３Ｎｂを、供給元の推奨に従い、ＨｉＴｒａｐＮＨＳ－ａｃｔｉｖａｔｅｄＳｅｐｈａｒｏｓｅＨＰカラム（１ｍＬ；ＧＥ）上に固定化した。ＡＣＤ抗凝固剤（Ｔｅｂｕ－Ｂｉｏ、ＳＥＲ－ＰＬＥ２００ＭＬ－ＡＣＤ）により処理された、３０ｍＬのヒト全血由来血漿を、蠕動ポンプを使用する、１２０分間にわたる再循環により、ＣＡ１１１４３Ｎｂカップリングカラムにロードした。次に、カラムを、１５ＣＶの洗浄緩衝液（２０ｍＭのＨｅｐｅｓｐＨ８．０、１５０ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＣａＣｌ_２）により洗浄した。次いで、カラムを、Ａｋｔａｓｙｓｔｅｍ（ＧＥ）へと接続し、第ＩＸ因子を、０．０５ｍＬ／分の流量において、剥離剤として使用される９．９２μＭのＭｅｇａＢｏｄｙであるＣＡ１６３８３を含有する、１ｍＬの緩衝液（２０ｍＭのＨｅｐｅｓｐＨ８．０、１５０ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＣａＣｌ_２）により溶出させた。２８０ｎｍにおける吸光度（タンパク質による吸光）を測定することにより、精製工程をモニタリングした（図４２）。溶出ピークを、７５０μｌの画分内に回収し、画分を、ＳＤＳ／ＰＡＧＥゲル中において解析し、市販のヒト凝固第ＩＸ因子を、陽性対照として含むウェスタンブロットにより解析した（図４２）。カラムの再生は、５ＣＶの２００ｍＭのグリシン緩衝液、ｐＨ２．３により得た。溶出画分についてのＳＤＳ－ＰＡＧＥ解析から、本発明者らは、捕捉剤であるＮｂ（ＣＡ１１１４３）を、機能化剥離剤であるＮｂ（ＣＡ１６３８３）と組み合わせて使用することが、血漿からの、ヒト凝固第ＩＸ因子タンパク質の精製を可能としたと結論することができる。主溶出ピークに対応する画分４及び５が、ＭｅｇａＢｏｄｙと複合体化した、精製ヒト凝固第ＩＸ因子タンパク質を含有したことは、メガボディーを、剥離剤－捕捉剤対として、ナノボディーと組み合わせて、天然のタンパク質を、天然の複合供給源から精製しうることを指し示す。

［実施例２４］ＨｉＴｒａｐＮＨＳ－ａｃｔｉｖａｔｅｄＳｅｐｈａｒｏｓｅＨＰ上の固定化捕捉剤としてのＭｅｇａＢｏｄｙであるＣＡ１６３８８及び剥離剤としての機能化ナノボディー（ＭｅｇａＢｏｄｙＭｂ_{ＣＡ１０３０９} ^ＹｇｊＫ）であるＮｂＣＡ１６３８３を使用する、天然ヒト凝固第ＩＸ因子の精製
実施例２３の下に示された通り、ナノボディーを、ＭｅｇａＢｏｄｙと組み合わせた、捕捉剤として使用して、機能化樹脂から、標的を剥離させることができる。実施例２４において、本発明者らは、捕捉剤としてのＭｅｇａＢｏｄｙを、剥離剤としての別のＭｅｇａＢｏｄｙと組み合わせて使用して、ヒト血清から、ヒト凝固第ＩＸ因子を精製した。この原理を実証するために、本発明者らは、ＮＡＮＥＸにより、ＭｅｇａＢｏｄｙであるＣＡ１６３８３と複合体化したヒト凝固第ＩＸ因子を精製するのに、捕捉剤としてのＭｅｇａＢｏｄｙであるＣＡ１６３８８及び剥離剤としてのＭｅｇａＢｏｄｙであるＣＡ１６３８３を使用して、ＡＣＤ抗凝固剤により処理されたヒト血漿から、天然ヒト凝固第ＩＸ因子を精製するＮＡＮＥＸ実験を実施した。

カップリングのために、１．１ｍｇ（１０．８７ナノモル）のＭｅｇａＢｏｄｙであるＣＡ１６３８８を、供給元の推奨に従い、ＨｉＴｒａｐＮＨＳ－ａｃｔｉｖａｔｅｄＳｅｐｈａｒｏｓｅＨＰカラム（１ｍＬ；ＧＥ）上に固定化した。ＡＣＤ抗凝固剤（Ｔｅｂｕ－Ｂｉｏ、ＳＥＲ－ＰＬＥ２００ＭＬ－ＡＣＤ）により処理された、３０ｍＬのヒト全血由来血漿を、蠕動ポンプを使用する、６０分間にわたる再循環により、ＣＡ１６３８８Ｎｂカップリングカラムにロードした。カラムを、１５ＣＶの洗浄緩衝液（２０ｍＭのＨｅｐｅｓｐＨ８．０、１５０ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＣａＣｌ_２）により洗浄した。次いで、洗浄されたカラムを、Ａｋｔａｓｙｓｔｅｍ（ＧＥ）に接続し、第ＩＸ因子を、０．０５ｍＬ／分の流量において、９．９２μＭのＭｅｇａＢｏｄｙであるＣＡ１６３８３を、剥離剤として含有する、１ｍＬの緩衝液（２０ｍＭのＨｅｐｅｓｐＨ８．０、１５０ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＣａＣｌ_２）により溶出させた。２８０ｎｍにおける吸光度（タンパク質による吸光）を測定することにより、精製工程をモニタリングした（図４３）。溶出ピークを、７５０μｌの画分内に回収し、ＳＤＳ／ＰＡＧＥゲル中において解析し、市販のヒト凝固第ＩＸ因子を、対照として含むウェスタンブロットにより解析した（図４３）。カラムの再生は、５ＣＶの２００ｍＭのグリシン緩衝液、ｐＨ２．３により得た。溶出画分についてのＳＤＳ－ＰＡＧＥ解析及びウェスタンブロット解析から、本発明者らは、捕捉剤－剥離剤対としての、ＭｅｇａＢｏｄｙであるＣＡ１６３８８及びＭｅｇａＢｏｄｙであるＣＡ１６３８３が、ＮＡＮＥＸによる、血漿からの、ヒト凝固第ＩＸ因子タンパク質の精製を可能としたと結論することができる。溶出画分４及び５は、主ピーク内に検出される、ヒト凝固第ＩＸ因子タンパク質と複合体化した剥離剤Ｎｂを含有した。

