HU225771B1 - Process for identifying of transformants by use of systems of mannose or xylose based positive selection - Google Patents

Process for identifying of transformants by use of systems of mannose or xylose based positive selection Download PDF

Info

Publication number
HU225771B1
HU225771B1 HU9502566A HU9502566A HU225771B1 HU 225771 B1 HU225771 B1 HU 225771B1 HU 9502566 A HU9502566 A HU 9502566A HU 9502566 A HU9502566 A HU 9502566A HU 225771 B1 HU225771 B1 HU 225771B1
Authority
HU
Hungary
Prior art keywords
mannose
cells
selection
compound
transformed
Prior art date
Application number
HU9502566A
Other languages
English (en)
Other versions
HUT73387A (en
HU9502566D0 (en
Inventor
Kirsten Bojsen
Iain Donaldson
Anna Haldrup
Morten Joersboe
Jette Dina Kreiberg
John E Nielsen
Finn Thyge Okkels
Steen Guldager Petersen
Original Assignee
Syngenta Participations Ag
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=10731298&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=HU225771(B1) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Syngenta Participations Ag filed Critical Syngenta Participations Ag
Publication of HU9502566D0 publication Critical patent/HU9502566D0/hu
Publication of HUT73387A publication Critical patent/HUT73387A/hu
Publication of HU225771B1 publication Critical patent/HU225771B1/hu

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H15/00—Compounds containing hydrocarbon or substituted hydrocarbon radicals directly attached to hetero atoms of saccharide radicals
    • C07H15/20—Carbocyclic rings
    • C07H15/203—Monocyclic carbocyclic rings other than cyclohexane rings; Bicyclic carbocyclic ring systems
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H15/00—Compounds containing hydrocarbon or substituted hydrocarbon radicals directly attached to hetero atoms of saccharide radicals
    • C07H15/26—Acyclic or carbocyclic radicals, substituted by hetero rings
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H17/00—Compounds containing heterocyclic radicals directly attached to hetero atoms of saccharide radicals
    • C07H17/02—Heterocyclic radicals containing only nitrogen as ring hetero atoms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H19/00—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof
    • C07H19/02—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof sharing nitrogen
    • C07H19/04—Heterocyclic radicals containing only nitrogen atoms as ring hetero atom
    • C07H19/16—Purine radicals
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H19/00—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof
    • C07H19/02—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof sharing nitrogen
    • C07H19/04—Heterocyclic radicals containing only nitrogen atoms as ring hetero atom
    • C07H19/16—Purine radicals
    • C07H19/20—Purine radicals with the saccharide radical esterified by phosphoric or polyphosphoric acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/65—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression using markers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8201—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation
    • C12N15/8209—Selection, visualisation of transformants, reporter constructs, e.g. antibiotic resistance markers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8242—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits
    • C12N15/8243—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits involving biosynthetic or metabolic pathways, i.e. metabolic engineering, e.g. nicotine, caffeine
    • C12N15/8245—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits involving biosynthetic or metabolic pathways, i.e. metabolic engineering, e.g. nicotine, caffeine involving modified carbohydrate or sugar alcohol metabolism, e.g. starch biosynthesis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/0018—Culture media for cell or tissue culture
    • C12N5/0025—Culture media for plant cell or plant tissue culture
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/90—Isomerases (5.)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/90—Isomerases (5.)
    • C12N9/92—Glucose isomerase (5.3.1.5; 5.3.1.9; 5.3.1.18)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y503/00—Intramolecular oxidoreductases (5.3)
    • C12Y503/01—Intramolecular oxidoreductases (5.3) interconverting aldoses and ketoses (5.3.1)
    • C12Y503/01008—Mannose-6-phosphate isomerase (5.3.1.8)

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Nutrition Science (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Polysaccharides And Polysaccharide Derivatives (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Feedback Control In General (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Led Devices (AREA)
  • Semiconductor Lasers (AREA)
  • Nitrogen Condensed Heterocyclic Rings (AREA)

