CN112805370A - 诱导高阻力跨内皮屏障的协同转录因子 - Google Patents

Abstract

本申请涉及能够增加跨内皮屏障完整性的转录因子。此外，本申请涉及编码此类转录因子的载体和包含此类载体的细胞的用途。

Description

诱导高阻力跨内皮屏障的协同转录因子

技术领域

本申请涉及能够增加跨内皮屏障完整性的转录因子。此外，本申请涉及编码此类转录因子的载体和包含此类载体的细胞的用途。

背景技术

内皮细胞(EC)发育在发育早期开始，并且经历独立的发育步骤，其中每一步均会生成更特化的EC类型，最终随着器官血管化而生成功能齐全的特化EC(Potente M,MakinenT.Nature reviews Molecular cell biology.2017；18(8):477-94,Dejana E,HirschiKK.2017；8:14361)。血脑屏障(BBB)的EC是特化的，因为它们通过紧密连接的表达而形成非常高阻力的屏障(Dejana E,Tournier-Lasserve E,Weinstein BM.Developmentalcell.2009；16(2):209-21)。转录因子是基因表达和发育的主要调节因子中的一种，它们在早期血管发育中的作用已得到广泛研究(De Val S,Black BL.Developmental cell.2009；16(2):180-95)，但人们对器官特异性分化过程中内皮细胞发育的转录调节知之甚少(例如BBB，(Dejana E.2010；107(8):943-52,Mizee MR,Wooldrik D,Lakeman KA,van het HofB,Drexhage JA,Geerts D等人The Journal of neuroscience:the official journal ofthe Society for Neuroscience.2013；33(4):1660-71,Engelhardt B,Liebner S.2014；355(3):687-99))。

目前存在的用于体外模拟EC屏障的模型高度复杂，难以准确重现，因此难以适用于药物研发。因此，仍然需要适用于生成大量能够建立高阻力体外跨内皮屏障完整性(TBI)的EC的稳健细胞培养方法，作为研究例如在健康条件和患病条件下的BBB的模型。

本发明人先前已建立了简单且可放大的6天方案，以将人多能干细胞分化为功能性内皮细胞(Patsch C,Challet-Meylan L,Thoma EC,Urich E,Heckel T,O'Sullivan JF等人，Nature cell biology.2015；17(8):994-1003)。

在此，发明人提供了转录因子的协同组合，该转录因子可生成能够在体外建立高阻力屏障的内皮细胞(EC)。本文描述的转录因子的组合可用于直接和稳健的方案中，以产生能够建立高屏障完整性的EC，该EC可尤其用于疾病建模或用于药物研发或毒理学研究。

发明内容

本发明提供一种用于产生能够建立高跨内皮电阻(TEER)的细胞的方法，该方法包括使所述细胞与至少一种转录因子接触的步骤，其中相较于未与所述至少一种转录因子接触的细胞的汇合单层，所述细胞的汇合单层建立更高的跨内皮电阻。

在一个实施例中，所述至少一种转录因子分别选自由以下项组成的组：TAL1、SOX18、FOXF2、SOX7、FOXC1、ETS1、KLF11、LMO2和LEF1。

在一个实施例中，所述至少一种转录因子选自由以下项组成的组：ETS1、SOX18和SOX7，特别地，其中转录因子为ETS1、SOX18和SOX7。

在一个实施例中，转录因子为i)ETS1、SOX18、SOX7和TAL1；或(ii)ETS1、SOX18、SOX7和LEF1。

在一个实施例中，将编码所述至少一种转录因子的分离的核酸引入细胞中。

在一个实施例中，分离的核酸包含在至少一种表达载体中，特别地，其中所述至少一种表达载体分别选自由以下项组成的组：病毒载体、非病毒载体和质粒载体。

在一个实施例中，细胞为内皮细胞(EC)。

在一个实施例中，提供一种表达载体，该表达载体包含编码至少一种转录因子的分离的核酸，所述至少一种转录因子选自由以下项组成的组：TAL1、SOX18、FOXF2、SOX7、FOXC1、ETS1、KLF11、LMO2和LEF1

在一个实施例中，载体为病毒载体、非病毒载体或质粒载体。

在一个实施例中，分离的核酸编码选自由以下项组成的组的转录因子中的至少一种：ETS1、SOX18和SOX7，特别地，分离的核酸编码转录因子ETS1、SOX18和SOX7。

在一个实施例中，分离的核酸编码转录因子(i)ETS1、SOX18、SOX7和TAL1；或(ii)ETS1、SOX18、SOX7和LEF1。

在一个实施例中，提供一种包含如本文所述的表达载体中的一种或多种的细胞。

在一个实施例中，细胞为哺乳动物细胞，特别地是人类细胞。

在一个实施例中，提供一种如本文所述的方法，其中能够建立高TEER的细胞用于鉴定能够i)增加内皮细胞(EC)的体内跨内皮屏障完整性(TBI)或ii)降低EC的体内TBI的候选药物。在一个实施例中，该方法包括以下步骤：

(a)提供能够建立高TEER的细胞的单层；

(b)使细胞与候选药物接触；

(c)在使细胞与候选药物接触之前和之后测量体外TEER，或者测量与候选药物接触的细胞的体外TEER并且并行地测量未与候选药物接触的细胞的体外TEER；

其中(i)相较于未与候选药物接触的细胞的体外TEER，与候选药物接触的细胞的体外TEER更高指示能够增加EC的体内TBI的药物，并且(ii)相较于未与候选药物接触的细胞的体外TEER，与候选药物接触的细胞的体外TEER更低指示能够降低EC的体内TBI的药物。

附图说明

图1.鉴定促进内皮屏障阻力的转录因子。加入80MOI腺病毒后的24小时处测量平均相对屏障阻力，稳定化后的阻力测量(在10小时处)，平均值来自3个独立实验(图1A)。使用ECIS完成针对转录因子的EC屏障阻力的实时测量，该转录因子具有在24小时处增加屏障阻力的显著效应或倾向。屏障测量值稳定后，将值归一化至处理后10小时。线条表示平均阻力(图1B)。在转导后48小时处测量FITC-葡聚糖的通透性，平均值来自3个独立实验(图1C)。EC标志基因(图1D、1E、1F)、EC屏障连接形成基因(图1G、1H、1I、1J、1K、1L、1M、1N、1O)和已知在EC屏障形成中很重要的基因(图1P、1Q、1R)的相对mRNA表达。柱形示出均值±SD。*＝p或FDR<0.05，**＝p或FDR<0.01，**＝p或FDR<0.001。所有处理均以三重复的方式进行。

图2.转录因子的组合的过表达协同诱导内皮细胞屏障阻力。加入20MOI腺病毒后的24小时处测量平均相对屏障阻力，稳定化后的阻力测量(在10小时处)，平均值来自3个独立实验(图2A)。在转导后48小时处测量FITC-葡聚糖的通透性，平均值来自3个独立实验(图2B)。在加入4种腺病毒(每种20MOI)的组合后的24小时处测量平均相对屏障阻力，稳定化后的阻力测量(在10小时处)，平均值来自3个独立实验(图2C)。针对TF(每种20MOI)的组合实时测量EC屏障阻力。线条表示平均阻力，并且阴影对应于标准偏差(图2D)。在转导后48小时处测量FITC-葡聚糖的通透性；平均值来自3个独立实验。柱形为均值±SD(图2E)。

参考文献

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Srinivasan B.,Kolli AR,Esch MB,Abaci HE,Shuler ML,Hickman JJ.J LabAutom.2015；20(2):107-126.

具体实施方式

如本文所用，术语“已知成分培养基”(defined medium)或“已知化学成分培养基”(chemically defined medium)是指其中所有单个组分及其各自浓度均已知的细胞培养基。已知成分培养基可包含重组的和已知化学成分的组分。

本文所用的术语“分化”(differentiating、differentiation和differentiate)是指将分化程度较低的细胞转化为体细胞的一个或多个步骤，例如将多能干细胞转化为EC。通过本文所述的方法来实现将多能干细胞分化为EC。

如本文所用，“内皮细胞”，简称“EC”，是指表达特异性表面标志物CD144(分化簇144，也称为2型钙粘素5或血管内皮(VE)钙粘素，基因名称CDH5)并具有内皮细胞(即类毛细血管形成)以及表达一种或多种选自由以下项组成的组的其他表面标志物的特征的细胞：CD31(分化簇31，基因名称PECAM1)、vWF(血管性血友病因子，基因名称VWF)、CD34(分化簇34，基因名称CD34)、CD105(分化簇105，基因名称ENG)、CD146(分化簇34，基因名称MCAM)和VEGFR-2(激酶插入域受体(一种III型受体酪氨酸激酶)，基因名称KDR)。

本文所用的“扩增培养基”(Expansion medium)是指对于在单层上扩增和传代内皮细胞有用的任何已知化学成分培养基。

如本文所用，术语“生长因子”意指引起细胞增殖的生物学活性多肽或小分子化合物，并且包括生长因子及其类似物两者。

本文所用的“高通量筛选”应理解为表示可并行地和/或顺序地加以分析和比较的大量不同的疾病模型条件和/或化合物。通常，此类高通量筛选在多孔微量滴定板中进行，例如在96孔板或384孔板或具有1536或3456孔的板中进行。

本文所用的“诱导培养基”是指对于在单层上将引发的细胞诱导为CD144阳性(CD144+)内皮细胞有用的任何已知化学成分培养基。

本文所用的“单层细胞”(monolayer of cells)是指作为单个细胞提供的细胞，所述细胞以单张膜的形式附着至粘合基质，其与培养非汇合单细胞和/或细胞团块(例如，胚状体)相对，其中呈多层形式的细胞的固体团形成附着至粘合基质的各种三维形态。

术语“核酸”涉及包含嘌呤碱基和嘧啶碱基的碱基组合物和/或碱基序列，其由多核苷酸组成，由此所述碱基代表编码多肽和/或蛋白质(例如转录因子)的核酸的主要结构。术语核酸与术语多核苷酸和核酸分子在本文同义使用。在此，术语核酸包括DNA、cDNA、基因组DNA、RNA、DNA的合成形式以及包含这些分子中的两种或更多种的混合聚合物。此外，术语核酸包括有义链和反义链两者。此外，如本领域技术人员容易理解的，本文所述的核酸可包含非天然或衍生的核苷酸碱基。

“分离的核酸”(isolated nucleic acids)分子或“分离的多核苷酸”(isolatedpolynucleotides)意指已从其天然环境中除去的核酸分子，DNA或RNA。例如，编码包含在载体中的多肽的重组多核苷酸出于本发明的目的被视为分离的。分离的多核苷酸的另外的实施例包括维持在异源宿主细胞中的重组多核苷酸或处于溶液中的纯化的(部分地或基本上纯化的)多核苷酸。分离的多核苷酸包括多核苷酸分子，该多核苷酸分子包含在通常包含多核苷酸分子的细胞中，但该多核苷酸分子存在于染色体外或存在于与其天然染色体位置不同的染色体位置上。

“编码至少一种转录因子的核酸”是指编码本发明的转录因子(或其片段和/或突变体)的一种或多种核酸分子，包括在单个载体或单独载体中的此类核酸分子，以及存在于宿主细胞中的一个或多个位置处的此类核酸分子。