［実施例２５］ＨｉＴｒａｐＮＨＳ－ａｃｔｉｖａｔｅｄＳｅｐｈａｒｏｓｅＨＰ上の固定化捕捉剤としてのＮｂＣＡ１５８１６及び剥離剤としてのＮｂＣＡ１２６７０を使用する、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞溶解物からの、その天然の分子シャペロンと複合体化した、ヒトＧＦＰタグ付けグルココルチコイド受容体（ＧＦＰ－ＧＲ）の精製
ＮＡＮＥＸ技術は、溶出のために、高塩濃度又は極端なｐＨ条件を要求せず、完全に、天然条件（ｐＨ、緩衝液組成物、温度、・・・）下において実施されうるので、この方法はまた、天然供給源からの、（一過性の）タンパク質間複合体の精製にも適用可能である。この原理を実証するために、本発明者らは、ヒトグルココルチコイド受容体（ＧＲ）を、ＧＦＰによりタグ付けし、この融合タンパク質を、ヒト細胞系内において発現させ、精製された受容体を、その分子シャペロンである、Ｈｓｐ７０及びＨｓｐ９０（熱ショックタンパク質）と複合体化させた。文献から、ａｐｏ－ＧＲは、主に、細胞質性であり、その休眠状態下、いわゆるフォールドソーム内において、熱ショックタンパク質及びイムノフィリンと会合していることが公知である（Ｐｒａｔｔら、１９９７）。したがって、本発明者らは、ＨｉＴｒａｐＮＨＳ－ａｃｔｉｖａｔｅｄＳｅｐｈａｒｏｓｅＨＰカラム上の固定化捕捉剤（ＧＦＰに対する、中アフィニティーの捕捉剤）としてのＣＡ１５８１６（配列番号３）及びその分子シャペロンと会合した、ＧＦＰタグ付けＧＲ受容体に対する、高アフィニティーの剥離剤としてのＮｂＣＡ１２６７０（配列番号１）を使用して、ヒトＨＥＫ２９３Ｔ細胞から、Ｈｓｐ７０及びＨｓｐ９０と複合体化した、ｅＧＦＰタグ付け組換えヒトグルココルチコイド受容体（配列番号３４）を精製した。

カップリングのために、１ｍｇ（６６．９５５ナノモル）のＣＡ１５８１６Ｎｂを、供給元の推奨に従い、ＨｉＴｒａｐＮＨＳ－ａｃｔｉｖａｔｅｄＳｅｐｈａｒｏｓｅＨＰカラム（１ｍＬ；ＧＥ）上に固定化した。組換えヒトｅＧＦＰ－６Ｈｉｓ－ＴＥＶ－ＧＲは、一過性発現のために、Ｘ－ｔｒｅｍｅＧＥＮＥ（商標）９ＤＮＡＴｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎＲｅａｇｅｎｔ（ＸＴＧ９－ＲＯＲｏｃｈｅ）を使用し、１５０×２１ｍｍディッシュ（Ｎｕｎｃｌｏｎ（商標）Ｄｅｌｔａ）内において増殖させたヒトＨＥＫ２３９Ｔ細胞にトランスフェクトするｐｃＤＮＡ３．１＋Ｎ－ｅＧＦＰベクターを使用して発現させた。トランスフェクションの後、ＨＥＫ２３９Ｔ細胞を、３７℃、５％のＣＯ_２下において、４８時間にわたり増殖させた。３枚のプレートからの細胞は、ピペッティング及び遠心分離により回収し、ＰＢＳにより洗浄し、１０ｍＭのリン酸ＮａｐＨ８、５ｍＭのＤＴＴ、０．１ｍＭのＥＤＴＡ、１０ｍＭのＮａ_２ＭｏＯ_４、１０％のグリセロール（プロテアーゼ阻害剤を補充された）を含有する１０ｍＬの溶解緩衝液中に再懸濁させてから、Ｄｏｕｎｃｅホモジナイザーを使用して溶解させた。溶解物を、遠心分離により清澄化させ、上清を回収し、濾過し（０．４５μｍのフィルター）、シリンジを使用して、ＣＡ１５８１６Ｎｂによりコーティングされた、ＨｉＴｒａｐＮＨＳ－ａｃｔｉｖａｔｅｄＳｅｐｈａｒｏｓｅＨＰカラムへとロードした。シリンジを使用して、１０ＣＶの洗浄緩衝液（５０ｍＭのＨｅｐｅｓｐＨ７．５、１５０ｍＭのＮａＣｌ）を、カラム上に適用した。次いで、アフィニティーカラムを、ＦＰＬＣ（ＡｋｔａＰｕｒｅ－ＧＥ）システムへと接続し、流量を０．１ｍＬ／分として、５０ｍＭＨｅｐｅｓｐＨ７．５、１５０ｍＭＮａＣｌ中に、６６．７μＭＣＡ１５８１６Ｎｂ剥離剤（１ｍｇ／ｍＬ）を含有する、１ｍＬの溶出緩衝液により、フォールドソームを溶出させた。カラムの再生は、５ＣＶの２００ｍＭのグリシン緩衝液、ｐＨ２．３を使用して得た。２８０ｎｍ（タンパク質による吸光）及び４８８ｎｍ（ｅＧＦＰ）における吸光度を測定することにより、精製工程をモニタリングした（図４４）。溶出ピークを、５００μＬの画分内に回収し、ＳＤＳ／ＰＡＧＥゲル中において解析し、市販の抗ヒトグルココルチコイド受容体抗体（抗ＧＲＧ－５、ＳａｎｔａＣｒｕｚ）を使用するウェスタンブロットにより解析した（図４４）。溶出画分についてのＳＤＳ－ＰＡＧＥ解析において観察された３つ主要なバンドを切り出し、質量分析により解析した。主要なバンドを、それぞれ、ヒトグルココルチコイド受容体、ＨＳＰ９０及びＨＳＰ７０タンパク質として同定した（図４４）。Ｈｓｐ７０及びＨｓｐ９０は、細胞質内において、ヒトグルココルチコイド受容体などの核内受容体と共に、複合体（フォールドソーム）を形成することが公知の分子シャペロンであり、ＮＡＮＥＸが、とりわけ、トランスフェクトされたＨＥＫ２９３Ｔ細胞からの、ｅＧＦＰタグ付けＧＲ、Ｈｓｐ７０、Ｈｓｐ９０及び剥離剤を含有する天然のタンパク質間複合体の、迅速かつ容易な精製を可能とすることを示す。

［実施例２６］ＨｉＴｒａｐＮＨＳ－ａｃｔｉｖａｔｅｄＳｅｐｈａｒｏｓｅＨＰ上の固定化捕捉剤としてのＮｂＣＡ１５８１６及び剥離剤としてのＮｂＣＡ１２６７０を使用する、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞溶解物からの、分子シャペロンと複合体化した、組換えヒトＧＦＰタグ付けアンドロゲン受容体（ＧＦＰ－ＡＲｂ）の精製
実施例２５において裏付けられた通り、ＮＡＮＥＸはまた、（一過性の）タンパク質複合体を精製するのにも使用されうる。この原理をさらに実証するために、本発明者らはまた、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞から、いわゆるフォールドソーム内において、その分子シャペロンであるＨｓｐ７０及びＨｓｐ９０並びにイムノフィリンと共に複合体化したヒトアンドロゲン受容体（Ｐｒａｔｔら、１９９７）も精製した。