Description

A találmány tárgya eljárás olyan genetikai úton transzformáit sejtek szelekciójára, melyekbe egy kívánt nukleotidszekvenciát juttattunk, és ezáltal a transzformált sejtek szelektív előnyre tesznek szert. A transzformált sejtek által mutatott szelektív előny lehet a nem transzformált sejtekhez képest egy hozzáadott vegyület tápanyagként, növekedési faktorként vagy energiaforrásként történő megnövekedett felhasználási képessége.
Ismert, hogy amikor transzformációval egy sejtpopulációba genetikai anyagot juttatunk, a sejteknek csak egy bizonyos része transzformálódik sikeresen. A transzformált sejtek azonosítását és elkülönítését hagyományos módon „negatív szelekcióval végezzük, mely eljárás szerint egy adott anyag jelenlétében, melyet a transzformált sejtek a transzformációnak köszönhetően képesek tolerálni, a transzformált sejtek képesek életben maradni és szaporodni, míg a nem transzformáit sejtek szaporodása gátolt, vagy éppen elpusztulnak a sejtek.
Növényi sejtekből álló populáció transzformációját követően például a transzformált sejtek szelekciója tipikus esetében a transzformált sejtekben található „szelekciós gén” jelenlétén alapul, mely a sejteknek antibiotikum- vagy herbicidrezisztenciát kölcsönöz. A szelekciós gént - amelynek önmagában nincs hasznos funkciója a transzformált növényben (és jelenléte a növényben valójában nemkívánatos lehet) - összekapcsoljuk vagy együtt juttatjuk be a növénybe juttatandó kívánt génnel, ilyen módon mindkét gén beépül a sejtpopulációba, vagy inkább a populáció bizonyos sejtjeibe, mivel nehéz, ha nem lehetetlen valójában valamennyi sejtet transzformálni. Ezután a sejteket azt az antibiotikumot vagy herbicidet tartalmazó táptalajon vagy táptalajban tenyésztjük, amellyel szemben a genetikai úton transzformált sejtek a szelekciós gén révén rezisztensekké váltak, ilyen módon lehetővé válik a transzformált sejtek azonosítása, mivel a nem transzformáit sejtek - melyek nem tartalmazzák az antibiotikum- vagy herbicidrezisztencia-gént - szaporodása gátolt vagy elpusztulnak.
Piruzyan és társai [Doki. Akad. Nauk. SSSR, 305(3), 729-731, 1989] bakteriális glükóz izomeráz génnel transzformált dohánynövények előállítását ismertetik, ahol a glükóz - fruktóz és xilóz - xilulóz átalakulás van katalizálva E. coliban, és lehetővé válik az E. coli sejtek xilózon, mint egyedüli szénforráson való szaporodása. A transzformált sejtek szelekcióját szelekciós vegyületként kanamycint tartalmazó közegben hajtják végre.
A 4 857 467 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás a Pichia nemzetség egy élesztőtörzsét ismerteti, amelyet a vad típusú törzsből hiányzó, vagy a vad típusú törzsben hibás génfunkciókat kódoló DNS-fragmensekkel transzformáltak. A transzformált élesztősejtek képesek egy, a DNS-fragmens által biztosított génfunkció expresszálódásához szükséges szénforráson szaporodni. Ilyen módon a DNS-fragmensekkel való transzformáció lehetővé teszi a transzformáit törzsek szelekcióját.
A WO 93/05163 számú nyilvánosságra hozott nemzetközi szabadalmi bejelentés bejelentési napja megelőzi a jelen találmány bejelentési napját, de nyilvánosságra a bejelentési nap után került. A WO 93/05163 irodalom egy sejtpopulációból származó genetikailag transzformált növényi sejtek szelektálásának módszerét ismerteti, ahol ehhez a populációhoz egy olyan vegyületet adnak, amelyet a transzformált növényi sejtekbe bevitt nukleotidszekvencia expressziós terméke metabolizálni képes. Mannóz és mannóz-6-foszfát-izomeráz kombinációjának alkalmazását ismertetik közelebbről.
Ezeknek a negatív szelekciós eljárásoknak több hátránya van. Például a táptalajban antibiotikumok vagy herbicidek jelenlétének következtében a nem transzformáit sejtek elpusztulhatnak. Ennek következtében, amennyiben a sejtpopuláció összefüggő szövetet alkot, fennáll annak a veszélye, hogy nemcsak a nem transzformáit sejtek, hanem a transzformált sejtek is elpusztulnak, mivel a nem transzformált sejtek pusztulása elvágja a transzformált sejtekhez jutó tápanyag-utánpótlás útját, valamint a károsodott vagy pusztuló nem transzformált sejtek toxikus vegyületeket választhatnak ki.
A negatív szelekció másik hátránya, hogy egy felesleges gén, például antíbiotikumrezisztenciát létrehozó gén jelenléte nemkívánatos lehet. Környezetvédelmi csoportok és kormányzati erők aggodalmukat fejezik ki aziránt, hogy biztonságos-e növényekbe és mikroorganizmusokba antíbiotikumrezisztenciát kódoló gének beépítése. Ez az aggodalom különösen erős táplálékul szolgáló növények és olyan mikroorganizmusok esetében, melyeket nem zárt környezetben történő felhasználás céljára terveztek (például mezőgazdaságban alkalmazott mikroorganizmusok esetében), és olyan mikroorganizmusok esetében, melyeket zárt környezetben történő felhasználás céljára terveztek, de amelyek véletlenül kiszabadulhatnak onnan.
A negatív szelekció további hátránya, hogy toxikus szerekkel kezelt növényi szövetek vagy sejtek különösen fogékonyak baktériumfertőzésre. Ez a probléma merül fel, amennyiben transzformációs vektorként AgrobacteriumcA alkalmazunk, mivel a kezelt szöveteket vagy sejteket néha túlnövik a baktériumok, még abban az esetben is, ha a baktériumszaporodás megakadályozására antibiotikumot használtunk.
Továbbá sejtek vagy szövetek negatív szelekciós eljárás alkalmazásával történő szelekciója a bejuttatott gének expresszálódásának pontos időzítését teszi szükségessé a szelekciós eljáráshoz képest. Ha a transzgenikus sejteket toxikus vegyülettel kezeljük, mielőtt a toxikus hatást kiküszöbölő gén expresszálódna, vagy mielőtt elegendő géntermék termelődne ahhoz, hogy a toxikus vegyület hatását csökkentse, mind a transzgenikus, mind a nem transzgenikus sejtek elpusztulnak. Amennyiben a szelekcióra túl későn kerül sor, a transzgenikus sejtek szelekcióját megnehezítheti például a nem transzgenikus sejtekből vagy szövetekből kiinduló sarj- vagy kalluszképzödés, melyek a transzformált sejtek szelekciójára alkalmazott vegyület átjutása számára gátat képeznek.
A találmány szerinti eljárás alkalmazásával (melyet „pozitív szelekciónak” vagy kombinált „pozitív/negatív”
HU 225 771 Β1 szelekciónak nevezünk) a fenti hátrányok legalább nagyobb részben áthidalhatók, mely eljárás lehetővé teszi genetikai úton transzformált sejtek azonosítását és izolálását a populációban található nem transzformált sejtek károsítása vagy elpusztítása nélkül, és antibiotikum- vagy herbicidrezisztenciát kódoló gének egyidejű bejuttatása nélkül. Azonfelül, hogy az antibiotikumvagy herbicidrezisztenciát kódoló gének alkalmazását kiküszöböltük, a találmány szerinti pozitív szelekciós eljárás gyakran sokkal hatékonyabb, mint a hagyományos negatív szelekció, és a pozitív, valamint negatív szelekció kombinálásával olyan frekvenciával szelektálhatunk transzgenikus hajtásokat, amely legalább olyan magas, ha nem nagyobb, mint a csupán negatív szelekciós eljárás alkalmazásával kapott frekvencia. A pozitív szelekció alkalmazása azzal az előnnyel jár továbbá, hogy riportergénként és szelekciós génként egyetlen gént használhatunk, ami a vektorkonstrukció leegyszerűsítését, sokkal stabilabb konstrukció létrejöttét, és a riportergén, valamint szelekciós gén expresszálódásának 100%-os egybeesését eredményezi.
A pozitív szelekció kiküszöbölheti továbbá a fent említett időzítési problémát, mivel a szelektív vegyületek meghatározott szubsztráton történő tenyésztés során, a bejuttatott gének expresszálódása által létrejövő géntermékek hatásának eredményeképp keletkeznek. A szelektív vegyület tehát a szelekciós gén expresszálódása következtében felhalmozódhat, és a szelekciós hatás akkor jelentkezik, amikor elegendő mennyiségű szelektív vegyület termelődött.
A találmány tárgyát legalább egy szelekciós vegyületet tartalmazó táptalajban vagy táptalajon tenyésztett, gyümölcsök, szántóföldi növények, aprómagvas gabonanövények és zöldségfélék közül választott növényi sejtpopulációból olyan sejtek azonosítására és szelekciójára alkalmas eljárás képezi, melyek transzformáció következtében metabolikus előnnyel rendelkeznek, ahol:
i) a sejteket egy nukleotidszekvenciával vagy együttesen bejuttatott nukleotidszekvenciákkal transzformáljuk, melyek egyike olyan régiót tartalmaz, amely egy, a szelekciós vegyület metabolizmusában szerepet játszó proteint kódol: cukorfoszfát-izomerázok, cukorfoszfát-mutázok, foszfatázok és cukor-epimerázok; és ii) a szelekciós vegyület mannóz vagy xilóz vagy ezek származéka vagy prekurzora vagy a mannóz vagy xilóz metabolizmusában közvetlenül vagy közvetve szerepet játszó enzimprotein szubsztrátja.
A találmány tárgyát képezi továbbá a legalább egy szelekciós vegyületet tartalmazó táptalajban vagy táptalajon tenyésztett gyümölcsök, szántóföldi növények, aprómagvas gabonanövények és zöldségfélék közül választott növényi sejtpopulációból olyan sejtek azonosítására és szelekciójára alkalmas eljárás, melyek transzformáció következtében metabolikus előnnyel rendelkeznek, ahol:
i) a sejteket egy nukleotidszekvenciával vagy együttesen bejuttatott nukleotidszekvenciákkal transzformáljuk, melyek egyike olyan régiót tartalmaz, amely egy, a szelekciós vegyület metabolizmusában szerepet játszó proteint kódol: cukorfoszfát-izomerázok, cukorfoszfát-mutázok, foszfatázok, cukor-epimerázok cukorpermeázok és cukorfoszfát-permeázok; és ii) a szelekciós vegyület mannóz vagy xilóz vagy ezek származéka vagy prekurzora vagy a mannóz vagy xilóz metabolizmusában közvetlenül vagy közvetve szerepet játszó enzimprotein szubsztrátja;
iii) a táptalajhoz a szelekciós vegyületnek a sejtekre kifejtett toxikus hatását csökkentő szert adunk.
Előnyös, ha amennyiben a táptalajhoz toxicitást csökkentő szert adtunk, a szelekciós vegyület mannóz, és a nukleotidszekvencia vagy azzal együttesen bejuttatott nukleotidszekvencia mannóz-6-foszfát-izomerázt kódol.
A „metabolikus előnnyel rendelkező sejtek többek között gyorsabban képesek szaporodni, mint az előnyös tulajdonsággal nem rendelkező sejtek, és/vagy előnyösen képesek olyan szubsztrátok felhasználására, melyeket az előnyös tulajdonsággal nem rendelkező sejtek nem képesek hasznosítani, és/vagy képesek olyan szubsztrátok méregtelenítésére, melyek az előnyös tulajdonsággal nem rendelkező sejtekre toxikus hatást fejtenek ki, vagy azok szaporodását másképp gátolják.
A „vegyület metabolizmusában szerepet játszó” protein tipikusan, de anélkül, hogy igényünket az alábbiakra korlátoznánk, olyan enzim, amely közvetlenül vagy közvetett módon szerepet játszik a szelekciós vegyület vagy annak származékai vagy prekurzorai előállításában vagy felhasználásában. A protein úgy is szerepet játszhat a szelekciós vegyület metabolizmusában, hogy ahhoz kötődik, azt a sejten, szöveten vagy szervezeten belül egyik helyről a másikra juttatja vagy másképp különválasztja, ezáltal annak helyi hozzáférhetőségét megváltoztatja.
A nukleotidszekvenciának „egy proteint kódoló gén aktivitását szabályozó” régiója megváltoztathatja az endogén gén expresszálódásának szintjét azáltal, hogy promoter, vagy a gén vonatkozásában promoteraktivitással bír, és az endogén génbe vagy annak közelébe van beépítve. A „közelébe” kifejezés maximálisan 10 000 kb-t jelent. Másképp, közvetett szabályozás létrejöhet úgy is, hogy az RNS-polimeráznak a proteint kódoló strukturális gén promoteréhez történő kötődése módosul, vagy annak révén, hogy a nukleotidszekvencla a strukturális gén legalább egy részéhez komplementer módon kötődik, ennek következtében a protein mennyisége tipikus esetben csökken a sejtben.