本文所用的“多能培养基”是指对于将多能干细胞作为单细胞附着在单层上、同时保持其多能性有用的任何已知化学成分培养基。本文也描述了本领域众所周知的有用多能培养基。在如本文所述的特定实施例中，多能培养基包含以下生长因子中的至少一种：碱性成纤维细胞生长因子(bFGF，也描述为成纤维细胞生长因子2，FGF2)和转化生长因子β(TGFβ)。

如本文所用，术语“重编程”是指将体细胞转化为分化程度较低的细胞，例如用于将成纤维细胞、脂肪细胞、角质细胞或白细胞转化为多能干细胞所需的一个或多个步骤。“重编程”细胞是指如本文所述的通过重编程体细胞而衍生的细胞。

本文所用的术语“小分子”或“小化合物”或“小分子化合物”是指合成的或在自然界中发现的有机或无机分子，其分子量通常小于每摩尔10,000克、任选地小于每摩尔5,000克、并且任选地小于每摩尔2,000克。

本文所用的术语“体细胞”是指形成生物体的任何细胞，其不是生殖细胞(例如精子和卵子、由它们产生的细胞(配子母细胞))和未分化的干细胞。

本文所用的术语“干细胞”是指具有自我更新能力的细胞。本文所用的“未分化的干细胞”是指具有分化为多种细胞类型的能力的干细胞。如本文所用，“多能干细胞”是指可产生多种细胞类型的细胞的干细胞。多能干细胞(PSC)包括人胚胎干细胞(hESC)和人诱导多能干细胞(hiPSC)。人诱导多能干细胞可例如通过本领域已知和本文进一步描述的方法转导四种已知成分因子(Sox2、Oct4、Klf4、c-Myc)而衍生自重编程的体细胞。所述人类体细胞可从健康个体或从患者获得。这些供体细胞可从任何合适的来源获得。本文优选的是允许在不对人体进行侵入性操作的情况下分离出供体细胞的来源，例如人类皮肤细胞、血细胞或可从尿样获得的细胞。

尽管人类细胞为优选的，但如本文所述的方法也适用于非人类细胞，诸如灵长类动物细胞、啮齿动物(例如，大鼠、小鼠、兔)细胞和狗细胞。

如本文所用，术语“高阻力跨内皮屏障”是指内皮细胞在体外和体内的功能性标志。内皮细胞(EC)作为血管腔与周围组织之间的半选择性屏障，控制物质的通过和白血球进出血流的转运。此高阻力跨内皮屏障的完整性在本文称为“跨内皮屏障完整性”或“TBI”。可在健康和疾病状况下观察到屏障功能的丧失，例如，创伤愈合、血管化以及与TBI的暂时或永久丧失相符的慢性炎症。TBI可通过在如本文所述(例如，来自多能细胞的EC培养物)和本领域已知(例如，短期原代细胞培养物)的适当条件下产生的单层EC(例如，EC培养物)在体外建模。TBI，例如体外TBI，可使用本领域已知(例如，测量TEER和FITC-葡聚糖通透性)和如本文所述的方法测量。如本文所用，术语“体外TBI”是指体外EC培养物的TBI，其中TBI是跨培养物中的细胞单层，例如在单层细胞下方的培养皿表面与单层细胞上方的细胞培养基之间(在传统的2D细胞培养设置中)测量的。因此，如本文所用，术语“体内TBI”是指体内EC的TBI，其中TBI在血管腔与周围组织之间建立和/或测定(例如，测得)。

如本文所用，术语“跨内皮电阻”或“TEER”是指EC单层的细胞培养物中紧密连接动态完整性的定量测量。TEER为在体外屏障模型系统的背景中广泛接受的参数(SrinivasanB.,Kolli AR,Esch MB,Abaci HE,Shuler ML,Hickman JJ.J Lab Autom.2015；20(2):107-126)。在一个实施例中，细胞单层的电阻或阻抗是屏障完整性的定量测量。作为一种非侵入性技术，TEER特别适用于短期、中期或长期细胞培养物的重复或实时测量。可基于TEER测量来跨合适的频谱测量欧姆电阻或阻抗。在一个实施例中，在半通透滤芯上培养细胞单层，该半通透滤芯限定了上部(顶端)和下部(基底外侧)隔室。在一个实施例中，放置在顶侧隔室中的第一电极和放置在基底外侧隔室中的第二电极由细胞单层隔开。在一个实施例中，施加具有方形波形的交流电(AC)电压信号。在一个实施例中，施加频率为200-300Hz的AC。在一个实施例中，以250Hz的频率测量覆盖了直径为250μm的圆形金电极的细胞上方的阻抗。

在此背景下，本发明人惊讶地发现某些转录因子，特别地是如本文所述的转录因子的组合在内皮细胞(EC)中诱导强烈的TBI。与此类转录因子接触的细胞，特别地是EC变得能够形成限制分子和离子通过例如此类细胞的单层的高阻力跨内皮屏障。在此背景下，本发明提供了能够形成/建立高阻力跨内皮屏障的细胞，特别地是EC。根据如本文所述的方法产生的如本文所述的细胞尤其可用于建立细胞培养物，特别地是健康或患病状态的细胞培养模型，其中跨内皮屏障完整性为一个标志(例如，TBI破坏是由疾病或BBB完整性造成的)。在一个实施例中，如本文所述的细胞培养物用于药物开发环境中。用如本文所述的方法产生的细胞培养物的一个示例性用途为预测细胞/组织对候选药物的体内应答。作为概念证明，EC与如本文所述的转录因子的组合(例如，TAL1、SOX18、FOXF2、SOX7、FOXC1、ETS1、KLF11、LMO2、LEF1和它们的组合)接触，于是观察到跨内皮电阻(TEER)明显增加(参见例如图1B、图2C、图2D、图2E)。TEER与离子跨例如单层细胞的运动相关，因此与TBI相关。在此背景下，如本文进一步所述，高TEER与已建立的高阻力跨内皮屏障相关。如本文所提供的此数据和其他数据证明，如本文所述的特异性转录因子和它们的组合能够协同诱导TBI(例如，通过TEER或FITC-葡聚糖通透性而测得的)，并且对于产生能够形成/建立高阻力跨内皮屏障的细胞是有用的。如本文所述的转录因子、编码此类转录因子的表达载体和包含此类表达载体的细胞对于生成健康状态和患病状态的EC的有意义稳健模型尤其有用。此类细胞培养模型可用于剖析化学文库的方法中，以发现增加内皮屏障完整性或预防屏障破坏损失的化合物。

本文提供了与转录因子接触的细胞。细胞响应于转录因子建立起增加的跨内皮屏障完整性，该跨内皮屏障完整性可例如通过如本领域已知和如本文所述(实时)测量TEER而测得。因此，与如本文所述的转录因子或如本文所述的转录因子的组合接触的细胞变得能够形成高阻力跨内皮屏障。在一优选实施例中，细胞为一种或多种内皮细胞。在又一实施例中，细胞响应于与如本文所述的转录因子接触而建立和/或维持体内内皮细胞特性。

在一个实施例中，细胞与至少一种转录因子接触。在一个实施例中，转录因子选自由以下项组成的组：TAL1、SOX18、FOXF2、SOX7、FOXC1、ETS1、KLF11、LMO2和LEF1。在一个实施例中，细胞与选自由以下项组成的组的两种转录因子接触：TAL1、SOX18、FOXF2、SOX7、FOXC1、ETS1、KLF11、LMO2和LEF1。在一个实施例中，细胞与选自由以下项组成的组的三种转录因子接触：TAL1、SOX18、FOXF2、SOX7、FOXC1、ETS1、KLF11、LMO2和LEF1。在一个实施例中，细胞与选自由以下项组成的组的四种转录因子接触：TAL1、SOX18、FOXF2、SOX7、FOXC1、ETS1、KLF11、LMO2和LEF1。在一个实施例中，细胞与选自由以下项组成的组的五种转录因子接触：TAL1、SOX18、FOXF2、SOX7、FOXC1、ETS1、KLF11、LMO2和LEF1。在一个特定实施例中，转录因子为ETS1、SOX18和SOX7。在优选实施例中，转录因子为(i)ETS1、SOX18、SOX7和TAL1；或(ii)ETS1、SOX18、SOX7和LEF1，最优选为ETS1、SOX18、SOX7和TAL1。

在一个实施例中，将所述至少一种转录因子引入细胞中。转录因子可通过本领域已知的方法和如本文所述的方法引入细胞，例如EC中。在一个实施例中，由分离的核酸编码转录因子。在一个实施例中，将编码所述至少一种转录因子的分离的核酸引入细胞中。在一个实施例中，分离的核酸包括至少一种多核苷酸。在一个实施例中，编码所述至少一种转录因子的分离的核酸包含在至少一种表达载体中。在一个实施例中，细胞，例如内皮细胞与至少一种表达载体接触，特别地，其中所述至少一种表达载体独立地选自由以下项组成的组：病毒载体、非病毒载体和质粒载体。在一个实施例中，将1种、2种、3种、4种或5种表达载体引入细胞中(例如，EC)。在一个实施例中，将一种表达载体，特别地是病毒载体引入细胞中。在一个实施例中，将两种表达载体引入细胞中，其中表达载体独立地选自由以下项组成的组：病毒载体、非病毒载体和质粒载体。在一个实施例中，将三种表达载体引入细胞中，其中表达载体独立地选自由以下项组成的组：病毒载体、非病毒载体和质粒载体。在一个实施例中，将四种表达载体引入细胞中，其中表达载体独立地选自由以下项组成的组：病毒载体、非病毒载体和质粒载体。在一个实施例中，将五种表达载体引入细胞中，其中表达载体独立地选自由以下项组成的组：病毒载体、非病毒载体和质粒载体。在一优选实施例中，由分离的核酸编码转录因子，该分离的核酸包含在选自由以下项组成的组的一种表达载体中：病毒载体、非病毒载体和质粒载体，特别地是病毒载体。

本发明的又一方面为编码根据本发明的一种或若干种转录因子的分离的核酸(多核苷酸)和载体(例如，表达载体)。在一个实施例中，表达载体包括编码至少一种转录因子的分离的核酸，所述至少一种转录因子选自由以下项组成的组：TAL1、SOX18、FOXF2、SOX7、FOXC1、ETS1、KLF11、LMO2和LEF1。在一个特定实施例中，分离的核酸编码转录因子ETS1、SOX18和SOX7。在优选实施例中，分离的核酸编码转录因子(i)ETS1、SOX18、SOX7和TAL1；或(ii)ETS1、SOX18、SOX7和LEF1，最优选为ETS1、SOX18、SOX7和TAL1。