本実施例は、固定化捕捉剤（ＧＦＰに対する、中アフィニティーの捕捉剤）としてのＣＡ１５８１６（配列番号３）及び剥離剤（ＧＦＰに対する、高アフィニティーの剥離剤）としてのＮｂＣＡ１２６７０（配列番号１）を使用する、ヒトＨＥＫ２９３Ｔ細胞溶解物からの、Ｈｓｐ７０及びＨｓｐ９０と複合体化した、ｅＧＦＰタグ付け組換えヒトアンドロゲン受容体（配列番号３５）の、ＮＡＮＥＸによる精製について記載する。

カップリングのために、１ｍｇ（６６．９５５ナノモル）のＣＡ１５８１６Ｎｂを、供給元の推奨に従い、ＨｉＴｒａｐＮＨＳ－ａｃｔｉｖａｔｅｄＳｅｐｈａｒｏｓｅＨＰカラム（１ｍＬ；ＧＥ）上に固定化した。

組換えヒトｅＧＦＰ－６Ｈｉｓ－ＴＥＶ－ＡＲは、ヒトＨＥＫ２３９Ｔ細胞にトランスフェクトするｐｃＤＮＡ３．１＋Ｎ－ｅＧＦＰベクターを使用して発現させた。１５０×２１ｍｍディッシュ（Ｎｕｎｃｌｏｎ（商標）Ｄｅｌｔａ）内において、ＤＮＡ１μｇ当たりのμＬ比を３：１として、Ｘ－ｔｒｅｍｅＧＥＮＥ（商標）９ＤＮＡＴｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎＲｅａｇｅｎｔ（ＸＴＧ９－ＲＯＲｏｃｈｅ）を使用して、細胞にトランスフェクトした。トランスフェクションの後、ＨＥＫ２３９Ｔ細胞を、３７℃及び５％のＣＯ_２下において、４８時間にわたり増殖させた。３枚のプレートからの細胞は、ピペッティング及び遠心分離により回収し、ＰＢＳにより洗浄し、１０ｍＭのＨｅｐｅｓ７．５、２．５ｍＭのＤＴＴ、１ｍＭのＥＤＴＡ、２０ｍＭのＮａ_２ＭｏＯ_４、１０％のグリセロール（プロテアーゼ阻害剤を補充された）を含有する１０ｍＬの溶解緩衝液中に再懸濁させてから、Ｄｏｕｎｃｅホモジナイザーを使用して溶解させた。溶解物を、遠心分離により清澄化させ、上清を回収し、濾過し（０．４５μｍのフィルター）、シリンジを使用して、ＣＡ１５８１６Ｎｂによりコーティングされた、ＨｉＴｒａｐＮＨＳ－ａｃｔｉｖａｔｅｄＳｅｐｈａｒｏｓｅＨＰカラムにロードした。次に、シリンジを使用して、１０ＣＶの洗浄緩衝液（１０ｍＭのＨｅｐｅｓ７．５、２．５ｍＭのＤＴＴ、１ｍＭのＥＤＴＡ、２０ｍＭのＮａ_２ＭｏＯ_４、１０％のグリセロール）により、カラムを洗浄した。次いで、アフィニティーカラムを、６ｍＬ（６ＣＶ）にわたる流量を０．１ｍＬ／分とする、１０ｍＭのＨｅｐｅｓ７．５、２．５ｍＭのＤＴＴ、１ｍＭのＥＤＴＡ、２０ｍＭのＮａ_２ＭｏＯ_４、１０％のグリセロール中に、６６．７μＭのＣＡ１５８１６Ｎｂである剥離剤（１ｍｇ／ｍＬ）を含有する、１ｍＬの溶出緩衝液による溶出のために、ＦＰＬＣ（ＡｋｔａＰｕｒｅ－ＧＥ）システムへと接続した。カラムの再生は、５ＣＶの２００ｍＭのグリシン緩衝液、ｐＨ２．３により得た。精製工程は、２８０ｎｍにおける吸光度（タンパク質による吸光）及び４８８ｎｍにおける吸光度（ｅＧＦＰによる吸光）を測定することによりモニタリングした（図４５）。溶出ピークを、５００μｌの画分内に回収し、ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル上において解析し、市販の抗ＧＦＰ抗体により現像されるウェスタンブロットを使用して解析した（図４５）。溶出画分についてのＳＤＳ－ＰＡＧＥ解析からの、３つの、最も顕著なバンドを切り出し、質量分析により解析した。バンドを、ヒトアンドロゲン受容体（ＡＲｂ）タンパク質、Ｈｓｐ９０タンパク質及びＨｓｐ７０タンパク質として同定した（図４５）。Ｈｓｐ７０及びＨｓｐ９０は、細胞質内において、ヒトアンドロゲン受容体などの核内受容体と共に、複合体を形成することが公知の分子シャペロンである。本実施例は、ＮＡＮＥＸが、とりわけ、トランスフェクトされたＨＥＫ２９３Ｔ細胞からの、ｅＧＦＰタグ付けアンドロゲン受容体、Ｈｓｐ７０、Ｈｓｐ９０及び剥離剤を含有する天然のタンパク質間複合体の、迅速かつ容易な精製を可能とすることを確認する。

［実施例２７］磁気トシル活性化Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）上の固定化捕捉剤としてのＮｂＣＡ１５８１６及び剥離剤としてのＮｂＣＡ１２７６０を使用する、ハイスループットナノボディー交換クロマトグラフィー（ＮＡＮＥＸ）による、酵母（Ｓ．セレビシエ）細胞溶解物からの、多様なＧＦＰタグ付け融合タンパク質の精製
固相を、液相と混合し、分離する、ナノボディー交換クロマトグラフィー（ＮＡＮＥＸ）は、カラム内に充填されたビーズ上のタンパク質の精製に限定されない。実施例２７において、本発明者らは、ＫｉｎｇＦｉｓｈｅｒＦｌｅｘ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）装置上、標準的な９６ウェルプレート内において、１２の異なるタンパク質を並行して精製するように準備された、自動式のハイスループット法において、磁気ビーズを、磁石と組み合わせて使用して、固体と、液体とを混合及び交換する。

この実験のために、１２の酵母クローンのセットを、酵母ＧＦＰクローンコレクションから選び出した（Ｈｕｈら、２００３）。各クローンは、ＧＦＰとの融合体としての、異なるタンパク質を発現しているので、捕捉剤として、ＮｂＣＡ１５８１６を使用し、剥離剤としてのＮｂＣＡ１２７６０を使用するＮＡＮＥＸにより精製されうる。

