CN105339489B - 多能干细胞向多能肾前体分化的方法 - Google Patents

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Abstract

本申请涉及使多能干细胞(PSC)向表达Six2的多能肾前体细胞分化的方法。这些肾前体细胞能够分化成完全功能性的和完全分化的足细胞。此外，本申请涉及基于化学成分确定的培养基诱导的连接步骤，将人胚胎干细胞(ESC)和经诱导的多能干细胞(iPSCs)分化成表达Six2的确定的肾前体细胞和足细胞的方法。

Description

多能干细胞向多能肾前体分化的方法
发明领域
本申请涉及多能干细胞(PSC)向表达Six2的确定的多能肾前体细胞分化的方法。这些肾前体细胞能够分化成完全功能性的和完全分化的足细胞。此外，本申请涉及基于化学成分确定的培养基诱导的连接步骤，使人胚胎干细胞(ESC)和经诱导的多能干细胞(iPSCs)分化成表达Six2的确定的肾前体细胞和足细胞的方法。
背景
肾细胞用于基础研究、疾病模型、组织工程、药物筛选和体外毒理学。肾具有高度分化和复杂的结构，并且在许多生理过程中具有关键作用，所述生理过程为诸如体液重量摩尔渗透压浓度、流体和电解质平衡的调节、酸碱平衡的调节、代谢废物和外来化学物的排泄，和控制血压的激素的产生和红细胞生成。一旦受损，肾脏很少恢复其功能。肾细胞(例如，足细胞和肾小管细胞)在急性坏死后可以在一定程度上再生。然而，肾脏在具有慢性肾病的患者中一般不再生(Humphreysh Bonventre,2007),导致末期肾功能不全。慢性肾病(CKD)是发病和死亡的主要原因，在西方国家影响11％的成年人口。患有CKD的人遭受生命质量的显著下降。该疾病引起的药物经济负担是非常高的，因为用于移植的供体肾脏存在持久短缺。
哺乳动物肾脏来自间介中胚层(IM)，间介中胚层产生输尿管(ND)，和后肾间充质(MM)。ND产生集尿管系统，其由两个关键细胞类型：主细胞和闰细胞组成。MM限定了帽间充质(CM)并且也产生了间质。CM是肾单位祖先群体并且在肾泡中通过间充质向上皮的转变分化。
肾单位由肾小球簇或血管小球，和肾小管组成。血管小球是高度特化的过滤单位，其为分离废物作为尿排泄。血管小球中血液和尿之间的过滤屏障由高度特化的，称作足细胞的终末分化细胞提供。
会聚的证据提示足细胞的损伤是引发肾功能损失的关键事件之一。足细胞损伤在超高胰岛素血症、血液动力学机制和其他机制之后发生。足细胞的渐进性损失导致肾小球的广泛硬化，伴随着增加的蛋白尿和清除功能的减弱(Wiggins,2007)。
然而，还没有完全理解导致肾脏肾单位中病理生理改变的胰岛素抗药性和再生性质丧失的潜在机理。从而，需要体外细胞模型来研究肾病像CKD的生物学和促进开发新的治疗。
胚胎干(ES)细胞和患者特异性诱导的多能干细胞(iPSCs)是大规模生产肾前体细胞和足细胞的潜在来源，所述细胞用于再生性药物和疾病建模用于药物发现。使用经诱导的多能干细胞(iPSCs)技术(Takahashi,K.&Yamanaka,S.,“Induction of pluripotentstem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by definedfactors”,Cell 126,663–676(2006))，可以通过转导四种确定的因子(Sox2,Oct4,Klf4,c-20Myc)，将体细胞再编程为iPSCs。iPSC技术使得能够产生患者特异性iPSCs，其可以分化为患者特异性肾细胞。这些患者特异性肾细胞可用于例如肾病如慢性肾病(CKD)、局灶性节段性肾小球硬化症(FSGS)、膜性增生性肾小球肾炎、多囊性肾病(PKD)和与2型糖尿病相关的糖尿病肾病的病理生理学的体外建模或用于评估药物毒性。尝试这种体外疾病建模的一个重要的前提是实现有效的、稳健的和大小可变的分化系统(Tiscornia等人,2011)。
