JP4426376B2 - マンノースまたはキシロースに基づく陽性選択 - Google Patents

マンノースまたはキシロースに基づく陽性選択 Download PDF

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Description

本発明は、その中に所望のヌクレオチド配列が挿入されている、遺伝子的に形質転換された細胞に、形質転換細胞に選択的優勢(selective advantage)を与えることにより選択する方法に関する。形質転換細胞が有する選択的優勢は、非形質転換細胞と比較して、栄養素、成長因子またはエネルギー源のような添加化合物の高められた利用能によるものであってよい。
遺伝子材料を形質転換により細胞集団中に挿入した場合、ある数の細胞しか形質転換が成功しないことは知られている。形質転換細胞の同定および分離は、伝統的に、形質転換細胞は生存および成育できるが、形質転換細胞がその形質転換によって寛容性である物質により非形質転換細胞は成育が阻害されまたは恐らく死滅さえする「陰性選択」を使用して成されている。
例えば、植物細胞集団が形質転換された場合、形質転換細胞の選択は、典型的には抗生物質または除草剤耐性を提供する「選択遺伝子」の存在に基づく。それ自身形質転換植物中では有用な機能を有しない可能性のある(実際植物中で望ましくない場合もあり得る)−選択遺伝子は、植物中に挿入すべき所望の遺伝子と両方の遺伝子が細胞集団内、または細胞の全ての形質転換の実行は、不可能でないにしても難しいため、むしろ細胞集団内のある程度に挿入されるように組み合わせて、または共挿入する。次いで、遺伝子的形質転換細胞は、選択遺伝子により耐性である抗生物質または除草剤を含む培地上または中で細胞を培養し、−抗生物質または除草剤耐性遺伝子を有しない−非形質転換細胞は成育阻害または死滅の対象となるため、それにより形質転換細胞を同定する。
これらの陰性選択法はある不利点を有する。例えば、非形質転換細胞は、成育培地中の抗生物質または除草剤の存在により死滅し得る。結果として、細胞集団がコヘレント(coherent)組織である場合、非形質転換細胞の死骸が形質転換細胞への栄養の供給を遮断し得るという事実のため、もしくは傷害を受けた末期の非形質転換細胞は有毒化合物を排出し得るため、非形質転換細胞だけでなく、形質転換細胞も死滅するという危険性がある。
陰性選択の他の不利点は、例えば抗生物質耐性を提供するような不必要な遺伝子の存在が望ましくない場合があり得る。植物および微生物に抗生物質耐性をコードする遺伝子を挿入することが安全か否かについて、環境保護グループおよび政府当局で懸念されている。この懸念は食用植物ならびに閉鎖環境中での使用のために設計されていない微生物(例えば農業で使用する微生物)および閉鎖環境の使用のために設計されているが、突発的にそこから放出され得る微生物について特に著しい。
陰性選択の他の不利点は、有毒物質で処理された植物組織または細胞は、細菌感染により感受性になるということである。これは、アグロバクター(Agrobacterium)が形質転換細胞として使用された場合、細菌成育を妨げるために抗生物質を使用したとしても、処理組織または細胞で細菌がはびこることがあるため、問題である。
加えて、陰性選択を使用した細胞または組織の選択は、選択工程に関して遺伝子を誘発する厳密なタイミングが必要である。無毒化遺伝子の発現前か、有毒化合物の作用を改善するために充分な遺伝子産物が産生される前にトランスジェニック細胞を有毒化合物で処理した場合、トランスジェニックおよび非トランスジェニック細胞の両方が死滅するであろう。もし選択が遅すぎれば、トランスジェニック細胞または組織の選択は、例えば、形質転換細胞を選択するために使用した化合物の浸透に対する障壁を形成する非トランスジェニック細胞または組織からの新芽またはカルス形成により妨げられ得る。
本発明が解決使用とする課題は、上記の陰性選択に関する不利点を克服するために、真核細胞の選択のための新たな方法を開発することであった。
本発明者らは、かかる課題に鑑みて鋭意研究を行い、以下に示すような、真核細胞の選択のための新規方法を開発するに至った。すなわち、本発明は、以下のものを提供する：
（１）少なくとも１種の化合物を含む培地上または中で培養された植物細胞集団から、形質転換の結果として代謝優勢を有する細胞を同定または選択するにあたり、
ｉ）前記細胞を、ホスホ糖−イソメラーゼ、ホスホ糖−ムターゼ、ホスファターゼ、および糖−エピメラーゼからなる群より選択される、前記化合物の代謝に関与する酵素タンパク質をコードする領域をいずれかが含むヌクレオチド配列または共挿入ヌクレオチド配列で形質転換する、かつ
ii）前記化合物がマンノースまたはキシロースもしくはそれらの誘導体または前駆体、またはマンノースまたはキシロースの代謝に直接または間接に関与する前記酵素タンパク質の基質である、
ことを特徴とする方法；
ただし、前記化合物は、前記酵素がマンノース−６−ホスフェートイソメラーゼである場合、マンノースではない；
（２）少なくとも１種の化合物を含む培地上または中で培養された植物細胞の集団から、形質転換の結果として代謝的優位性を有する細胞を同定または選択するにあたり、
ｉ）前記細胞を、キシロイソメラーゼ、マンノース−１−フォスフェートイソメラーゼ、ホスホ糖−ムターゼ、およびホスファターゼからなる群より選択される前記化合物の代謝に関与する酵素タンパク質をコードする領域をいずれかが含むヌクレオチド配列または共挿入ヌクレオチド配列で、形質転換する、かつ
ii）前記化合物がマンノースまたはキシロースもしくはそれらの誘導体または前駆体、またはマンノースまたはキシロースの代謝に直接または間接に関与する前記酵素タンパク質の基質である、
ことを特徴とする方法；
（３）化合物が非形質転換細胞中で不活性であるか、または形質転換細胞中よりも非形質転換細胞中で活性が低いか、または非形質転換細胞よりも形質転換細胞に対して毒性が低いものであり、ヌクレオチド配列の発現または転写が前記化合物の細胞への利用を増加させるか、または細胞中に内因的に存在する酵素の活性を高めるものであり、かくして形質転換細胞中の酵素活性が非形質転換細胞中の酵素活性よりも大となるものであるか、またはヌクレオチド配列の発現または転写が、形質転換細胞中の前記化合物の代謝阻害または合成阻害を導くものであり、それにより形質転換細胞が非形質転換細胞から同定できる、（１）または（２）に記載の方法；
（４）細胞が、外因性プロモーターにより制御され得る構造遺伝子の中または近傍にあるＤＮＡ配列と相同的組換が可能な外因性プロモーターをコードしているヌクレオチド配列で形質転換されている、（１）〜（３）の何れかに記載の方法；
（５）該細胞が、該化合物に感受性の細菌によって形質転換されたものである、（１）〜（４）のいずれかに記載の方法；
（６）ホスホ糖−イソメラーゼ、ホスホ糖―ムターゼ、ホスファターゼおよび糖エピメラーゼからなる群より選択される酵素タンパク質をコードする領域を含むヌクレオチド配列であって、該酵素タンパク質が、化合物マンノースまたはキシロースもしくはそれらの誘導体または前駆体、またはマンノースまたはキシロースの代謝に直接または間接に関与する酵素タンパク質の基質の代謝に関与し、ここで当該コード領域が、配列が挿入された植物細胞によって好まれるコドンが使用され、当該植物細胞において該修飾されたＤＮＡの発現が、該配列のタンパク質コード成分が内因性である該植物細胞中の非修飾ＤＮＡの発現によって得られるタンパク質と実質的に類似のタンパク質を産生するように修飾されているＤＮＡを含む、ヌクレオチド配列；
（７）酵素がキシロイソメラーゼおよびマンノース−ホスフェートイソメラーゼ；ホスホマンノムターゼ；マンノースエピメラーゼ；マンノースホスファターゼ；およびマンノースパーミアーゼからなる群から選択される、（６）に記載のヌクレオチド配列；
（８）完全増強３５Ｓプロモーター、大腸菌ホスホマンノースイソメラーゼのコード領域およびＣaＭＶターミネーターを含むフラグメントを含む、（６）または（７）に記載のヌクレオチド配列；
（９）（６）〜（８）のいずれかに記載のヌクレオチド配列を含むトランスジェニック植物；
（１０）マンノースまたはキシロースまたはそれらの誘導体または前駆体、またはマンノースまたはキシロースの代謝に直接または間接に関与する酵素タンパク質の基質の代謝に関与する、ホスホ糖−イソメラーゼ、ホスホ糖−ムターゼ、ホスファターゼ、および糖−エピメラーゼからなる群より選択される酵素タンパク質をコードする領域を、いずれかが含むヌクレオチド配列または共挿入ヌクレオチド配列を含む、全植物およびそのような植物または植物細胞から由来する後代または種子であってもよい、形質転換植物細胞；
ただし、該化合物は、該タンパク質がマンノース６ホスフェートイソメラーゼであるとき、マンノースではない；
（１１）化合物マンノースまたはキシロースまたはそれらの誘導体または前駆体、またはマンノースまたはキシロースの代謝に直接または間接に関与する酵素タンパク質の基質の代謝に関与する、ホスホ糖−イソメラーゼ、ホスホ糖−ムターゼ、ホスファターゼ、および糖−エピメラーゼからなる群より選択される酵素タンパク質をコードする領域を、いずれかが含むヌクレオチド配列または共挿入ヌクレオチド配列を含む、全植物およびそのような植物または植物細胞から由来する後代または種子であってもよい、形質転換植物細胞；
（１２）酵素がキシロースイソメラーゼおよびマンノース−１−ホスフェートイソメラーゼ；ホスホマンノムターゼ；マンノースエピメラーゼ；マンノースホスファターゼおよびマンノースパーミアーゼからなる群から選択される、全植物または当該植物由来の後代または種子であってもよい、（１１）に記載の形質転換植物細胞；