９６ウェルフォーマットは、酵母細胞の少量の培養物（１ｍＬ）を増殖させるのに使用することができ、並行して、異なる細胞系を形質転換する、これらにトランスフェクトする、これらを誘導する又は溶解させる可能性をもたらす。これは、タンパク質発現、タンパク質精製、ＥＬＩＳＡ、機能的なアッセイなど、下流の適用のための、迅速かつハイスループットの工程を可能とする。

この原理の実現可能性を実証するために、本発明者らは、ＮＡＮＥＸ実験を実施して、１ｍＬの培養物中において発現され、標準的な９６ウェルプレート内において、並行して溶解させられ、精製される、１２の異なる酵母タンパク質を精製した。固体支持体として、本発明者らは、トシル活性化Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）を使用し、これらを、捕捉剤としてのＮｂＣＡ１５８１６（配列番号３）によりコーティングした。精製工程は、ＫｉｎｇＦｉｓｈｅｒＦｌｅｘ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）装置上の、９６ウェルプレート内において実施し、ＮｂＣＡ１２７６０（配列番号１）を、剥離剤として使用する溶出ステップを含む。

これらのクローンが、過剰発現されず、それらの生理学的発現レベルにおいて作製されることを踏まえ、本発明者らは、高レベルにおいて発現される、酵母ハウスキーピングタンパク質を選択することが可能であったが、また、生存細胞内、低レベルにおいて発現されるタンパク質も選択することが可能であった（図４６）。

ＧＦＰタグ付けタンパク質を、異なるレベルにおいて発現する、選択された１２のクローンのセット（図４６）を、９６ウェル深型ウェルプレート内、１ｍＬのＹＰＤ培地中において、７２時間にわたり増殖させた。ペレットを、Ｙ－ＰＥＲ（商標）Ｐｌｕｓ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）内において、１時間にわたり溶解させ、凍結させ、解凍した後において、スピニングした。回収された溶解物は、ＫｉｎｇＦｉｓｈｅｒＦｌｅｘ装置を伴う、ＮＡＮＥＸによる、ＧＦＰ融合タンパク質の精製のための供給源として用いられたが、Ｋｉｎｇｆｉｓｈｅｒは、９６ウェルフォーマットにおいて、磁気ビーズを加工することが可能な、多目的、ベンチトップ型、自動式の抽出装置である。製造元の指示書に従い、トシル活性化磁気Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）を、ビーズ１ｍｇ当たりの捕捉剤４０ｍｇの濃度において、捕捉剤であるＮｂＣＡ１５８１６とカップリングさせた。ウェル１つ当たり、溶液１ｍＬ当たり１００ｍｇのビーズ５μＬ（２０ｍｇのカップリングされた捕捉剤ＣＡ１５８１６に対応する）を使用して、ハイスループットモードにおいて、タンパク質を、個々のクローンから固定化し、精製した。並行的精製手順は、ビーズの、１００ｍｌのＰＢＳ緩衝液（あらかじめ平衡化させた）との、３０秒間にわたる自動式のインキュベーション、溶解物との、３０分間にわたるインキュベーション（標的結合への）、ＰＢＳ緩衝液による、１分間ずつ、３回にわたる洗浄を伴った。４０μＬの剥離剤であるＮｂＣＡ１２７６０を、ＰＢＳ緩衝液中に０．５ｍｇ／ｍＬの濃度（３３．３５μＭ）において使用して、１５分間にわたり、タンパク質を、磁気ビーズから溶出させた。精製の異なるステップについてのＳＤＳ－ＰＡＧＥ解析及びウェスタンブロット解析から、本発明者らは、内因的に発現されたＧＦＰ融合タンパク質を、ＮｂＣＡ１５８１６－ビーズ上において捕捉し、適切な剥離剤を使用することにより、これらのビーズを、特異的に溶出させうると結論づける（図４７）。

［実施例２８］剥離剤としてのＮｂＣＡ１２７６０を使用する、１マイクロリットル未満（＜１μＬ）のマイクロ流体カラム内に充填された磁気ＮＨＳ活性化アガロースビーズ上の固定化捕捉剤としてのＮｂＣＡ１５８１６を使用する、ナノボディー交換クロマトグラフィーによる、ＧＦＰの精製
ハイスループット適用プロテオミクス研究及び単一細胞研究は、（とりわけ）少量の試料からタンパク質を分離する、小型のデバイス（ダウンスケーリング）を要求する、タンパク質精製法を要求する。実施例２８は、本発明者らが、本発明者らのＮＡＮＥＸ技術を、１マイクロリットル未満のカラム容量（＜１μＬ）へとダウンスケーリングし、目的のタンパク質を、少量の試料から精製するのに要求される、（固定化）捕捉剤の量及び剥離剤の量を減少させるために、どのようにしてマイクロ流体チップをデザインしたのかを例示する。

マイクロ流体デバイス上において、ＧＦＰを精製するために、本発明者らは、捕捉剤であるＮｂＣＡ１５８１６（実施例１を参照されたい）を、供給元の推奨に従い、５０μｌの、市販の磁気ＮＨＳ活性化アガロースビーズ（直径３０μｍ、ＣｕｂｅＢｉｏｔｅｃｈ）上に、共有結合的に固定化させた。０．７μｌのこれらのアガロースビーズを、図４８に詳述される、カスタム製のマイクロ流体チップの、小型のチャンバー（＜１μＬ）へと詰めた。この３０×３０×６ｍｍのマイクロ流体チップは、フライス盤（ＤａｔｒｏｎｍｏｄｅｌＭ７）により、３ｍｍのＰＭＭＡプレート内に０．４２０ｍｍの深型チャネル２つ及び０．４２０ｍｍの深型チャンバーをフライス加工することにより作製した。次に、３ｍｍのＰＭＭＡカバープレートを、（－）－ブチルＬ－ラクテート（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）によりシーリングし、インレットキャピラリー（融合シリカ、ＯＤ：０．３６０ｍｍ、ＩＤ：０．２５０ｍｍ、ＣＭＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）及び小径アウトレットキャピラリー（融合シリカ、ＯＤ：０．３６０ｍｍ、ＩＤ：０．０７５ｍｍ、ＣＭＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を、チャネル内に挿入し、接着剤（ＮｏｒｌａｎｄＯｐｔｉｃａｌＡｄｈｅｓｉｖｅ８５）及びＵＶ光により硬化させた。キャピラリーを挿入したチャンバー及びチャネルの寸法を、図４８に描示する。インレットキャピラリーを、シリンジポンプ（ＷｏｒｌｄＰｒｅｃｉｓｉｏｎＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓｍｏｄｅｌＳＰ１００ｉＺ）により作動させられる５０μＬのシリンジ（ＨａｍｉｌｔｏｎＣｏｍｐａｎｙ）へと接続し全ての異なる試薬（洗浄緩衝液、試料、溶出緩衝液及びグリシン緩衝液）を、チップ内に注入した。捕捉剤－機能化磁気ビーズを含有する、０．７μｌのスラリーを、広径キャピラリーを介して注入した。ビーズは、アウトレットキャピラリー（ＩＤ：０．０７５ｍｍ）を通らないので、ビーズは、小型のチャンバーを満たして、小型のクロマトグラフィーデバイス（＜１μＬ）を構成し、２つのキャピラリーは、カラムのインレット及びアウトレットとして機能する（図４８）。