以前的将人PSC分化成肾细胞的努力没有实现在人类(Batchelder等人,2009；Lin等人,2010；Mae等人,2013；Narayanan等人,2013；Song等人,2012)或小鼠(Kim andDressler,2005；Mae等人,2010；Morizane等人,2009；Nishikawa等人,2012；Ren等人,2010)中与药物发现运动或再生细胞疗法相关的规模和功效。此外，主要的担心是细胞错误分化成不想要的组织或甚至形成畸胎瘤。为了避免该危险，必须将细胞导向一种分化状态，其一方面为它们提供再生成熟的目的肾细胞的潜力并且另一方面防止错误分化。这可以通过肾转录因子的正确网络的受控活化实现。不幸的是，已经证明在体外获得该精确的分化状态是十分困难的。已经应用生长因子组合[骨形态发生蛋白(BMP)/激活蛋白/视黄酸]和遗传方法，进行了许多尝试来以这种方式诱导多能细胞。然而，多数分化研究，甚至在成功诱导肾谱系基因后，都不能在肾发生中精确地找到该确切状态(IM,MM,CM)，其中ESC沿着肾谱系分化成该状态。
因此，仍待开发用于刺激人多能干细胞分化成肾谱系的高度有效和化学上确定的方法。
Mae等人2013描述了使用确定的诱导步骤，在无血清的培养基中使人多能干细胞分化成表达Osr1的间介中胚层细胞的方案。作者用Accutase解离了未分化的细胞以得到单层细胞并用在第一步中用激活蛋白A、GSK3β抑制剂和ROCK激酶抑制剂并且在第二步中用GSK3β抑制剂诱导分化。作者在第11天仅获得了90％Osr1阳性细胞。在18天后观察到PAX2,LIM1,WT1,CITED2,EYA1和SALL1(正发育肾、性腺和肾上腺皮质的标记基因)的表达，表明作者获得了不同细胞类型和不同分化状态细胞的异质细胞群体。
Lin等人,2010描述了通过降低血清浓度和饲养层密度14天，人胚胎干细胞分化成中胚层肾祖细胞谱系。作者获得了分化的人胚胎细胞的异质性群体，通过流式细胞术将它们分级分离。
Batchelder等人,2009描述了通过以单层在层粘连蛋白或明胶基质上用视黄酸、激活蛋白A、BMP7或BMP4培养胚胎干细胞，使胚胎干细胞向肾谱系直接分化。他们在第4天获得了具有被上调的间介中胚层标记基因(PAX2,SIX2,WT1和OSR1)的细胞。然而，肾前体的标记物和未分化细胞的标记物也在第4天升高。Batchelder等人没有表明该异质性群体进一步分化成确定的细胞类型。通过具有胚状体的阶段实现了胚胎干细胞的分化，该阶段一般限制了该方案的再现性和标准化。
因此，用于人胚胎干细胞分化成肾前体的现有技术方案具有主要的缺陷：首先，多数方案导致异质性细胞群体并且稳定表达后肾间充质标记物的确定肾前体细胞的绝对产率是非常低的。此外，通过多数已知的方法使多能干细胞分化成肾前体细胞的总体时间是非常长的。许多方案需要不确定的要素，如用原代细胞分泌的因子调节的培养基、与饲养层共培养，其限制了这些方案的标准化。此外，许多方案依赖于细胞聚集物或胚状体，其由于它们的异质性性质而限制了这些技术的再现性。
Song等人2012是首次报道的将人诱导的多能干细胞分化成肾足细胞的方案。在补充胎牛血清和不同的生长因子(BMP7、激活蛋白A和视黄酸)的培养基中10天的定向分化后，作者获得了具有足细胞表型的iPS细胞。他们获得了表达足细胞特异性基因但是仍然表达后肾间质基因PAX2和WT1的细胞，表明所获得的足细胞是不成熟的和不完全分化的。Song等人没有描述任何分化的中间阶段，像间介中胚层或后肾间充质。
已知的方案均提供了确定的肾前体细胞，其表达Six2,WT1,和SALL1，PAX2的表达被下调，即，确定的后肾间充质细胞。已知的方案均没有描述肾前体细胞向足细胞的分化。
总之，没有一种方法提供在仅仅六天后以非常高产率表达后肾间充质标记物的肾前体细胞的确定群体。此外，已知的方案均没有提供仅在13天后非常高产率的完全功能和完全分化的足细胞。
本发明提供了与现有技术方案相比，以更短的时间量(6天)和显著增加的产率(高达95％产率的表达标记基因SIX2,SALL1和WT1的肾前体细胞)使多能干细胞分化成确定的后肾间充质肾前体阶段的改进方法。该新方法减少了从多能干细胞获得胚状体或小细胞团的必要性并且去除了迄今已知的方法的低再现性和标准化的主要缺陷。此外，高效率允许在药物发现和安全性评估中、在再生性药物应用中和在制药工业中体外疾病建模中以大规模使用这些确定的前体细胞。此外，该新方法允许选择性调节后肾间充质肾前体细胞，其使得能够在13天后将谱系定型转变成完全分化的足细胞(～99％)。