A leírásban mannóz vagy xilóz „származékai alatt bármely olyan vegyületet értünk, melyet a mannózvagy xilózmetabolizmusban közvetlenül vagy közvetett módon szerepet játszó valamely protein képes felhasználni, mely ilyen proteinhez képes kötődni, vagy annak szubsztrátját vagy termékét képezi. A mannóz esetében nyilvánvaló, hogy ilyen származékok lehetnek szénhidrátok, mint például glükóz vagy galaktóz, melyek epimerázok hatásának eredményeképp mannózzá, annak származékaivá vagy prekurzoraivá alakulhatnak. A leírásban „származékok” alatt olyan mannózvagy xiiózcsoportokat is értünk, melyeken egy vagy
HU 225 771 Β1 több olyan hidroxilcsoport is található, melyekhez kovalens vagy ionos kötéssel más atomcsoportok kapcsolódnak. Ilyen csoportok lehetnek észterek, éterek, amlnocsoportok, amidocsoportok, foszfátcsoportok, szulfátcsoportok, karboxilcsoportok, karboxi-alkil-csoportok, valamint ezek kombinációi. Mannóz- vagy xilózszármazékok lehetnek mannóz- vagy xilózprekurzorok is, amennyiben a járulékos csoportok eltávolíthatók oly módon, hogy mannóz vagy xilóz keletkezzék.
A leírásban a „sejt kifejezés protoplasztokra vonatkozik, „sejtpopuláció” alatt szövetet, szervet vagy annak egy részét, egy táptalajon vagy táptalajban található különálló sejtekből álló populációt vagy teljes szervezetet, például növényt értünk.
Ugyancsak a találmány tárgyát képezik a találmány szerinti eljárással szelektált transzformált sejtek, valamint olyan transzformált sejtek, melyek lehetnek növényi sejtek, növények, ilyen sejtek utódai vagy azokból származó magok. A találmány szerinti eljárással szelektálható növények lehetnek: gyümölcsök, ezen belül paradicsom, mangó, barack, alma, körte, eper, banán és dinnye; szántóföldi növények, például repce, napraforgó, dohány, cukorrépa, lehetnek aprómagvas gabonanövények, például búza, rozs, rizs, kukorica, valamint gyapot, lehetnek zöldségfélék, például burgonya, répa, saláta, káposzta és hagyma.
Különösen előnyös növények a cukorrépa és a kukorica.
Különös jelentőséggel bír a találmány szerinti pozitív szelekciós eljárás in vivő alkalmazása, például teljes növényen vagy növényi részeken végzett transzformáció vonatkozásában, mely eljárás alkalmazása során a növény vagy annak részei mind transzformált, mind nem transzformált sejteket tartalmaznak, mivel a transzformált sejtek szelekciója a szomszédos nem transzformált sejtek közvetlen károsítása nélkül történik. Ezáltal a transzformált sejtek összehasonlítva a nem transzformált sejtekkel szelektív „előnyre tesznek szert (például hajtást képesek létrehozni), de a nem transzformált sejtek nincsenek súlyosan hátrányos helyzetben olyan értelemben, hogy nem károsodnak és nem pusztulnak el, mint az az antibiotikum vagy herbicid alkalmazásával történő negatív szelekció esetén történik.
A transzformált sejtekre jellemző „szelektív előny” tipikusan olyan eltérés vagy előnyös tulajdonság lehet, amely lehetővé teszi a transzformált sejteknek egyszerűen, vizuális eszközökkel történő azonosítását, azaz a markergén jelenlétének kimutatására szolgáló külön vizsgálati eljárás alkalmazása nélkül történő azonosítását.
A sejtpopulációt legalább egy olyan vegyületet tartalmazó táptalajon vagy táptalajban tenyészthetjük, amely inaktív, és amely közvetlenül vagy közvetett módon a transzformált sejtben aktiválódik, a szelekciós vegyület a nem transzformált sejtekben inaktív vagy kevésbé aktív, mint a transzformált sejtekben, ezáltal a transzformált sejtek olyan szelektív előnyre tesznek szert, amely lehetővé teszi azoknak a sejtpopulációból történő szelekcióját.
A sejtpopulációt legalább egy olyan vegyületet tartalmazó táptalajon vagy táptalajban is tenyészthetjük, amely a nukleotidszekvencia expresszálódása vagy transzkripciója révén válik felhasználhatóvá a sejtek számára, a szelekciós vegyület nem használható fel a nem transzformált sejtek számára, vagy kevésbé felhasználható a nem transzformált sejtek számára, ezáltal a transzformált sejtek szelektív előnyre tesznek szert.
Abban az esetben, ha a nukleotidszekvencia által kódolt polipeptid a transzformált sejtben közvetlenül aktivál egy inaktív vegyületet, a nem transzformált sejtek endogén módon tartalmazhatnak vagy termelhetnek bizonyos mennyiségű említett polipeptidet, amely tipikus esetben egy enzim. Ilyen esetben az „inaktív vegyületnek” nem kell feltétlenül teljesen inaktívnak lennie a nem transzformált sejtekben, elegendő lehet, ha a szelekciós vegyület vagy tápanyag a nem transzformáit sejtekben csupán sokkal kevésbé aktív, mint a transzformált sejtekben. Más szóval, szelekciós célra az eredetileg inaktív vegyület aktiválását illetően elegendő lehet a transzformált sejtek és nem transzformáit sejtek közti kvalitatív különbség fennállása. Ilyen esetekben a sejtekhez gátlószerek vagy a natív enzimekért versengő szubsztrátok adhatók. Különösen alkalmasak a natív enzim által aktivált gátlószerek, melyek alkalmazása önkatalizált módon az aktív gátlószer olyan mennyiségben történő termelődését eredményezi, amely mellett a natív enzim lényegében teljesen gátolt.
Amennyiben két nukleotidszekvenciát együtt juttatunk a sejtbe, azokat kívánt esetben összekapcsolhatjuk, vagy azokat másképp juttathatjuk be együtt, oly módon, hogy az egyik nukleotidszekvencia jelenléte a sejtben a másik szekvencia jelenlétére vagy jelenlétének fokozott valószínűségére utaljon. A két nukleotidszekvencia tehát tipikusan, de nem szükségszerűen egyazon genetikai konstrukció részét képezi, és azokat egyazon vektorral juttathatjuk a sejtbe.
Mivel a bejuttatott nukleotidszekvenciáknak a transzformált sejtekben expresszálódniuk kell, a két nukleotidszekvenciát tartalmazó genetikai konstrukció tipikusan olyan szabályozószekvenciákat tartalmaz, melyek lehetővé teszik a nukleotidszekvenciák expresszálódását, például ismert promotereket és transzkripciós terminátorokat. Az együtt bejuttatott nukleotidszekvencia tipikusan tehát egy olyan promoterrel kapcsolódik, amely lehet folyamatos (konstitutív) vagy szabályozható.
A leírásban ismertetett eljárás alkalmazható akkor is, ha a két nukleotidszekvenciát egymástól függetlenül juttatjuk be. Ezt például oly módon végezhetjük, hogy mindkét gén befogadására ugyanazt a baktériumot alkalmazzuk, és a kívánt nukleotidszekvencia viszonylag nagyszámú példányát juttatjuk a sejtekbe, ezáltal viszonylag nagy lesz a valószínűsége annak, hogy az együtt bejuttatott nukleotidszekvenciát expresszáló sejtek tartalmazzák és expresszálják a kívánt nukleotidszekvenciát is. Egyazon sejtbe két vagy több gén egymástól független bejuttatásának, és ezáltal a gének
HU 225 771 Β1 együttes expresszálódásának általában kicsi a valószínűsége, a pozitív szelekciós eljárással elérhető magasabb szelekciós frekvencia ezért ilyen rendszerekben különösen előnyös.
A szelekciós célra alkalmazott vegyületnek mind pozitív, mind negatív hatásai lehetnek. A mannóz például kellően magas koncentrációban alkalmazva a legtöbb növényre toxikus, de mannózmetabolizáló enzimeket tartalmazó sejtekben a negatív hatás nem érvényesül, a sejtek továbbá azzal az előnnyel rendelkeznek, hogy képesek mannózt szénhidrátforrásként felhasználni. Ebben az esetben egyetlen vegyület és egyetlen gén együttesen, kombinált pozitív és negatív szelekciós rendszert képez, bár ilyen rendszereket előállíthatunk két vagy több gén alkalmazásával is, melyek együtt felelősek a transzformált sejtekben a szelekciós vegyület negatív hatásainak kiküszöböléséért és a szelekciós vegyület pozitív hatásainak érvényesüléséért.
A találmány egy további megvalósítási módja szerint a nukleotidszekvencia expressziója vagy transzkripciója megakadályozza egy, a sejtpopulációhoz adott vegyület metabolizálódását, vagy a transzformált sejtekben megakadályozza egy vegyület szintézisét, ezáltal a transzformált sejtek a nem transzformált sejtektől elkülöníthetők vagy szelektálhatok.
A találmány egy további megvalósítási módja szerint a transzformált sejtek szelekciójára pozitív szelekciós és negatív szelekciós eljárások kombinációját alkalmazzuk, a nukleotidszekvenciát a transzformált sejtekbe egy olyan további nukleotidszekvenciával együtt juttatjuk be, amely a felsoroltak közül legalább eggyel szemben létrejövő rezisztenciát kódol: toxinok, antibiotikumok vagy herbicidek; és a táptalaj, amelyben vagy amelyen a sejteket tenyésztjük, legalább egy olyan toxint, antibiotikumot vagy herbicidet tartalmaz, mellyel szemben a transzformált sejteket rezisztenssé tettük. Előnyös, ha a nukleotidszekvenciát legalább két különböző szelekciós génnel együtt juttatjuk a sejtbe.
Előnyös, ha a szelekciós vegyület a mannóz vagy a xilóz. Amint azt fentiekben említettük, a szelekciós vegyület lehet mannózszármazék, például mannóz-6foszfát, vagy lehet xilózszármazék, például xilóz-6foszfát, vagy lehet mannóz- vagy xilózprekurzor.
A sejteket bármely olyan nukleotidszekvenciával transzformálhatjuk, melyet a sejtekbe kívánunk juttatni. Ilyen nukleotidszekvenciák kódolhatnak vírus-, gomba-, baktérium- vagy nematodarezisztenciát létrehozó géneket.
A sejteket transzformálhatjuk olyan baktérium, például Agrobacterium-laj alkalmazásával, amely érzékeny az adott vegyületre, úgy, hogy a transzformált sejteknek a szelekciós vegyülettel történő szelekciója azzal az előnnyel jár, hogy csökken a transzformációt követően a transzformált sejtek baktériummal történő fertőződésének a veszélye. Nyilvánvaló, hogy a sejteket bármely, a technika állása szerint ismert eljárással transzformálhatjuk, például elektroporációval, mikroinjektálással, mikrolövedékek bejuttatására alkalmas eszköz alkalmazásával, valamint Ri- és Ti-plazmidokkal történő transzformációval. A transzformált sejteket megfelelő esetben olyan teljes növényekké regenerálhatjuk, melyekben a rekombináns DNS stabilan beépült a genomba.
A protein előnyösen a mannóz- vagy xilózmetabolizmusban szerepet játszó enzim. Ilyen enzimek például a felsoroltak: xiloizomerázok és foszfomannoizomerázok, például mannóz-6-foszfát-izomeráz és mannóz-1 -foszfát-izomeráz; foszfomannomutáz; mannózepimerázok, például szénhidrátokat mannózzá alakító vagy mannózt szénhidrátokká, például glükózzá vagy galaktózzá alakító enzimek; foszfatázok, például mannóz-6-foszfatáz és mannóz-1-foszfatáz.
A szelekciós vegyületnek a sejtre kifejtett toxikus hatását csökkentő szer tipikusan egy glükózszármazék, például metil-3-O-glűkóz vagy phloridzin.
A találmány szerinti megoldás lényege még világosabbá válik az alábbi kitanítás és a csatolt ábrák alapján.
Az alábbiakban röviden ismertetjük a leírásokhoz csatolt ábrákat.
Az 1. ábra az E. coli foszfomannóz-izomerázt kódoló régiót tartalmazó BCII/HindlII restrikciós fragmens előállításának menetét ismerteti;
a 2. ábra az EPL-plazmidot ábrázolja [Pietrzak M és munkatársai: Nucleic Acids Rés. 14, 5857 (1986)];
a 3. ábra a pBKL4 jelzésű bináris plazmidot mutatja [Nielsen K. K. és munkatársai: Mól. Plánt Microbe Interact. 6, 495 (1993)];
a 4. ábra a GUS-gén és az NPTII-gén közé inszertált roan-A-gént tartalmazó pBKL4plazmidot ábrázolja.
Az E. coli foszfomannóz-izomerázt kódoló szekvenciát tartalmazó p(BKL4-mannóz) bináris plazmid előállítása
Az E. coli foszfomannóz-izomeráz (EC 5.3.2.8) gén a pGS63-plazmidból származik [Miles H. és munkatársai: Gene 32, 41 (1984)] (1. ábra), amely konstrukció a pBR322-plazmid származéka, melyben a Pstl és Hindill egyedi hasítási helyek között található régiót az E. coli kromoszómájának a foszfomannóz-izomerázt (man-A) kódoló strukturális gént, valamint a szomszédos fumaráz (fum-A) gén egy fragmensét tartalmazó részével helyettesítettük. A pGS63-plazmidból tehát hiányzik a b-laktamáz-gén egy része, és tertraciklinen kell szelektálni.