（１３）化合物がマンノースであり、ヌクレオチドまたは共挿入ヌクレオチド配列が大腸菌マンノース−６−ホスフェートイソメラーゼをコードする、（１０）〜（１２）の何れかに記載の全植物または当該植物由来の後代または種子であってもよい、形質転換植物細胞；
（１４）ヌクレオチド配列の少なくとも１つが、当該配列が挿入された植物によって好まれるコドンが使用されて、当該配列のタンパク質コード成分が内因性である植物中において非修飾ＤＮＡの発現で得られたのと実質的に類似しているタンパク質を産生するように修飾されたＤＮＡを含む、（１０）〜（１３）の何れかに記載の、全植物または当該植物由来の後代または種子であってもよい、形質転換植物細胞；
（１５）毒素、抗生物質および除草剤からなる群より選択される少なくとも１つに対する耐性をコードするさらなるヌクレオチド配列であって、その発現が形質転換細胞を耐性とするものを含む、（１０）〜（１４）の何れかに記載の、全植物または当該植物由来の後代または種子であってもよい、形質転換植物細胞；
（１６）当該植物細胞が、果実、圃場作物、小穀粒禾穀類、および野菜からなる群より選択される植物由来である、（１０）〜（１５）の何れかに記載の、全植物または当該植物由来の子孫または種子であってもよい、形質転換植物細胞；
（１７）当該植物細胞が、トマト、マンゴ、モモ、リンゴ、ナシ、イチゴ、バナナ、およびメロンからなる群より選択される植物由来である、（１６）に記載の、全植物または当該植物由来の後代または種子であってもよい、形質転換植物細胞；
（１８）当該植物細胞が、キャノーラ、ヒマワリ、タバコ、シュガービート、トウモロコシおよびワタからなる群より選択される植物由来である、（１６）記載の、全植物または当該植物由来の後代または種子であってもよい、形質転換植物細胞；
（１９）当該植物細胞が、コムギ、オオムギ、およびイネからなる群より選択される植物由来である、（１６）記載の、全植物または当該植物由来の後代または種子であってもよい、形質転換植物細胞；
（２０）当該植物細胞が、ジャガイモ、ニンジン、レタス、キャベツ、およびタマネギからなる群より選択される植物由来である、（１６）に記載の、全植物または当該植物由来の子孫または種子であってもよい、形質転換植物細胞。
上記の不利点は、非形質転換細胞に障害を与えまたは死滅することなく、かつ抗生物質または除草剤耐性遺伝子の共挿入なく集団から遺伝子的形質転換細胞を同定および単離することを可能にした本発明の方法(「陽性選択」または組み合わさった「陽性／陰性」選択と命名)により、少なくともかなりの程度まで征服できる。抗生物質または除草剤耐性遺伝子の必要性を除いたという事実に加えて、本発明の陽性選択法は伝統的な陰性選択よりしばしば遥かに優れており、陽性および陰性選択の組み合わせは陰性選択単独使用で得られるより高くはなくても、同等なトランスジェニック新芽の選択頻度が得られる。更に、陽性選択の使用は、１個の遺伝子がレポーター遺伝子および選択遺伝子として使用され得るため、ベクター構築物の単純化をもたらし、より安定な構築およびレポーターの発現と選択遺伝子の間の１００％の相関関係という利点を提供する。
選択化合物が、特定の基質上において挿入遺伝子の発現によりもたらされた遺伝子生産物の作用の結果産生され得るため、陽性選択は、タイミングに関する上記の問題を排除し得る。従って、選択化合物は選択遺伝子の発現の結果蓄積され得、充分な量の選択化合物が産生された場合、選択効果が現れる。
本発明により、少なくとも１種の化合物を含む培地上または中で培養された真核細胞集団から、形質転換の結果代謝優勢を有する細胞を同定または選択する方法を提供し、それは：
ｉ）前記細胞が(ａ)化合物の代謝に含まれるタンパク質をコードするか、および／または(ｂ)当該タンパク質をコードする遺伝子の活性を制御する領域を含むヌクレオチド配列または共挿入ヌクレオチド配列で形質転換されていること、および
ii）前記化合物がマンノースもしくはキシロースまたはそれらの誘導体または前駆体、または前記タンパク質の基質であるか、または形質転換細胞によりそのような基質に代謝される(ただし前記化合物は前記タンパク質がマンノース−６−リン酸イソメラーゼである場合、マンノースではない。)。
本発明は、更に少なくとも１種の化合物を含む培地上または中で培養された真核細胞集団から、形質転換の結果代謝優勢を有する細胞を同定または選択する方法を提供し、それは：
ｉ）前記細胞が(ａ)化合物の代謝に関与するタンパク質をコードするか、および／または(ｂ)タンパク質をコードする遺伝子の活性を制御する領域を含むヌクレオチド配列または共挿入ヌクレオチド配列で形質転換されていること、およびii）前記化合物の細胞に対する毒性を低下させる薬剤を培地に添加する。
好ましくは、毒性を減少させる薬剤を培地に添加する場合、化合物はマンノースであり、ヌクレオチド配列または共挿入ヌクレオチド配列はマンノース−６−リン酸イソメラーゼをコードする。
「代謝優勢」を有する細胞は、とりわけ、劣勢の細胞より早く成育することができ、および／または劣勢細胞が利用できない(栄養素前駆体等の)基質を有利に利用でき、および／または劣勢細胞に毒性またはそうでなければ成育阻害する基質を無毒化できる。
「化合物の代謝に関与する」タンパク質は、排他的ではないが典型的には、化合物またはその誘導体または前駆体の産生または利用を、直接または間接的に担い得る酵素である。タンパク質が化合物に結合し、化合物を細胞または組織または生物内の他の部位に移し、そうでなければ化合物を隔離し、それによりその局所能力を変えるのであれば、化合物の代謝にまた関与し得る。
「タンパク質をコードする遺伝子の作用を制御する」ヌクレオチド配列の領域は、プロモーターにより、またはそれによりプロモーター活性を有することにより、およびその近接部位内または近くに挿入することにより内因性遺伝子の発現のレベルを変え得る。「近く」は、１０,０００kbまでを意味する。別法として、間接制御は、ＲＮＡポリメラーゼの結合をタンパク質をコードする構造遺伝子のプロモーターに変え、または相補的結合を構造遺伝子の少なくとも一部分のヌクレオチド配列に変え、従って典型的には細胞中のタンパク質の量を減少することに起因し得る。
マンノースまたはキシロースの「誘導体」は、直接または間接的にマンノースまたはキシロースの代謝に関与する任意のタンパク質に利用され、結合し、基質になりまたは生産物であることができる任意の化合物を意味する。マンノースの場合、このような誘導体は、エピメラーゼ作用の対象となり、それによりマンノースまたは誘導体または前駆体が産生されるグルコースまたはガラクトースのような炭水化物を含むことは認められよう。「誘導体」は、残基が共有またはイオン結合している１個またはそれ以上の水酸基を有するマンノースまたはキシロースをまた含む。このような結合残基は、エステル、エーテル、アミノ基、アミド基、リン酸基、スルフェート基、カルボキシル基、カルボキシ−アルキル基およびそれらの組み合わせを含む。もし誘導体化がマンノースまたはキシロースを産生するためにこのような方法での除去を担うのであれば、マンノースまたはキシロース誘導体は、マンノースまたはキシロース前駆体もまた含み得る。
本発明の明細書における「細胞」の語はプロトプラストを含み、「細胞集団」は組織、器官またはそれらの一部、基質中または上の個々の細胞集団または全生物、例えば植物を含む。
本発明は、本発明の方法を使用して選択された形質転換細胞および植物細胞のような形質転換細胞およびこのような細胞由来の植物、子孫または種子を含む。本発明の方法により選択し得る植物は：トマト、マンゴー、桃、リンゴ、ナシ、イチゴ、バナナおよびメロンを含む果実；キャノーラ、ヒマワリ、タバコ、サトウダイコンならびに小麦、大麦および米のような小穀粒穀物、トウモロコシおよび綿ならびにジャガイモ、ニンジン、レタス、キャベツおよびタマネギのような野菜を含む農地作物を含む。
特に好ましい植物はサトウダイコンおよびトウモロコシである。
イン・ビボでの本陽性選択法の使用は、形質転換細胞の選択を、隣接する非形質転換細胞を直接傷付けずに行うため、例えば全植物または植物部分(ここで、植物または部分は形質転換および非形質転換細胞を含むものである)上で行った形質転換に関して、特に適切である。このように、形質転換細胞は非形質転換細胞と比較して選択「優勢」を有する(例えば、新芽形成能力)が、抗生物質または除草剤を使用した陰性選択の場合のように、非形質転換細胞は傷害または死滅という意味で深刻な損失を被らない。
形質転換細胞が有する「選択優勢」は、形質転換細胞を、簡単な視覚的手段により、すなわちマーカー遺伝子の存在を測定するために別のアッセイーを使用する必要なく同定できるようにする差異または利点である。
細胞集団は、不活性であり得、直接または間接的に形質転換細胞中で活性化される少なくとも１種の化合物を含む培地上または中で培養し得、本化合物は、形質転換細胞を細胞集団から選択可能にするような選択優勢を提供するように、非形質転換細胞中で不活性または形質転換細胞中より非形質転換細胞中でのほうが活性が少ない。
細胞集団は、ヌクレオチド配列の発現または転写により形質転換細胞中で利用されるようになる化合物を含む培地上または中でまた栽培し得、本化合物は、形質転換細胞に選択優勢を提供するように、非形質転換細胞中で利用されず、または非形質転換細胞中であまり利用されない。
ヌクレオチド配列によりコードされるポリペプチドが形質転換細胞中で不活性化合物を直接活性化する場合、非形質転換細胞は、典型的には酵素であり得る上記ポリペプチドを一定量内因性に含むかまたは産生し得る。このような場合、「不活性化合物」は、化合物または栄養素が単に実質的に形質転換細胞中より、非形質転換細胞中で活性が低いだけで充分であり得るため、非形質転換細胞中で完全に不活性である必要はない。言い換えれば、形質転換細胞と非形質転換細胞の間の最初は不活性な化合物の活性化の量的差異が、選択の目的で充分であり得る。このような場合、天然酵素と競合する阻害剤または基質を、細胞に加え得る。特に好適には、阻害剤は天然酵素により活性化され、天然酵素が実質的に完全に阻害されるレベルまでの活性化阻害剤の産生の自己触媒をもたらす。