发明概述
本文提供了将多能干细胞分化成表达SIX2的肾前体细胞的方法，该方法包括步骤：
a)在多能培养基中提供多能干细胞单层，
b)在补充糖原合酶激酶3(Gsk3a-b)的小分子抑制剂的引发培养基中温育细胞，
c)通过在诱导培养基中温育引发的细胞诱导分化。
在一个实施方案中，肾前体细胞表达额外的标记基因WT1和/或SALL1。
在一个实施方案中，糖原合酶激酶3(Gsk3a-b)的小分子抑制剂是3-(3-氨基-苯基)-4-(1-甲基-1H-吲哚-3-基)-吡咯-2,5-二酮。
在一个实施方案中，步骤a)的多能培养基是无血清培养基，其补充有Rho-相关的卷曲螺旋形成蛋白丝氨酸/苏氨酸激酶家族蛋白激酶的抑制剂(ROCK激酶抑制剂)。
在一个实施方案中，ROCK激酶抑制剂选自1-(5-异喹啉磺酰基)高哌嗪)、N-苄基-2-(嘧啶-4-基氨基)噻唑-4-羧酰胺)和(+)-(R)-反式-4-(1-氨基乙基)-N-(4-吡啶基)环己烷羧酰胺二盐酸盐)。
在一个实施方案中，步骤b)的引发培养基是补充胰岛素、转铁蛋白和孕酮的无血清培养基。
在一个实施方案中，步骤b)的引发培养基额外包含重组骨形态发生蛋白-4(BMP4)。
在一个实施方案中，步骤a)包括在多能培养基中温育细胞18小时到30小时。
在一个实施方案中，步骤b)包括在引发培养基中温育细胞2到4天。
在一个实施方案中，步骤c)包括在诱导培养基中温育细胞18到48小时。
在一个实施方案中，诱导培养基是补充有重组骨形态发生蛋白-7(BMP7)的无血清培养基。
在一个实施方案中，诱导培养基是补充有视黄酸的无血清培养基。
在一个实施方案中，所述方法额外包括步骤
d)在适合足细胞增殖的条件下温育步骤c)的产物。
在一个实施方案中，多能干细胞是经诱导的多能干细胞。
在一个实施方案中，经诱导的多能干细胞是人细胞。
在一个实施方案中，从患有肾病的受试者获得经诱导的多能干细胞。
在一个实施方案中，提供了通过根据本文所述的任一个实施方案的方法获得的表达SIX2的肾前体细胞或经分化的足细胞。
在一个实施方案中，提供了通过根据本文所述的任一个实施方案的方法获得的表达SIX2的肾前体细胞或经分化的足细胞的生物库。
在一个实施方案中，提供了通过根据本文所述的任一个实施方案的方法获得的表达SIX2的肾前体细胞或经分化的足细胞或根据本文所述的任一个实施方案的方法获得的表达SIX2的肾前体细胞或经分化的足细胞的生物库作为肾病的体外模型的用途。
在一个实施方案中，提供了包含通过根据本文所述的任一个实施方案的方法获得的表达SIX2的肾前体细胞或经分化的足细胞或根据本文所述的任一个实施方案的方法获得的表达SIX2的肾前体细胞或经分化的足细胞的生物库的药物组合物。
任一上述实施方案可以单独或组合存在。
附图简述
图1:通过基于图像的高内容分析(HCA)对BRY+,PAX2+,LIM1+,iPSCs细胞的定量。人iPS细胞已经在单层条件下培养。定量图：在第1天在多能培养基中BRY+,PAX2+,和LIM1+阳性细胞的百分比。这些发现通过全基因组表达谱分析证实(数据未显示)。
图2：通过基于图像的高内容分析(HCA)定量BRY+,PAX2+,LIM1+,iPSCs衍生的细胞。人iPS细胞已经在单层条件下分化。定量图：第4天在引发培养基中BRY+,PAX2+,和LIM1+阳性细胞的百分比。这些发现通过全基因组表达谱分析证实(数据未显示)。
图3:通过基于图像的高内容分析(HCA)定量WT1+,SIX2+,SALL1+,和PAX2low,iPSCs衍生的多能肾前体。人iPS细胞已经在单层条件下分化。主要小图：定量图：第6天在诱导培养基中WT1+,SIX2+,SALL1+,和PAX2+阳性细胞的百分比。这些发现通过全基因组表达谱分析证实(数据未显示)。
图4:通过基于图像的高内容分析(HCA)定量WT1+,a-ACTININ4+,NEPRHIN+,PODOCIN+和SYNAPTOPODIN+,iPSCs衍生的功能足细胞。人iPS细胞已经在单层条件下分化。主要小图：定量图：第13天在足细胞增殖培养基中WT1+,a-ACTININ4+,NEPRHIN+,PODOCIN+和SYNAPTOPODIN+阳性细胞的百分比。这些发现通过全基因组表达谱分析证实(数据未显示)。