此类转录因子的多肽序列可在UniProtKB/Swiss-Prot数据库中获得，并且可从http://www.uniprot.org/uniprot检索。本文提供用于人转录因子的示例性特定参考文献。(人)TAL1(T细胞急性淋巴细胞白血病蛋白1)的序列可从Swiss-Prot数据库条目P17542(条目版本187，序列版本2)获得。(人)SOX18(转录因子SOX-18)的序列可从Swiss-Prot数据库条目P35713(条目版本168，序列版本2)获得。(人)FOXF2(叉头框(Forkhead box)蛋白F2)的序列可从Swiss-Prot数据库条目Q12947(条目版本149，序列版本2)获得。(人)SOX7(转录因子SOX-7)的序列可从Swiss-Prot数据库条目Q9BT81(条目版本144，序列版本1)获得。(人)FOXC1(叉头框(Forkhead box)蛋白C1)的序列可从Swiss-Prot数据库条目Q12948(条目版本184，序列版本3)获得。(人)ETS1(蛋白C-ets-1)的序列可从Swiss-Prot数据库条目P14921(条目版本203，序列版本1)获得。(人)KLF11(Krueppel样因子11)的序列可从Swiss-Prot数据库条目O14901(条目版本171，序列版本2)获得。(人)LMO2(Rhombotin-2)的序列可从Swiss-Prot数据库条目P25791(条目版本178，序列版本1)获得。(人)LEF1(淋巴增强子结合因子1)的序列可从Swiss-Prot数据库条目Q9UJU2(条目版本177，序列版本1)获得。

可使用常规程序(例如，通过使用能够与如本文所述的基因转录因子特异性结合的寡核苷酸探针)容易地分离和测序、或通过重组方法产生、或通过化学合成获得编码至少一种如本文所述的转录因子的分离的核酸。本发明的转录因子的示例性多核苷酸序列可在NCBI数据库中获得，并且可从www.ncbi.nlm.nih.gov检索。本文提供用于人转录因子的示例性特定参考文献。编码(人)TAL1(T细胞急性淋巴细胞白血病蛋白1)的核酸序列可从NCBI数据库条目NP_001274276.1获得。编码(人)SOX18(转录因子SOX-18)的核酸序列可从NCBI数据库条目NP_060889.1获得。编码(人)FOXF2(叉头框蛋白F2)的核酸序列可从NCBI数据库条目NP_001443.1获得。编码(人)SOX7(转录因子SOX-7)的核酸序列可从NCBI数据库条目NP_113627.1获得。编码(人)FOXC1(叉头框蛋白C1)的核酸序列可从NCBI数据库条目NP_001444.2获得。编码(人)ETS1(蛋白C-ets-1)的核酸序列可从NCBI数据库条目NP_001137292.1获得。编码(人)KLF11(Krueppel样因子11)的核酸序列可从NCBI数据库条目NP_001171187.1获得。编码(人)LMO2(Rhombotin-2)的核酸序列可从NCBI数据库条目NP_001135787.1获得。编码(人)LEF1(淋巴增强子结合因子1)的核酸序列可从NCBI数据库条目NP_001124185.1获得。

可将编码如本文所述的至少一种转录因子的分离的核酸分离并将其插入一种或多种载体中，以用于进一步在宿主细胞中克隆、引入和/或表达。用于转染或转导，即转化(真核)细胞的合适载体在本领域已知并且在本文描述。编码本发明的一种或若干种转录因子的分离的核酸可处于调节序列的控制下。例如，可采用允许诱导表达本发明的转录因子的启动子、转录增强子和/或序列。在本发明的背景中，分离的核酸在组成型或诱导型启动子的控制下表达。合适的启动子为例如CMV启动子、UbiC启动子PGK、EF1A启动子、CAGG启动子、SV40启动子、COPIA启动子、ACT5C启动子、TRE启动子、Oct3/4启动子或Nanog启动子。因此，本发明还涉及包含本发明中所述的分离的核酸的一种或多种载体。在某些实施例中，载体为病毒载体、非病毒载体和质粒载体。在一个实施例中，所述载体能够转化(例如，转染或转导)真核细胞。在一个实施例中，该载体能够转导真核细胞。在此，术语“载体”涉及可在已将其导入的宿主细胞中(即在转导细胞中)自主复制的环状或线性核酸分子。许多合适的载体是分子生物学领域技术人员已知的，其选择取决于所需的功能，包括质粒、粘粒、病毒、噬菌体和基因工程中常规使用的其他载体。本领域技术人员公知的方法可以用于构建各种质粒和载体；参见，例如，Sambrook等人(引自上文)和Ausubel，Current Protocols inMolecular Biology,Green Publishing Associates and Wiley Interscience,N.Y.(1989),(1994)中描述的技术。另选地，可将分离的核酸(多核苷酸)和本发明的载体重构为脂质体，以递送至靶细胞。此外，克隆载体可用于分离DNA的单个序列。相关序列可以转移到需要特定多肽表达的表达载体中。典型的克隆载体包括pBluescript SK、pGEM、pUC9、pBR322、pGA18和pGBT9。典型的表达载体包括pTRE、pCAL-n-EK、pESP-1、pOP13CAT。

在此背景下，本发明还涉及(a)包含分离的核酸(多核苷酸)的一种或多种载体，所述一种或多种载体为可操作地连接至所述分离的核酸的调节序列，所述分离的核酸编码如本文所定义的一种或多种转录因子。此类调节序列(控制元件)是技术人员已知的，并且可包括用于将插入序列引入载体的启动子、剪接盒、翻译起始密码子、翻译和插入位点。在本发明的背景中，所述分离的核酸可操作地连接至所述表达控制序列，以允许在真核或原核细胞中表达。设想所述载体为表达载体，该表达载体包含编码如本文所定义的转录因子的分离的核酸。可操作地连接是指并置，其中所述的组分处于允许它们以其预期方式起作用的关系。可操作地连接至编码序列的控制序列被连接，使得在与控制序列相容的条件下实现编码序列的表达。在控制序列是启动子的情况下，对于技术人员显而易见的是，优选使用双链核酸。在一个实施例中，载体为多顺反子的。

表达包括优选地将分离的核酸(多核苷酸)转录成可翻译的mRNA。确保在原核生物和/或真核细胞中表达的调节元件是本领域技术人员公知的。在真核细胞的情况下，它们通常包含确保转录起始的启动子并且任选地包含确保转录终止和转录物稳定的poly-A信号。允许在原核宿主细胞中表达的可能的调节元件包括，例如，大肠杆菌中的PL、lac、trp或tac启动子，并且允许在真核宿主细胞中表达的调节元件的实施例是酵母中的AOX1或GAL1启动子或哺乳动物和其他动物细胞中的CMV启动子、SV40启动子、RSV启动子(Rous肉瘤病毒)、CMV增强子、SV40增强子或球蛋白内含子。

除了负责转录起始的元件之外，此类调节元件还可以在多核苷酸下游包含转录终止信号，例如SV40-poly-A位点或tk-poly-A位点。此外，取决于所使用的表达系统，可将编码能够将多肽引导至细胞区室或将其分泌至培养基中的信号肽的前导序列添加至所述核酸序列的编码序列，并且其在本领域是众所周知的。

在本发明的背景中，表达控制序列将是在能够转化真核细胞的载体中的真核启动子系统，但也可使用原核细胞的控制序列。一旦载体已并入适当的细胞中，则在适用于表达核苷酸序列的条件下维持该细胞。其他调节元件可包括转录以及翻译增强子。本发明的上述载体可进一步包括可选择的和/或可标记的标志物。可选择标志基因对转化细胞的选择有用，例如npt，其将阻力赋予氨基糖苷类新霉素、卡那霉素和巴龙霉素(Herrera-Estrella,EMBO J.2(1983),987-995)和hygro，其将阻力赋予潮霉素(Marsh,Gene 32(1984),481-485)。已描述了其他可选择基因，即允许细胞利用吲哚代替色氨酸的trpB；允许细胞利用组氨醇(histinol)代替组氨酸的hisD(Hartman,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85(1988),8047)；甘露糖-6-磷酸异构酶，其允许细胞利用甘露糖(WO 94/20627)和ODC(鸟氨酸脱羧酶)，其将阻力赋予鸟氨酸脱羧酶抑制剂、2-(二氟甲基)-DL-鸟氨酸、DFMO(McConlogue,1987,In:Current Communications in Molecular Biology,Cold SpringHarbor Laboratory ed.)或来自土曲霉的脱氨酶，其将阻力赋予灭瘟素(Tamura,Biosci.Biotechnol.Biochem.59(1995),2336-2338)。

有用的可标记标志物也是本领域技术人员已知的，并且可商购获得。有利的是，所述标志物为编码荧光素酶(Giacomin,Pl.Sci.116(1996),59-72；Scikantha,J.Bact.178(1996),121)、绿色荧光蛋白(Gerdes,FEBS Lett.389(1996),44-47)或β-葡萄糖醛酸酶(Jefferson,EMBO J.6(1987),3901-3907)的基因。此实施例对于简单快速筛选包含所述载体的细胞、组织和生物体特别有用。

所述分离的核酸和载体可设计为直接引入或者经由脂质体或病毒载体(例如腺病毒载体、逆转录病毒载体)引入细胞。在本发明的背景中，所述细胞优选为EC或EC的前体。

根据上文，本发明涉及衍生载体，特别地是在基因工程中常规使用的质粒、粘粒和病毒载体的方法，所述衍生载体包含编码至少一种如本文所定义的转录因子的分离的核酸。在特定实施例中，转录因子独立地选自由以下项组成的组：TAL1、SOX18、FOXF2、SOX7、FOXC1、ETS1、KLF11、LMO2和LEF1。在本发明的背景中，所述载体为表达载体和/或基因转移或靶向载体。衍生自病毒，诸如逆转录病毒、牛痘病毒、腺相关病毒、疱疹病毒或牛乳头状瘤病毒的表达载体可用于将所述核酸或载体递送至目标细胞群中。

本发明还提供一种用如本文所述的载体来转化或转染的细胞。所述细胞可通过将上述载体中的至少一种引入细胞或其前体细胞中而产生。如本文所述的所述至少一种载体的存在指示细胞根据本发明发生转染。被引入细胞(例如，EC)或其前体细胞中的所述分离的核酸或载体可整合至细胞的基因组中，或者可在染色体外进行维持。

在此背景下，提供能够建立高TEER的细胞，包括使所述细胞与至少一种转录因子接触的步骤，其中相较于未与所述至少一种转录因子接触的细胞的汇合单层，所述细胞的汇合单层建立更高的TEER。不受理论的束缚，能够形成高阻力跨内皮屏障的细胞为能够建立高跨内皮电阻(TEER)的细胞。在一个实施例中，在形成汇合细胞单层后，与本文提供的转录因子接触的根据本发明的细胞能够建立高TEER。在一个实施例中，相较于未与所述至少一种转录因子接触的细胞的汇合单层，与所述至少一种转录因子接触的细胞的汇合单层能够建立更高的TEER。在一个实施例中，相较于未表达所述至少一种转录因子的细胞的汇合单层，表达如本文所述的至少一种转录因子的细胞的汇合单层能够建立更高的TEER。在一个实施例中，相较于未表达所述至少一种转录因子的细胞的汇合单层，表达选自由TAL1、SOX18、FOXF2、SOX7、FOXC1、ETS1、KLF11、LMO2和LEF1组成的组的至少一种转录因子的细胞的汇合单层能够建立更高的TEER。在一个实施例中，相较于未表达所述至少一种转录因子的细胞的汇合单层的TEER，表达选自由TAL1、SOX18、FOXF2、SOX7、FOXC1、ETS1、KLF11、LMO2和LEF1组成的组的所述至少一种转录因子的细胞的汇合单层的TEER高1.1倍、1.2倍、1.3倍、1.4倍、1.5倍、1.6倍、1.7倍、1.8倍、1.9倍、2倍、5倍或10倍。在一个实施例中，相较于未表达所述至少一种转录因子的细胞的汇合单层的TEER，表达转录因子ETS1、SOX18和SOX7的细胞的汇合单层的TEER高1.2倍、1.3倍、1.4倍、1.5倍、1.6倍、1.7倍、1.8倍、1.9倍、2倍、5倍或10倍。在优选实施例中，转录因子为(i)ETS1、SOX18、SOX7和TAL1；或(ii)ETS1、SOX18、SOX7和LEF1，最优选为ETS1、SOX18、SOX7和TAL1。