不活性化合物の「活性化」が、形質転換細胞による化合物の選択的取り込みを含み、非形質転換細胞による取り込みは、不可能であるか、少ない程度で行われるように、化合物の細胞膜の通過を可能にし、形質転換細胞内へ挿入させ、または他の(細胞小器官)膜を通過させるパーミアーゼまたは他の輸送因子をコードし得る共挿入ヌクレオチド配列で、細胞を形質転換し得る。細胞内への化合物の促進された取り込みの変わりに、共挿入ヌクレオチド配列は、その産生を、不活性化合物が位置する部位、例えば細胞質膜の外側または液胞中または小胞体へ代わりに向ける。
２種のヌクレオチドが細胞内へ共挿入される場所へ、細胞内の１つのヌクレオチド配列の存在が他の配列の細胞内の存在を示唆するかまたは存在の可能性を増大させる方法で所望により各々組み合わせてまたはそうでなければ一緒に挿入し得る。２個のヌクレオチド配列は、したがって、必須ではないが、典型的には同じ遺伝子構築物の一部であり、同じベクターを経由して挿入し得る。
挿入ヌクレオチド配列が形質転換細胞内で発現されることが必要であるため、２種のヌクレオチド配列を含む遺伝子構築物は、典型的にはヌクレオチド配列の発現を可能にする制御配列、例えば既知のプロモーターおよび転写ターミネーターを一般的に含む。したがって、共挿入ヌクレオチド配列は、一般的には構造的または制御可能であり得るプロモーターと関連する。
本明細書に記載の方法は、２種のヌクレオチド配列が独立して挿入された場合も使用し得る。これは、例えば両方の遺伝子の取り込みのために同じ細菌を使用して、所望のヌクレオチド配列の相対的に多い数のコピーを細胞に取り込ませて行い得、それにより共挿入ヌクレオチド配列の発現を示す細胞がまた所望のヌクレオチド配列を含有し、発現する確立が相対的に高くなる。同じ細胞内での遺伝子の共発現をもたらす２個またはそれ以上の遺伝子の個々の挿入は、一般的に低い確実性が予期され、陽性選択法により得られる改善された選択頻度は、したがってこのような系で特に有利であると予期される。
選択の目的で使用される化合物は、加えて、陽性および陰性作用の両方を有し得る。例えば非常に高濃度のマンノースは殆どの植物にとって有毒であるが、マンノース代謝酵素を有している細胞においては陰性作用はなくなり、細胞はマンノースを炭水化物源として使用できるようになるという利点を更に得る。この場合、１個の化合物および１個の遺伝子が、共に複合陽性および陰性選択系を提供するが、このような系は、形質転換細胞内の化合物の陰性作用の阻害および化合物の陽性作用の明示を担う２個またはそれ以上の遺伝子と共に使用してまた確立し得る。
本方法の更なる態様において、ヌクレオチド配列の発現または転写が、形質転換細胞中における細胞集団に供給された化合物の代謝の阻止または化合物の合成の阻止をもたらし、それにより形質転換細胞が、非形質転換細胞から同定または選択できる。
本方法の更に別の態様において、形質転換細胞は、陽性選択および陰性選択を組み合わせて選択し得、形質転換細胞中のヌクレオチド配列は、毒素、抗生物質および除草剤からなる群から選択された少なくとも１つの要素に対する耐性をコードするヌクレオチド配列と共挿入され、細胞を培養する培地中または培地上に形質転換細胞が耐性を示す、毒素、抗生物質および除草剤からなる群から選択された少なくとも１つの要素を含有する。ヌクレオチド配列が、少なくとも２種の異なった選択遺伝子と共挿入されるのが好ましい。
化合物がマンノースまたはキシロースであるのが好ましい。上に示唆したように、化合物は、しかしながらマンノース誘導体、例えばマンノース−６−リン酸もしくはキシロースリン酸のようなキシロース誘導体もしくはマンノースまたはキシロース前駆体であり得る。
細胞は、その中に包含されるのが好ましい任意のヌクレオチド配列で形質転換し得る。このようなヌクレオチドは、ウィルス、真菌、細菌または線虫耐性を提供する遺伝子をコードし得る。
細胞は、化合物による形質転換細胞の選択が細菌による形質転換細胞の形質転換後感染の危険性を減少させる利点を有するように、化合物に感受性のアグロバクター種のような細菌により形質転換し得る。細胞を、電気泳動、顕微注射法、微小噴出ガン(micro-projectile gun)の使用ならびにＲiおよびＴiプラスミドでの形質転換を含む任意の好適な既知の手段で形質転換し得ることは認められよう。形質転換細胞は、好適な場合、組換ＤＮＡが安定にゲノム内へ取り込まれている全植物に再生し得る。
タンパク質は、好ましくはマンノースまたはキシロース代謝に関与する酵素である。このような酵素は、キシロイソメラーゼおよびマンノース−６−リン酸イソメラーゼおよびマンノース−１−リン酸−イソメラーゼのようなホスホマンノイソメラーゼ；炭水化物をマンノースへまたはマンノースをグルコースまたはガラクトースのような炭水化物に転換するようなマンノースエピメラーゼ；マンノース−６−ホスファターゼーゼおよびマンノース−１−ホスファターゼのようなホスファターゼおよびマンノースまたは誘導体または前駆体の細胞内への輸送に関与するパーミアーゼを含む。
化合物の細胞への毒性を軽減する薬剤は、典型的にはメチル−Ｏ−グルコースまたはフロリジン(phloridzin)のようなグルコース誘導体である。
以下に本発明の実施に用いた方法につき説明するが、当業者は、本発明の実施にあたり、これらの方法に拘泥する必要はないことを認識することができる。
大腸菌ホスホマンノースイソメラーゼコード配列含有バイナリーｐ(ＢＫＬ４−マンノース)の構築
大腸菌ホスホマンノースイソメラーゼ(EC5.3.2.8)遺伝子は、プラスミドｐＧＳ６３(マイルス,Ｈら、Gene３２、４１〜４８頁(１９８４))(図１)由来であり、構築物はｐＢＲ３２２由来であり、その中の独自のＰstＩおよびＨindIII部位の間の領域が、ホスホマンノースイソメラーゼの構造遺伝子(マンＡ)およびフマラーゼ(フムＡ(fum A))の隣接遺伝子のフラグメントを保持する大腸菌染色体の一部で置き換えられている。ｐＧＳ６３は、したがって、β−ラクタマーゼ遺伝子の部分を欠失しており、テトラサイクリン上で選択される。
完全なＰstＩ/ＨindIII染色体フラグメントおよびｐＢＲ３２２の３５７bpセクションを含むＰstＩ/ＢamＨＩフラグメント(２４６６bp)を、ｐＵＣ１８の多重クローニング部位にライゲーションし、ｐＤＯ１８を形成した(図１参照)。
ｐＤＯ１８をＨindIIIで消化させ、残った休息３'末端をクレノーポリメラーゼを使用して満たす。ＨindIII部位(ＨindIII*)で満たされた開放ＤＯ１８プラスミド(図１参照)を、ＢcIIで消化させ、ホスホマンノースイソメラーゼコード領域を含む１２１８bpＢcII−ＨindIII*フラグメントを、最初にＳmaＩおよび次いでＢamＨＩで消化させたプラスミド内へクローン化する。得られるプラスミドをp(ＥＰＬ−マンノース)と呼ぶ。
ｐＥＰＬは、ＣＡＴ遺伝子がＰstＩにより除去されているＣaＭＶＣＮ(フロムら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA８２、５８２４頁(１９８５)；フロムら、Nature３１９、７１９頁(１９８６))から構築した。小リンカー(リンカー：ＰstＩ−ＢamＨＩ−ＢaII−ＰstＩ)を本プラスミドＰstＩ部位に挿入し、pＬise(ｐＬ)と呼ぶプラスミドを得る。ｐＬは、ＨincIIおよびＢgIIIで消化し、得られる３５ＳプロモーターおよびＮＯＳターミネーターを含むフラグメントを、ＥcoＲＶおよびＢgIIIで消化した他のｐＬプラスミドにクローン化する。ＥcoＲＶおよびＨincIIは、平滑末端部位である。得られる構築物をpEnhanced-Lise(ｐＥＬ)と呼ぶ。ｐＥＬは、変異体３５Ｓプロモーターをプロモーターの２５０bp上流の縦列複写と共に含むという点で、本質的にｐＣaＭＶＣＮと異なる。変異体３５Ｓプロモーターは天然３５Ｓプロモーター(ケーら、Science２３６、１２９９〜１３０２頁(１９８７))の約１０倍高い転写活性を有する。ｐＥＬをＰstＩおよびＢgIIIで消化し、それによりＮＯＳターミネーターを除去し、ＣaＭＶターミネーター(ＤＷ２t)を代わりに挿入する。最後に、リンカー(ＰstＩ−ＢamＨＩ−ＳmaＩ−ＳacＩ−ＳaII−ＳphＩ)を促進された３５ＳプロモーターおよびＣaＭＶターミネーターの間に位置するＰstＩ部位に挿入する。本プラスミドをｐＥＰＬと呼ぶ(図２参照)。
p(ＥＰＬ−マンノース)を、完全促進３５Ｓプロモーター、大腸菌ホスホマンノースイソメラーゼおよびＣaＭＶターミネーターコード領域を含むフラグメントを単離するためにＨindIIIで消化した。単離フラグメントをバイナリーベクターｐＢＫＬ４のＨindIII部位にクローン化する(図４)。得られるプラスミドをp(ＢＫＬ−マンノース)と名付ける。ｐＢＫＬ４中のＨindIII部位をカナマイシン耐性遺伝子およびβ−グルクロニダーゼ(ＧＵＳ)遺伝子の間に位置させる(図３)。マンノースキメラ遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子(ＮＰＴII)およびＧＵＳ遺伝子は、各々プロモーターおよびターミネーターを有する。図４は、プラスミドｐＢＬＫ４のＧＵＳおよびＮＰＴII遺伝子の間に挿入されたキメラホスホマンノースイソメラーゼ遺伝子を含むp(ＢＫＬ−マンノース)構築物を示す。
構築物p(ＢＫＬ−マンノース)を大腸菌から単離し、脱腕(dearmed)ヘルパープラスミドpＡＬ４４０４(ヘーケマら、Nature３０３、１７９〜１８０頁(１９８３)；オームスら、Plasmid７、１５〜２９頁(１９８２))から成るアグロバクテリウム・ツメファシエンス(Agrobacterium tumefaciens)株ＬＢＡ４４０４内に、凍結融解法(ホルスターら、Mol.Gen.Genet１６３、１８１〜１８７(１９７８))により形質転換する。