图5：足细胞分化方法的再现性，用作起始hESC。在足细胞分化方法期间受调节的关键标志物的基于图像的高内容分析(HCA)定量。人胚胎干细胞系(来自Cellartis的SA001)已经在单层条件中分化。主要小图：定量图：第4天在引发培养基中PAX2+阳性细胞的百分比；第6天在诱导培养基中SIX2+和SALL1+阳性细胞百分比；第13天在足细胞增殖培养基中WT1+,和a-ACTININ4+阳性细胞百分比。
图6：第13天单层分化的hPSCs衍生的足细胞的表征。hiPSCs已经在单层条件下分化并且在第13天已经测试了对TGFβ(10ng/ml)应激物刺激的功能应答。已经通过免疫细胞化学分析测试了紧密连接标记物ZO-1的表达并通过基于图像的高内容分析(HCA)分析了其细胞定位。上图：代表性图像ZO-1免疫细胞化学，其中显示了在没有TGF Beta(CTR D1–TGFb1)的条件下在DMEMF12培养基中第一天在膜处确定的ZO-1定位，当TGFβ刺激时，我们报道了ZO-1表达的重建和迁移已经在第一天形成了膜到核周区(D1+TGFb1)，并且其通过用TGFβ(D2+TGFb1和(D5+TGFb1)连续刺激而随时间持续。下图：定量图：在不同天数足细胞中ZO-1表达的核周迁移阳性细胞百分数。
图7：在第13天单层分化的hPSCs衍生的足细胞的表征。hiPSCs已经在单层条件下分化并且在第13天已经测试了对血管紧张肽II(AngII)(100nM)应激因子刺激的功能应答。已经通过免疫细胞化学分析测试了紧密连接标记物ZO-1的表达并且通过基于图像的高内容分析(HCA)测定了其细胞定位。上图：代表性图像ZO-1免疫细胞化学，其中其显示了在没有AngII(CTR D1–AngII)的条件下在DMEMF12培养基中第一天确定的ZO-1定位在膜处，当AngII刺激时，我们报道了ZO-1表达的重建和迁移已经在第一天形成了膜到核周区(D1+AngII)，并且其通过用AngII(D2+AngII和(D5+AngII)连续刺激而随时间持续。下图：定量图：在不同天数足细胞中ZO-1表达的核周迁移阳性细胞百分数。
图8：促炎细胞因子应答测定。当在DMEMF12培养基中24小时后用TNFα(1ng/ml和5ng/ml)刺激时，在第13天hPSCs衍生的足细胞上调促炎标记物如IL-8,RANTES,MIP1b和MCP1的表达。主要小图：定量图：所提到的细胞因子的收获上清液中的浓度(pg/ml)。Bio-Plex Pro细胞因子,趋化因子和生长因子测定法用于测量hPSCs-衍生的足细胞应答TNFα的活化。经分泌的细胞因子显著上调(定量图)。
图9：人多能干细胞(PSCs)分化成足细胞的方法的图示。第0天：人PSC用酶解离并使用浓度37000个细胞/cm2平板接种的预先包被的基质胶平板上的多能培养基中(具有Y2763110μM的mTeSR1)。第1天：培养基用新鲜的引发培养基(具有化合物21(CP21R7)1μM和25ng/ml BMP4的N2B27)改变。第4天：用新鲜的诱导培养基(DMEMF12，具有2.5％FBS,100nM视黄酸和50ng/ml BMP7)改变培养基。第6天：细胞用accutase解吸并且离心后用50000个细胞/cm2的浓度平板接种在胶原I包被的平板中的足细胞分化培养基(DMEMF12，具有10％FBS,0.1mM视黄酸和100nM维生素D3)中。在第13天显示了足细胞。
发明详述
本发明提供了与现有技术方案相比，将多能干细胞以更短的时间量(6天)和显著增加的产率(高达95％产率的表达标记基因SIX2,SALL1和WT1的肾前体细胞)分化成确定的后肾间充质肾前体阶段的改进方法。肾前体细胞表达SIX2,SALL1和WT1，它们都是后肾间充质的重要标记物。SIX2，也称作SIX同源异形框2(NCBI Gene ID:10736)，是编码与果蝇属'sine oculis'同源异形框蛋白质同源的蛋白质的脊椎动物基因家族的成员。所编码的蛋白质是一种转录因子，其对于后肾发育具有重要作用。SIX2是后肾间充质的重要标记物(见例如，Nishinakamura et al,2011和Chai et al,2013)。