A teljes Pstl/Hindl11 kromoszomális fragmenst, valamint a pBR322-plazmidból 357 bázispárt tartalmazó Pstl/BamHI fragmenst (2466 bázispár) pUC18-plazmid többszörös klónozási helyére ligáltuk, így kaptuk a pDO18-plazmidot (lásd 1. ábra).
A pDO18-plazmidot Hindlll-enzimmel emésztettük, és a kapott beugró 3’-végeket Klenow-polimerázzal feltöltöttük. A feltöltött Hindill hasítási hellyel (Hindill*) rendelkező nyitott pDO18-plazmidot (lásd 1. ábra) Bcllenzimmel emésztettük, és a foszfomannóz-izomerázkódoló régiót tartalmazó, 1218 bázispárból álló Bcll5
HU 225 771 Β1
Hindill*-fragmenst a pEnhanced-Peter-Linker (pEPL) plazmidba klónoztuk, melyet először Smal-enzimmel, majd BamHI-enzimmel emésztettünk. Az így kapott plazmidot p(EPL-mannóz)-plazmidnak neveztük.
A pEPL-plazmidot pCaMVCN-plazmidból állítottuk elő [Fromm és munkatársai: Proc. Natl. Acad. Sci USA 82, 5824 (1985); Fromm és munkatársai, Natúré 319, 791 (1986)] oly módon, hogy abból a CAT-gént Pstl-enzimmel történő emésztéssel eltávolítottuk. A fenti plamzid Pstl hasítási helyére egy kisméretű linkért inszertáltunk (linker: Pstl-BamHI-Ball-Pstl), ezúton kaptuk a pLise (pL) plazmidot. A pL-plazmidot Hincl- és Bglll-enzimekkel emésztettük, és az így kapott, a 35S-promotert és a NOS-terminátort tartalmazó fragmenst egy másik pL-plazmidba klónoztuk, melyet előzőleg EcoRV- és Bglll-enzimekkel emésztettünk. Mind az EcoRV-, mind a Bglll-enzim tompa végeket eredményez. A kapott konstrukciót pEnhanced-Lise (pEL) plazmidnak neveztük. A pEL-plazmid lényegében abban tér el a pCaMVCN-plazmidtól, hogy egy módosított 35S-promotert tartalmaz, melyben a promoter 5'-végi, 250 bázispárból álló szekvenciája tandem módon megismétlődik. A módosított 35S-promoter transzkripciós aktivitása körülbelül tízszer nagyobb, mint az eredeti 35S-promoteré [Kay és munkatársai: Science 236, 1299 (1987)]. A pEL-plazmidot Pstl- és Bglll-enzimekkel emésztettük, ezáltal a NOSterminátort eltávolítottuk, és helyére a CaMV-terminátort (DW2t) inszertáltuk. Végül a felerősített 35S-promoter és a CaMV-terminátor között található Pstl hasítási helyre egy linkért (Pstl-BamHI-Smal-Sacl-SallSphl) inszertáltunk. Ezt a plazmidot pEPL-plazmidnak neveztük (lásd 2. ábra).
A teljes felerősített 35S-promotert, az E. coli foszfomannóz-izomerázt, valamint a CaMV-terminátort tartalmazó fragmens izolálása céljából a p(EPL-mannóz)-plazmidot Hindlll-enzimmel emésztettük. Az izolált fragmenst a pBLK4 bináris vektor Hindlll hasítási helyére klónoztuk (4. ábra). Az így kapott plazmidot p(BKL-mannóz)-plazmidnak neveztük. A pBLK4-plazmidban a Hindlll hasítási hely a kanamycinrezisztencia-gén és a b-glukuronidáz (GUS) gén között található (lásd 3. ábra). Mind a mannóz kiméra génnek, mind a kanamycinrezisztencia-génnek (NPTII), mind a GUS-génnek saját promotere és terminátora van. A 4. ábra a p(BKL-manóz)-konstrukciót ábrázolja, amely a kiméra foszfomannóz-izomeráz-gént a pBKL4-plazmidban a GUS- és NPTII-gének közé inszertálva tartalmazza.
A p(BKL-mannóz)-konstrukciót E. coliból izoláltuk, és fagyasztásos-olvasztásos módszer alkalmazásával [Holster és munkatársai: Mól. Gén. Génét. 163, 181 (1978)] Agrobacterium tumefaciens LBA4404 jelzésű törzsbe transzformáltuk, amely tartalmazza az ártalmatlanított pAL4404 segítő („helper) plazmidot [Hoeckma és munkatársai: Natúré 303, 179 (1983); Ooms és munkatársai: Plasmid 7, 15 (1982)].
A foszfomannóz-izomerázt kódoló strukturális gén (man-A) szekvenciáját Miles és Guest közölték [Gene 32,41 (1984)].
Parazitamentes törzstenyészetek „Saturna”, Bintje” vagy „Daniella” fajtákhoz tartozó Solanum tuberosum hajtásokat tartalmazó tenyészeteket Linsmaier és Skoog eljárása szerint tartottunk fenn [Physiol. Plánt. 18, 100 (1965)] 2 μηηοΙ/I ezüst-tioszulfáttal kiegészített LS-táptalajon (lásd az alábbiakban), 25 °C-on, 16 óra világosságot és 8 óra sötétséget tartalmazó ciklusok mellett. A törzstenyészetekből 20-40 naponként szubkultúrát készítettünk. A hajtásokról eltávolítottuk a leveleket, és azokat nodális szegmensekké vágtuk (körülbelül 0,8 cm méretű szegmensekké), valamennyi szegmens egy nodust tartalmazott.
Burgonyaszövetek beoltása
Az együtt tenyésztésnél alkalmazott lemezek LStáptalajt (szacharóz 30 g/l), agart (8 g/l), 2,4-diklorofenoxi-ecetsavat (2,0 mg/l) és transz-zeatint (0,5 mg/l) tartalmaztak.
Körülbelül 40 napos hajtástenyészetekből származó hajtásokat (5-6 cm magas hajtásokat) internodális szegmensekké (körülbelül 0,8 cm méretű szegmensekké) vágtunk össze. A szegmenseket olyan Agrobacterium tumefaciens baktériumokat tartalmazó folyékony LS-táptalajba (LS) helyeztük, amely a burgonyasejtekbe beépítendő géneket hordozó bináris vektorral lett transzformálva. Ilyen gének például a β-glukuronidázt (GUS-t) kódoló gén, a kanamycinantibiotikummal szemben rezisztenciát létrehozó, NPTII-t kódoló gén és/vagy a mannózmetabolizmusban szerepet játszó proteineket kódoló gének, például a mannóz-6-foszfát-izomerázt, mannóz-epimerázokat, foszfomannomutázokat kódoló gének stb. (lásd az alábbiakban).
Az Agrobacterium-törzset egy éjszakán át, a megfelelő (az Agrobacterium-törzs rezisztenciájának megfelelő) antibiotikumot tartalmazó YMB-táptalajban [dikálium-hidrogén-foszfát (trihidrát) (0,66 g/l); magnézium-szulfát (heptahidrát) (0,20 g/l); nátrium-klorid (0,10 g/l); mannitol (10,0 g/l); élesztőkivonat (0,40 g/l)j tenyésztettük, amíg a 660 nm-en mért optikai denzitás (OD-660) körülbelül 0,8-es értéket ért el. Ezt követően a szuszpenziót centrifugáltuk, és a sejteket LS-táptalajban szuszpendáltuk OD-660=0,5 eléréséig.
Ezután a fenti internodális szegmenseket 30 percig a felszuszpendált Agraóacíer/um-szuszpenzióban inkubáltuk, majd a baktériumfelesleget steril szűrőpapírral történő leitatással eltávolítottuk.
A hajtásszegmensek és az Agrobacteriumok együtt tenyésztése
A hajtásszegmenseket 72 órán át baktériumok jelenlétében tenyésztettük fehér selyempapírral lefedett Petri-csészékben, LS-táptalajra (lásd fent) helyezett szűrőpapíron. Ezt a táptalajt a továbbiakban „együtt tenyésztő táptalajként” említjük. A táptalajt és a szegmenseket steril szűrőpapírral lefedtük, és a Petricsészéket 16 óra világosságot és 8 óra sötétséget tartalmazó ciklusok mellett, 25 °C hőmérsékleten tartottuk.
HU 225 771 Β1
Mosási eljárás
Miután az együtt tenyésztést 48 óráig folytattuk, a hajtásszegmenseket 800 mg/l carbenicillinnel kiegészített LS-táptalajba vittük át. Az így átvitt szegmenseket ezután óvatosan ráztuk, hogy a rájuk tapadt Agrobacteriumokat eltávolítsuk és elöljük.
Transzformált szövetek szelekciója
A mosott szegmenseket ezután LS-táptalajba vittük át (lásd fent), azzal az eltéréssel, hogy az LS-táptalaj transz-zeatin-koncentrációja 1 mg/l volt, és a táptalajt gibberellinsavval (0,1 mg/ml), carbenicillinnel (800 mg/l) és kívánt esetben kanamycin-szulfáttal (50 mg/l) és/vagy mannózzal (0-20 g/l) és/vagy szacharózzal (0-20 g/l) egészítettük ki. Ezt a táptalajt a továbbiakban „szelekciós/regenerációs táptalajnak” neveztük.
A szegmenseket kéthetente vagy az alább leírtak szerint friss táptalajba vittük át. Két-négy hét elteltével a szegmensekből hajtások fejlődtek ki, és az új hajtások kifejlődése körülbelül 3-4 hónapig tartott.
A regenerált hajtások gyökereztetesa
A regenerált hajtásokat gyökereztető táptalajba vittük át, amely carbenicillinnel (500 mg/l) kiegészített LStáptalajt tartalmazott.
A regenerált hajtások talajba helyezése
Az új gyökerekkel rendelkező (körülbelül 2-3 cm magas) hajtásokat (növényeket) a gyökereztető táptalajból talajra vittük át és tenyésztőtartályba helyeztük, melyet 21 °C-on, 16 óra fény/8 óra sötétség ciklusban, 200-400 pE/m2/másodperc értéken tartottunk. Amikor a növények eléggé megerősödtek, azokat üvegházba vittük át, ahol azokat addig neveltük, amíg gumókat nem hoztak, és a növény felső részei az öregedés jeleit nem mutatták.
A transzformánsok genetikai azonosságának megerősítése
A regenerált hajtásokról az alább leírtak szerint igazoltuk, hogy azok transzgenikus genotípussal rendelkeznek:
(a) Radke és munkatársai szerint végzett NPTII vizsgálati eljárással [Theor. Appl. Génét. 75, 685 (1988)]; vagy (b) Hodal és munkatársai szerint [Plánt. Sci. 87, 115 (1992)], az együtt bejuttatott b-glukuronidázgén által expresszált enzim GUS vizsgálati eljárással történő kimutatásával; vagy (c) a mannózmetabolizmusban szerepet játszó enzimet, például a foszfomannóz-izomerázt kódoló bejuttatott génnek megfelelő mRNS expresszálódásának kimutatásával vagy az enzim aktivitásának mérésével.
A találmány szerinti megoldást a pontosabb értelmezhetőség céljából a továbbiakban konkrét megvalósítási példákon keresztül kívánjuk szemléltetni, anélkül azonban, hogy igényünket az ismertetettekre korlátoznánk.
1. példa
Regenerált hajtásokat állítottunk elő a fent leírtak szerint, azzal az eltéréssel, hogy a hajtásszegmenseket nem tenyésztettük baktériumokkal együtt, ebből adódóan a mosási eljárást elhagytuk. A regenerált hajtások számát a kísérlet kezdetétől számított 40. nappal bezárólag meghatároztuk. Az 1. táblázat mannóznak az Agrobacteriumma\ nem transzformált burgonyatörzsszegmensekből származó hajtások regenerálódására kifejtett gátlóhatását szemlélteti. Az 1. táblázatból látható, hogy a mannóz hatékonyan gátolja az ilyen hajtások regenerálódását, a szacharóz pedig elősegíti a regenerációt. Általánosságban, a mannóz a legtöbb növényfajban nem alkalmazható szénhidrátforrásként. Amennyiben a növényekhez mannózt adunk, az metabolizálódik és mannóz-6-foszfát halmozódik fel. A mannóz-6-foszfátot a mannóz-6-foszfát-izomeráz fruktóz-6foszfáttá képes alakítani, az átalakult mennyiség az izomeráz aktivitásától függ. Ezt a fruktóz-6-foszfátot a növények képesek felhasználni, de általánosságban a magas mannózszint (akár rendelkezésre áll más szénhidrátforrás, akár nem) toxikus hatású a növényekre. Amint az az 1. táblázatból látható, a mannóz a hajtásképződést 5-10 g/l koncentráció mellett teljes mértékben gátolta, függetlenül a szacharóz jelenlététől, még abban az esetben is, ha az utóbbi magas koncentrációban volt jelen.
1. táblázat
Mannóznak nem transzformált burgonyatörzsszegmensekből származó hajtások regenerációjára kifejtett gátlóhatása
Szacharózkon- centráció (g/i) Mannózkoncent- ráció (g/i) Regenerált hajtások/explantátum (%)
0 0 0
0 5 0
0 10 0
0 20 0
10 0 50
10 5 3
10 10 0
10 20 0
20 0 53
20 5 0
20 10 0
20 20 0
2. példa
A fent leírtak szerint, regenerálódott növényeket állítottunk elő. A hajtásszegmensekkel együtt tenyésztett Agrobacterium-törzset p(BKL-mannóz)-konstrukcióval
HU 225 771 Β1 transzformáltuk, melyet a fent leírtak szerint állítottunk elő, így a baktériumok tartalmazták a GUS- és a mannóz-6-foszfát-lzomerázt kódoló géneket hordozó vektort.
Transzgenikus (GUS+)-hajtásokat a hajtásoknak egy, a mannóz hajtásokra kifejtett toxikus hatását csökkentő szer (metil-3-O-glükóz) jelenlétében mutatott mannózmetabolizáló képessége alapján szelektáltunk. (GUS+)-hajtásokat a hajtások azon képessége alapján szelektáltunk, hogy azok körülbelül 5 g/l mannózkoncentráció mellett képesek növekedésre.