在一个实施例中，能够形成高TEER的细胞为哺乳动物细胞。在一个实施例中，细胞为啮齿动物细胞，特别地是小鼠细胞或大鼠细胞。在一个优选实施例中，细胞为人类细胞。

在一个优选实施例中，细胞为内皮细胞(EC)。EC可根据本领域已知的方案在体外产生。衍生自多能干细胞的EC对于本发明的目的特别有用。多能干细胞具有自我更新的特性，并且可在成年哺乳动物体的所有主要细胞类型中分化。多能干细胞可在标准化的细胞培养条件下大量产生。因此，在一个优选实施例中，EC分化自多能干细胞。在一个实施例中，EC分化自胚胎干细胞。在另一实施例中，EC分化自诱导多能干细胞(IPSC)。在一个实施例中，由重编程的体细胞生成IPSC。将体细胞重编程为IPSC可通过引入参与维持IPSC特性的特异性基因来实现。适用于将体细胞重编程为IPSC的基因包括但不限于Oct4、Sox2、Klf4和C-Myc及它们的组合。在一个实施例中，用于重编程的基因为Oct4、Sox2、Klf4和C-Myc。

内脏、皮肤、骨骼、血液和结缔组织均由体细胞组成。用于生成IPSC的体细胞包括但不限于成纤维细胞、脂肪细胞和角质细胞，并且可从皮肤活体组织切片中获得。其他合适的体细胞为白细胞、从血样获得的成红细胞、或者从血样或尿样获得的上皮细胞或其他细胞，并且通过本领域已知的方法和如本文所述的方法重编程为IPSC。体细胞可从健康个体或从患病个体获得。在一个实施例中，体细胞衍生自患有疾病的受试者(例如，人受试者)。在一个实施例中，疾病与血管并发症相关联(例如，与糖尿病性视网膜病变和/或湿性AMD相关的血管并发症类似或相同)。本文所述的用于重编程的基因通过本领域已知的方法引入体细胞中，或通过经由重编程载体递送至细胞中、或通过经由小分子激活所述基因。用于重编程的方法尤其包括逆转录病毒、慢病毒、腺病毒、质粒和转座子、微RNA、小分子、经修饰的RNA信使RNA和重组蛋白。在一个实施例中，慢病毒用于递送如本文所述的基因。在另一实施例中，使用仙台病毒颗粒将Oct4、Sox2、Klf4和C-Myc递送至体细胞。此外，体细胞可在存在至少一种小分子的情况下进行培养。在一个实施例中，所述小分子包括蛋白激酶的Rho相关卷曲螺旋形成蛋白丝氨酸/苏氨酸激酶(ROCK)家族的抑制剂。ROCK抑制剂的非限制性示例包括法舒地尔(1-(5-异喹啉磺酰基)高哌嗪)、Thiazovivin(N-苄基-2-(嘧啶-4-基氨基)噻唑-4-甲酰胺)和Y-27632((+)-(R)-反式-4-(1-氨基乙基)-N-(4-吡啶基)环己烷甲酰胺二盐酸盐)。

针对所得培养物的重现性和效率，优选地提供已知成分的单层多能干细胞。在一个实施例中，可通过将细胞酶解为单细胞并将它们提供至粘合基质，诸如预涂基质胶板(例如，来自BD Bioscience的BD Matrigel hESC-qualified、来自Invitrogen的GeltrexhESC-qualified、来自Corning的Synthemax)上而产生单层的多能干细胞。适用于解离为单细胞的酶的示例包括Accutase(Invitrogen)、Trypsin(Invitrogen)、TrypLe Express(Invitrogen)。在一个实施例中，每平方厘米有20000至60000个细胞铺板在粘合基质上。本文所用的培养基为有助于多能干细胞作为单细胞以单层形式附着和生长的多能培养基。在一个实施例中，多能培养基为补充有蛋白激酶的Rho相关联的卷曲螺旋形成蛋白丝氨酸/苏氨酸激酶(ROCK)家族的小分子抑制剂(本文称为ROCK激酶抑制剂)的无血清培养基。

因此，在一个实施例中，本文所述的方法包括在多能培养基中提供单层多能干细胞，其中所述多能培养基为补充有ROCK激酶抑制剂的无血清培养基。

适用于将多能干细胞附着至基质的无血清培养基的示例为来自Stem CellTechnologies的mTeSR1或TeSR2、来自ReproCELL的Primate ES/iPS细胞培养基和来自Invitrogen的StemPro hESC SFM、来自Lonza的X-VIVO。本文有用的ROCK激酶抑制剂的示例为法舒地尔(1-(5-异喹啉磺酰基)高哌嗪)、Thiazovivin(N-苄基-2-(嘧啶-4-基氨基)噻唑-4-甲酰胺)和Y27632((+)-(R)-反式-4-(1-氨基乙基)-N-(4-吡啶基)环己烷甲酰胺二盐酸盐，例如来自Tocris bioscience的目录号：1254)。在一个实施例中，多能培养基为补充有2-20μMY27632，优选为5-10μM Y27632的无血清培养基。在另一实施例中，多能培养基为补充有2-20μM法舒地尔的无血清培养基。在另一实施例中，多能培养基为补充有0.2-10μMThiazovivin的无血清培养基。

在一个实施例中，本文所述的方法包括在多能培养基中提供单层的多能干细胞，以及使所述单层在多能培养基中生长一天(24小时)。在另一实施例中，本文所述的方法包括在多能培养基中提供单层的多能干细胞，以及使所述单层在多能培养基中生长18小时至30小时，优选为23小时至25小时。

在另一实施例中，本文所述的方法包括在多能培养基中提供单层的多能干细胞，其中所述多能培养基为补充有ROCK激酶抑制剂的无血清培养基，以及使所述单层在多能培养基中生长一天(24小时)。在另一实施例中，本文所述的方法包括在多能培养基中提供单层的多能干细胞，其中所述多能培养基为补充有ROCK激酶抑制剂的无血清培养基，以及使所述单层在多能培养基中生长18小时至30小时，优选为23小时至25小时。

在一个实施例中，细胞与引发培养基接触以诱导分化。在一个实施例中，细胞与补充有小分子的引发培养基接触，并且通过在诱导培养基中孵育引发的细胞来诱导分化，该小分子激活β-连环蛋白和/或Wnt信号传导和/或Hedgehog(HH)信号传导。在一个实施例中，激活β-连环蛋白和/或Wnt信号传导和/或Hedgehog(HH)信号传导的小分子选自由以下项组成的组：糖原合成酶激酶3(Gsk3a-b)的小分子抑制剂、CDC样激酶1(Clk1-2-4)的小分子抑制剂、丝裂原活化蛋白激酶15(Mapk15)的小分子抑制剂、双特异性酪氨酸-(Y)-磷酸化调节激酶(Dyrk1a-b 4)的小分子抑制剂、周期蛋白依赖性激酶16(Pctk1-3 4)的小分子抑制剂、介于β-连环蛋白(或γ-连环蛋白)与共激活蛋白CBP(CREB结合蛋白)和p300(E1A结合蛋白p300)之间的相互作用的平滑化(SMO)激活剂和调节剂。

优选地，所述糖原合成酶激酶3(Gsk3a-b)抑制剂为吡咯烷二酮基GSK3抑制剂。如本文所用的“吡咯烷二酮基GSK3抑制剂”涉及具有低IC₅₀值的GSK3α和GSK3β的选择性细胞通透性ATP竞争性抑制剂。在一个实施例中，吡咯烷二酮基GSK3抑制剂选自由以下项组成的组：SB216763(3-(2,4-二氯苯基)-4-(1-甲基-1H-吲哚-3-基)-1H-吡咯-2,5-二酮)、SB415286(3-[(3-氯-4-羟基苯基)氨基]-4-(2-硝基苯基)-1H-吡咯-2,5-二酮)、N⁶-{2-[4-(2,4-二氯-苯基)-5-(咪唑-1-基-嘧啶-2-基氨基]-乙基}-3-硝基-吡啶-2,6-二胺2HCl、3-咪唑并[1,2-a]吡啶-3-基-4-[2-(吗啉-4-羰基)-1,2,3,4-四氢-[1,4]二氮杂

并[6,7,1-hi]吲哚-7-基]-吡咯-2,5-二酮、肯帕罗酮(9-溴-7,12-二氢-吲哚并[3,2-d][1]苯并氮杂

-6(5H)-酮)、CHIR99021(9-溴-7,12-二氢-吡啶并[3′,2′:2,3]氮杂

并[4,5-b]吲哚-6(5H)-酮)和3-(3-氨基-苯基)-4-(1-甲基-1H-吲哚-3-基)-吡咯-2,5-二酮(CP21R7，本文也称为“化合物21”；参见例如L.Gong等人；Bioorganic&Medicinal Chemistry Letters20(2010),1693-1696)。在一个优选实施例中，所述吡咯烷二酮基GSK3抑制剂为CP21R7。

在一个实施例中，所述CDC样激酶1(Clk1-2-4)抑制剂选自包含以下项的组：苯并噻唑和3-氟-N-[1-异丙基-6-(1-甲基-哌啶-4-基氧基)-1,3-二氢-苯并咪唑-(2E)-亚基]-5-(4-甲基-1H-吡唑-3-磺酰基)-苯甲酰胺。

在一个实施例中，所述丝裂原活化蛋白激酶15(Mapk15)抑制剂选自包含以下项的组：4-(4-氟苯基)-2-(4-甲基亚磺酰基苯基)-5-(4-吡啶基)-1H-咪唑(SB203580)和5-异喹啉磺酰胺(H-89)。

在一个实施例中，所述双特异性酪氨酸-(Y)-磷酸化调节激酶(Dyrk1a-b 4)抑制剂选自包含以下项的组：6-[2-氨基-4-氧代-4H-噻唑-(5Z)-亚基甲基]-4-(四氢-吡喃-4-基氧基)-喹啉-3-腈。

在一个实施例中，所述平滑化激活剂为Purmorphamine(2-(1-萘氧基)-6-(4-吗啉基苯胺)-9-环己基嘌呤。

介于β-连环蛋白(或γ-连环蛋白)与共激活蛋白CBP(CREB结合蛋白)和p300(E1A结合蛋白p300)之间的相互作用的调节剂的示例为IQ-1(2-(4-乙酰基-苯偶氮基)-2-[3,3-二甲基-3,4-二氢-2H-异喹啉-(1E)-亚基]-乙酰胺和ICG-001((6S,9aS)-6-(4-羟基-苄基)-8-萘-1-基甲基-4,7-二氧代-六氢-吡嗪并[1,2-a]嘧啶-1-羧酸苯甲酰胺(WO2007056593)。