SALL1(全名:SALL1 sal-样1(Drosophila)[Homo sapiens(人)]NCBI Gene ID:6299),也称作TBS；HSAL1；Sal-1；ZNF794。该基因编码的蛋白质是锌指转录阻抑蛋白并且在间充质中多能肾单位前体中高水平表达(Nishinakamura et al,2011)。WT1(全名:维尔姆斯瘤1,也已知为GUD；AWT1；WAGR；WT33；NPHS4；WIT-2；EWS-WT,NCBI基因ID:7490)编码一种转录因子，其在C末端含有四个锌指基序和在N末端的富含脯氨酸/谷氨酰胺的DNA结合结构域。它在泌尿生殖系统的正常发育中具有基本作用，并且它在具有维尔姆斯瘤的一小部分患者中突变。WT1是后肾间充质的一种重要标记物(见例如，Chai et al,2013)。
除了获得确定的后肾间充质肾前体细胞外，该新方法允许选择性调节后肾间充质肾前体细胞，其使得能够在13天后将谱系定型转向完全分化的足细胞(～99％)。
本文提供了使多能干细胞分化为表达SIX2的肾前体细胞的方法，该方法包括步骤：
a)在多能培养基中提供多能干细胞单层，
b)在补充有糖原合酶激酶3(Gsk3a-b)的小分子抑制剂的引发培养基中温育细胞，
c)通过在诱导培养基中温育引发的细胞诱导分化。
在一个实施方案中，所述肾前体细胞是后肾间充质细胞。在一个实施方案中，所述肾前体细胞表达额外的标记基因WT1和/或SALL1。在一个实施方案中，所述肾前体细胞表达WT1,SALL1和SIX2。在另一实施方案中，所述肾前体细胞下调间介中胚层的标记基因。所以，在一个实施方案中，所述肾前体细胞仅以非常低的水平表达PAX2。PAX2(全名Paired Box2,NCBI Gene ID 5076,也称作PAPRS)编码成对盒基因2，其是黑腹果蝇基因prd的许多人同源物之一。该转录因子基因家族的重要特征是保守的DNA结合成对盒结构域。PAX2是间介中胚层的重要标记物(Chai et al,2013,Nishikawa et al,2012)并且在后肾间充质中被下调。在一个实施方案中，肾前体细胞不表达LIM1和/或BRY。LIM1(官方符号LHX1,全名LIM同源异形框1,NCBI Gene ID 3975)编码含有LIM结构域的大蛋白质家族的一个成员，LIM结构域是独特的富含半胱氨酸的锌结合结构域。所编码的蛋白质是对于肾和泌尿生殖系统重要的转录因子：LIM1是肾发生间介中胚层的标记物(Nishikawa et al,2012)。T基因的蛋白质产物(全名:T,brachyury同源物(小鼠)[Homo sapiens(人)]NCBI Gene ID:6862,下文称作“BRY”)Brachyury是一种胚胎核转录因子并且广泛用作中胚层分化的确定基准(Nishikawaet al,2012)。
优选地，培养基在每个步骤之间改变，这意味着在第二种培养基加入细胞前，例如通过抽吸丢弃第一种培养基。
如本文所用的“多能细胞单层”指以单个细胞提供多能干细胞，所述细胞以单层膜附着到粘附性基质，与培养细胞团或胚状体相反，在细胞团或胚状体中多层中细胞的固体块形成附着到粘附性基质到三维结构。
在初始步骤中提供多能干细胞单层对于该方法的再现性和效率是关键的。在一个实施方案中，多能干细胞单层可以通过酶促解离细胞为单个细胞并将它们置于粘附性基质如预先包被的基质胶平板(例如来自BD Bioscience的BD Matrigel hESC,来自Invitrogen的Geltrex hESC,来自Corning的Synthemax)上。
适于解离成单个细胞的酶的实例包括Accutase(Invitrogen),Trypsin25(Invitrogen),TrypLe Express(Invitrogen)。在一个实施方案中，在粘附性基质上平板接种20000到60000个细胞/cm2。本文所用到培养基是多能培养基，其促进多能干细胞作为单个细胞以单层附着和生长。
如本文所用到“多能培养基”指用于将多能干细胞作为单个细胞附着在单层上而保持它们的多能性并且在本领域公知到任何化学成分确定的培养基。在一个实施方案中，多能培养基包含至少一种以下生长因子：碱性成纤维细胞生长因子(bFGF,也描述为成纤维细胞生长因子2,FGF2)和转化生长因子β(TGFβ)。在一个实施方案中，多能培养基是无血清培养基，其补充有Rho相关的卷曲螺旋形成蛋白丝氨酸/苏氨酸激酶(ROCK)家族蛋白激酶的小分子抑制剂(本文也称作ROCK激酶抑制剂)。