ホスホマンノースイソメラーゼをコードする構造遺伝子(マンＡ)の配列は、マイルスおよびゲストらにより公開されている(Gene３２、４１〜４８(１９８４))。
無菌保存培養
ソラナム・ツベロサム(Solanum tuberosum)「サツルナ(Saturna)」「ビンチェ(Bintje)」または「ディアネラ(Dianella)」の新芽培養を、２μＭチオ硫酸銀を添加したＬＳ基質(下記参照)上に温度は２５℃で、培養を１６時間明／８時間暗のサイクルに付してリンスマイアーおよびスコーグ(Physiol.Plant.、１８：１００〜１２７(１９６５))に記載のように維持する。保存培養を２０〜４０日後副次培養する。葉は新芽から除去し、それぞれ１個の節を有するように節セグメント(約０.８cm)に切断した。
ジャガイモ組織の接種
共培養皿はＬＳ基質(シュークロース３０ｇ／ｌ)、寒天(８ｇ／ｌ)、２,４−ジクロロフェノキシ酢酸(２.０mg／ｌ)およびトランス−ゼアチン(０.５mg／ｌ)を含む。
約４０日令新芽培養由来の新芽(高さ約５〜６cm)を節間セグメント(約０.８cm)に切断する。ジャガイモ細胞内に包含することを意図した遺伝子を含むバイナリーベクターを含むように形質転換されたアグロバクテリウム・ツメファシエンス含有液体ＬＳ−基質(ＬＳ−培地)内にセグメントを置く。このような遺伝子は、例えばβ−グルクロニダーゼ(ＧＵＳ)、抗生物質カナマイシンに対する耐性を提供するＮＰＴII遺伝子をコードするものおよび／またはマンノース代謝に関与するタンパク質、例えばマンノース−６−リン酸イソメラーゼ、マンノースエピメラーゼ、ホスホマンノースムターゼ等(下記参照)をコードする遺伝子を含む。 アグロバクターは、好適な抗生物質(アグロバクター株の耐性遺伝子に対応)を含むＹＭＢ−基質(リン酸水素二カリウム(三水和物)(０.６６ｇ／ｌ)；硫酸マグネシウム(七水和物)(０.２０ｇ／ｌ)；塩化ナトリウム(０.１０ｇ／ｌ)；マンニトール(１０.０ｇ／ｌ)；および酵母抽出物０.４０ｇ／ｌ)中で一晩培養し、６６０nmの光学密度(ＯＤ−６６０)を約０.８にする。懸濁液を次いで遠心し、ＯＤ−６６０のを０.５にするために細胞をＬＳ−培地に再懸濁する。
上記の節間セグメントを、次いで再懸濁アグロバクターの懸濁液中で３０分インキュベーションし、次いで滅菌濾紙にブロットすることにより、セグメントから過剰の細菌を除去する。
新芽セグメントおよびアグロバクターの共培養
新芽セグメントを細菌と７２時間、白薄葉紙で覆ったペトリ皿中のＬＳ−基質(上記で定義の通り)中の濾紙上で共培養する。本基質を以後「共培養基質」と呼ぶ。基質およびセグメントを滅菌濾紙で覆い、ペトリ皿を２５℃に置き、１６時間明／８時間暗のサイクルに付す。
洗浄方法
共培養４８時間後、新芽セグメントを８００mg／ｌカルベニシリン添加ＬＳ−培地に移す。このように移したセグメントを、次いで穏やかに振り、付着アグロバクターを除去または破壊する。
形質転換組織の選択
このように洗浄したセグメントを、次いでトランス−ゼアチンの濃度が１mg／ｌである以外上記と同様であるＬＳ−基質に移し、基質にジベレリン酸(０.１mg／ｌ)およびカルベニシリン(８００mg／ｌ)および所望により硫酸カナマイシン(５０mg／ｌ)および／またはマンノース(０〜２０ｇ／ｌ)および／またはシュークロース(０〜２０ｇ／ｌ)を添加する。本基質を以後「選択／再生基質」と呼ぶ。
本セグメントを新鮮基質上で２週間間隔でまたは下記のように副次培養する。２〜４週間内に新芽がセグメントから発生し、新しい新芽の形成を約３〜４カ月続ける。
再生新芽の発根
再生新芽をカルベニシリン(５００mg／ｌ)を加えたＬＳ−基質から成る発根基質に移す。
再生新芽の土壌への植え変え
新規発根再生新芽(植物)(高さ約２〜３cm)を発根基質から土壌に植え変え、１６時間明／８時間暗サイクルおよび２００〜４００μＥ／sqm／秒の成育室に置く。植物が十分確立された場合、それらを温室に移し、そこでそれらを塊茎が発育し、植物の上部が老境を示すまで成育させる。
形質転換体の遺伝的同定の確認
再生新芽のトランスジェニック遺伝子型を：
(ａ)ラッドケら(Theor.Appl.Genet.７５,６８５〜６９４(１９８８))記載のＮＰＴII測定を行う；または
(ｂ)ホダルら(Plant.Sci.８７,１１５〜１２２(１９９２))に従った共挿入β−グルクロニダーゼ遺伝子による酵素発現におけるＧＵＳ測定を行う；または
(ｃ)マンノース代謝に関与する酵素、例えばホスホマンノースイソメラーゼをコードする挿入遺伝子のmＲＮＡの発現を測定するまたは酵素の活性を測定する:ことにより確認する。
以下に実施例を示して本発明を説明するが、実施例は本発明を限定するものと解してはならない。
再生植物を、新芽セグメントを細菌と共培養せず、その上で重要な洗浄工程を省く以外、上記のように産生する。実験開始４０日目まで再生新芽の数を測定する。表１は、アグロバクターで形質転換していないジャガイモ茎セグメント由来の新芽再生のマンノースによる阻害を示す。表１から、マンノースが有効にそのような新芽の再生を阻害し、シュークロースがそのような再生を促進することを見ることができる。一般にマンノースは、ほとんどの植物種において炭水化物源として使用されない。マンノースを植物に加えた場合、代謝され、マンノース−６−リン酸が蓄積される。マンノース−６−リン酸は、マンノース−６−リン酸イソメラーゼによりフルクトース−６−リン酸に変換され、その変換される量はイソメラーゼの活性に依存する。このようなフルクトース−６−リン酸は植物により利用されるが、実際高濃度のマンノースは植物にとって(代替炭水化物源が利用可能であってもなくても)有毒である。したがって、表１から見られるように、新芽形成は、シュークロースの利用能に拘わりなく、シュークロースが高濃度で存在している場合でさえ、マンノース濃度が５〜１０ｇ／ｌの場合完全に阻害される。
Figure 0004426376
再生植物を上記のように産生する。新芽セグメントと共インキュベーションするアグロバクターを、細菌がＧＵＳおよびマンノース−６−リン酸イソメラーゼコード遺伝子を含むベクターを有するように上記のようにして得られた構築物p(ＢＫＬ−マンノース)で形質転換する。
トランスジェニック(ＧＵＳ＋)新芽を、マンノースの新芽に対する毒性を減少させる薬剤(メチル−３−Ｏ−グルコース)の存在下でマンノース代謝能力を基本にして選択する。ＧＵＳ＋新芽を約５ｇ／ｌの濃度のマンノースの存在下での成育の能力を基本にして選択する。
新芽セグメントの形質転換に使用したアグロバクターがマンノース−６−リン酸イソメラーゼコード遺伝子を欠く以外p(ＢＫＬ−マンノース)と同様のベクターを有するものである対照実験をまた行った。再生形質転換新芽を５ｇ／ｌマンノースおよび２０ｇ／ｌシュークロース存在下で成育させた場合、ＧＵＳ＋形質転換体は得られなかった。
新芽セグメントの形質転換に使用するアグロバクターがマンノース−６−リン酸イソメラーゼコード遺伝子を欠く以外p(ＢＫＬ−マンノース)と同様のベクターを有するものである更なる実験を行う。このようなベクターは、形質転換された細胞にカナマイシン耐性を与えるＮＰＴIIコード遺伝子を含む。したがって、ＧＵＳ＋形質転換体は、５０mg／ｌの濃度で存在するカナマイシンに対するそれらの耐性を基本にして選択する。この後者の選択において、選択された細胞の実施例２より低い割合がＧＵＳ＋である。
アグロバクターをp(ＢＫＬ−マンノース)で形質転換し、ＧＵＳ＋形質転換体を、そのカナマイシン(５０mg／ml)上での成育の能力を基本にして選択する以外、実施例３を繰り返す。この場合、選択された新芽の実施例３より低い割合がＧＵＳ＋である。
アグロバクターの接種および共培養工程を除く以外ＰＣＴ／９２／００２５２の実施例１３に記載のような標準葉ディスク法をタバコで行う。ベンジルアデニン(１mg／ｌ)をサイトキニンとして使用し、炭水化物含量を下記のようにする。各々の葉ディスクからの再生新芽の数を２１日後に記録する。
表２は、Ｄ−キシロースが、シュークロースが存在する場合、新芽再生を阻害しないこと、加えてＤ−キシロースは炭水化物源として使用されないことを示す。Ｄ−キシルロースは新芽再生の間の良好な炭水化物源である。
Figure 0004426376
キシロースはキシロースイソメラーゼによりキシルロースに変換できる。したがって、機能的キシロースイソメラーゼ遺伝子および好適なプロモータおよびターミネーターの制御下にある更なる構造遺伝子を、植物、その部分またはそれらの細胞に挿入し、形質転換植物、その部分またはそれらの細胞を、炭水化物源としてのキシロース代謝の能力を基本にして選択する。
外植体は、選択／再生基質にカナマイシンおよびカルベニシリンを添加しない以外、上記の「形質転換組織の選択」に記載のように産生して処理し、植物を形質転換しない。したがって、副次培養は、下記に示唆する量でキシロースを添加する選択／再生基質へ、共培養基質から外植体を移された場合のみである。再生新芽の数は１２週間後に記録する。
Figure 0004426376
表３は、Ｄ−キシロースが(Ｄ−マンノースと比較して)、シュークロースが存在する場合、新芽再生の弱い阻害剤であり、更にＤ−キシロースはキシロース代謝酵素またはタンパク質の点では非形質転換である植物において炭水化物源として作用しないことを示す。更に、Ｄ−キシルロース(５ｇ／ｌ)を、シュークロース非存在下で基質に加え、９週間後外植体当たり２.２新芽の再生が可能であった。
選択／再生基質にメチル−３−Ｏ−グルコース(ＭＯＧ)を表４で示唆する濃度で加える以外、実施例５を繰り返す。生存外植体の割合を８週間後に記録する。
表４は、ＭＯＧによる共処理は、感受性植物組織におけるマンノースの毒性効果を阻害することを示す。炭水化物源として作用する化合物にとって最適の濃度でマンノースは毒性であるため、ＭＯＧの添加は、マンノースの形での最適炭水化物源を基質に添加することを可能にする。これは、他の炭水化物源非存在下での陽性選択剤としてのマンノースの利用を可能にする。