在一个实施例中，引发培养基补充有转化生长因子β(TGFβ)的小分子抑制剂。在一个实施例中，TGFβ的小分子抑制剂为SB431542。

在一个实施例中，本文所述的方法包括将所述细胞在引发培养基中孵育约2天至约4天(约48小时至约96小时)。在一个实施例中，上述方法的步骤a)包括将所述细胞在引发培养基中孵育约3天(约72小时)。

在一个实施例中，所述引发培养基为补充有胰岛素、转铁蛋白和孕酮的无血清培养基。在一个实施例中，所述无血清培养基补充有10-50μg/ml胰岛素、10-100μg/ml转铁蛋白和10-50nM孕酮，优选为30-50μg/ml胰岛素、20-50μg/ml转铁蛋白和10-30nM孕酮。适用于引发的无血清培养基的示例为N2B27培养基(N2B27为补充有N2和B27(两者均来自Gibco)的DMEM/F12(Gibco,Paisley,UK)的1:1混合物)、N3培养基(由DMEM/F12(Gibco,Paisley,UK)、25μg/ml胰岛素、50μg/ml转铁蛋白、30nM亚硒酸钠、20nM孕酮、100nM腐胺(Sigma)组成)或

NS-A增殖培养基(Stemcell Technologies)。在一个实施例中，所述引发培养基为补充有胰岛素、转铁蛋白、孕酮以及激活β-连环蛋白(钙粘素相关蛋白，β1；人基因名称CTNNB1)途径和/或Wnt受体信号传导途径和/或Hedgehog(HH)信号传导途径的小分子的无血清培养基。优选地，所述小分子选自包含以下项的组：3-(2,4-二氯苯基)-4-(1-甲基-1H-吲哚-3-基)-1H-吡咯-2,5-二酮(SB216763)、3-[(3-氯-4-羟基苯基)氨基]-4-(2-硝基苯基)-1H-吡咯-2,5-二酮(SB415286)、N⁶-{2-[4-(2,4-二氯-苯基)-5-(咪唑-1-基-嘧啶-2-基氨基]乙基}-3-硝基-吡啶-2,6-二胺2HCl、3-咪唑并[1,2-a]吡啶-3-基-4-[2-(吗啉-4-羰基)-1,2,3,4-四氢-[1,4]二氮杂

并[6,7,1-hi]吲哚-7-基]-吡咯-2,5-二酮、9-溴-7,12-二氢-吲哚并[3,2-d][1]苯并氮杂

-6(5H)-酮(肯帕罗酮)、9-溴-7,12-二氢-吡啶并[3′,2′:2,3]氮杂

并[4,5-b]吲哚-6(5H)-酮(CHIR99021)、3-(3-氨基-苯基)-4-(1-甲基-1H-吲哚-3-基)-吡咯-2,5-二酮(CP21R7，本文也称为“化合物21”)、苯并噻唑、3-氟-N-[1-异丙基-6-(1-甲基-哌啶-4-基氧基)-1,3-二氢-苯并咪唑-(2E)-亚基]-5-(4-甲基-1H-吡唑-3-磺酰基)-苯甲酰胺、4-(4-氟苯基)-2-(4-甲基亚磺酰基苯基)-5-(4-吡啶基)-1H-咪唑(SB203580)、5-异喹啉磺酰胺(H-89)、6-[2-氨基-4-氧代-4H-噻唑-(5Z)-亚基甲基]-4-(四氢-吡喃-4-基氧基)-喹啉-3-腈、2-(1-萘氧基)-6-(4-吗啉基苯胺)-9-环己基嘌呤(Purmorphamine)、2-(4-乙酰基-苯偶氮基)-2-[3,3-二甲基-3,4-二氢-2H-异喹啉-(1E)-亚基]-乙酰胺(IQ-1)和ICG-001((6S,9aS)-6-(4-羟基-苄基)-8-萘-1-基甲基-4,7-二氧代-六氢-吡嗪并[1,2-a]嘧啶-1-羧酸苯甲酰胺。

在另一实施例中，本文所述的方法包括在引发培养基中孵育所述细胞，其中所述引发培养基为补充有CP21R7(3-(3-氨基-苯基)-4-(1-甲基-1H-吲哚-3-基)-吡咯-2,5-二酮)的无血清培养基。优选地，所述引发培养基补充有0.5-4μMCP21R7(3-(3-氨基-苯基)-4-(1-甲基-1H-吲哚-3-基)-吡咯-2,5-二酮)，最优选为1-2μM CP21R7(3-(3-氨基-苯基)-4-(1-甲基-1H-吲哚-3-基)-吡咯-2,5-二酮)。在另一实施例中，上述方法的步骤a)包括在引发培养基中孵育所述细胞，其中所述引发培养基为补充有CP21R7(3-(3-氨基-苯基)-4-(1-甲基-1H-吲哚-3-基)-吡咯-2,5-二酮)的无血清培养基，以及使所述细胞生长2天至4天(48小时至96小时)。在另一实施例中，上述方法的步骤a)包括在引发培养基中孵育所述细胞，其中所述引发培养基为补充有CP21R7(3-(3-氨基-苯基)-4-(1-甲基-1H-吲哚-3-基)-吡咯-2,5-二酮)的无血清培养基，并且将所述细胞孵育三天(72小时)。

在一个实施例中，引发培养基为无血清培养基，该无血清培养基包含10-50μg/ml胰岛素、10-100μg/ml转铁蛋白和10-50nM孕酮，补充有0.5-4μMCP21R7(3-(3-氨基-苯基)-4-(1-甲基-1H-吲哚-3-基)-吡咯-2,5-二酮)。

在一个实施例中，引发培养基另外地包含重组骨形态发生蛋白-4(BMP4)。在一个优选实施例中，引发培养基为无血清培养基，该无血清培养基包含10-50μg/ml胰岛素、10-100μg/ml转铁蛋白和10-50nM孕酮，补充有0.5-4μMCP21R7(3-(3-氨基-苯基)-4-(1-甲基-1H-吲哚-3-基)-吡咯-2,5-二酮)和10-50ng/ml重组骨形态发生蛋白-4(BMP4)。在一个实施例中，引发培养基包含1μMCP21R7和25ng/ml BMP4。

在一个实施例中，细胞与诱导培养基接触以进行分化。对于内皮细胞的主要诱导，所述诱导培养基补充有VEGF(＝血管内皮生长因子)或胎盘样生长因子1(PLGF-1)和小分子腺苷酸环化酶激活剂。在一个实施例中，所述小分子腺苷酸环化酶激活剂使得PKA/PKI信号传导途径活化。在一个实施例中，所述小分子腺苷酸激活剂选自包含以下项的组：佛司可林((3R)-(6aαH)十二氢-6β,10α,10bα-三羟基-3β,4aβ,7,7,10aβ-五甲基-1-氧代-3-乙烯基-1H-萘并[2,1-b]吡喃-5β-基乙酸酯)、8-溴-cAMP(8-溴腺苷-3',5'-环单磷酸)和肾上腺髓质素。在一个实施例中，所述诱导培养基为补充有人血清白蛋白、乙醇胺、转铁蛋白、胰岛素和氢化可的松的无血清培养基。适用于诱导的无血清培养基的示例为StemPro-34(Invitrogen，主要成分：人血清白蛋白、脂质剂诸如Human

和乙醇胺或其混合物、人锌胰岛素、氢化可的松、铁饱和转移2-巯基乙醇、及D,L-生育酚醋酸酯、或其衍生物或混合物)以及X-VIVO 10和15(Lonza)。

在一个实施例中，所述诱导培养基为补充有人血清白蛋白、乙醇胺、转铁蛋白、胰岛素和氢化可的松、及1-10μM佛司可林和5-100ng/ml VEGF-A的无血清培养基。在另一实施例中，诱导培养基包括补充有VEGF-A 30-70ng/ml或胎盘样生长因子1(PLGF-1)30-70ng/ml的StemPro-34(来自Invitrogen)。

在一个实施例中，本文所述的方法包括通过在补充有VEGF-A或胎盘样生长因子1(PLGF-1)和小分子腺苷酸环化酶激活剂的诱导培养基中孵育所述引发的细胞来诱导分化为EC，其中所述小分子腺苷酸环化酶激活剂选自由以下项组成的组：佛司可林、8-溴-cAMP和肾上腺髓质素。在一个实施例中，诱导培养基为补充有1-10μM佛司可林和5-100ng/mlVEGF-A，优选为2μM佛司可林和50ng/ml VEGF-A的无血清培养基。

在另一实施例中，本文所述的方法包括通过在补充有VEGF-A或胎盘样生长因子1(PLGF-1)和小分子腺苷酸环化酶激活剂的诱导培养基中，将所述引发的细胞孵育一天来诱导分化为EC。

在另一实施例中，本文所述的方法包括通过在补充有VEGF-A或胎盘样生长因子1(PLGF-1)和小分子腺苷酸环化酶激活剂的诱导培养基中，将所述引发的细胞孵育18小时至48小时，优选为22小时至36小时，来诱导分化为EC。

在一个实施例中，本文所述的方法包括将所述细胞在诱导培养基中孵育约18小时至约48小时。在一个实施例中，本文所述的方法包括将所述细胞在诱导培养基中孵育约24小时。

在引发和诱导之后，EC可进一步扩增以产生大量细胞。因此，在另一实施例中，本发明的方法另外地包括将引发和诱导的产物在适用于EC增殖的条件下进行孵育。所述适用于内皮细胞增殖的条件可进一步包括收获对内皮标志物呈阳性的细胞，以及在任何已知化学成分的扩增培养基中扩增它们。本文所用的“收获”涉及将细胞从粘合基质酶解以及随后在新培养基中的重悬。在一个优选实施例中，如本文所述，在收获之后对细胞进行分选。在一个实施例中，所述扩增培养基为补充有VEGF-A的无血清培养基。适用于EC扩增的无血清培养基的示例为补充有8ng/ml FGF-2、50ng/ml VEGF和10μM SB431542(4-(4-苯并[1,3]二唑-5-基-5-吡啶-2-基-1H-咪唑-2-基)-苯甲酰胺)的StemPro-34(Invitrogen)、EGM2(Lonza)和DMEM/F12(Invitrogen)。优选地，在贴壁培养条件下培养EC。在一个实施例中，扩增培养基补充有5-100ng/ml VEGF-A。在另一实施例中，扩增培养基为补充有5-100ng/ml，优选为50ng/ml VEGF-A的StemPro-34。

通过本文所述的方法获得的细胞(例如EC)可扩增若干代，并且培养得到了充分表征。可重复冷冻和解冻通过本文所述的方法获得的EC的等分试样。解冻的细胞可如本文所述进一步扩增以达到所需的细胞数，这特别适合建立化合物筛选所需的通量。