从而，在一个实施方案中，上述方法的步骤a)包括在多能培养基中提供多能干细胞单层，其中多能培养基是补充有ROCK激酶抑制剂的无血清培养基。
适合附着的无血清多能培养基的实例是来自Stem Cell Technologies的mTeSR1或TeSR2、来自ReproCELL的Primate ES/iPS细胞培养基或来自Invitrogen的StemPro hESCSFM、来自Lonza的X-VIVO、来自Sigma Aldrich的Stemline多能干细胞培养基、来自Stemgent的NutriStem XF/FF培养基、来自Invitrogen的Essential 8TM Medium(原型)和来自ScienCell Research Laboratories的STEMium。
本文可用的ROCK激酶抑制剂的实例是法舒地尔(1-(5-异喹啉磺酰基)高哌嗪),Thiazovivin(N-苄基-2-(嘧啶-4-10基氨基)噻唑-4-甲酰胺)和Y27632((+)-(R)-反式-4-(1-氨基乙基)-N-(4-吡啶基)环己烷甲酰胺二盐酸盐,例如来自Tocris bioscience的目录号:1254)。在一个优选的实施方案中，ROCK激酶抑制剂是Y27632。在一个实施方案中，多能培养基是补充2-20μM Y27632,优选5-10μM Y27632的无血清培养基。在另一个实施方案中，多能培养基是补充2-20μM法舒地尔的无血清培养基。在另一个实施方案中，多能培养基是补充0.2-10μM Thiazovivin的无血清培养基。
在一个实施方案中，上述方法的步骤a)包括在多能培养基中提供多能干细胞单层并在多能培养基中温育(生长)该单层一天(24小时)。在另一实施方案中，上述方法的步骤a)包括在多能培养基中提供多能干细胞单层并在多能培养基中温育该单层18小时到30小时，优选23到25小时。
在另一实施方案中，上述方法的步骤a)包括在多能培养基中提供多能干细胞单层，并在该多能培养基中温育该单层一天(24小时)，其中该多能培养基是补充ROCK激酶抑制剂的无血清培养基。在另一实施方案中，上述方法的步骤a)包括在多能培养基中提供多能干细胞单层，并在该多能培养基中温育该单层18小时到30小时，优选23到25小时，其中该多能培养基是补充ROCK激酶抑制剂的无血清培养基。
如本文所用的“用于引发的合适培养基”，也描述为“引发培养基”指用于向肾前体细胞引发多能干细胞的任何化学成分确定的培养基。如本文所用，“引发培养基”指包含至少一种因子，如小分子的培养基，所述因子活化β-连环蛋白(钙粘蛋白相关蛋白，β1；人基因名CTNNB1)途径和/或Wnt受体信号途径和/或hedgehog(HH)信号途径，促进间介中胚层的诱导活性。在一个优选实施方案中，引发培养基包含糖原合酶激酶3(Gsk3a-b)的小分子抑制剂。在一个实施方案中，糖原合酶激酶3(Gsk3a-b)的小分子抑制剂是3-(3-氨基-苯基)-4-(1-甲基-1H-吲哚-3-基)-吡咯-2,5-二酮。
当在引发培养基中温育时，多能干细胞开始随时间改变细胞形态并且细胞增殖增加了。“引发”步骤通过参与间介中胚层转变(例如，BRY,PAX2,LIM1,GATA2,VIMENTIN,SMA,HAND1,KDR和FOXa2的上调(低表达))和多能性相关基因和标记物的下调(例如，OCT4(POU5F1),NANOG,SOX2,REX1(ZFP42),LEFTY1,LEFTY2,TDGF1,DNMT3B,GABRB3,GDF3,TERT,见例如Tan et al,2007)的特定基因和标记物的表达来定义。
在一个实施方案中，活化β-连环蛋白(钙粘蛋白相关蛋白，β1；人基因名CTNNB1)途径和/或Wnt受体信号途径和/或hedgehog(HH)信号途径的小分子选自糖原合酶激酶3(Gsk3a-b)的小分子抑制剂、CDC-样激酶1(Clk1-2-4)的小分子抑制剂、促分裂原活化蛋白激酶15(Mapk15)的小分子抑制剂、双特异性酪氨酸-(Y)-磷酸化调节的激酶(Dyrk1a-b 4)的小分子抑制剂、细胞周期蛋白依赖的激酶16(Pctk1-3 4)的小分子抑制剂、Smoothened(SMO)激活子和β-连环蛋白(或γ-连环蛋白)15和辅激活蛋白CBP(CREB结合蛋白)与p300(E1A结合蛋白p300)之间相互作用的调节剂。