Kontrolikísérletet is végeztünk, melyben a hajtásszegmensek transzformálására alkalmazott Agrobacterium-törzs a p(BKL-mannóz)-vektorhoz hasonló vektort tartalmazott, azzal az eltéréssel, hogy abból a mannóz-6-foszfát-izomerázt kódoló gén hiányzott. Amikor a regenerált transzformáns hajtásokat 5 g/l mannóz és 20 g/l szacharóz jelenlétében tenyésztettük, nem kaptunk (GUS+)-transzformánsokat.
3. példa
Egy további kísérlet során a hajtásszegmensek transzformálására használt Agrobacterium-törzs a p(BKL-mannóz)-vektorhoz hasonló vektort hordozott, azzal az eltéréssel, hogy abból a mannóz-6-foszfát-izomerázt kódoló gén hiányzott. A fenti vektor tartalmazta az NPTII-t kódoló gént, amely a vele transzformált sejtekben kanamycinrezisztenciát képes létrehozni. Ennek megfelelően (GUS+)-transzformánsokat azok 50 mg/l koncentrációban jelen levő kanamycinnel szemben mutatott rezisztenciája alapján szelektálhattunk. Az utóbbi szelekció során a szelektált sejtek kisebb része volt (GUS+), mint a 2. példában leírt kísérlet során.
4. példa
A 3. példában leírt eljárást ismételtük meg, azzal az eltéréssel, hogy az Agrobacterium-törzset p(BKL-mannóz)-konstrukcióval transzformáltuk, és a (GUS+)transzformánsokat kanamycin (50 mg/ml) jelenlétében történő növekedés alapján szelektáltuk. Ebben az esetben a szelektált hajtások kisebb része volt (GUS+), mint a 3. példában leírt kísérlet során.
5. példa
A PCT/92/00 252 számú közzétételi irat 13. példájában dohány esetében ismertetett, szokásos levéllemez-eljárást végeztük, azzal az eltéréssel, hogy az Agrobacteriummal történő beoltást és az együtt tenyésztést elhagytuk. Citokininként benziladenint (1 mg/ml) alkalmaztunk, a szénhidráttartalom pedig az alábbi volt. Valamennyi levéllemezből származó regenerált hajtások számát a 21. napot követően feljegyeztük.
A 2. táblázat szerint szacharóz jelenlétében a D-xilóz nem gátolta a hajtások regenerálódását, továbbá a D-xilóz szénhidrátforrásként nem hasznosult. A D-xilulóz a hajtások regenerálódása során jó szénhidrátforrásnak bizonyult.
2. táblázat
D-xilóz és D-xilulóz szénhidrátforrásként történő hasznosíthatóságának vizsgálata a hajtások dohánylevéllemezekből történő regenerálódása során
Xilóz (g/l) Szacharóz (g/l) Xilulóz (g/l) Az egyes levéllemezekből regenerálódott hajtások száma
0 0 0 0
10 0 0 0
10 10 0 4,3
0 10 0 2,3
0 0 10 4,1
0 10 10 11,7
A xilózt a xilóz-izomeráz enzim xilulózzá képes alakítani. Tehát megfelelő promoterek és terminátorok szabályozása alatt álló funkcionális xilulóz-izomerázgént, valamint egy további strukturális gént juttathatunk növényekbe, azok részeibe, sejtjeibe, és a transzformáit növényt, annak részeit vagy sejtjeit annak alapján szelektálhatjuk, hogy azok szénhidrátforrásként xilózt képesek-e felhasználni.
6. példa
Explantátumokat állítottunk elő, és azokat a „transzformált szövetek szelekciójánál” fent leírtak szerint kezeltük, azzal az eltéréssel, hogy a szelekciós/regenerációs táptalajt nem egészítettük ki kanamycinnel vagy carbenicillinnel, és a növényi szövet nem volt transzformálva. Az egyetlen továbbtenyésztési lépés az volt, amikor az explantátumokat az együtt tenyésztésre használt táptalajból a xilózzal alábbi koncentrációkban kiegészített szelekciós/regenerációs táptalajba vittük át.
A regenerált hajtások számát a 12. hetet követően feljegyeztük.
3. táblázat
D-xilóz szénhidrátforrásként való felhasználhatósága a hajtások burgonyatörzsszegmensekből történő regenerációja során
Xilóz (g/l) Szacharóz (g/l) Az egyes levéllemezekből regenerálódott hajtások száma
0 0 0
5 0 0
10 0 0
20 0 0
0 10 6
5 10 3
10 10 0
20 10 0
HU 225 771 Β1
A 3. táblázat azt mutatja, hogy szacharóz jelenlétében a D-xilóz (a D-mannózhoz képest) gyengén gátolja a hajtások regenerálódását, és a D-xilóz xilózmetabolizáló enzimre vagy proteinre nézve nem transzgenikus növényekben szénhidrátforrásként nem hasznosul. Továbbá a táptalajhoz adott D-xilulóz (5 g/l) szacharóz hiányában, 9 hét elteltével explantátumonként 2,2 hajtás regenerálódását tette lehetővé.
7. példa
Az 5. példában leírt eljárást ismételtük meg, azzal az eltéréssel, hogy a szelekciós/regenerációs táptalajt metil-3-O-glükózzal (MOG) egészítettük ki a 4. táblázatban jelzett koncentrációk alkalmazásával. Nyolc hét elteltével feljegyeztük az élő explantátumok számának százalékos arányát.
A 4. táblázatból látható, hogy a MOG-gal történő együttes kezelés gátolja a mannóznak érzékeny növényi szövetekre kifejtett toxikus hatását. Mivel a mannóz egyéb szénhidrátforrásként felhasználható vegyületek esetében optimális koncentráció mellett toxikus, a MOG hozzáadása lehetővé teszi a táptalajnak mannóz formájában, optimális szénhidrát-koncentrációval történő kiegészítését. Ez lehetővé teszi mannóznak egyéb szénhidrátforrás hiányában, pozitív szelekciós szerként történő alkalmazását.
4. táblázat
Mannóz toxikus hatásának gátlása metil-3-O-glükózzal (MOG) történő együtt kezeléssel
Mannóz (g/l) 0 5 10 0 5 10
Szacharóz (g/l) 0 0 0 10 10 10
MOG (g/l)
0 71 4 0 100 1 4
5 13 54 0 100 100 5
10 47 82 9 100 100 41
20 50 98 88 100 100 100
8. példa
A 7. példában leírt eljárást ismételtük meg, azzal az eltéréssel, hogy a szelekciós/regenerációs táptalaj mannózt (15 g/l), az 5. táblázatban jelzett koncentrációkban metil-3-O-glükózt tartalmazott, de nem tartalmazott szacharózt. A transzformált növényi anyag mannóz-6-foszfát-izomeráz-génre nézve transzgenikus volt. Huszonegy (21) nap elteltével a szelektált hajtásokat összegyűjtöttük. Valamennyi összegyűjtött hajtást megvizsgáltuk az együtt bejuttatott β-glukuronidázgén expresszálódására nézve, és (két gyűjtés alapján) kiszámítottuk az egy explantátumra jutó, transzgenikus, β-glukuronidázt expresszáló (GUS+)-hajtások számát, valamint az összes szelektált hajtásra jutó, β-glukuronidázt expresszáló (GUS+)-hajtások arányát (5. táblázat).
Az 5. táblázat alapján látható, hogy amennyiben a mannózt metil-3-O-glükózzal együtt adjuk a táptalajhoz, a transzgenikus hajtások szelekciója egyéb szénhidrátforrás hiányában még magas mannózkoncentrációk esetén is lehetséges.
5. táblázat
A metil-3-O-glükóz hatása transzgenikus hajtások mannóztartalmú, szacharózt nem tartalmazó táptalajon történő szelekciójára
Mannóz (g/l) 15 15 15 15 15
MOG (g/l) 0 2,5 5,0 10 15
(GUS+)-hajtá- sok/explantátum 0 0,2 1,0 0,5 0,6
(GUS+)-hajtások/szelektált hajtások (%) 0 57 81 89 53
9. példa
A 8. példában leírt eljárást ismételtük meg, azzal az eltéréssel, hogy MOG helyett phloridzint alkalmaztunk. A 6. táblázatból látható, hogy mannóz és phloridzin együttes alkalmazásával magas mannózkoncentrációk mellett, egyéb szénhidrátforrás hiányában a transzgenikus hajtások 100%-os szelekcióját lehetett elérni. Ez azt szemlélteti, hogy egy szénhidráttranszport-gátlóval hogyan lehet minimális mértékűre szorítani a kereszttáplálást és a szelekciót elkerülő hajtások keletkezését.
6. táblázat
0,5 g/l phloridzin
Mannóz (g/i) (GUS+)-hajtások/szelektált hajtások (GUS+)-hajtá- sok/explantátum
+sza- charóz -szacha- róz ♦-sza- charóz -szacha- róz
5,0 94,0% 100,0% 1,2 0,08
7,5 88,0% 78,5% 0,5 0,5
10,0 100,0% 95% 0,5 0,5
12,5 100,0% - 0,03 0,0
15,0 100,0% - 0,03 0,0
10. példa
A 7. táblázat alapján látható, hogy transzgenikus növényi szövetekben, többek között az E. coliból származó mannóz-6-foszfát-izomeráz-gént tartalmazó szövetekben szelekciós szerként mannózon kívül egyéb vegyületek is alkalmazhatók.
7. táblázat
Mannózzal, továbbá egyéb vegyületekkel szelektált regenerált hajtások egy explantátumra jutó száma
Egy explantátumra jutó regenerált hajtások száma
vegyület genotípus
vad típusú Μ-6-P-izomeráz
D-mannóz 0 1,1
D-mannózamin 0 0,8
D-mannóz-6-foszfát 0 0,7
HU 225 771 Β1
11. példa
Cukorrépát transzformáltunk a WO 92/17591 számú közzétételi iratban leírt, úgynevezett „cot-pet eljárással, mely szerint levélnyelet is tartalmazó szikleveleket használtunk explantátumként. Négy-hét (4-7) hétig, 12 °C-on, 16 óra nappali megvilágítás és 8 óra sötétség mellett csíráztatott és nevelt magokból magoncokat nyertünk. A szikleveleket 2-3 cm-rel a csomópont alatt elvágtuk, szétszedtük, és xilóz jelenlétében vagy anélkül, sötétben vagy világosban tenyésztettük. A 8. táblázat azt mutatja, hogy a cukorrépa megvilágítás mellett a xilózt szénhidrátforrásként hasznosítja, de sötétben nem, ami azt jelenti, hogy a többek között xilózizomeráz-génre nézve transzgenikus cukorrépa xilózfelhasználáson alapuló pozitív szelekcióját sötétben kell végezni.
8. táblázat
D-xilóz hatásának vizsgálata cukorrépában szacharózzal kombinálva, megvilágítással és anélkül
Eredmények 3 hét elteltével (megvilágítás mellett)
D-xilóz (g/i) szacha- róz (g/i) hajtással rendelkező explantátumok (%) tömeg (nedves) (g) zöld szín (%)
0 10 98 7,41 100
0 0 13 0,64 60
10 0 90 1,53 90
10 10 97 5,47 100
2 hétig sötétben és 1 hétig megvilágítás mellett tartott explantátumok eredményei
D-xilóz (g/i) szacha- róz (g/i) hajtással rendelkező explantátumok (%) tömeg (nedves) (g) zöld szín (%)
0 10 50 1,38 97
0 0 0 0,36 47
10 0 13 0,37 77
10 10 80 0,89 97
12. példa
Olyan explantátumokat állítottunk elő, melyek többek között a mannóz-6-foszfát-izomeráz-génre transzgenikusak voltak, és a szelekciós/regenerációs táptalajt a 9. táblázatban jelöltek szerint, mannózzal és szacharózzal egészítettük ki. A regenerált hajtások számát 11 hét elteltével feljegyeztük. A 9. táblázat a metil-3-Οglükózt tartalmazó táptalajon regenerálódott hajtások számát mutatja mannózt és metil-3-O-glükózt nem tartalmazó táptalajon regenerálódott hajtások számához viszonyítva, százalékban kifejezve.
9. táblázat
Metil-3-O-glükóz (g/i)
mannóz (g/i) szacha- róz (g/D vad típusú Man-6-Ρ- izomeráz
2,5 5,0 2,5 5,0
0 0 0 0 0 0
5 0 0 0 7 0
10 0 0 0 64 28
20 0 0 0 107 128
0 10 53 17 0 0
5 10 0 41 64 64
10 10 0 0 86 36
20 10 0 0 200 86
Hajtások regenerálódása szacharózt tartalmazó (10 g/l), de mannózt és metil-3-O-glükózt nem tartalmazó táptalajon:
transzgenikus szövet: 1,4 hajtás/explantátum vad típusú szövet: 1,7 hajtás/explantátum
Miután a találmány szerinti megoldást teljes egészében ismertettük, szakember számára nyilvánvaló, hogy a találmány tárgyköre nem korlátozódik a fenti példákban ismertetettekre. Például az ilyen szövetek fejlődési folyamatát szabályozhatjuk egy mannóz- vagy xilózmetabolizmusban, vagy egy mannóz- vagy xilózszármazék vagy mannóz- vagy xilózprekurzor metabolizmusában szerepet játszó enzimet kódoló gén szövetspecifikus expresszióján keresztül oly módon, hogy a szöveteket az említett enzim modulátorának szubsztrátjával érintkeztetjük. A mannóz vagy xilóz (vagy azok származékai vagy perkurzorai) alkalmazhatók továbbá szelektív herbicidekként, hogy a xilóz- vagy mannózmetabolizmusban vagy azok származékainak vagy perkurzorainak metabolizmusában szerepet játszó proteineket kódoló génekkel transzformált, a fenti géneket tartalmazó terményeket szelektív módon előnyös helyzetbe hozzuk.
Nyilvánvaló az is, hogy a találmány szerinti eljárás alkalmazása az alábbiakat eredményezheti:
i) egy gén, például foszfomannóz-izomerázt kódoló gén bejuttatásával, általában vagy egyes szövetekben/sejttípusokban csökkent fruktóz-6-foszfát-szinttel, vagy az előbbi származékainak csökkent szintjével rendelkező eukarióta szervezeteket;
ii) egy gén, például foszfomannóz-izomerázt kódoló gén bejuttatásával, általában vagy egyes szövetekben/sejttípusokban megnövekedett mannóz-6-foszfátszinttel, vagy az előbbi származékainak megnövekedett szintjével rendelkező eukarióta szervezeteket;
iii) foszfomannóz-izomerázt kódoló gén sejtekbe történő bejuttatásával, valamennyi vagy egyes sejttípusokban fokozott foszfomannóz-izomeráz-aktivitással rendelkező eukarióta szervezeteket.