在本发明的一个实施例中，提供一种用于生成患者特异性或健康个体特异性EC的方法。这对于与基因突变相关联的疾病状况是特别理想的，然而，在没有基因突变与疾病状况相关联的情况下，或者在与基因突变的连接未知或应建立与基因突变的连接的情况下，患者特异性疾病模型也可为相关的。为此，从患者或健康个体获得的人诱导多能干细胞(iPSC)用于本文所述的方法中。所述患者特异性人iPSC可通过本领域已知的方法和如本文进一步所述的方法通过将从患者或健康个体获得的体细胞重编程为多能干细胞获得。例如，成纤维细胞、角质细胞或脂肪细胞可由来自需要治疗的个体或健康个体的皮肤活体组织切片获得，并且通过本领域已知的方法和如本文进一步所述的方法重编程为诱导多能干细胞。对于诱导多能干细胞，适合作为来源的其他体细胞为从血样获得的白细胞或从尿样获得的上皮细胞或其他细胞。然后，通过本文所述的方法将患者特异性诱导多能干细胞分化为患者特异性患病EC或健康EC。在本发明的另一方面，提供了由前述任何方法产生的EC群。优选地，EC群为患者特异性的，即衍生自从患病个体获得的iPSC。在另一实施例中，从健康个体获得所述EC群。患者衍生的EC代表与疾病相关的体外模型，该模型用于研究针对如2型和1型糖尿病、湿性AMD、代谢综合征和重度肥胖的疾病的血管并发症的病理生理学。在一个实施例中，通过此方法获得的EC用于筛选逆转、抑制或预防由EC功能障碍引起的血管并发症(例如，由2型和1型糖尿病、湿性AMD、代谢综合征、重度肥胖、高胆固醇血症、高血压、冠状动脉疾病、肾病、视网膜病变、肾衰竭、组织缺血、慢性缺氧、动脉粥样硬化和由药物诱导的毒性引起的组织水肿引起的血管并发症)的化合物。优选地，通过本发明的方法获得的所述EC衍生自患病的受试者。分化来自患病受试者的EC代表在人类背景范式中早期评估药物安全性的独特机会。

在另一实施例中，通过此方法获得的EC用作血视网膜屏障(BRB)和/或血脑屏障(BBB)的体外模型。根据本发明的方法产生的细胞对于建立病理或非病理条件的体外模型是有用的，其中跨内皮屏障功能(例如TBI)的建立或丧失具有相关性。在一特定实施例中，提供一种体外方法以用于鉴定能够i)增加内皮细胞(EC)的体内跨内皮屏障完整性(TBI)或ii)降低EC的体内TBI的候选药物，该方法由以下顺序步骤组成：

a)提供能够建立高跨内皮电阻(TEER)的EC，

b)将EC与候选药物接触并在EC与候选药物接触之前和之后测量体外TEER，或者将EC与候选药物接触并测量与候选药物接触的EC的体外TEER，并且并行地测量未与候选药物接触的EC的体外TEER。

其中(i)相较于未与候选药物接触的EC的体外TEER，与候选药物接触的EC的体外TEER更高指示能够增加EC的体内TBI的药物，并且(ii)相较于未与候选药物接触的EC的体外TEER，与候选药物接触的EC的体外TEER更低指示能够降低EC的体内TBI的药物。

在另一实施例中，提供一种体外方法以用于选择体内应用于患有与破坏或丧失跨内皮屏障完整性(TBI)相关联的疾病的个体的候选药物，该方法由以下顺序步骤组成：

a)提供能够建立高跨内皮电阻(TEER)的EC，

b)将EC与候选药物接触并在EC与候选药物接触之前和之后测量体外TEER，或者将EC与候选药物接触并测量与候选药物接触的EC的体外TEER，并且并行地测量未与候选药物接触的EC的体外TEER。

其中，选择相较于未与候选药物接触的EC的体外TEER，其与候选药物接触的EC的体外TEER更高的候选药物，用于候选药物的体内应用。

如本文所述且如用于鉴定候选药物的方法中所用的能够建立高TEER的EC包括一种或多种如本文所述的表达载体。在一个实施例中，将用于选择候选药物的本文所述方法的步骤a)中的EC作为单层的细胞，特别地是作为细胞的汇合单层提供。包含至少一种表达载体的EC的汇合单层能够建立高TEER，所述至少一种表达载体包含编码至少一种选自由以下项组成的组的转录因子的核酸：TAL1、SOX18、FOXF2、SOX7、FOXC1、ETS1、KLF11、LMO2和LEF1。在一个特定实施例中，形成汇合单层的细胞表达转录因子ETS1、SOX18和SOX7。在优选实施例中，细胞表达转录因子i)ETS1、SOX18、SOX7和TAL1；或(ii)ETS1、SOX18、SOX7和LEF1，最优选为ETS1、SOX18、SOX7和TAL1。

在本发明的背景中，对关注的细胞培养物(例如，与候选药物接触的EC培养物)与基准条件下的细胞培养物(例如，未与候选药物接触的EC培养物)进行比较，测量与TBI相关的参数，例如，TEER。在一个实施例中，相较于未与候选药物接触的EC培养物的测得的体外TEER，与候选药物接触的EC培养物的测得的体外TEER更高，特别地是相较于未与候选药物接触的EC培养物的实测体外TEER，高至少约1.1倍、1.2倍、1.3倍、1.4倍、1.5倍、1.6倍、1.7倍、1.8倍、1.9倍、2倍、5倍或10倍。在一个实施例中，相较于未与候选药物接触的EC培养物的测得的体外TEER，与候选药物接触的EC培养物的测得的体外TEER更低，特别地是相较于未与候选药物接触的EC培养物的实测体外TEER，低至少约1.1倍、1.2倍、1.3倍、1.4倍、1.5倍、1.6倍、1.7倍、1.8倍、1.9倍、2倍、5倍或10倍。

可通过本领域已知的方法和如本文所提供的方法来测量TEER。在一个实施例中，实时测量TEER。在一个实施例中，在金电极上测量细胞的汇合单层的复阻抗谱(Z、R、C)。在一个实施例中，在受控气体环境中实时测量TEER。在一个实施例中，在多电极阵列上测量TEER。在一个实施例中，在8孔、16孔、24孔或96孔多电极阵列上测量TEER，优选地在96孔多电极阵列上测量TEER。在一个实施例中，在来自Applied Biophysics的ECIS Z-θ系统上，优选地在96孔多电极阵列上测量TEER。

因此，一个实施例为根据本发明的方法获得的EC培养物用于确定候选药物的功效的用途，特别地是在高通量模式下。培养物可衍生自健康个体和/或衍生自患病个体，并且可对使用如本文所述的EC培养物进行的功效和/或毒性研究的结果进行整合，以预测候选药物的疾病和/或疗法相关的生理效应。在一个实施例中，评估候选药物的体外功效特征，并选择具有有利功效特征的候选药物以用于进一步开发。进一步开发可包括在非人灵长类物种中对候选药物进行体内测试和/或在人类中进行体内测试。

示例性实施例：

1.一种用于产生能够建立高跨内皮电阻(TEER)的细胞的方法，该方法包括使所述细胞与至少一种转录因子接触的步骤，其中相较于未与所述至少一种转录因子接触的细胞的汇合单层，所述细胞的汇合单层建立更高的跨内皮电阻。

2.根据实施例1所述的方法，其中所述至少一种转录因子独立地选自由以下项组成的组：TAL1、SOX18、FOXF2、SOX7、FOXC1、ETS1、KLF11、LMO2和LEF1。

3.根据实施例1或2中任一项所述的方法，其中所述至少一种转录因子选自由以下项组成的组：ETS1、SOX18和SOX7。

4.根据实施例1至3中任一项所述的方法，其中转录因子为i)ETS1、SOX18、SOX7和TAL1；或(ii)ETS1、SOX18、SOX7和LEF1。

5.根据实施例1至4中任一项所述的方法，其中将编码所述至少一种转录因子的分离的核酸引入细胞中。

6.根据实施例5所述的方法，其中分离的核酸编码转录因子ETS1、SOX18和SOX7。

7.根据实施例5或6中任一项所述的方法，其中分离的核酸编码转录因子(i)ETS1、SOX18、SOX7和TAL1；或(ii)ETS1、SOX18、SOX7和LEF1。

8.根据实施例1至7中任一项所述的方法，其中分离的核酸包含在至少一种表达载体中。

9.根据实施例8所述的方法，其中所述至少一种表达载体独立地选自由以下项组成的组：病毒载体、非病毒载体和质粒载体。

10.根据实施例1至9中任一项所述的方法，其中将1种、2种、3种或4种表达载体引入细胞中。

11.根据实施例1至10中任一项所述的方法，其中细胞为哺乳动物细胞，特别地是人类细胞。

12.根据实施例1至11中任一项所述的方法，其中细胞为内皮细胞(EC)。

13.根据实施例1至12中任一项所述的方法，其中细胞由多能干细胞，特别是由胚胎干细胞或诱导多能干细胞生成。

14.根据实施例13所述的方法，其包括在补充有激活β-连环蛋白和/或Wnt信号传导和/或Hedgehog(HH)信号传导的小分子的引发培养基中孵育多能干细胞，以及通过在诱导培养基中孵育引发的细胞来诱导分化。

15.根据实施例14所述的方法，其中激活β-连环蛋白和/或Wnt信号传导和/或Hedgehog(HH)信号传导的小分子选自由以下项组成的组：糖原合成酶激酶3(Gsk3a-b)的小分子抑制剂、CDC样激酶1(Clk1-2-4)的小分子抑制剂、丝裂原活化蛋白激酶15(Mapk15)的小分子抑制剂、双特异性酪氨酸-(Y)-磷酸化调节激酶(Dyrk1a-b 4)的小分子抑制剂、周期蛋白依赖性激酶16(Pctk1-3 4)的小分子抑制剂、介于β-连环蛋白(或γ-连环蛋白)与共激活蛋白CBP(CREB结合蛋白)和p300(E1A结合蛋白p300)之间的相互作用的平滑化(SMO)激活剂和调节剂。

16.根据实施例14或15中任一项所述的方法，其中引发培养基补充有转化生长因子β(TGFβ)的小分子抑制剂。

17.根据实施例16所述的方法，其中TGFβ的小分子抑制剂为SB431542。

18.根据实施例14至17中任一项所述的方法，其包括将细胞在引发培养基中孵育2天至4天，特别地是3天。

19.根据实施例14至18中任一项所述的方法，其中步骤a)的引发培养基为补充有胰岛素、转铁蛋白和孕酮的无血清培养基。

20.根据实施例14至19中任一项所述的方法，其中激活步骤a)的β-连环蛋白和/或Wnt信号传导和/或Hedgehog(HH)信号传导的小分子为3-(3-氨基-苯基)-4-(1-甲基-1H-吲哚-3-基)-吡咯-2,5-二酮(CP21R7)。

21.根据实施例14至20中任一项所述的方法，其中步骤a)的引发培养基另外地包含重组骨形态发生蛋白-4(BMP4)。

22.根据实施例14至21中任一项所述的方法，其中引发培养基为无血清培养基，该无血清培养基包含10-50μg/ml胰岛素、10-100μg/ml转铁蛋白和10-50nM孕酮，补充有0.5-4μM CP21R7(3-(3-氨基-苯基)-4-(1-甲基-1H-吲哚-3-基)-吡咯-2,5-二酮)和10-50ng/ml重组骨形态发生蛋白-4(BMP4)，特别地，其中引发培养基包含1μM CP21R7和25ng/ml BMP4。