Figure 0004426376
再生／選択基質がマンノース(１５ｇ／ｌ)および下記表５に示唆する濃度のメチル−３−Ｏ−グルコースを含み、シュークロースを含まない以外、実施例７を繰り返す。形質転換植物材料はマンノース−６−リン酸イソメラーゼ遺伝子についてトランスジェニックである。２１日後、選択した新芽を回収する。全ての回収した新芽で、共挿入β−グルクロニダーゼ遺伝子の発現を測定し、外植体当たりのトランスジェニックβ−グルクロニダーゼ発現(ＧＵＳ＋)新芽の全数(２回の収穫で)を、選択新芽の全数中のβ−グルクロニダーゼ発現(ＧＵＳ＋)新芽の関数として計算する(表５)。
表５は、マンノースがメチル−３−Ｏ−グルコースと共に添加された場合、トランスジェニック新芽の選択は、他の炭水化物源非存在下で、マンノースの高い濃度でさえ可能であることを示す。
Figure 0004426376
ＭＯＧをフロリジンに変える以外、実施例８を繰り返す。表６は、マンノースをフロリジンと共に加えた場合、１００％トランスジェニック新芽の選択が、他の炭水化物シュークロース非存在下で高濃度のマンノースで可能であることを示す。炭水化物輸送阻害剤の添加により、いかに交差摂食およびエスケーパーの産生を最小にできるかという例である。
Figure 0004426376
表７は、マンノース以外の化合が、とりわけ大腸菌由来のマンノース−６−リン酸イソメラーゼ遺伝子を含むトランスジェニック植物において選択薬剤として使用し得ることを示唆する。
Figure 0004426376
葉柄を含む子葉を外植体として使用しているＰＣＴ特許出願場番号ＰＣＴ／ＤＫ９２／００１０８に記載のいわゆるコット−ペット(cot-pet)法により、サトウダイコンを形質転換する。苗木は、４〜７週間１２℃で、１６時間昼／８時間夜の体制で発芽および成育させた種子由来である。子葉は、節の下２〜３mmを切断し、離し(tawn apart)、暗い中または明るい中で、キシロース存在下または非存在下に培養する。表８は、光の存在下ではサトウダイコンはキシロースを炭水化物源として使用するが、暗い中では使用しないことを示し、とりわけキシロースイソメラーゼ遺伝子に対してトランスジェニックであるサトウダイコンのキシロース基本陽性選択は、暗い中で行うべきであることを示唆する。
Figure 0004426376
とりわけマンノース−６−リン酸イソメラーゼ遺伝子についトランスジェニックな外植体を産生し、選択／再生基質に、表９に示唆するようにマンノースおよびシュークロースを添加する。再生新芽の数を１１週間後に記録する。表９は、メチル−３−Ｏ−グルコース含有基質上での再生新芽の数を、マンノースおよびメチル−３−Ｏ−グルコース非存在下の基質上の新芽再生の数に対するパーセントとして示す。
Figure 0004426376
シュークロース(１０ｇ／ｌ)含有、マンノース非含有およびメチル−３−Ｏ−グルコース非含有基質上での新芽の再生：
形質転換組織： １.４新芽／外植体
野生型組織： １.７新芽／外植体
本発明が、上記の実施例に限定されないことは認められよう。例えば、マンノースまたはキシロース代謝、もしくはマンノースまたはキシロース誘導体もしくはマンノースまたはキシロース前駆体の代謝に関与する酵素をコードする遺伝子の特異的発現組織は、上記酵素のモジュレーターの基質にそれらを暴露することによりこのような組織の成育制御の調節に使用し得る。更に、マンノースまたはキシロース(それらの誘導体または前駆体を含む)は、このようなキシローウまたはマンノースまたはそれらの前駆体又は誘導体の代謝に関与するタンパク質をコードする遺伝子を含むように形質転換された選択的優勢穀物に対して選択的除草剤として使用し得る。
本発明の方法の使用は：
ｉ）例えばホスホマンノースイソメラーゼコード遺伝子の挿入により、全般にまたはある組織／細胞型においてフルクトース−６−リン酸またはそれらの誘導体の濃度が減少した真核生物；
ii）例えばホスホマンノースイソメラーゼコード遺伝子の挿入により、全般にまたはある組織／細胞型においてマンノース−６−リン酸またはそれらの誘導体の濃度が増加した真核生物；
iii)細胞内にホスホマンノースイソメラーゼコード遺伝子を挿入したことにより、全体またはある細胞型のホスホマンノースイソメラーゼ活性が増加した、真核生物：
を産生することもまた認められよう。
本発明は、真核細胞の選択、特にトランスジェニック植物細胞の選択のための新規方法を提供するものであり、農業や園芸分野、例えば植物の機能解析や品種改良などに利用することができる。さらに真核細胞による有用物質の製造の分野、例えば医薬品の製造の分野などに利用することができる。
図１は、大腸菌(E.coli)ホスホマンノースイソメラーゼコード領域を含むＢＣl１/ＨindIII制限フラグメントの製造を示す。 図２は、プラスミドＥＰＬ(ピートルザック,Ｍら、Nucleic Acids Res.１４、５８５７〜５８６８頁(１９８６))を示す。 図３はバイナリープラスミドｐＢＫＬ４(ニールセン,Ｋ.Ｋ.ら、Mol.Plant.Microbe Interact.６、４９５〜５０６頁(１９９３))を示す。 図４は、ＧＵＳ遺伝子およびＮＰＴII遺伝子の間にマンＡ(man A)遺伝子を含むプラスミドｐＢＫＬ４を示す。

Claims (13)

  1. 植物に挿入される所望のヌクレオチド配列およびマンノース−ホスフェートイソメラーゼをコードする領域を含む共挿入ヌクレオチド配列にて形質転換されたトランスジェニック植物細胞であって、該植物細胞中で該領域が発現された場合に、化合物マンノースを含有する培地上または中において培養された植物細胞の集団から形質転換植物細胞を選択する方法において使用可能になるという代謝上の利点が該形質転換植物細胞に与えられるものである、トランスジェニック植物細胞。
  2. 植物に挿入される所望のヌクレオチド配列およびマンノース−ホスフェートイソメラーゼをコードする領域を含む共挿入ヌクレオチド配列にて形質転換された、果実、圃場作物、小穀粒禾穀類および野菜からなる群より選択されるトランスジェニック植物細胞であって、該植物細胞中で該領域が発現された場合に、化合物マンノースを含有する培地上または中において培養された植物細胞の集団から形質転換植物細胞を選択する方法において使用可能になるという代謝上の利点が該形質転換植物細胞に与えられるものである、トランスジェニック植物細胞。
  3. 化合物がマンノースであり、ヌクレオチド配列がマンノース−６−ホスフェートイソメラーゼをコードするものである、請求項１または２記載のトランスジェニック植物細胞。
  4. ヌクレオチド配列の少なくとも１つが、当該配列が挿入された植物によって好まれるコドンが使用されて、当該配列の酵素タンパク質コード成分が内因性である植物中において非修飾ＤＮＡの発現で得られたのと実質的に類似している酵素タンパク質を産生するように修飾されたＤＮＡを含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載のトランスジェニック植物細胞。
  5. 抗生物質および除草剤からなる群より選択される少なくとも１つに対する耐性をコードしており、その発現が抗生物質および除草剤からなる群より選択される少なくとも１つに対する耐性を形質転換細胞に与えるヌクレオチド配列を含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載のトランスジェニック植物細胞であって、該植物中における該配列の発現により、該形質転換植物細胞が、それぞれマンノース、マンノース−６−ホスフェートまたはＤ−マンノサミンのほかに抗生物質または除草剤を含有する培地上または中において培養された植物細胞の集団から形質転換植物細胞を選択する方法において使用可能になるものである、トランスジェニック植物細胞。
  6. 少なくとも２種の異なる選択遺伝子が共挿入された所望ヌクレオチド配列を含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載のトランスジェニック植物細胞。
  7. 植物細胞がトマト、マンゴ、モモ、リンゴ、ナシ、イチゴ、バナナおよびメロンからなる群より選択される植物由来である、請求項１〜６のいずれか１項に記載のトランスジェニック植物細胞。
  8. 植物細胞がキャノーラ、ヒマワリ、タバコ、シュガービート、トウモロコシおよびワタからなる群より選択される植物由来である、請求項１〜６のいずれか１項に記載のトランスジェニック植物細胞。
  9. 植物細胞がコムギ、オオムギおよびイネからなる群より選択される植物由来である、請求項１〜６のいずれか１項に記載のトランスジェニック植物細胞。
  10. 植物細胞がジャガイモ、ニンジン、レタス、キャベツおよびタマネギからなる群より選択される植物由来である、請求項１〜６のいずれか１項に記載のトランスジェニック植物細胞。
  11. 請求項１〜１０のいずれか１項に記載の植物細胞を含む、トランスジェニック植物。
  12. 請求項１１に記載のトランスジェニック植物の子孫。
  13. 請求項１１に記載の植物または請求項１２に記載の子孫植物の種子。
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Families Citing this family (164)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
MX9707666A (es) * 1995-04-06 1997-11-29 Seminis Vegetables Proceso de seleccion de celulas de planta transgenica.