このＣＡ１５８１６Ｎｂカップリングマイクロ流体カラム（１ＣＶを０．７μｌとする）を、まず、１０μＬ／分の流量において、５０μｌ（７０ＣＶ）の洗浄緩衝液（ＰＢＳ）により洗浄した。次いで、ＧＦＰを含有する４０μｌの試料（２５ｍＭのＨｅｐｅｓｐＨ７．４、１５０ｍＭのＮａＣｌ、４．８μｇのＧＦＰ（０．１２ｍｇ／ｍＬ））を、１０μＬ／分において注入した。次に、１０μＬ／分において、９０μｌの洗浄緩衝液（ＰＢＳ）を、カラムに通して、結合しなかった材料を除去した。次に、剥離剤（２５ｍＭのＨＥＰＥＳｐＨ７．４、１５０ｍＭのＮａＣｌ、２６μｇの剥離剤であるＮｂＣＡ１２７６０（０．５ｍｇ／ｍＬ））を含有する、５２μｌ（７４ＣＶ）の溶出緩衝液を適用することにより、マイクロ流体デバイスから、アフィニティー捕捉ＧＦＰを溶出させた。８０μｌの洗浄緩衝液による洗浄の後、カラムの再生は、５０μｌのグリシン緩衝液を注入すること（１０μＬ／分における、２００ｍＭのグリシン緩衝液、ｐＨ２．３）により得た。ＮｂＣＡ１５８１６を使用する、マイクロカラム上におけるＧＦＰの捕捉、ＮｂＣＡ１２７６０による、ＧＦＰの、マイクロカラムからの剥離及びグリシンによるマイクロカラムの再生は、倒立蛍光顕微鏡（オリンパス株式会社、ＩＸ７１ｍｏｄｅｌＩＸ７１Ｓ１Ｆ－３）を使用してモニタリングした（図４９）。また、１回目の洗浄液、試料のフロースルー、２回目の洗浄液、剥離剤溶出液、３回目の洗浄液及びグリシン溶出液も、アウトレットキャピラリーから、１．５ｍＬのエッペンドルフ管へと回収し、青色光トランスイルミネーターに入れ、異なる画分内の、ＧＦＰの存在又は非存在を可視化し（図４９）、ＮＡＮＥＸの原理に従い、最小量の捕捉剤及び剥離剤を使用して、実際に、ＧＦＰを捕捉し、このマイクロ流体カラムから溶出させたことを確認した。

ナノボディーの発現及び精製
Ｃ末端Ｈｉｓ６タグを含有するナノボディーに続き、ＥＰＥＡタグを含有するナノボディーを、Ｅ．コリー株であるＷＫ６のペリプラズムから、ルーチン的に発現させ、精製した（Ｐａｒｄｏｎら、２０１４）。