23.根据实施例14至22中任一项所述的方法，其中诱导培养基为补充有VEGF-A(血管内皮生长因子)或胎盘样生长因子1(PLGF-1)和小分子腺苷酸环化酶激活剂的无血清培养基。

24.根据实施例23所述的方法，其中小分子腺苷酸激活剂选自包含以下项的组：佛司可林((3R)-(6aαH)十二氢-6β,10α,10bα-三羟基-3β,4aβ,7,7,10aβ-五甲基-1-氧代-3-乙烯基-1H-萘并[2,1-b]吡喃-5β-基乙酸酯)、8-溴-cAMP(8-溴腺苷-3',5'-环单磷酸)和肾上腺髓质素。

25.根据实施例14至24中任一项所述的方法，其中诱导培养基为补充有1-10μM佛司可林和5-100ng/ml VEGF-A，特别地是200ng/ml VEGF和2μM佛司可林的无血清培养基。

26.根据实施例14至25中任一项所述的方法，其包括将细胞在诱导培养基中孵育18小时至48小时。

27.根据实施例1至26中任一项所述的方法，其另外地包括将步骤a)的产物在适用于EC增殖的扩增培养基中进行孵育。

28.根据实施例27所述的方法，其中扩增培养基补充有VEGF-A，特别地是补充有50ng/ml VEGF-A。

29.根据实施例13至28中任一项所述的方法，其中多能干细胞衍生自患有与血管并发症相关联的疾病的受试者。

30.根据实施例1至29中任一项所述的方法，其中分离的核酸包括至少一种多核苷酸。

31.根据实施例1至30中任一项所述的方法，其另外地包括冷冻、储存和/或重新解冻细胞，其中细胞保持活性。

32.一种表达载体，其包含编码至少一种转录因子的分离的核酸，所述至少一种转录因子选自由以下项组成的组：TAL1、SOX18、FOXF2、SOX7、FOXC1、ETS1、KLF11、LMO2和LEF1。

33.根据实施例32所述的表达载体，其中分离的核酸编码转录因子ETS1、SOX18和SOX7。

34.根据实施例32或33中任一项所述的表达载体，其中分离的核酸编码转录因子(i)ETS1、SOX18、SOX7和TAL1；或(ii)ETS1、SOX18、SOX7和LEF1。

35.根据实施例32至34中任一项所述的表达载体，其选自由以下项组成的组：病毒载体、非病毒载体和质粒载体。

36.一种试剂盒，其包含两种或更多种根据实施例32至35中任一项所述的单个表达载体。

37.根据实施例36所述的试剂盒，其中表达载体编码转录因子ETS1、SOX18和SOX7。

38.根据实施例36或37中任一项所述的试剂盒，其中表达载体编码转录因子(i)ETS1、SOX18、SOX7和TAL1；或(ii)ETS1、SOX18、SOX7和LEF1。

39.一种细胞，其包含根据实施例32至35中任一项所述的表达载体或根据实施例36至38中任一项所述的试剂盒的表达载体。

40.根据实施例39所述的细胞，其中细胞为内皮细胞。

41.根据实施例39或40中任一项所述的细胞，其中细胞为哺乳动物细胞，特别地是人类细胞。

42.根据实施例39至41中任一项所述的细胞，其中细胞由多能干细胞，特别地是由胚胎干细胞或诱导多能干细胞生成。

43.根据实施例1至31中任一项所述的方法，其中所述能够建立高TEER的细胞用于鉴定能够i)增加内皮细胞的体内跨内皮屏障完整性(TBI)或ii)降低内皮细胞的体内TBI的候选药物。

44.根据实施例43所述的方法，该方法包括以下步骤：

(a)提供单层的能够建立高TEER的细胞；

(b)使所述细胞与所述候选药物接触；

(c)在使细胞与候选药物接触之前和之后测量体外TEER，或者测量与候选药物接触的细胞的体外TEER并且并行地测量未与候选药物接触的细胞的体外TEER；

其中(i)相较于未与所述候选药物接触的所述细胞的体外TEER，与所述候选药物接触的所述细胞的体外TEER更高指示能够增加EC的体内TBI的药物，并且(ii)相较于未与所述候选药物接触的所述细胞的体外TEER，与所述候选药物接触的所述细胞的体外TEER更低指示能够降低EC的体内TBI的药物。

45.根据实施例44所述的方法，其中能够建立高TEER的细胞包括根据实施例32至35中任一项所述的表达载体或根据实施例36至38中任一项所述的试剂盒的表达载体中的至少一种。

46.根据实施例43至45中任一项所述的方法，其中在细胞培养支架上(特别是在多孔板上，更特别地是在选自由24孔板、96孔板、384孔板或1536孔板组成的组的多孔板上)提供步骤a)中的细胞。

47.根据实施例43至46中任一项所述的方法，其中TEER指示体外TBI。

48.根据实施例43至47中任一项所述的方法，该方法以高通量模式执行。

49.根据实施例43至48中任一项所述的方法，其用于在药物开发环境中筛选药物分子，特别地是用于高通量筛选候选药物化合物文库。

50.一种用于鉴定能够i)增加内皮细胞的体内跨内皮屏障完整性(TBI)或ii)降低内皮细胞的体内TBI的候选药物的方法，该方法包括以下步骤：

(a)提供根据实施例39至42中任一项所述的细胞的单层；

(b)使所述细胞与所述候选药物接触；

(c)在使细胞与候选药物接触之前和之后测量体外TEER，或者测量与候选药物接触的细胞的体外TEER并且并行地测量未与候选药物接触的细胞的体外TEER；

其中(i)相较于未与所述候选药物接触的所述细胞的体外TEER，与所述候选药物接触的所述细胞的体外TEER更高指示能够增加EC的体内TBI的药物，并且(ii)相较于未与所述候选药物接触的所述细胞的体外TEER，与所述候选药物接触的所述细胞的体外TEER更低指示能够降低EC的体内TBI的药物。

51.如前所述的本发明。

材料和方法

培养并分化人PSC。hPSC系SA001(Englund MC,Caisander G,Noaksson K,Emanuelsson K,Lundin K,Bergh C等人In vitro cellular&developmental biologyAnimal.2010；46(3-4):217-30,Cellartis AB)如所描述的进行分化(Patsch C,Challet-Meylan L,Thoma EC,Urich E,Heckel T,O'Sullivan JF等人Nat Cell Biol.2015；17(8):994-1003)，并具有一些修饰：由具有50ng/mL VEGFA的StemPro组成的扩增培养基仅在第一次分裂时已保留在细胞上。从第二次分裂开始，使用VascuLife VEGF内皮细胞培养基完整试剂盒(LifeLine Cell Technology)培养细胞。加至培养基的补充物的最终组成为：10％FBS、4mM L-谷氨酰胺、0.75U/mL硫酸肝素、5ng/mL FGF-2、5ng/mL EGF、5ng/mL VEGFA、15ng/mL IGF1、1μg/mL氢化可的松半琥珀酸酯、50μg/mL抗坏血酸。将SB431542(10μM)补充至培养基。

产生腺病毒。

以腺病毒的不同感染复数(MOI)测试若干种表达GFP的启动子(UbiC、E1Fα和CMV)(数据未示出)。选择UbiC启动子用于在80MOI下过表达转录因子。克隆在UbiC启动子的下游之后的具有聚腺苷酸化ORF序列的GFP的3'序列。通过在携带编码E1-和E3-缺失的腺病毒基因组的SIR-BAC-Ad5的大肠杆菌DH10B中转化和重组来生成细菌人工染色体。通过将线性化构建体转染至HEK293细胞中、随后使用AdenoONE纯化试剂盒纯化具有复制能力的腺病毒，生成感染性重组腺病毒颗粒。

分析已发布的基因表达数据集。来自EC、平滑肌细胞和PDGFRα的单细胞表达数据的归一化计数表达已从GEO(GSE98816，(Vanlandewijck M,He L,Mae MA,Andrae J,AndoK,Del Gaudio F等人Nature.2018；554(7693):475-80))下载。已使用R包ggplot2绘制具有所选转录因子的平均表达的单细胞表达小提琴图。使用R中的皮尔逊相关系数来完成单细胞表达数据中的基因表达与CLDN5的相关性。原始Affymetrix表达文件从GEO(GSE47067(Nolan DJ,Ginsberg M,Israely E,Palikuqi B,Poulos MG,James D等人Developmentalcell.2013；26(2):204-19)、GSE35802(Tam SJ,Richmond DL,Kaminker JS,Modrusan Z,Martin-McNulty B,Cao TC等人Developmental cell.2012；22(2):403-17)、GSE48209(Coppiello G,Collantes M,Sirerol-Piquer MS,Vandenwijngaert S,Schoors S,Swinnen M等人Circulation.2015；131(9):815-26))下载，并使用Partek Genomic Suite进行分析。探针组数据如下进行归一化：对GC校正和探针序列偏置进行预背景调整，随后进行RMA背景校正和分位数归一化。归一化的探针组数据经log2转换，并且通过中位数平滑(median polish)法进行汇总。通过方差分析模型确定差异表达。对于Nolan等人的研究(Nolan DJ,Ginsberg M,Israely E,Palikuqi B,Poulos MG,James D等人Developmentalcell.2013；26(2):204-19)，其中将脑内皮细胞与若干种其他组织进行比较，使用了RankProdIt(Laing E,Smith CP.BMC research notes.2010；3:221)，一种生成共识脑EC基因标记的基于排序的元分析工具。

细胞裂解和RNA分离。使用350μL RLT裂解缓冲液(Qiagen)+β-巯基乙醇(1％)将培养的EC裂解，随后在室温下涡旋1分钟，并进行速冻。使用自动化Maxwell Total RNA纯化试剂盒(Promega)从细胞裂解物中分离RNA，用DNAse I消化来去除DNA。

RNA-测序和分析。总RNA经过oligo(dT)捕获和富集，并且所得mRNA部分用于构建ccDNA文库。在Illumina HiSeq平台上使用标准方案(TruSeq Stranded Total RNALibrary,Illumina)执行测序，该标准方案在每个样品50个碱基对生成约3000万个读段。使用STAR将读段映射至人类基因组(hg19/Refseq)(Dobin A,Davis CA,Schlesinger F,Drenkow J,Zaleski C,Jha S等人Bioinformatics.2013；29(1):15-21)，并且使用HtSeq的联合模式执行计数(Anders S,Pyl PT,Huber W.Bioinformatics.2015；31(2):166-9)。使用DESeq2执行差异表达(Dobin A,Davis CA,Schlesinger F,Drenkow J,Zaleski C,Jha S等人Bioinformatics.2013；29(1):15-21)。使用GSEA(Subramanian A,Tamayo P,MoothaVK,Mukherjee S,Ebert BL,Gillette MA等人Proceedings of the National Academy ofSciences of the United States of America.2005；102(43):15545-50)使用HallmarksMsigDb数据库(Liberzon A,Birger C,Thorvaldsdottir H,Ghandi M,Mesirov JP,TamayoP.Cell Syst.2015；1(6):417-25)使用加权分析来执行基因集富集分析，其中基因列表按从上调基因至下调基因的倍数变化进行排序，遵循默认条件，忽略小于15个和大于500个基因的基因集。