GB9702592D0 (en) * 1997-02-07 1997-03-26 Danisco Selection method
EP0870836A1 (de) 1997-04-09 1998-10-14 IPK Gatersleben 2-Desoxyglucose-6-Phosphat (2-DOG-6-P) Phosphatase DNA-Sequenzen als Selektionsmarker in Pflanzen
US6075134A (en) * 1997-05-15 2000-06-13 The Regents Of The University Of California Glycoconjugates and methods
US6586661B1 (en) * 1997-06-12 2003-07-01 North Carolina State University Regulation of quinolate phosphoribosyl transferase expression by transformation with a tobacco quinolate phosphoribosyl transferase nucleic acid
US7087420B1 (en) 1997-07-17 2006-08-08 Cambia Microbial β-glucuronidase genes, gene products and uses thereof
US6391547B1 (en) * 1997-09-09 2002-05-21 Center For The Application Of Molecular Biology To International Agriculture Microbial β-glucuronidase genes, gene products and uses thereof
WO1999014331A2 (en) 1997-09-16 1999-03-25 Cropdesign Nv Cyclin-dependent kinase inhibitors and uses thereof
AR020078A1 (es) 1998-05-26 2002-04-10 Syngenta Participations Ag Metodo para alterar la expresion de un gen objetivo en una celula de planta
GB9817465D0 (en) * 1998-08-11 1998-10-07 Danisco Selection method
US8013138B1 (en) 1998-11-12 2011-09-06 Max-Planck-Gesellschaft Zur Foerderung Der Wissenschaften E.V. Chimeric promoters capable of mediating gene expression in plants upon pathogen infection and uses thereof
DE19926216A1 (de) * 1999-06-09 2001-02-22 Metallgesellschaft Ag Verfahren zur Herstellung von Bariumsulfat, Bariumsulfat und Verwendung des Bariumsulfats
AU2001236839A1 (en) 2000-02-11 2001-08-20 Metabolix, Inc. Multi-gene expression constructs containing modified inteins
WO2001066779A2 (en) * 2000-03-08 2001-09-13 Univ. Of Georgia Research Foundation, Inc. Arabitol or ribitol as positive selectable markers
US7005561B2 (en) 2000-03-08 2006-02-28 University Of Georgia Research Foundation, Inc. Arabitol or ribitol as positive selectable markers
EP1780283A1 (en) * 2000-04-21 2007-05-02 Martek Biosciences Corporation Trophic conversion of obligate photographic algae through metabolic engineering
AU2001253699B2 (en) * 2000-04-21 2006-04-27 Martek Biosciences Corporation Trophic conversion of obligate phototrophic algae through metabolic engineering
AU2001268523A1 (en) 2000-06-16 2001-12-24 Martek Biosciences Corporation High fluorescent intensity cross-linked allophycocyanin
AU8980001A (en) * 2000-08-11 2002-02-25 Syngenta Participations Ag Methods for stable transformation of plants
WO2002018607A2 (en) * 2000-08-30 2002-03-07 North Carolina State University Transgenic plants containing molecular decoys that alter protein content therein
CN1258593C (zh) * 2000-11-07 2006-06-07 北卡罗莱纳州立大学 腐胺－n－甲基转移酶启动子
WO2002040690A2 (en) * 2000-11-17 2002-05-23 Metabolix, Inc. Production of medium chain length polyhydroxyalkanoates from fatty acid biosynthetic pathways
US20060157072A1 (en) * 2001-06-08 2006-07-20 Anthony Albino Method of reducing the harmful effects of orally or transdermally delivered nicotine
HUP0400161A2 (hu) * 2001-06-08 2004-08-30 Vector Tobacco Ltd., Módosított nikotin- és nitrozamintartalmú dohány
EP1925672A1 (en) 2001-06-22 2008-05-28 Syngeta Participations AG Abiotic stress responsive polynucleotides and polypeptides
NL1019308C2 (nl) 2001-11-06 2003-05-07 Stichting Tech Wetenschapp Werkwijze voor het selecteren van genetisch getransformeerde cellen.
EP1537136B1 (en) 2001-11-07 2011-01-12 Syngenta Participations AG Promoters for regulation of gene expression in plant roots
US7534934B2 (en) 2002-02-20 2009-05-19 J.R. Simplot Company Precise breeding
EP1585384B1 (en) * 2002-02-20 2012-07-11 J.R. Simplot Company Precise breeding
US7939709B2 (en) 2002-02-26 2011-05-10 Syngenta Limited Method for selectively producing male or female sterile plants
CA2481167A1 (en) * 2002-04-09 2003-10-23 Vector Tobacco Ltd. Tobacco having reduced nicotine and nitrosamines
DE60230071D1 (de) 2002-06-14 2009-01-08 Monier Tadros Methode für die herstellung von protamin
US20060174366A1 (en) 2002-07-09 2006-08-03 Mariette Andersson Use of ahas mutant genes as selection marker in potato transformation
CN101018864A (zh) 2002-12-26 2007-08-15 先正达合作有限公司 细胞增殖相关多肽及其应用
AU2004283850C1 (en) 2003-10-16 2011-11-03 Amgen Research (Munich) Gmbh Multispecific deimmunized CD3-binders
CA2542574C (en) 2003-11-12 2014-03-18 E. I. Du Pont De Nemours And Company Delta-15 desaturases suitable for altering levels of polyunsaturated fatty acids in oleaginous plants and yeast
DE602004022857D1 (de) 2003-12-02 2009-10-08 Basf Se 2-methyl-6-solanylbenzochinon-methyltransferase als ziel für herbizide
CN104293912A (zh) 2003-12-16 2015-01-21 先锋高级育种国际公司 显性基因抑制性转基因及其使用方法
US20070169227A1 (en) 2003-12-16 2007-07-19 Pioneer Hi-Bred International Inc. Dominant Gene Suppression Transgenes and Methods of Using Same
BRPI0508518A (pt) 2004-03-08 2007-08-14 Syngenta Participations Ag proteìna e promotor de semente de milho rica em glutamina
UA94893C2 (ru) 2004-03-25 2011-06-25 Сингента Партисипейшнс Аг Трансгенное растение кукурузы mir604
US8093182B2 (en) * 2004-12-23 2012-01-10 Nonomura Arthur M Compositions and methods for anti-transpiration in plants
CA2800359A1 (en) 2005-03-16 2006-09-28 Metabolix, Inc. Chemically inducible expression of biosynthetic pathways
WO2007087153A2 (en) 2006-01-06 2007-08-02 University Of Georgia Research Foundation Cyst nematode resistant transgenic plants
WO2007080440A1 (en) * 2006-01-12 2007-07-19 Avestha Gengraine Technologies Pvt.Ltd. Novel efficient transformation method for sunflower and oil seeds based on positive selection
CA2641868A1 (en) * 2006-02-09 2007-08-16 Avesthagen Limited Method of selection and regeneration of transgenic brassica jxmcea on xylose
AU2007356171B8 (en) 2006-08-04 2014-01-16 Bp Corporation North America Inc. Glucanases, nucleic acids encoding them, and methods for making and using them
EP2057178B1 (en) 2006-09-21 2013-11-06 Verenium Corporation Phytases, nucleic acids encoding them and methods for making and using them
DK2479267T3 (en) 2006-12-21 2017-03-27 Basf Enzymes Llc Amylases and Glucoamylases, Nucleic Acids Encoding Them, and Methods for Preparing and Using Them
KR101589759B1 (ko) 2007-04-03 2016-01-29 암젠 리서치 (뮌헨) 게엠베하 종간 특이적 ｃｄ３―입실론 결합 도메인
WO2008119567A2 (en) 2007-04-03 2008-10-09 Micromet Ag Cross-species-specific cd3-epsilon binding domain
CA2584934A1 (en) 2007-04-17 2008-10-17 University Of Guelph Nitrogen-regulated sugar sensing gene and protein and modulation thereof
EP2463370B1 (en) 2007-06-01 2013-07-31 Sapphire Energy, Inc. Use of genetically modified organisms to generate biomass degrading enzymes
GB2463543A (en) 2007-09-11 2010-03-24 Sapphire Energy Inc Molecule production by photosynthetic organisms
US8314222B2 (en) 2007-10-05 2012-11-20 Sapphire Energy, Inc. System for capturing and modifying large pieces of genomic DNA and constructing organisms with chloroplasts
MX2010005693A (es) 2007-12-03 2010-06-01 Syngenta Participations Ag Proteinas suceptibles diseñadas enzimaticamente.