配列表
＞配列番号１：ＧＦＰ－Ｎｂ２０７である、ＣＡ１２７６０（Ｃ末端６×Ｈｉｓ＋ＥＰＥＡタグを含む）
＞配列番号２：ＧＦＰ－ＮｂＦ１０３Ａである、ＣＡ１５８１８（突然変異残基は、太字に下線を付される；Ｃ末端６×Ｈｉｓ＋ＥＰＥＡ）
ＱＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＡＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＲＴＦＳＴＡＡＭＧＷＦＲＱＡＰＧＫＥＲＤＦＶＡＧＩＹＷＴＶＧＳＴＹＹＡＤＳＡＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＴＶＹＬＱＭＤＳＬＫＰＥＤＴＡＶＹＹＣＡＡＲＲＲＧＡＴＬＡＰＴＲＡＮＥＹＤＹＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳＨＨＨＨＨＨＥＰＥＡ
＞配列番号３：ＧＦＰ－ＮｂＴ５４Ａ／Ｖ５５Ａである、ＣＡ１５８１６（突然変異残基は、太字に下線を付される；Ｃ末端６×Ｈｉｓ＋ＥＰＥＡ）
ＱＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＡＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＲＴＦＳＴＡＡＭＧＷＦＲＱＡＰＧＫＥＲＤＦＶＡＧＩＹＷＡＡＧＳＴＹＹＡＤＳＡＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＴＶＹＬＱＭＤＳＬＫＰＥＤＴＡＶＹＹＣＡＡＲＲＲＧＦＴＬＡＰＴＲＡＮＥＹＤＹＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳＨＨＨＨＨＨＥＰＥＡ
＞配列番号４：ＧＦＰ－ＮｂＴ５４Ａ／Ｖ５５Ａ／Ｆ１０３Ａである、ＣＡ１５８６１（突然変異残基は、太字に下線を付される；Ｃ末端６×Ｈｉｓ＋ＥＰＥＡ）
ＱＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＡＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＲＴＦＳＴＡＡＭＧＷＦＲＱＡＰＧＫＥＲＤＦＶＡＧＩＹＷＡＡＧＳＴＹＹＡＤＳＡＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＴＶＹＬＱＭＤＳＬＫＰＥＤＴＡＶＹＹＣＡＡＲＲＲＧＡＴＬＡＰＴＲＡＮＥＹＤＹＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳＨＨＨＨＨＨＥＰＥＡ
＞配列番号５：Ｍｂ_{Ｎｂ２０７} ^{ｃＨｏｐＱ}である、ＣＡ１５６２１（Ｃ末端６×Ｈｉｓ）
＞配列番号６：Ｍｂ_{Ｎｂ２０７} ^ＹｇｊＫである、ＣＡ１５６１６（Ｃ末端６×Ｈｉｓ）
＞配列番号７：ＥＰＥＡ－ＮｂＳｙｎ２である、ＣＡ４３７５（Ｃ末端６×Ｈｉｓ）
＞配列番号８：二価ＥＰＥＡ－ＮｂＳｙｎ２ＥＰＥＡである、ＣＡ４３９４（Ｃ末端６×Ｈｉｓ）
＞配列番号９：シナプトジャニン特異的ＮｂＣＡ１３０１６（捕捉剤；Ｃ末端６×Ｈｉｓ＋ＥＰＥＡ）
＞配列番号１０：シナプトジャニン特異的ＮｂＣＡ１３０８０（剥離剤；Ｃ末端６×Ｈｉｓ＋ＥＰＥＡ）
＞配列番号１１：ＦＩＸａ特異的ＮｂＣＡ１１１３８（捕捉剤１；Ｃ末端６×Ｈｉｓ＋ＥＰＥＡ）
＞配列番号１２：ＦＩＸａ特異的ＮｂＣＡ１０３０４（剥離剤１；Ｃ末端６×Ｈｉｓ＋ＥＰＥＡ）
＞配列番号１３：ＦＩＸａ特異的ＮｂＣＡ１０５０２（捕捉剤２；Ｃ末端６×Ｈｉｓ＋ＥＰＥＡ）
＞配列番号１４：ＦＩＸａ特異的ＮｂＣＡ１０３０９（剥離剤２；Ｃ末端６×Ｈｉｓ＋ＥＰＥＡ）
＞配列番号１５：ＦＩＸａ特異的ＭｅｇａＢｏｄｙＭｂ_{ＮｂＦＩＸａ} ^{ｃＨｏｐＱ}である、ＣＡ１４２０８（剥離剤２；Ｃ末端６×Ｈｉｓ＋ＥＰＥＡ）
＞配列番号１６：ＧＦＰタンパク質
＞配列番号１７：ヘリコバクター・ピロリＧ２７ＨｏｐＱ株のアドヘシンドメインタンパク質（ＰＤＢ５ＬＰ２）
＞配列番号１８：第２のＧＦＰナノボディー剥離剤である、ＣＡ１６０４７（Ｃ末端６×Ｈｉｓ＋ＥＰＥＡタグを含む）
＞配列番号１９：第２のＧＦＰナノボディー捕捉剤である、ＣＡ１６６９５（Ｙ１１９Ｆ）（Ｃ末端６×Ｈｉｓ＋ＥＰＥＡタグを含む）
＞配列番号２０：ＧＳＴナノボディー剥離剤である、ＣＡ１６２３９（Ｃ末端６×Ｈｉｓ＋ＥＰＥＡタグを含む）
＞配列番号２１：ＧＳＴナノボディー捕捉剤である、ＣＡ１６２４０（Ｙ１０９Ａ）（Ｃ末端６×Ｈｉｓ＋ＥＰＥＡタグを含む）
＞配列番号２２：ＧＳＴ（グルタチオンＳ－トランスフェラーゼ）
＞配列番号２３：ＳＭＴ３ナノボディー剥離剤である、ＣＡ１５８３９（Ｃ末端６×Ｈｉｓ＋ＥＰＥＡタグを含む）
＞配列番号２４：ＳＭＴ３ナノボディー捕捉剤である、ＣＡ１６６８７（Ｄ５０Ａ）（Ｃ末端６×Ｈｉｓ＋ＥＰＥＡタグを含む）
＞配列番号２５：ＳＭＴ３（ＹＤＲ５１０Ｗ）
＞配列番号２６：ｍＣｈｅｒｒｙナノボディー捕捉剤である、ＣＡ１６９６４（Ｃ末端６×Ｈｉｓ＋ＥＰＥＡタグを含む）
＞配列番号２７：ｍＣｈｅｒｒｙナノボディー剥離剤である、ＣＡ１７３０２（Ｃ末端６×Ｈｉｓ＋ＥＰＥＡタグを含む）
＞配列番号２８：ｍＣｈｅｒｒｙナノボディー捕捉剤である、ＣＡ１７３４１（ＣＡ１７３０２のＩ１０３Ａ突然変異体）（Ｃ末端６×Ｈｉｓ＋ＥＰＥＡタグを含む）
＞配列番号２９：ｍＣｈｅｒｒｙ（ＦｍｌＨ＿ｌｅｃｔｉｎ＿ｍＣｈｅｒｒｙ＿ｈｉｓ）（ＣＡ１７３３７）
＞配列番号３０：ＦＩＸ機能化ナノボディー剥離剤である、ＣＡ１６３８３（Ｃ末端６×Ｈｉｓ＋ＥＰＥＡタグを含むＭｅｇａＢｏｄｙＭｂ_{ＣＡ１０３０９} ^ＹｇｊＫ）
＞配列番号３１：ＦＩＸナノボディー捕捉剤である、ＣＡ１１１４３（Ｃ末端６×Ｈｉｓ＋ＥＰＥＡタグを含む）
＞配列番号３２：Ｅ．コリーＹｇｊｋタンパク質（ＰＤＢ３ＷＦＳ）
＞配列番号３３：ＦＩＸ機能化ナノボディー捕捉剤である、ＣＡ１６３８８（Ｃ末端６×Ｈｉｓ＋ＥＰＥＡタグを含む、ＭｅｇａＢｏｄｙＭｂ_{ＣＡ１１１４３} ^ＹｇｊＫ）
＞配列番号３４：ＣＡ１６６０７による、ｅＧＦＰタグ付けヒト組換えグルココルチコイド受容体であるＰ０４１５０（ｅＧＦＰ－６Ｈｉｓ－ＴＥＶ－ＧＲ）
＞配列番号３５：ＣＡ１６９７６による、ｅＧＦＰタグ付けヒト組換えアンドロゲン受容体であるＰ１０２７５（ｅＧＦＰ－６Ｈｉｓ－ＴＥＶ－ＡＲｂ）

本開示の態様：
標的タンパク質を精製するための方法であって、
・標的タンパク質のエピトープに特異的に結合する、第１のタンパク質結合剤を、標的タンパク質を含有する試料と混合するステップ、
・第１の結合剤と同じである又は大部分において重複する、標的タンパク質のエピトープを認識して、標的タンパク質に特異的に結合することにより第１の結合剤を標的タンパク質から剥離させる第２のタンパク質結合剤を、ａ）の混合物に添加するステップ及び
・標的タンパク質と複合体化して、溶出する第２のタンパク質結合剤を回収するステップ
を含み、
第２のタンパク質結合剤が、エピトープに特異的に結合する免疫グロブリン単一可変ドメイン（ＩＳＶＤ）又はその活性断片を含み、
第２のタンパク質結合剤解離速度定数（ｋ_ｏｆｆ値）が、第１の結合剤のｋ_ｏｆｆ値と比較して低い
方法。

第２のタンパク質結合剤が、エピトープに対する、第１のタンパク質結合剤と比較して低い又は高いアフィニティーを有する、本明細書において記載される方法。

標的タンパク質のエピトープに対するＫ_Ｄ値が、第１のタンパク質結合剤について、１μＭ～１ｎＭの範囲であり、第２のタンパク質結合剤について、１ｎＭ～１ｐＭの範囲である、本明細書において記載される方法。