实例1

为了鉴定可将hPSC-EC分化为高跨内皮屏障阻力的EC的转录因子，分析了不同小鼠血管床的已发布的表达数据集(Tam SJ,Richmond DL,Kaminker JS,Modrusan Z,Martin-McNulty B,Cao TC等人Developmental cell.2012；22(2):403-17.,Coppiello G,Collantes M,Sirerol-Piquer MS,Vandenwijngaert S,Schoors S,Swinnen M等人Circulation.2015；131(9):815-26,Nolan DJ,Ginsberg M,Israely E,Palikuqi B,Poulos MG,James D等人Developmental cell.2013；26(2):204-19)。计算了针对所有转录因子的脑EC与其他血管床EC之间的研究中的倍数变化表达(Ravasi T,Suzuki H,Cannistraci CV,Katayama S,Bajic VB,Tan K等人Cell.2010；140(5):744-52)。鉴定出在脑中的EC中高度上调(>2FC)的转录因子。接下来，对来自最近的脑EC单细胞表达谱研究中的基因表达数据(分析了1445个细胞(Vanlandewijck M,He L,Mae MA,Andrae J,Ando K,Del Gaudio F等人Nature.2018；554(7693):475-80))重新分析，并且鉴定出CLDN5的高表达，CLDN5为介导内皮细胞屏障阻力的重要紧密连接。将CLDN5的基因表达与单细胞脑EC中的其他基因进行关联，以便鉴定可用于预测活性转录因子的基因标记。相关性最高的基因用于使用整合在enrichR中的Transfac和Jasper分析来预测转录因子的活性。用单一的所选转录因子(腺病毒-80MOI)转导hPSC-EC，并且使用ECIS测量跨内皮阻力。通过TAL1和SOX18的过表达以及FOXF2、SOX7、FOXC1、ETS1、KLF11、LMO2和LEF1在屏障稳定化后24小时的屏障增加倾向来观察EC屏障的显著诱导(图1A)。TAL1对屏障阻力的作用最快，其次是SOX18(图1B)。ETS1能够诱导屏障，但动力学较慢(图1B)。使用FITC-葡聚糖通透性测定，表明SOX18、SOX7、ETS1和LEF1的屏障活性最强(图1C)。没有观察到TAL1的效应，因为该测定是在处理后48小时当TAL1效应已下降时执行的(图1C)。在处理后48小时处执行RNA-seq分析，并且测得过表达的转录因子的较高上调。接下来，使用Hallmarks MsgDB数据库执行GSEA分析，专注于与EC屏障诱导相关的途径。在过表达除KLF11外的所有转录因子时，观察到针对所有转录因子的和Wnt信号传导的Hedgehog信号传导的富集。ETS1和FOXF2诱导的途径最多，这表明作用于其他转录因子的上游。此外，ETS1和TAL1能够广泛促进血管生成。KLF11是唯一能够诱导增殖的转录因子。接下来我们专注于途径的各个成员。SOX18和SOX7通常诱导相同基因(Wnt、Hedgehog和Notch信号传导)，这表明它们作用于相同网络中。专注于标志EC基因发现，KLF11、FOXC1和KLF11下调了VEGFR2、VEGFR1和CD34(图1D、1E、1F)，这表明它们可能不适用于EC屏障诱导，因为它们改变EC表型。接下来，分析了参与形成跨内皮细胞屏障的紧密连接的表达。观察到由FOXF2、FOXC1和KLF11对血管内皮钙粘素(VE-Cadherin)进行的下调，而SOX18、TAL1、SOX7和LEF1能够对其进行诱导。SOX7能够诱导PECAM1、GJA1、ESAM和JAM2(图1H、1I、1H、1M)。SOX18能够诱导JAM2和MARVELD2的表达(图1M、1O)。ETS1是唯一能够诱导CLDN5表达的转录因子(图1N)。高阻力屏障表明PLVAP(Zhou Y,Nathans J.2014；31(2):248-56)的低表达以及MFSD2A(Ben-Zvi A,Lacoste B,Kur E,Andreone BJ,MaysharY,Yan H等人Nature.2014；509:507)和TNFRSF21(Tam SJ,Richmond DL,Kaminker JS,Modrusan Z,Martin-McNulty B,Cao TC等人Death receptors DR6 and TROY regulatebrain vascular development.Developmental cell.2012；22(2):403-17)的高表达。本文呈现的数据表明，SOX18，SOX7和TAL1大幅下调PLVAP(图1P)。MFSD2A由SOX18强烈诱导，同时TNFRSF21由SOX18、TAL1、FOXC1、ETS1和LEF1诱导(图1Q、1R)。

实例2

由于转录因子在网络中工作(Neph S,Stergachis AB,Reynolds A,Sandstrom R,Borenstein E,Stamatoyannopoulos JA.Cell.2012；150(6):1274-86)，我们已经探索了组合使用较低水平的转录因子(20MOI)与其他因子的可能性。首先，我们已在20MOI下过表达单一转录因子，并评估了阻力。阻力稳定化后24小时之后，我们未能观察到任何显著诱导(图2A)。在实时ECIS测量中，未观察到显著的屏障阻力诱导，仅观察到SOX18用于屏障诱导的倾向。在FITC-葡聚糖测定中，SOX18引起EC屏障通透性的显著降低，而据发现，TAL1增加通透性，因为经过48小时效果已经降低(图2B)。接下来组合那些表明可诱导屏障的转录因子，该转录因子或者作为单因子(SOX18、TAL1)或者能够诱导参与EC屏障形成的基因(ETS1、LEF1、SOX7)。通过将固定因子与LEF1或TAL1进行结合而在阻力稳定化后24小时处测量阻力，并且观察到两种组合的屏障阻力均显著提高(图2C)。实时ECIS表明，ETS1+SOX18+SOX7+TAL1的组合能够协同诱导屏障。最高诱导量为1.7倍，这高于4种因子的添加剂组合(20MOI)，也高于单因子80MOI的过表达。通过两种组合均观察到FITC-葡聚糖的通透性显著降低。最后，执行qRT-PCR，鉴定出转录因子的组合能够有效诱导Wnt信号传导的(上调MARVEKD2、TSPAN12、TNFRSF19和AXIN2并且下调APCDD1；数据未示出)。

转录因子中的组合性相互作用在细胞类型的分化中至关重要(Ravasi T,SuzukiH,Cannistraci CV,Katayama S,Bajic VB,Tan K等人Cell.2010；140(5):744-52,Neph S,Stergachis AB,Reynolds A,Sandstrom R,Borenstein E,StamatoyannopoulosJA.Cell.2012；150(6):1274-86)。在此工作中鉴定出一种协同作用以诱导EC屏障阻力的转录因子的组合。目前存在的用于体外模拟EC屏障的模型高度复杂，难以准确重现，因此难以适用于药物研发。4种转录因子的简单组合可用于生成高屏障阻力的EC的体外模型，该体外模型可用于寻找治疗EC破坏疾病的新途径和分子标靶。

Claims (16)

1.一种用于产生能够建立高跨内皮电阻(TEER)的细胞的方法，所述方法包括使所述细胞与至少一种转录因子接触的步骤，其中相较于未与所述至少一种转录因子接触的细胞的汇合单层，所述细胞的汇合单层建立更高的跨内皮电阻。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述至少一种转录因子独立地选自由以下项组成的组：TAL1、SOX18、FOXF2、SOX7、FOXC1、ETS1、KLF11、LMO2和LEF1。

3.根据权利要求1或2中任一项所述的方法，其中所述至少一种转录因子选自由以下项组成的组：ETS1、SOX18和SOX7。

4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中所述转录因子为i)ETS1、SOX18、SOX7和TAL1；或(ii)ETS1、SOX18、SOX7和LEF1。

5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中将编码所述至少一种转录因子的分离的核酸引入所述细胞中。

6.根据权利要求5所述的方法，其中所述分离的核酸包含在至少一种表达载体中，特别地，其中所述至少一种表达载体独立地选自由以下项组成的组：病毒载体、非病毒载体和质粒载体。

7.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其中所述细胞为内皮细胞(EC)。

8.一种表达载体，其包含编码至少一种转录因子的分离的核酸，所述至少一种转录因子选自由以下项组成的组：TAL1、SOX18、FOXF2、SOX7、FOXC1、ETS1、KLF11、LMO2和LEF1。

9.根据权利要求8所述的表达载体，所述表达载体为病毒载体、非病毒载体或质粒载体。

10.根据权利要求8或9中任一项所述的表达载体，其中所述分离的核酸编码所述转录因子ETS1、SOX18和SOX7。

11.根据权利要求8至10中任一项所述的表达载体，其中所述分离的核酸编码所述转录因子(i)ETS1、SOX18、SOX7和TAL1；或(ii)ETS1、SOX18、SOX7和LEF1。

12.一种细胞，其包含根据权利要求8至11中任一项所述的表达载体中的一种或多种。

13.根据权利要求12所述的细胞，其中所述细胞为哺乳动物细胞，特别地是人类细胞。

14.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其中所述能够建立高TEER的细胞用于鉴定能够i)增加内皮细胞的体内跨内皮屏障完整性(TBI)或ii)降低内皮细胞的体内TBI的候选药物。

15.根据权利要求14所述的方法，其包括以下步骤：

(a)提供能够建立高TEER的细胞的单层；

(b)使所述细胞与所述候选药物接触；

(c)在使所述细胞与所述候选药物接触之前和之后测量体外TEER，或者测量与所述候选药物接触的所述细胞的体外TEER并且并行地测量未与所述候选药物接触的细胞的体外TEER；

其中(i)相较于未与所述候选药物接触的所述细胞的体外TEER，与所述候选药物接触的所述细胞的体外TEER更高指示能够增加EC的体内TBI的药物，并且(ii)相较于未与所述候选药物接触的所述细胞的体外TEER，与所述候选药物接触的所述细胞的体外TEER更低指示能够降低EC的体内TBI的药物。

16.一种用于鉴定能够i)增加内皮细胞的体内跨内皮屏障完整性(TBI)或ii)降低内皮细胞的体内TBI的候选药物的方法，所述方法包括以下步骤：

(a)提供根据权利要求12或13中任一项所述的细胞的单层；

(b)使所述细胞与所述候选药物接触；

(c)在使所述细胞与所述候选药物接触之前和之后测量体外TEER，或者测量与所述候选药物接触的所述细胞的体外TEER并且并行地测量未与所述候选药物接触的细胞的体外TEER；

其中(i)相较于未与所述候选药物接触的所述细胞的体外TEER，与所述候选药物接触的所述细胞的体外TEER更高指示能够增加EC的体内TBI的药物，并且(ii)相较于未与所述候选药物接触的所述细胞的体外TEER，与所述候选药物接触的所述细胞的体外TEER更低指示能够降低EC的体内TBI的药物。

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