优选地，糖原合酶激酶3(Gsk3a-b)抑制剂是基于吡咯烷二酮的GSK3抑制剂。如本文所用的“基于吡咯烷二酮的GSK3抑制剂”涉及GSK3α和GSK3β的具有低IC50值的选择性细胞可渗透的ATP竞争性抑制剂。在一个实施方案中，基于吡咯烷二酮的GSK3抑制剂选自3-(2,4-二氯苯基)-4-(1-甲基-1H-吲哚-3-基)-1H-吡咯-2,5-二酮(SB216763),3-[(3-氯-4-羟苯基)氨基]-4-(2-硝基苯基)-1H-吡咯-2,5-二酮(SB415286),N6-{2-[4-(2,4-二氯-苯基)-5-咪唑-1-基-嘧啶-2-基氨基]-乙基-3-硝基-吡啶-2,6-二胺2HCl,3-咪唑并[1,2-a]吡啶-3-基-4-[2-(吗啉-4-羰基)-251,2,3,4-四氢-[1,4]二氮杂
Figure BDA0000888571870000131
并[6,7,1-hi]吲哚-7-基]-吡咯-2,5-二酮,9-溴-7,12-二氢-吲哚并[3,2-d][1]苯并氮杂
Figure BDA0000888571870000132
-6(5H)-酮(Kenpaullone),9-溴-7,12-二氢-吡啶并[3′,2′:2,3]氮杂
Figure BDA0000888571870000133
并[4,5-b]吲哚-6(5H)-酮(CHIR99021)和(3-(3-氨基-苯基)-4-(1-甲基-1H-吲哚-3-基)-吡咯-2,5-二酮(CP21R7,本文也称作“化合物21”；见例如L.Gong et al；Bioorganic&Medicinal Chemistry Letters20(2010),1693-1696)。在一个实施方案中，CDC-样激酶1(Clk1-2-4)抑制剂选自苯并噻唑和3-氟-N-[1-异丙基-6-(1-甲基-吡啶-4-基氧)-1,3-二氢-苯并咪唑-(2E)-亚基]-5-(4-甲基-1H-吡唑-3-磺酰基)-苯甲酰胺。在一个实施方案中，促分裂原活化蛋白激酶15(Mapk15)抑制剂选自4-(4-氟苯基)-2-(4-甲基亚硫酰基苯基)-5-(4-吡啶基)-1H-咪唑(SB203580)和5-异喹啉磺酰胺。
在一个实施方案中，双特异性酪氨酸-(Y)-磷酸化调节的激酶5(Dyrk1a-b 4)抑制剂选自6-[2-氨基-4-氧代-4H-噻唑-(5Z)-亚基甲基]-4-(四氢-吡喃-4-基氧)-喹啉-3-腈。
在一个实施方案中，smoothened激活子是Purmorphamine(2-(1-萘氧基)-6-(4-吗啉代苯胺基)-9-环己基嘌呤。β-连环蛋白(或γ-连环蛋白)和辅激活蛋白CBP(CREB结合蛋白)与p300(E1A结合蛋白p300)之间相互作用的调节剂的实例是IQ-1(2-(4-乙酰基-苯基偶氮)-2-[3,3-二甲基-3,4-二氢-2H-异喹啉-(1E)-亚基]-乙酰胺,和ICG-001((6S,9aS)-6-(4-羟基-苄基)-8-萘-1-基甲基-4,7-二氧代-六氢-15吡嗪并[1,2-a]嘧啶-1-羧酸苯甲酰胺(WO2007056593)。
在一个实施方案中，引发培养基是补充胰岛素、转铁蛋白和孕酮的无血清培养基。在一个实施方案中，无血清培养基补充10-50μg/ml胰岛素、10-100μg/ml转铁蛋白和10-50nM孕酮，优选30-50μg/ml胰岛素、20-50μg/ml转铁蛋白和10-30nM孕酮。适于引发的无血清培养基的实例是补充N2和B27(都来自Gibco)的N2B27培养基(N2B27是DMEM/F12(Gibco,Paisley,UK)的1:1混合物)，N3培养基(由DMEM/F12(Gibco,Paisley,UK),25μg/ml胰岛素,50μg/ml转铁蛋白,30nM亚硒酸钠,20nM孕酮,100nM腐胺(Sigma)组成)，或25
Figure BDA0000888571870000141