第１のタンパク質結合剤についてのＫ_Ｄ値が、第２のタンパク質結合剤についてのＫ_Ｄ値と比較して、２００～５０００倍である、本明細書において記載される方法。

第１のタンパク質結合剤が、固定化され、第２のタンパク質結合剤が、溶液中にある、本明細書において記載される方法のうちのいずれかとしての方法。

第２のタンパク質結合剤が、機能的部分又は検出可能な標識を含む、本明細書において記載される方法のうちのいずれかとしての方法。

試料が、生物学的試料、複合混合物、細胞試料又はインビトロ試料である、本明細書において記載される方法のうちのいずれかとしての方法。

標的タンパク質のエピトープが、タグを含み、好ましくは、タグは、ＧＦＰ、ＧＳＴ、ＳＵＭＯ、ユビキチン及びＥＰＥＡの群から選択される、本明細書において記載される方法のうちのいずれかとしての方法。

標的タンパク質のエピトープが、天然タンパク質上又は内因性タンパク質上に存在する、特異的エピトープを含む、本明細書において記載される方法のうちのいずれかとしての方法。

標的タンパク質のエピトープが、ＭｅｇａＢｏｄｙの足場タンパク質ドメイン上、好ましくは、ＨｏｐＱ又はＹｇｊｋを含む足場タンパク質ドメイン上のタンパク質結合性部位を含む、本明細書において記載される方法のうちのいずれかとしての方法。

第１のタンパク質結合剤が、第２のタンパク質結合剤の突然変異体であり、第２のタンパク質結合剤と比較して、低アフィニティーを伴う、本明細書において記載される方法のうちのいずれかとしての方法。

第１のタンパク質結合剤が、エピトープに特異的に結合するＩＳＶＤ又はその活性断片を含む、本明細書において記載される方法のうちのいずれかとしての方法。

ＩＳＶＤが、ＦＲ１－ＣＤＲ１－ＦＲ２－ＣＤＲ２－ＦＲ３－ＣＤＲ３－ＦＲ４のフォーマットに従う、４つのフレームワーク領域（ＦＲ）及び３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む、本明細書において記載される方法のうちのいずれかとしての方法。

第２のタンパク質結合剤が、第１のタンパク質結合剤の多価形態である、本明細書において記載される方法のうちのいずれかの方法。

第２のタンパク質結合剤が、エピトープ及び足場タンパク質、好ましくは、ＨｏｐＱ、Ｙｇｊｋ又はこれらの誘導体を含む足場タンパク質に特異的に結合するＩＳＶＤの抗原結合性ドメインを含む抗原結合性キメラタンパク質、特に、ＭｅｇａＢｏｄｙ（商標）である、本明細書において記載される方法のうちのいずれかの方法。

本明細書において記載される方法のうちのいずれかの方法の、第１のタンパク質結合剤及び第２のタンパク質結合剤を含むキット。

第１のタンパク質結合剤が、表面上に固定化されたキット。

配列番号１～６又はこれらとの、少なくとも７０％のアミノ酸同一性を伴う配列において描示されたタンパク質の群から選択される、第１のタンパク質結合剤及び第２のタンパク質結合剤を含み、第１の結合剤及び第２の結合剤が、ＧＦＰのエピトープに特異的に結合する、本明細書において記載されるキット。

第１のタンパク質結合剤及び第２のタンパク質結合剤のそれぞれの代わりに、第３のタンパク質結合剤及び第４のタンパク質結合剤を使用して、本明細書において記載される方法のうちのいずれかとしての方法のステップを反復するステップをさらに含み、第３の結合剤及び第４の結合剤が、第１の結合剤及び第２の結合剤のためのエピトープと比較して異なる、標的タンパク質のエピトープに特異的に結合し、
第４のタンパク質結合剤が、第３のタンパク質結合剤についてのｋ_ｏｆｆ値と比較して低い解離速度定数（ｋ_ｏｆｆ値）を有する、
本明細書において記載される方法のうちのいずれかとしての、標的タンパク質を精製するための方法。

本明細書において記載される方法の、第２のタンパク質結合剤又は本明細書において記載される方法の、第４のタンパク質結合剤及び標的タンパク質を含むタンパク質複合体。

標的タンパク質が、ＧＦＰ、ＧＳＴ、ＳＵＭＯ、ユビキチン、及びＥＰＥＡの群から選択されるタグを含む、タンパク質複合体。

結晶質である、タンパク質複合体。

構造解析、構造ベースの薬物デザイン、質量分析法による解析又はプロテオミクスのための、タンパク質複合体のうちのいずれかの使用。

０．１～３Åに対応する分解能を伴う、本明細書において記載されるタンパク質複合体の原子分解における、三次元構造表示。

標的タンパク質としてのＧＦＰ及び第２のタンパク質結合剤としてのＧＦＰ特異的ナノボディーを含む、本明細書において記載されるタンパク質複合体を含み、ＧＦＰが、配列番号１６又はこれとの、少なくとも９０％のアミノ酸同一性を伴う配列内に描示され、ＧＦＰ特異的ナノボディーが、配列番号１又はこれとの、少なくとも９０％のアミノ酸同一性を伴う配列内に描示され、結晶が、以下の結晶格子定数：ａ＝７４．４９７Å±５％、ｂ＝１０３．４５０Å±５％、ｃ＝２０９．７７４Å±５％、α＝９０°、β＝９０°、γ＝９０°を伴う空間群である、Ｐ２１２１２１内にある点において、さらに特徴づけられる結晶。

本明細書において記載される結晶内に存在する、原子座標のサブセットからなる結合性部位であって、配列番号１６に描示される、ＧＦＰタンパク質のアミノ酸残基：Ｐｒｏ８９、Ｇｌｕ９０、Ｇｌｕ１１１、Ｌｙｓ１１３、Ｐｈｅ１１４、Ｇｌｕ１１５及びＧｌｙ１１６からなる結合性部位。