Claims (26)

  1. SZABADALMI IGÉNYPONTOK
    1. Eljárás a transzformáció következtében metabolikus előnnyel rendelkező transzformált sejtek azonosítására vagy szelektálására legalább egy szelekciós vegyületet tartalmazó táptalajban vagy táptalajon tenyésztett növényi sejtpopulációból, így gyümölcsök, aprómagvas gabonanövények, zöldségfélék, repce-, napraforgó-, dohány-, cukorrépa- vagy gyapotsejtekből, azzal jellemezve, hogy
    I) a sejteket egy nukleotidszekvenciával vagy együtt bejuttatott nukleotidszekvenciákkal transzformáljuk, amelyek egyike egy olyan régiót tartalmaz, amely egy, a vegyület metabolizmusában szerepet játszó, a következők közül választott enzimproteint kódol: cukorfoszfát-izomerázok, cukorfoszfát-mutázok, foszfatázok és cukor-epimerázok;
    ii) a szelekciós vegyület mannóz vagy xilóz vagy ezek származéka vagy prekurzora, vagy a mannóz vagy xilóz metabolizmusában közvetlenül vagy közvetve szerepet játszó enzimprotein szubsztrátja.
  2. 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy egy további lépésben a közeghez olyan szert adunk, amely csökkenti a szelekciós vegyületnek a sejtekkel szembeni toxicitását.
  3. 3. Az 1. vagy 2. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a nukleotidszekvenciák legalább egyike olyan DNS-t tartalmaz, amelyet úgy módosítottunk, hogy olyan kodonokat tartalmazzon, amelyeket az organizmus, amelybe a szekvenciákat bejuttattuk, előnyben részesít, és amelybe a szekvenciákat úgy juttattuk be, hogy az organizmusban a módosított DNS expresszálódása lényegében hasonló enzimproteint eredményezzen, mint a módosítatlan DNS expresszálódása abban az organizmusban, amelyben a szekvenciák enzimprotein-kódoló komponensei endogén módon vannak jelen.
  4. 4. Az 1-3. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a sejteket a nukleotidszekvencia expressziójára képes szabályozószekvenciákat tartalmazó nukleotidszekvenciával transzformáljuk.
  5. 5. A 4. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy szabályozószekvenciaként promotereket és transzkripciós terminátorokat alkalmazunk.
  6. 6. Az 5. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a sejteket egy exogén promotert kódoló nukleotidszekvenciával transzformáljuk, amely a fenti promoter által szabályozható struktúrgénen vagy környékén lévő DNS-szekvenciával homológ rekombinációra képes.
  7. 7. Az 5. vagy 6. igénypont bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy promoterként egy konstitutív promotert alkalmazunk.
  8. 8. Az 5. vagy 6. igénypont bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy promoterként egy szabályozható promotert alkalmazunk.
  9. 9. Az 1-8. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a nukleotidszekvenciákat együtt juttatjuk be a növényi sejtekbe.
  10. 10. Az 1-8. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a nukleotidszekvenciákat egymástól függetlenül juttatjuk be a növényi sejtekbe.
  11. 11. A 9. vagy 10. igénypont bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az együtt vagy egymástól függetlenül bejuttatott nukleotidszekvenciák legalább egyike vírussal, gombával, baktériummal vagy nematodával szembeni rezisztenciát kódol.
  12. 12. Az 1-11. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy szelekciós vegyületként mannózt alkalmazunk.
  13. 13. Az 1-12. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy szelekciós vegyületként mannózt alkalmazunk, és az együtt vagy egymástól függetlenül bejuttatott nukleotidszekvencia mannóz-6foszfát-izomerázt kódol.
  14. 14. Az 1-11. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy szelekciós vegyületként mannóz-6-foszfátot, xilózt vagy D-mannóz-amint alkalmazunk.
  15. 15. A 14. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy szelekciós vegyületként xilózt alkalmazunk.
  16. 16. A 15. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy együtt bejuttatott nukleotidszekvenciaként xilóz-izomerázt kódoló régiót tartalmazó szekvenciát juttatunk be.
  17. 17. Az 1-11. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy cukorfoszfát-mutázként foszfomannomutázt és foszfatázként mannóz-6-foszfatázt kódoló régiót tartalmazó szekvenciát juttatunk be.
  18. 18. Az 1-17. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a növényi sejteket a következők közül választott módszerrel transzformáljuk: elektroporáció, mikroinjekció, mikrolövedékek bejuttatására alkalmas eszköz alkalmazásával, vagy az Ri- és Ti-plazmidokkal történő transzformáció.
  19. 19. A 18. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy transzformációs vektorként egy Agrobacterium fajtát alkalmazunk.
  20. 20. Az 1-19. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a transzformált sejteket pozitív szelekciós és negatív szelekciós eljárások kombinációjával szelektáljuk, a transzformált sejtekben található nukleotidszekvenciával együtt egy olyan további nukleotidszekvenciát juttatunk be, amely a felsoroltak közül legalább eggyel szemben rezisztenciát kódol: toxinok, antibiotikumok és herbicidek, és a sejtek tenyésztésére olyan táptalajt alkalmazunk, amely a felsoroltak közül legalább egyet tartalmaz: toxinok, antibiotikumok és herbicidek, amely hatóanyaggal vagy hatóanyagokkal szemben a transzformált sejtekben rezisztencia jön létre.
  21. 21. A 20. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a nukleotidszekvenciát legalább két különböző szelekciós génnel együtt juttatjuk be.
  22. 22. Az 1-21. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy toxikus hatást csökkentő szerként metil-3-O-glükózt vagy phloridzint alkalmazunk.
    HU 225 771 Β1
  23. 23. Az 1-22. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy paradicsomból, mangóból, őszibarackból, almából, körtéből, eperből, banánból vagy dinnyéből származó növényi sejteket alkalmazunk.
  24. 24. Az 1-22. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy repcéből, napraforgóból, dohányból, cukorrépából, kukoricából vagy gyapotból származó növényi sejteket alkalmazunk.
  25. 25. Az 1-22. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy búzából, árpából vagy rizsből származó növényi sejteket alkalmazunk.
  26. 26. Az 1-22. igénypontok bármelyike szerinti eljá5 rás, azzal jellemezve, hogy burgonyából, sárgarépából, salátából, káposztából vagy vöröshagymából származó növényi sejteket alkalmazunk.
HU9502566A 1993-03-02 1994-02-28 Process for identifying of transformants by use of systems of mannose or xylose based positive selection HU225771B1 (en)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
GB939304200A GB9304200D0 (en) 1993-03-02 1993-03-02 Improvements in or relating to organic compounds
PCT/EP1994/000575 WO1994020627A1 (en) 1993-03-02 1994-02-28 Mannose or xylose based positive selection