US8487159B2 (en) * 2008-04-28 2013-07-16 Metabolix, Inc. Production of polyhydroxybutyrate in switchgrass
MX2010013917A (es) 2008-06-27 2011-03-03 Sapphire Energy Inc Induccion de floculacion en organismos fotosinteticos.
PT2356153T (pt) 2008-10-01 2016-07-15 Amgen Res (Munich) Gmbh Anticorpo biespecífico, de cadeia única, amepxcd3, específico interespécies
US10981998B2 (en) 2008-10-01 2021-04-20 Amgen Research (Munich) Gmbh Cross-species-specific single domain bispecific single chain antibody
BRPI0922656A2 (pt) 2008-12-16 2015-08-04 Syngenta Participations Ag Semente de uma planta de milho transgênica, planta de milho transgênica, células e tecidos desta, molécula de ácido nucléico, amplicos, par de iniciadores de polinucleotídeos, método e kit de detecção da presença de uma molécula de ácido nucléico, molécula de dna, método para confirmar a ausência de uma molécula de ácido nucléico, amostra biológica e extrato derivados de planta, tecido, semente ou célula de milho do evento 5307, métodos de reprodução de uma planta de milho, de seleção auxiliada por marcadores para uma característica resistente a insetos em milho, e de produção de plantas de milho híbridas resistentes a insetos coleópteros, semente e plantas de milho híbridas, sítio-alvo de cromossomo de milho, e método de preparação de uma planta de milho transgênica
CN101768213B (zh) 2008-12-30 2012-05-30 中国科学院遗传与发育生物学研究所 一种与植物分蘖数目相关的蛋白及其编码基因与应用
US7868688B2 (en) * 2008-12-30 2011-01-11 Cosmic Circuits Private Limited Leakage independent very low bandwith current filter
WO2011068567A1 (en) 2009-07-10 2011-06-09 Syngenta Participations Ag Novel hydroxyphenylpyruvate dioxygenase polypeptides and methods of use
CA2749524C (en) 2009-01-22 2021-07-06 Syngenta Participations Ag Mutant hydroxyphenylpyruvate dioxygenase polypeptides and methods of use
US9012719B2 (en) 2009-02-06 2015-04-21 Syngenta Participations Ag Modification of multidomain enzyme for expression in plants
CN101817879A (zh) 2009-02-26 2010-09-01 中国科学院遗传与发育生物学研究所 金属硫蛋白及其编码基因与应用
WO2010102293A1 (en) 2009-03-06 2010-09-10 Metabolix, Inc. Method of positive plant selection using sorbitol dehydrogenase
KR101817253B1 (ko) 2009-05-21 2018-01-10 신젠타 파티서페이션즈 아게 피타제, 이를 코딩하는 핵산 및 그의 제조 및 사용 방법
US20120174253A1 (en) 2009-09-15 2012-07-05 Nii Patterson Generation of high polyhydroxybutrate producing oilseeds
CN102596988B (zh) 2009-10-02 2016-07-13 先正达参股股份有限公司 杀虫蛋白
TWI653333B (zh) 2010-04-01 2019-03-11 安進研究（慕尼黑）有限責任公司 跨物種專一性之ＰＳＭＡｘＣＤ３雙專一性單鏈抗體
UA111592C2 (uk) 2010-07-07 2016-05-25 Сінгента Партісіпейшнс Аг Спосіб контролю над твердокрилими комахами-шкідниками
WO2012008748A2 (ko) * 2010-07-14 2012-01-19 건국대학교 산학협력단 지오바실러스 써모디니트리피칸스 유래 만노스-6-인산 이성화효소의 변이체 및 이를 이용한 엘-리보스 생산방법
WO2012037324A2 (en) 2010-09-15 2012-03-22 Metabolix, Inc. Increasing carbon flow for polyhydroxybutyrate production in biomass crops
EP2431471A1 (en) 2010-09-17 2012-03-21 Université Catholique De Louvain Methods for increasing the size of plants or plant organs
WO2012074868A2 (en) 2010-12-03 2012-06-07 Ms Technologies, Llc Optimized expression of glyphosate resistance encoding nucleic acid molecules in plant cells
AR083029A1 (es) 2010-12-09 2013-01-23 Syngenta Participations Ag Metodos y composiciones que utilizan arn interferente pequeño (arnip) para el control de nematodos en plantas
ES2461896B1 (es) 2010-12-21 2015-03-18 Centro De Investigación Y De Estudios Avanzados Del Instituto Politécnico Nacional Métodos para obtener plantas resistentes a sequía
AU2012242991B2 (en) 2011-04-11 2017-03-02 Targeted Growth, Inc. Identification and the use of KRP mutants in plants
AU2012249818B2 (en) 2011-04-26 2014-11-20 Syngenta Participations Ag Enhanced transformation of recalcitrant monocots
WO2012159891A1 (en) 2011-05-20 2012-11-29 Syngenta Participations Ag Endosperm-specific plant promoters and uses therefor
BR112014000580A2 (pt) 2011-07-15 2017-03-01 Syngenta Participations Ag métodos para aumento da produtividade e tolerância ao estresse em uma planta
US9861105B2 (en) 2011-07-28 2018-01-09 Syngenta Participations Ag Methods and compositions for controlling nematode pests
AU2012332343A1 (en) 2011-11-03 2014-05-22 Syngenta Participations Ag Polynucleotides, polypeptides and methods for enhancing photossimilation in plants
US20140182011A1 (en) 2011-11-03 2014-06-26 The University Of Hong Kong Methods Using Acyl-Coenzyme A-Binding Proteins to Enchance Drought Tolerance in Genetically Modified Plants
KR101952220B1 (ko) 2011-11-21 2019-05-27 이노베이션 해머 엘엘씨 실리케이트계 기질을 사용하여 식물을 성장시키는 방법 및 시스템, 내생성 글리코피라노실-단백질 유도체를 위한 외생성 글리코피라노사이드 사용에 의한 향상된 광합성 생산성 및 광안전화 재배, 및 그를 위한 제제, 방법 및 시스템
US9540654B2 (en) 2012-02-01 2017-01-10 Dow Agrosciences Llc Synthetic brassica-derived chloroplast transit peptides
KR102091297B1 (ko) 2012-02-03 2020-03-20 에프. 호프만-라 로슈 아게 항원-형질감염된 t 세포와 함께 사용되는 이중특이적 항체 분자 및 의약에서의 이들의 용도
EP2814965B1 (en) 2012-02-16 2018-03-21 Syngenta Participations AG Engineered pesticidal proteins
WO2013134651A1 (en) 2012-03-09 2013-09-12 Board Of Trustees Of Michigan State University Method of enhancing plant drought tolerance by expression of ndr1
MX362917B (es) 2012-05-21 2019-02-26 Innovation Hammer Llc Metodos para hacer seguros complejos de coordinacion micelares para el tratamiento de plantas y formulaciones para los mismos.
WO2013184768A1 (en) 2012-06-05 2013-12-12 University Of Georgia Research Foundation, Inc. Compositions and methods of gene silencing in plants
BR112014031789A2 (pt) 2012-06-22 2017-08-01 Syngenta Participations Ag controle biológico de pragas de coleópteros
WO2014028426A1 (en) 2012-08-13 2014-02-20 University Of Georgia Research Foundation, Inc. Compositions and methods for increasing pest resistance in plants
EP2911519A4 (en) 2012-10-23 2016-06-01 Univ Montana State PRODUCTION OF HIGH QUALITY HARD WHEAT WITH INCREASED AMYLOSIS CONTENT
US20160015749A1 (en) 2013-03-05 2016-01-21 Baylor College Of Medicine Engager cells for immunotherapy
CN105407902A (zh) 2013-03-05 2016-03-16 贝勒医学院 溶瘤病毒
EP2964753B1 (en) 2013-03-07 2018-04-25 Baylor College of Medicine Targeting cd138 in cancer
US20160015750A1 (en) 2013-03-09 2016-01-21 Baylor College Of Medicine Vascular-targeted t-cell therapy
JP6578271B2 (ja) 2013-04-17 2019-09-18 ベイラー カレッジ オブ メディスンＢａｙｌｏｒ Ｃｏｌｌｅｇｅ Ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ 免疫抑制ＴＧＦ−βシグナルコンバーター
AU2014278519B2 (en) 2013-06-11 2020-09-10 Syngenta Participations Ag Methods for generating transgenic plants
US20140380524A1 (en) 2013-06-19 2014-12-25 The University Of Hong Kong Methods of using 3-hydroxy-3-methylglutaryl-coa synthase to enhance growth and/or seed yield of genetically modified plants
CN105916876A (zh) 2013-09-16 2016-08-31 分子医学研究中心责任有限公司 用于骨髓恶性肿瘤诊断的突变钙网蛋白
SI3062606T1 (sl) 2013-10-29 2019-09-30 Biotech Institute, Llc Gojenje, priprava, predelava in uporaba posebnega kanabisa
US20170073690A1 (en) 2014-05-15 2017-03-16 CEMM - Forschungzentrum Fuer Molekulare Medizin GMBH Antagonists of slc38a9 and their use in therapy
MA41538A (fr) 2014-10-17 2017-12-26 Baylor College Medicine Cellules immunitaires bipartites et tripartites de signalisation
BR112017012362A2 (pt) 2014-12-12 2018-07-31 Syngenta Participations Ag composições e métodos para controle de pragas de plantas.