Claims

標的タンパク質を精製するための方法であって、
ａ）標的タンパク質に特異的に結合する、第１のタンパク質結合剤を、前記標的タンパク質を含有する試料と混合するステップ、
ｂ）前記標的タンパク質への結合について、前記第１の結合剤と競合し、前記標的タンパク質に特異的に結合することにより前記第１の結合剤を前記標的タンパク質から剥離させる第２のタンパク質結合剤を、ａ）の混合物に添加するステップ、及び
ｃ）前記標的タンパク質に結合した溶出する前記第２のタンパク質結合剤を回収するステップ
を含み、
前記第２のタンパク質結合剤が、前記標的タンパク質に特異的に結合する免疫グロブリン単一可変ドメイン（ＩＳＶＤ）又はその機能的変異体を含み、
前記第２のタンパク質結合剤の解離速度定数（ｋ_ｏｆｆ値）が、前記第１の結合剤のｋ_ｏｆｆ値と比較して低い又は等しい、
方法。
第２のタンパク質結合剤が、第１の結合剤と同じエピトープ又は大部分において重複するエピトープを認識する、請求項１に記載の方法。
標的タンパク質への結合についてのＫ_Ｄ値が、第１のタンパク質結合剤について、１ｍＭ～１ｎＭの範囲であり、第２のタンパク質結合剤について、１μＭを下回る、請求項１又は２に記載の方法。
第１のタンパク質結合剤についてのＫ_Ｄ値が、第２のタンパク質結合剤についてのＫ_Ｄ値と比較して、少なくとも２倍である、請求項３に記載の方法。
結合剤が、標的タンパク質上のタグに特異的に結合し、好ましくは、前記タグが、ＧＦＰ、ｍＣｈｅｒｒｙ、ＧＳＴ、ＳＭＴ３及びＥＰＥＡの群から選択される、請求項１～４のいずれかに記載の方法。
結合剤が、標的タンパク質上の翻訳後修飾に特異的に結合する、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。
結合剤が、少なくとも２つの部位を介して足場タンパク質に融合されたＩＳＶＤとして規定される抗原結合性キメラタンパク質を含む標的タンパク質の足場タンパク質ドメインに特異的に結合し、好ましくは、前記足場タンパク質ドメインが、ＨｏｐＱ、Ｙｇｊｋ又はこれらの誘導体を含む、請求項１～４のいずれかに記載の方法。
第２のタンパク質結合剤が、第１のタンパク質結合剤の多価形態又はマルチパラトープ形態である、請求項１～７のいずれかに記載の方法。
第１のタンパク質結合剤が、標的タンパク質に特異的に結合するＩＳＶＤ又はその機能的変異体を含む、請求項１～８のいずれかに記載の方法。
第１のタンパク質結合剤が、第２のタンパク質結合剤であるＩＳＶＤと比較して、標的タンパク質への結合性領域内において突然変異したＩＳＶＤを含み、前記第１のタンパク質結合剤が、前記第２のタンパク質結合剤と比較して高いｋ_ｏｆｆを有する、請求項９に記載の方法。
第１の結合剤と、第２の結合剤とが、同一のＩＳＶＤを含み、前記ＩＳＶＤが、標的タンパク質に特異的に、好ましくは、０．０００１秒^－１以上のｋ_ｏｆｆで結合する、請求項９に記載の方法。
第１のタンパク質結合剤及び／又は第２のタンパク質結合剤が、機能的部分又は検出可能な標識を含む、請求項１～１１のいずれかに記載の方法。
第１のタンパク質結合剤及び／又は第２のタンパク質結合剤が、機能化された結合剤が、少なくとも２つの部位を介して足場タンパク質に融合されたＩＳＶＤを含む抗原結合性キメラタンパク質である点において特徴づけられる機能的部分を含み、ＩＳＶＤが、標的タンパク質に特異的に結合し、好ましくは、足場タンパク質が、ＨｏｐＱ、Ｙｇｊｋ又はこれらの誘導体を含む、請求項１２に記載の方法。
第１のタンパク質結合剤が、固定化され、第２のタンパク質結合剤が、溶液中にある、請求項１～１３のいずれかに記載の方法。
試料が、生物学的試料、複合混合物、細胞試料又はインビトロ試料である、請求項１～１４のいずれかに記載の方法。
第１のタンパク質結合剤及び第２のタンパク質結合剤のそれぞれの代わりに又はこれらに加えて、第３のタンパク質結合剤及び第４のタンパク質結合剤を使用して、請求項１～１５に記載の方法のステップａ）～ｃ）を反復するステップをさらに含み、前記第３の結合剤及び前記第４の結合剤が、前記第１の結合剤及び前記第２の結合剤のエピトープと比較して、前記標的タンパク質の異なるエピトープに特異的に結合し、前記第４のタンパク質結合剤が、ＩＳＶＤを含み、前記第３のタンパク質結合剤についてのｋ_ｏｆｆ値と比較して、低い又は等しい解離速度定数（ｋ_ｏｆｆ値）を有する、請求項１～１５のいずれかに記載の方法。
請求項１４に記載の方法の、固定化された第１のタンパク質結合剤を含み、請求項１～１６のいずれか一項に記載の方法における使用のために構成されているマイクロチップ又はマイクロカラム。
請求項１～１６のいずれか一項に記載の方法の、第１のタンパク質結合剤及び第２のタンパク質結合剤を含み、第１のタンパク質結合剤が、請求項１４に記載の方法による表面上に固定化され、かつ／又は請求項１７に記載のマイクロカラム又はマイクロチップとして提供されるキット。
請求項５に記載の方法の、第１のタンパク質結合剤及び第２のタンパク質結合剤を含むキットであって、タグを含む標的タンパク質について競合する、第１のタンパク質結合剤及び第２のタンパク質結合剤を含み、結合剤が、
ａ．ＧＦＰへの特異的結合のための、配列番号１～６、１８若しくは１９又はこれらとの、少なくとも９０％のアミノ酸同一性を有する配列、
ｂ．ＧＳＴへの特異的結合のための、配列番号２０及び２１又はこれらとの、少なくとも９０％のアミノ酸同一性を有する配列、
ｃ．ＳＭＴ３への特異的結合のための、配列番号２３及び２４又はこれらとの、少なくとも９０％のアミノ酸同一性を有する配列、
ｄ．ｍＣｈｅｒｒｙへの特異的結合のための、配列番号２６、２７及び２８又はこれらとの、少なくとも９０％のアミノ酸同一性を有する配列
の群から選択される配列を含み、又はＣ末端Ｈｉｓ－ＥＰＥＡタグを伴わない、これらの配列を含み、
結合剤が、０．１ｎＭを下回るＫ_Ｄを有する場合、第１のタンパク質結合剤と、第２のタンパク質結合剤とが、同一とはならないキット。
請求項１～１５のいずれかに記載の、第２のタンパク質結合剤、又は請求項１６に記載の、第４のタンパク質結合剤、及び標的タンパク質を含むタンパク質複合体。
標的タンパク質が、ＧＦＰ、ＧＳＴ、ＳＭＴ３、ＥＰＥＡ及びｍＣｈｅｒｒｙの群から選択されるタグを含む、請求項２０に記載のタンパク質複合体。
結晶質である、請求項２０又は２１に記載のタンパク質複合体。
標的タンパク質と相互作用するタンパク質をさらに含む、請求項２０～２２のいずれかに記載のタンパク質複合体。
構造解析、構造ベースの薬物デザイン及び薬物発見、質量分析法による解析又はプロテオミクスのための、請求項２０～２３のいずれかに記載のタンパク質複合体の使用。
標的タンパク質を伴う、タンパク質間複合体の同定のための、請求項２３に記載のタンパク質複合体の使用。