Publications (3)

Publication Number Publication Date
HU9502566D0 HU9502566D0 (en) 1995-10-30
HUT73387A HUT73387A (en) 1996-07-29
HU225771B1 true HU225771B1 (en) 2007-08-28

Family

ID=10731298

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
HU9502566A HU225771B1 (en) 1993-03-02 1994-02-28 Process for identifying of transformants by use of systems of mannose or xylose based positive selection

Country Status (15)

Country Link
US (1) US5767378A (hu)
EP (1) EP0804599B2 (hu)
JP (3) JP3698722B2 (hu)
AT (1) ATE327336T1 (hu)
AU (1) AU682495B2 (hu)
CA (1) CA2157470C (hu)
DE (1) DE69434744T3 (hu)
DK (1) DK0804599T3 (hu)
ES (1) ES2265144T3 (hu)
GB (1) GB9304200D0 (hu)
HU (1) HU225771B1 (hu)
SK (1) SK285107B6 (hu)
UA (1) UA57696C2 (hu)
WO (1) WO1994020627A1 (hu)
ZA (1) ZA941467B (hu)

Families Citing this family (164)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
MX9707666A (es) * 1995-04-06 1997-11-29 Seminis Vegetables Proceso de seleccion de celulas de planta transgenica.
GB9702592D0 (en) * 1997-02-07 1997-03-26 Danisco Selection method
EP0870836A1 (de) 1997-04-09 1998-10-14 IPK Gatersleben 2-Desoxyglucose-6-Phosphat (2-DOG-6-P) Phosphatase DNA-Sequenzen als Selektionsmarker in Pflanzen
US6075134A (en) * 1997-05-15 2000-06-13 The Regents Of The University Of California Glycoconjugates and methods
US6586661B1 (en) * 1997-06-12 2003-07-01 North Carolina State University Regulation of quinolate phosphoribosyl transferase expression by transformation with a tobacco quinolate phosphoribosyl transferase nucleic acid
US7087420B1 (en) 1997-07-17 2006-08-08 Cambia Microbial β-glucuronidase genes, gene products and uses thereof
US6391547B1 (en) * 1997-09-09 2002-05-21 Center For The Application Of Molecular Biology To International Agriculture Microbial β-glucuronidase genes, gene products and uses thereof
WO1999014331A2 (en) 1997-09-16 1999-03-25 Cropdesign Nv Cyclin-dependent kinase inhibitors and uses thereof
AR020078A1 (es) 1998-05-26 2002-04-10 Syngenta Participations Ag Metodo para alterar la expresion de un gen objetivo en una celula de planta
GB9817465D0 (en) * 1998-08-11 1998-10-07 Danisco Selection method
US8013138B1 (en) 1998-11-12 2011-09-06 Max-Planck-Gesellschaft Zur Foerderung Der Wissenschaften E.V. Chimeric promoters capable of mediating gene expression in plants upon pathogen infection and uses thereof
DE19926216A1 (de) * 1999-06-09 2001-02-22 Metallgesellschaft Ag Verfahren zur Herstellung von Bariumsulfat, Bariumsulfat und Verwendung des Bariumsulfats
AU2001236839A1 (en) 2000-02-11 2001-08-20 Metabolix, Inc. Multi-gene expression constructs containing modified inteins
WO2001066779A2 (en) * 2000-03-08 2001-09-13 Univ. Of Georgia Research Foundation, Inc. Arabitol or ribitol as positive selectable markers
US7005561B2 (en) 2000-03-08 2006-02-28 University Of Georgia Research Foundation, Inc. Arabitol or ribitol as positive selectable markers
EP1780283A1 (en) * 2000-04-21 2007-05-02 Martek Biosciences Corporation Trophic conversion of obligate photographic algae through metabolic engineering
AU2001253699B2 (en) * 2000-04-21 2006-04-27 Martek Biosciences Corporation Trophic conversion of obligate phototrophic algae through metabolic engineering
AU2001268523A1 (en) 2000-06-16 2001-12-24 Martek Biosciences Corporation High fluorescent intensity cross-linked allophycocyanin
AU8980001A (en) * 2000-08-11 2002-02-25 Syngenta Participations Ag Methods for stable transformation of plants
WO2002018607A2 (en) * 2000-08-30 2002-03-07 North Carolina State University Transgenic plants containing molecular decoys that alter protein content therein
CN1258593C (zh) * 2000-11-07 2006-06-07 北卡罗莱纳州立大学 腐胺－n－甲基转移酶启动子
WO2002040690A2 (en) * 2000-11-17 2002-05-23 Metabolix, Inc. Production of medium chain length polyhydroxyalkanoates from fatty acid biosynthetic pathways
US20060157072A1 (en) * 2001-06-08 2006-07-20 Anthony Albino Method of reducing the harmful effects of orally or transdermally delivered nicotine
HUP0400161A2 (hu) * 2001-06-08 2004-08-30 Vector Tobacco Ltd., Módosított nikotin- és nitrozamintartalmú dohány
EP1925672A1 (en) 2001-06-22 2008-05-28 Syngeta Participations AG Abiotic stress responsive polynucleotides and polypeptides
NL1019308C2 (nl) 2001-11-06 2003-05-07 Stichting Tech Wetenschapp Werkwijze voor het selecteren van genetisch getransformeerde cellen.
EP1537136B1 (en) 2001-11-07 2011-01-12 Syngenta Participations AG Promoters for regulation of gene expression in plant roots
US7534934B2 (en) 2002-02-20 2009-05-19 J.R. Simplot Company Precise breeding
EP1585384B1 (en) * 2002-02-20 2012-07-11 J.R. Simplot Company Precise breeding
US7939709B2 (en) 2002-02-26 2011-05-10 Syngenta Limited Method for selectively producing male or female sterile plants
CA2481167A1 (en) * 2002-04-09 2003-10-23 Vector Tobacco Ltd. Tobacco having reduced nicotine and nitrosamines
DE60230071D1 (de) 2002-06-14 2009-01-08 Monier Tadros Methode für die herstellung von protamin
US20060174366A1 (en) 2002-07-09 2006-08-03 Mariette Andersson Use of ahas mutant genes as selection marker in potato transformation
CN101018864A (zh) 2002-12-26 2007-08-15 先正达合作有限公司 细胞增殖相关多肽及其应用
AU2004283850C1 (en) 2003-10-16 2011-11-03 Amgen Research (Munich) Gmbh Multispecific deimmunized CD3-binders
CA2542574C (en) 2003-11-12 2014-03-18 E. I. Du Pont De Nemours And Company Delta-15 desaturases suitable for altering levels of polyunsaturated fatty acids in oleaginous plants and yeast
DE602004022857D1 (de) 2003-12-02 2009-10-08 Basf Se 2-methyl-6-solanylbenzochinon-methyltransferase als ziel für herbizide
CN104293912A (zh) 2003-12-16 2015-01-21 先锋高级育种国际公司 显性基因抑制性转基因及其使用方法
US20070169227A1 (en) 2003-12-16 2007-07-19 Pioneer Hi-Bred International Inc. Dominant Gene Suppression Transgenes and Methods of Using Same
BRPI0508518A (pt) 2004-03-08 2007-08-14 Syngenta Participations Ag proteìna e promotor de semente de milho rica em glutamina
UA94893C2 (ru) 2004-03-25 2011-06-25 Сингента Партисипейшнс Аг Трансгенное растение кукурузы mir604
US8093182B2 (en) * 2004-12-23 2012-01-10 Nonomura Arthur M Compositions and methods for anti-transpiration in plants
CA2800359A1 (en) 2005-03-16 2006-09-28 Metabolix, Inc. Chemically inducible expression of biosynthetic pathways
WO2007087153A2 (en) 2006-01-06 2007-08-02 University Of Georgia Research Foundation Cyst nematode resistant transgenic plants
WO2007080440A1 (en) * 2006-01-12 2007-07-19 Avestha Gengraine Technologies Pvt.Ltd. Novel efficient transformation method for sunflower and oil seeds based on positive selection
CA2641868A1 (en) * 2006-02-09 2007-08-16 Avesthagen Limited Method of selection and regeneration of transgenic brassica jxmcea on xylose
AU2007356171B8 (en) 2006-08-04 2014-01-16 Bp Corporation North America Inc. Glucanases, nucleic acids encoding them, and methods for making and using them
EP2057178B1 (en) 2006-09-21 2013-11-06 Verenium Corporation Phytases, nucleic acids encoding them and methods for making and using them
DK2479267T3 (en) 2006-12-21 2017-03-27 Basf Enzymes Llc Amylases and Glucoamylases, Nucleic Acids Encoding Them, and Methods for Preparing and Using Them
KR101589759B1 (ko) 2007-04-03 2016-01-29 암젠 리서치 (뮌헨) 게엠베하 종간 특이적 ｃｄ３―입실론 결합 도메인
WO2008119567A2 (en) 2007-04-03 2008-10-09 Micromet Ag Cross-species-specific cd3-epsilon binding domain
CA2584934A1 (en) 2007-04-17 2008-10-17 University Of Guelph Nitrogen-regulated sugar sensing gene and protein and modulation thereof
EP2463370B1 (en) 2007-06-01 2013-07-31 Sapphire Energy, Inc. Use of genetically modified organisms to generate biomass degrading enzymes
GB2463543A (en) 2007-09-11 2010-03-24 Sapphire Energy Inc Molecule production by photosynthetic organisms
US8314222B2 (en) 2007-10-05 2012-11-20 Sapphire Energy, Inc. System for capturing and modifying large pieces of genomic DNA and constructing organisms with chloroplasts
MX2010005693A (es) 2007-12-03 2010-06-01 Syngenta Participations Ag Proteinas suceptibles diseñadas enzimaticamente.
US8487159B2 (en) * 2008-04-28 2013-07-16 Metabolix, Inc. Production of polyhydroxybutyrate in switchgrass
MX2010013917A (es) 2008-06-27 2011-03-03 Sapphire Energy Inc Induccion de floculacion en organismos fotosinteticos.
PT2356153T (pt) 2008-10-01 2016-07-15 Amgen Res (Munich) Gmbh Anticorpo biespecífico, de cadeia única, amepxcd3, específico interespécies
US10981998B2 (en) 2008-10-01 2021-04-20 Amgen Research (Munich) Gmbh Cross-species-specific single domain bispecific single chain antibody
BRPI0922656A2 (pt) 2008-12-16 2015-08-04 Syngenta Participations Ag Semente de uma planta de milho transgênica, planta de milho transgênica, células e tecidos desta, molécula de ácido nucléico, amplicos, par de iniciadores de polinucleotídeos, método e kit de detecção da presença de uma molécula de ácido nucléico, molécula de dna, método para confirmar a ausência de uma molécula de ácido nucléico, amostra biológica e extrato derivados de planta, tecido, semente ou célula de milho do evento 5307, métodos de reprodução de uma planta de milho, de seleção auxiliada por marcadores para uma característica resistente a insetos em milho, e de produção de plantas de milho híbridas resistentes a insetos coleópteros, semente e plantas de milho híbridas, sítio-alvo de cromossomo de milho, e método de preparação de uma planta de milho transgênica
CN101768213B (zh) 2008-12-30 2012-05-30 中国科学院遗传与发育生物学研究所 一种与植物分蘖数目相关的蛋白及其编码基因与应用
US7868688B2 (en) * 2008-12-30 2011-01-11 Cosmic Circuits Private Limited Leakage independent very low bandwith current filter
WO2011068567A1 (en) 2009-07-10 2011-06-09 Syngenta Participations Ag Novel hydroxyphenylpyruvate dioxygenase polypeptides and methods of use
CA2749524C (en) 2009-01-22 2021-07-06 Syngenta Participations Ag Mutant hydroxyphenylpyruvate dioxygenase polypeptides and methods of use
US9012719B2 (en) 2009-02-06 2015-04-21 Syngenta Participations Ag Modification of multidomain enzyme for expression in plants
CN101817879A (zh) 2009-02-26 2010-09-01 中国科学院遗传与发育生物学研究所 金属硫蛋白及其编码基因与应用
WO2010102293A1 (en) 2009-03-06 2010-09-10 Metabolix, Inc. Method of positive plant selection using sorbitol dehydrogenase
KR101817253B1 (ko) 2009-05-21 2018-01-10 신젠타 파티서페이션즈 아게 피타제, 이를 코딩하는 핵산 및 그의 제조 및 사용 방법
US20120174253A1 (en) 2009-09-15 2012-07-05 Nii Patterson Generation of high polyhydroxybutrate producing oilseeds
CN102596988B (zh) 2009-10-02 2016-07-13 先正达参股股份有限公司 杀虫蛋白
TWI653333B (zh) 2010-04-01 2019-03-11 安進研究（慕尼黑）有限責任公司 跨物種專一性之ＰＳＭＡｘＣＤ３雙專一性單鏈抗體
UA111592C2 (uk) 2010-07-07 2016-05-25 Сінгента Партісіпейшнс Аг Спосіб контролю над твердокрилими комахами-шкідниками
WO2012008748A2 (ko) * 2010-07-14 2012-01-19 건국대학교 산학협력단 지오바실러스 써모디니트리피칸스 유래 만노스-6-인산 이성화효소의 변이체 및 이를 이용한 엘-리보스 생산방법
WO2012037324A2 (en) 2010-09-15 2012-03-22 Metabolix, Inc. Increasing carbon flow for polyhydroxybutyrate production in biomass crops
EP2431471A1 (en) 2010-09-17 2012-03-21 Université Catholique De Louvain Methods for increasing the size of plants or plant organs
WO2012074868A2 (en) 2010-12-03 2012-06-07 Ms Technologies, Llc Optimized expression of glyphosate resistance encoding nucleic acid molecules in plant cells
AR083029A1 (es) 2010-12-09 2013-01-23 Syngenta Participations Ag Metodos y composiciones que utilizan arn interferente pequeño (arnip) para el control de nematodos en plantas
ES2461896B1 (es) 2010-12-21 2015-03-18 Centro De Investigación Y De Estudios Avanzados Del Instituto Politécnico Nacional Métodos para obtener plantas resistentes a sequía
AU2012242991B2 (en) 2011-04-11 2017-03-02 Targeted Growth, Inc. Identification and the use of KRP mutants in plants
AU2012249818B2 (en) 2011-04-26 2014-11-20 Syngenta Participations Ag Enhanced transformation of recalcitrant monocots
WO2012159891A1 (en) 2011-05-20 2012-11-29 Syngenta Participations Ag Endosperm-specific plant promoters and uses therefor
BR112014000580A2 (pt) 2011-07-15 2017-03-01 Syngenta Participations Ag métodos para aumento da produtividade e tolerância ao estresse em uma planta
US9861105B2 (en) 2011-07-28 2018-01-09 Syngenta Participations Ag Methods and compositions for controlling nematode pests
AU2012332343A1 (en) 2011-11-03 2014-05-22 Syngenta Participations Ag Polynucleotides, polypeptides and methods for enhancing photossimilation in plants
US20140182011A1 (en) 2011-11-03 2014-06-26 The University Of Hong Kong Methods Using Acyl-Coenzyme A-Binding Proteins to Enchance Drought Tolerance in Genetically Modified Plants
KR101952220B1 (ko) 2011-11-21 2019-05-27 이노베이션 해머 엘엘씨 실리케이트계 기질을 사용하여 식물을 성장시키는 방법 및 시스템, 내생성 글리코피라노실-단백질 유도체를 위한 외생성 글리코피라노사이드 사용에 의한 향상된 광합성 생산성 및 광안전화 재배, 및 그를 위한 제제, 방법 및 시스템
US9540654B2 (en) 2012-02-01 2017-01-10 Dow Agrosciences Llc Synthetic brassica-derived chloroplast transit peptides
KR102091297B1 (ko) 2012-02-03 2020-03-20 에프. 호프만-라 로슈 아게 항원-형질감염된 t 세포와 함께 사용되는 이중특이적 항체 분자 및 의약에서의 이들의 용도
EP2814965B1 (en) 2012-02-16 2018-03-21 Syngenta Participations AG Engineered pesticidal proteins
WO2013134651A1 (en) 2012-03-09 2013-09-12 Board Of Trustees Of Michigan State University Method of enhancing plant drought tolerance by expression of ndr1
MX362917B (es) 2012-05-21 2019-02-26 Innovation Hammer Llc Metodos para hacer seguros complejos de coordinacion micelares para el tratamiento de plantas y formulaciones para los mismos.
WO2013184768A1 (en) 2012-06-05 2013-12-12 University Of Georgia Research Foundation, Inc. Compositions and methods of gene silencing in plants
BR112014031789A2 (pt) 2012-06-22 2017-08-01 Syngenta Participations Ag controle biológico de pragas de coleópteros
WO2014028426A1 (en) 2012-08-13 2014-02-20 University Of Georgia Research Foundation, Inc. Compositions and methods for increasing pest resistance in plants
EP2911519A4 (en) 2012-10-23 2016-06-01 Univ Montana State PRODUCTION OF HIGH QUALITY HARD WHEAT WITH INCREASED AMYLOSIS CONTENT
US20160015749A1 (en) 2013-03-05 2016-01-21 Baylor College Of Medicine Engager cells for immunotherapy
CN105407902A (zh) 2013-03-05 2016-03-16 贝勒医学院 溶瘤病毒
EP2964753B1 (en) 2013-03-07 2018-04-25 Baylor College of Medicine Targeting cd138 in cancer
US20160015750A1 (en) 2013-03-09 2016-01-21 Baylor College Of Medicine Vascular-targeted t-cell therapy
JP6578271B2 (ja) 2013-04-17 2019-09-18 ベイラー カレッジ オブ メディスンＢａｙｌｏｒ Ｃｏｌｌｅｇｅ Ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ 免疫抑制ＴＧＦ−βシグナルコンバーター
AU2014278519B2 (en) 2013-06-11 2020-09-10 Syngenta Participations Ag Methods for generating transgenic plants
US20140380524A1 (en) 2013-06-19 2014-12-25 The University Of Hong Kong Methods of using 3-hydroxy-3-methylglutaryl-coa synthase to enhance growth and/or seed yield of genetically modified plants
CN105916876A (zh) 2013-09-16 2016-08-31 分子医学研究中心责任有限公司 用于骨髓恶性肿瘤诊断的突变钙网蛋白
SI3062606T1 (sl) 2013-10-29 2019-09-30 Biotech Institute, Llc Gojenje, priprava, predelava in uporaba posebnega kanabisa
US20170073690A1 (en) 2014-05-15 2017-03-16 CEMM - Forschungzentrum Fuer Molekulare Medizin GMBH Antagonists of slc38a9 and their use in therapy
MA41538A (fr) 2014-10-17 2017-12-26 Baylor College Medicine Cellules immunitaires bipartites et tripartites de signalisation
BR112017012362A2 (pt) 2014-12-12 2018-07-31 Syngenta Participations Ag composições e métodos para controle de pragas de plantas.
US20170327834A1 (en) 2014-12-15 2017-11-16 Syngenta Participations Ag Pesticidal microrna carriers and use thereof
BR112017013528A2 (pt) 2014-12-23 2018-03-06 Syngenta Participations Ag controle biológico de pragas de coleópteros
SG11201704272YA (en) 2014-12-31 2017-06-29 Synthetic Genomics Inc Compositions and methods for high efficiency in vivo genome editing
MA41433A (fr) 2015-01-26 2017-12-05 Baylor College Medicine Cellules immunitaires universelles pour l'immunothérapie anticancéreuse
KR20170138410A (ko) 2015-02-23 2017-12-15 시걸 테라퓨틱스 에스에이에스 비-천연 세마포린 3 및 이의 의학적 용도
WO2016164810A1 (en) 2015-04-08 2016-10-13 Metabolix, Inc. Plants with enhanced yield and methods of construction
EP3280271A4 (en) 2015-04-10 2019-04-10 Syngenta Participations AG ANIMAL FEED COMPOSITIONS AND METHODS OF USE
US12048716B2 (en) 2015-04-23 2024-07-30 Baylor College Of Medicine NKT-cell subset for in vivo persistence and therapeutic activity and propagation of same
AR105155A1 (es) 2015-07-07 2017-09-13 Syngenta Participations Ag Composiciones y métodos para controlar plagas de plantas
US10732170B2 (en) 2015-07-31 2020-08-04 Missum Biotechnology, Llc Quality of immunological synapse predicts effectiveness of chimeric antigen receptor (CAR) T cells
WO2017136668A1 (en) 2016-02-04 2017-08-10 Yield10 Bioscience, Inc. Transgenic land plants comprising a putative bicarbonate transporter protein of an edible eukaryotic algae
EP3216458A1 (en) 2016-03-07 2017-09-13 Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. Modified vascular endothelial growth factor a (vegf-a) and its medical use
EP4218414A1 (en) 2016-04-29 2023-08-02 Innovation Hammer LLC Formulations and methods for treating photosynthetic organisms and enhancing qualities and quantities of yields with glycan composite formulations
WO2018002358A1 (en) 2016-06-30 2018-01-04 F. Hoffmann-La Roche Ag Improved adoptive t-cell therapy
AR109205A1 (es) 2016-08-05 2018-11-07 Syngenta Participations Ag Control de plagas de coleópteros utilizando moléculas de arn
AR109206A1 (es) 2016-08-05 2018-11-07 Syngenta Participations Ag Control de plagas de coleópteros utilizando moléculas de arn
EP3562299A4 (en) 2016-09-09 2020-05-13 Syngenta Participations AG INSECTICIDE PROTEINS
TW201825674A (zh) 2016-09-09 2018-07-16 美商艾斯合顧問有限公司 表現雙特異性接合分子的溶瘤病毒
WO2018076335A1 (en) 2016-10-31 2018-05-03 Institute Of Genetics And Developmental Biology, Chinese Academy Of Sciences Compositions and methods for enhancing abiotic stress tolerance
WO2018083238A1 (en) 2016-11-03 2018-05-11 Roche Diagnostics Gmbh Novel anti-py792-ddr1 antibodies
WO2018083237A1 (en) 2016-11-03 2018-05-11 Roche Diagnostics Operations Inc. Novel anti-py520-ddr1 antibodies
WO2018083240A1 (en) 2016-11-03 2018-05-11 Roche Diagnostics Gmbh Novel anti-py796-ddr1 antibodies
WO2018083235A1 (en) 2016-11-03 2018-05-11 Roche Diagnostics Gmbh Novel anti-py513-ddr1 antibodies
AU2018224065B2 (en) 2017-02-22 2021-11-11 Yield10 Bioscience, Inc. Transgenic land plants comprising enhanced levels of mitochondrial transporter protein
RU2766710C2 (ru) 2017-03-13 2022-03-15 Бонамоуз, Инк. Ферментативное получение гексоз
TW201900673A (zh) 2017-03-27 2019-01-01 瑞士商赫孚孟拉羅股份公司 改良之抗原結合受體
RU2019133199A (ru) 2017-03-27 2021-04-28 Ф. Хоффманн-Ля Рош Аг Улучшенные форматы антигенсвязывающего рецептора
EP3652214A1 (en) 2017-07-13 2020-05-20 H. Hoffnabb-La Roche Ag New binding agent and assay for pivka
CA3076020A1 (en) 2017-10-02 2019-04-11 Syngenta Participations Ag Engineered pesticidal proteins and methods of controlling plant pests
AR113761A1 (es) 2017-10-18 2020-06-10 Syngenta Participations Ag Control de plagas de hemípteros utilizando moléculas de arn
US20200407719A1 (en) 2018-02-26 2020-12-31 Devgen Nv Control of insect pests using rna molecules
WO2019175127A1 (en) 2018-03-14 2019-09-19 F. Hoffmann-La Roche Ag Novel anti-troponint antibodies
JP7333332B2 (ja) 2018-03-14 2023-08-24 エフ． ホフマン－ラ ロシュ アーゲー 抗体のアフィニティ成熟のための方法
EP3561053A1 (en) 2018-04-26 2019-10-30 Baylor College of Medicine Immune effector cells and molecular adaptors with an antigen cytokine complex for effective cancer immunotherapy
EP3784784A1 (en) 2018-04-27 2021-03-03 Devgen NV Control of insect pests using rna molecules
US12084672B2 (en) 2018-09-04 2024-09-10 Yield10 Bioscience, Inc. Genetically engineered land plants that express an increased seed yield protein and/or an increased seed yield RNA
CN112805370A (zh) 2018-10-19 2021-05-14 豪夫迈·罗氏有限公司 诱导高阻力跨内皮屏障的协同转录因子
WO2020167796A1 (en) * 2019-02-12 2020-08-20 Bonumose Llc Enzymatic production of mannose
US20220194994A1 (en) 2019-02-20 2022-06-23 Syngenta Crop Protection Ag Engineered pesticidal proteins and methods of controlling plant pests
EP3942044A1 (en) 2019-03-21 2022-01-26 Devgen NV Control of insect pests using rna molecules
BR112021024656A2 (pt) 2019-09-17 2022-04-12 Beijing Dabeinong Biotechnology Co Ltd Polipeptídeo de hidroxife-nilpiruvato-dioxigenase mutante, gene codificador e uso do mesmo
EP4188964A1 (en) 2020-08-03 2023-06-07 F. Hoffmann-La Roche AG Improved antigen binding receptors
AR124562A1 (es) 2020-10-28 2023-04-12 Hoffmann La Roche Receptores de unión al antígeno mejorada
WO2022093977A1 (en) 2020-10-30 2022-05-05 Fortiphyte, Inc. Pathogen resistance in plants
CN115336534A (zh) 2021-05-12 2022-11-15 北京大北农生物技术有限公司 原卟啉原氧化酶的用途
AU2022315528A1 (en) 2021-07-22 2023-10-19 F. Hoffmann-La Roche Ag Heterodimeric fc domain antibodies
MX2024006303A (es) 2021-11-25 2024-06-12 Hoffmann La Roche Receptores de union al antigeno mejorados.
IL313168A (en) 2021-12-15 2024-07-01 Beijing Dabeinong Biotechnology Co Ltd Mutated hydroxyphenylpyruvate dioxygenase polypeptide and encoding gene and its use
EP4448564A1 (en) 2021-12-17 2024-10-23 F. Hoffmann-La Roche AG A novel antibody for detection of amyloid beta 42 (a-beta42)
WO2023154887A1 (en) 2022-02-11 2023-08-17 Northeast Agricultural University Methods and compositions for increasing protein and/or oil content and modifying oil profile in a plant
WO2023180511A1 (en) 2022-03-25 2023-09-28 F. Hoffmann-La Roche Ag Improved chimeric receptors
WO2023206126A1 (zh) 2022-04-27 2023-11-02 北京大北农生物技术有限公司 原卟啉原氧化酶的用途
WO2024023578A1 (en) 2022-07-28 2024-02-01 Institut Pasteur Hsc70-4 in host-induced and spray-induced gene silencing
WO2024052856A1 (en) 2022-09-09 2024-03-14 Friedrich Alexander Universität Erlangen-Nürnberg Plant regulatory elements and uses thereof
WO2024158934A1 (en) 2023-01-24 2024-08-02 Yale University Compositions and methods for controlling t-dna copy number in transformed plants
WO2024166076A1 (en) 2023-02-10 2024-08-15 King Abdullah University Of Science And Technology Recombinant production of antimicrobial peptides in planta