US20170327834A1 (en) 2014-12-15 2017-11-16 Syngenta Participations Ag Pesticidal microrna carriers and use thereof
BR112017013528A2 (pt) 2014-12-23 2018-03-06 Syngenta Participations Ag controle biológico de pragas de coleópteros
SG11201704272YA (en) 2014-12-31 2017-06-29 Synthetic Genomics Inc Compositions and methods for high efficiency in vivo genome editing
MA41433A (fr) 2015-01-26 2017-12-05 Baylor College Medicine Cellules immunitaires universelles pour l'immunothérapie anticancéreuse
KR20170138410A (ko) 2015-02-23 2017-12-15 시걸 테라퓨틱스 에스에이에스 비-천연 세마포린 3 및 이의 의학적 용도
WO2016164810A1 (en) 2015-04-08 2016-10-13 Metabolix, Inc. Plants with enhanced yield and methods of construction
EP3280271A4 (en) 2015-04-10 2019-04-10 Syngenta Participations AG ANIMAL FEED COMPOSITIONS AND METHODS OF USE
US12048716B2 (en) 2015-04-23 2024-07-30 Baylor College Of Medicine NKT-cell subset for in vivo persistence and therapeutic activity and propagation of same
AR105155A1 (es) 2015-07-07 2017-09-13 Syngenta Participations Ag Composiciones y métodos para controlar plagas de plantas
US10732170B2 (en) 2015-07-31 2020-08-04 Missum Biotechnology, Llc Quality of immunological synapse predicts effectiveness of chimeric antigen receptor (CAR) T cells
WO2017136668A1 (en) 2016-02-04 2017-08-10 Yield10 Bioscience, Inc. Transgenic land plants comprising a putative bicarbonate transporter protein of an edible eukaryotic algae
EP3216458A1 (en) 2016-03-07 2017-09-13 Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. Modified vascular endothelial growth factor a (vegf-a) and its medical use
EP4218414A1 (en) 2016-04-29 2023-08-02 Innovation Hammer LLC Formulations and methods for treating photosynthetic organisms and enhancing qualities and quantities of yields with glycan composite formulations
WO2018002358A1 (en) 2016-06-30 2018-01-04 F. Hoffmann-La Roche Ag Improved adoptive t-cell therapy
AR109205A1 (es) 2016-08-05 2018-11-07 Syngenta Participations Ag Control de plagas de coleópteros utilizando moléculas de arn
AR109206A1 (es) 2016-08-05 2018-11-07 Syngenta Participations Ag Control de plagas de coleópteros utilizando moléculas de arn
EP3562299A4 (en) 2016-09-09 2020-05-13 Syngenta Participations AG INSECTICIDE PROTEINS
TW201825674A (zh) 2016-09-09 2018-07-16 美商艾斯合顧問有限公司 表現雙特異性接合分子的溶瘤病毒
WO2018076335A1 (en) 2016-10-31 2018-05-03 Institute Of Genetics And Developmental Biology, Chinese Academy Of Sciences Compositions and methods for enhancing abiotic stress tolerance
WO2018083238A1 (en) 2016-11-03 2018-05-11 Roche Diagnostics Gmbh Novel anti-py792-ddr1 antibodies
WO2018083237A1 (en) 2016-11-03 2018-05-11 Roche Diagnostics Operations Inc. Novel anti-py520-ddr1 antibodies
WO2018083240A1 (en) 2016-11-03 2018-05-11 Roche Diagnostics Gmbh Novel anti-py796-ddr1 antibodies
WO2018083235A1 (en) 2016-11-03 2018-05-11 Roche Diagnostics Gmbh Novel anti-py513-ddr1 antibodies
AU2018224065B2 (en) 2017-02-22 2021-11-11 Yield10 Bioscience, Inc. Transgenic land plants comprising enhanced levels of mitochondrial transporter protein
RU2766710C2 (ru) 2017-03-13 2022-03-15 Бонамоуз, Инк. Ферментативное получение гексоз
TW201900673A (zh) 2017-03-27 2019-01-01 瑞士商赫孚孟拉羅股份公司 改良之抗原結合受體
RU2019133199A (ru) 2017-03-27 2021-04-28 Ф. Хоффманн-Ля Рош Аг Улучшенные форматы антигенсвязывающего рецептора
EP3652214A1 (en) 2017-07-13 2020-05-20 H. Hoffnabb-La Roche Ag New binding agent and assay for pivka
CA3076020A1 (en) 2017-10-02 2019-04-11 Syngenta Participations Ag Engineered pesticidal proteins and methods of controlling plant pests
AR113761A1 (es) 2017-10-18 2020-06-10 Syngenta Participations Ag Control de plagas de hemípteros utilizando moléculas de arn
US20200407719A1 (en) 2018-02-26 2020-12-31 Devgen Nv Control of insect pests using rna molecules
WO2019175127A1 (en) 2018-03-14 2019-09-19 F. Hoffmann-La Roche Ag Novel anti-troponint antibodies
JP7333332B2 (ja) 2018-03-14 2023-08-24 エフ． ホフマン－ラ ロシュ アーゲー 抗体のアフィニティ成熟のための方法
EP3561053A1 (en) 2018-04-26 2019-10-30 Baylor College of Medicine Immune effector cells and molecular adaptors with an antigen cytokine complex for effective cancer immunotherapy
EP3784784A1 (en) 2018-04-27 2021-03-03 Devgen NV Control of insect pests using rna molecules
US12084672B2 (en) 2018-09-04 2024-09-10 Yield10 Bioscience, Inc. Genetically engineered land plants that express an increased seed yield protein and/or an increased seed yield RNA
CN112805370A (zh) 2018-10-19 2021-05-14 豪夫迈·罗氏有限公司 诱导高阻力跨内皮屏障的协同转录因子
WO2020167796A1 (en) * 2019-02-12 2020-08-20 Bonumose Llc Enzymatic production of mannose
US20220194994A1 (en) 2019-02-20 2022-06-23 Syngenta Crop Protection Ag Engineered pesticidal proteins and methods of controlling plant pests
EP3942044A1 (en) 2019-03-21 2022-01-26 Devgen NV Control of insect pests using rna molecules
BR112021024656A2 (pt) 2019-09-17 2022-04-12 Beijing Dabeinong Biotechnology Co Ltd Polipeptídeo de hidroxife-nilpiruvato-dioxigenase mutante, gene codificador e uso do mesmo
EP4188964A1 (en) 2020-08-03 2023-06-07 F. Hoffmann-La Roche AG Improved antigen binding receptors
AR124562A1 (es) 2020-10-28 2023-04-12 Hoffmann La Roche Receptores de unión al antígeno mejorada
WO2022093977A1 (en) 2020-10-30 2022-05-05 Fortiphyte, Inc. Pathogen resistance in plants
CN115336534A (zh) 2021-05-12 2022-11-15 北京大北农生物技术有限公司 原卟啉原氧化酶的用途
AU2022315528A1 (en) 2021-07-22 2023-10-19 F. Hoffmann-La Roche Ag Heterodimeric fc domain antibodies
MX2024006303A (es) 2021-11-25 2024-06-12 Hoffmann La Roche Receptores de union al antigeno mejorados.
IL313168A (en) 2021-12-15 2024-07-01 Beijing Dabeinong Biotechnology Co Ltd Mutated hydroxyphenylpyruvate dioxygenase polypeptide and encoding gene and its use
EP4448564A1 (en) 2021-12-17 2024-10-23 F. Hoffmann-La Roche AG A novel antibody for detection of amyloid beta 42 (a-beta42)
WO2023154887A1 (en) 2022-02-11 2023-08-17 Northeast Agricultural University Methods and compositions for increasing protein and/or oil content and modifying oil profile in a plant
WO2023180511A1 (en) 2022-03-25 2023-09-28 F. Hoffmann-La Roche Ag Improved chimeric receptors
WO2023206126A1 (zh) 2022-04-27 2023-11-02 北京大北农生物技术有限公司 原卟啉原氧化酶的用途
WO2024023578A1 (en) 2022-07-28 2024-02-01 Institut Pasteur Hsc70-4 in host-induced and spray-induced gene silencing
WO2024052856A1 (en) 2022-09-09 2024-03-14 Friedrich Alexander Universität Erlangen-Nürnberg Plant regulatory elements and uses thereof
WO2024158934A1 (en) 2023-01-24 2024-08-02 Yale University Compositions and methods for controlling t-dna copy number in transformed plants
WO2024166076A1 (en) 2023-02-10 2024-08-15 King Abdullah University Of Science And Technology Recombinant production of antimicrobial peptides in planta

Family Cites Families (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4931373A (en) † 1984-05-25 1990-06-05 Zymogenetics, Inc. Stable DNA constructs for expression of α-1 antitrypsin
US4857467A (en) * 1986-07-23 1989-08-15 Phillips Petroleum Company Carbon and energy source markers for transformation of strains of the genes Pichia
DE3719053A1 (de) * 1987-06-06 1988-12-15 Hoechst Ag Verbesserte nutzung von pflanzenverwertbarem stickstoff durch kulturpflanzen mit ueberexpression der glutaminsynthetase
JPH02138966A (ja) * 1987-10-20 1990-05-28 Oji Paper Co Ltd 植物の形質転換体を作出する方法
HU220115B (hu) * 1991-05-24 2001-11-28 Universidad Politecnica De Madrid Antipatogén peptidek, ezeket tartalmazó készítmények, eljárás növények védelmére és a peptideket kódoló szekvenciák
DK152291D0 (da) † 1991-08-28 1991-08-28 Danisco Fremgangsmaade og kemiske forbindelser
WO2009113991A1 (en) * 2008-03-10 2009-09-17 Mobank Solutions, Llc Systems and methods for mobile device and code based money deposit, withdrawal and transfer
US8098881B2 (en) * 2008-03-11 2012-01-17 Sony Ericsson Mobile Communications Ab Advertisement insertion systems and methods for digital cameras based on object recognition

Also Published As

Publication number Publication date
ES2265144T3 (es) 2007-02-01
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WO1994020627A1 (en) 1994-09-15
AU6207794A (en) 1994-09-26

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