Family Cites Families (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4931373A (en) † 1984-05-25 1990-06-05 Zymogenetics, Inc. Stable DNA constructs for expression of α-1 antitrypsin
US4857467A (en) * 1986-07-23 1989-08-15 Phillips Petroleum Company Carbon and energy source markers for transformation of strains of the genes Pichia
DE3719053A1 (de) * 1987-06-06 1988-12-15 Hoechst Ag Verbesserte nutzung von pflanzenverwertbarem stickstoff durch kulturpflanzen mit ueberexpression der glutaminsynthetase
JPH02138966A (ja) * 1987-10-20 1990-05-28 Oji Paper Co Ltd 植物の形質転換体を作出する方法
HU220115B (hu) * 1991-05-24 2001-11-28 Universidad Politecnica De Madrid Antipatogén peptidek, ezeket tartalmazó készítmények, eljárás növények védelmére és a peptideket kódoló szekvenciák
DK152291D0 (da) † 1991-08-28 1991-08-28 Danisco Fremgangsmaade og kemiske forbindelser
WO2009113991A1 (en) * 2008-03-10 2009-09-17 Mobank Solutions, Llc Systems and methods for mobile device and code based money deposit, withdrawal and transfer
US8098881B2 (en) * 2008-03-11 2012-01-17 Sony Ericsson Mobile Communications Ab Advertisement insertion systems and methods for digital cameras based on object recognition

Also Published As

Publication number Publication date
ES2265144T3 (es) 2007-02-01
HUT73387A (en) 1996-07-29
US5767378A (en) 1998-06-16
DE69434744D1 (de) 2006-06-29
CA2157470C (en) 2012-04-17
GB9304200D0 (en) 1993-04-21
SK285107B6 (sk) 2006-06-01
EP0804599A1 (en) 1997-11-05
EP0804599B2 (en) 2012-10-10
AU682495B2 (en) 1997-10-09
JP2008301827A (ja) 2008-12-18
JP4805309B2 (ja) 2011-11-02
JP3698722B2 (ja) 2005-09-21
UA57696C2 (uk) 2003-07-15
JP4426376B2 (ja) 2010-03-03
CA2157470A1 (en) 1994-09-15
ATE327336T1 (de) 2006-06-15
HU9502566D0 (en) 1995-10-30
ZA941467B (en) 1995-09-04
DK0804599T3 (da) 2006-09-25
EP0804599B1 (en) 2006-05-24
DE69434744T3 (de) 2013-03-21
JPH08509861A (ja) 1996-10-22
SK107095A3 (en) 1995-12-06
JP2004254705A (ja) 2004-09-16
DE69434744T2 (de) 2007-05-03
WO1994020627A1 (en) 1994-09-15
AU6207794A (en) 1994-09-26

Similar Documents

Publication Publication Date Title
HU225771B1 (en) Process for identifying of transformants by use of systems of mannose or xylose based positive selection
DE69733945T2 (de) Metabolismusregulierung durch verändern des gehaltes an trehalose-6-phosphat
Zambre et al. A reproducible genetic transformation system for cultivated Phaseolus acutifolius (tepary bean) and its use to assess the role of arcelins in resistance to the Mexican bean weevil
AU2010343047B2 (en) Male and female sterility lines used to make hybrids in genetically modified plants
WO2008137985A2 (en) Methods for inducing cotton embryogenic callus
EA028662B1 (ru) Рнк-интерференция для борьбы с грибами и оомицетами путем ингибирования гена сахаропиндегидрогеназы
US6914175B2 (en) Process for preparing an anti-oxidant
US7767885B2 (en) Plastid genetic engineering via somatic embryogenesis
WO2006057306A1 (ja) ストレス耐性及び／又は生産性を改良したイネ科植物、及びその作出方法
TW517087B (en) Pre- and postharvest inhibition of remobilisation of storage compounds
RU2127759C1 (ru) Способ идентификации или селекции эукариотических клеток
JP3755876B2 (ja) 選択マーカーを含まない組換え植物の作出方法、ならびに該方法により作出される組換え植物
US7005561B2 (en) Arabitol or ribitol as positive selectable markers
JP4413615B2 (ja) 遺伝的に形質転換された細胞の選択方法
CN111471707B (zh) 一种延缓森林草莓叶片衰老的载体及其制备方法和应用
US20100248372A1 (en) Composition and Method for Modulating Plant Transformation
CN118726376A (zh) 一种增强马铃薯耐旱性的基因AtCAH1及其表达蛋白和应用
BG100268A (bg) Продуциране на трехалоза в растения
Tirajoh Tissue culture and agrobacterium-mediated transformation of North American ginseng (Panax quinquefolium L.)

Legal Events

Date Code Title Description
DGB9 Succession in title of applicant

Owner name: NOVARTIS AG., CH