NS-A Proliferation培养基(Stemcell Technologies)。在一个实施方案中，引发培养基是补充胰岛素、转铁蛋白、孕酮和糖原合酶激酶3(Gsk3a-b)的小分子抑制剂的无血清培养基。
优选地，小分子抑制剂是(3-(3-氨基-苯基)-4-(1-甲基-1H-吲哚-3-基)-吡咯-2,5-二酮，在本文也称作CP21R7。在一个实施方案中，引发培养基是包含10-50μg/ml胰岛素,10-100μg/ml转铁蛋白和10-50nM孕酮和0.5-4μM CP21R7(3-(3-氨基-苯基)-4-(1-甲基-1H-吲哚-3-基)-吡咯-2,5-二酮)的无血清培养基。在一个实施方案中，引发培养基包含1μMCP21R7。在一个实施方案中，本文所述的任一实施方案的引发培养基额外包含重组骨形态发生蛋白-4(BMP4)。在一个优选实施方案中，引发培养基是包含10-50μg/ml胰岛素,10-100μg/ml转铁蛋白,10-50nM孕酮,0.5-4μM CP21R7(3-(3-氨基-苯基)-4-(1-甲基-1H-吲哚-3-基)-吡咯-2,5-二酮)和10-50ng/ml重组骨形态发生蛋白-4(BMP4)的无血清培养基。
在一个实施方案中，上文所述方法的步骤b)包括在引发培养基中温育细胞至少3天(72小时)。在一个实施方案中，上文所述方法的步骤b)包括在引发培养基中温育细胞2到4天(48小时到96小时)。在另一实施方案中，上文所述方法的步骤b)包括在引发培养基中温育细胞，其中引发培养基是补充CP21R7(3-(3-氨基-苯基)-4-(1-甲基-1H-吲哚-3-基)-吡咯-2,5-二酮)的无血清培养基。优选地，引发培养基补充0.5–4μM CP21R7(3-(3-氨基-苯基)-4-(1-30甲基-1H-吲哚-3-基)-吡咯-2,5-二酮),最优选1-2μM CP21R7(3-(3-氨基-苯基)-4-(1-甲基-1H-吲哚-3-基)-吡咯-2,5-二酮)。在一个实施方案中，引发培养基额外包含重组骨形态发生蛋白-4(BMP4)。在另一实施方案中，上文所述方法的步骤b)包括在引发培养基中温育细胞，其中引发培养基是补充CP21R7(3-(3-氨基-苯基)-4-(1-甲基-1H-吲哚-3-基)-吡咯-2,5-二酮)的无血清培养基，并且温育细胞3天(72小时)。在一个此类实施方案中，引发培养基额外包含重组骨形态发生蛋白-4(BMP4)。
在另一实施方案中，上文所述方法的步骤b)包括在引发培养基中温育细胞，其中引发培养基是补充CP21R7(3-(3-氨基-苯基)-4-(1-甲基-1H-吲哚-3-基)-吡咯-2,5-二酮)的无血清培养基，并且温育细胞2到4天(48小时到96小时)。在一个此类实施方案中，引发培养基额外包含重组骨形态发生蛋白-4(BMP4)。
如本文所用到“诱导培养基”指用于在单层上将引发的细胞诱导成SIX2和/或WT1和/或SALL1阳性肾前体细胞的任何化学成分确定的培养基。在一个实施方案中，肾前体细胞表达所有三种标记基因SIX2,WT1和SALL1并且也称作SWS+肾前体细胞。在一个实施方案中，肾前体细胞是后肾间充质细胞。在另一实施方案中，肾前体细胞下调间介中胚层的标记基因。所以，在一个实施方案中，肾前体细胞仅以极低水平表达PAX2。在一个实施方案中，肾前体细胞不表达LIM1和/或BRY。
适于诱导的培养基的实例是DEMEM/F12,RPMI 1640(Invitrogen)或William's E培养基(Invitrogen)。
在一个实施方案中，诱导培养基补充骨形态发生蛋白(BMP),像BMP4,BMP7或其他BMPs像BMP2,BMP3,BMP 5,BMP 6,BMP 8a,BMP 8b,或BMP 9。
优选地，诱导培养基是补充BMP7的培养基。在一个此类实施方案中，诱导培养基补充20–80ng/ml BMP7,优选50ng/ml BMP7。
使用本文给出的新方法，现在可能从多能干细胞分化表达SIX2的肾前体细胞，产率高达95％。步骤c)的产物可以在细胞培养物中容易地鉴定为SIX2和WT1和/或SALL1阳性细胞。
在一个实施方案中，诱导培养基额外包含视黄酸(RA)，像全反式视黄酸或9-顺式视黄酸。在另一实施方案中，诱导培养基包含视黄酸抑制剂或视黄酸激动剂。视黄酸抑制剂和视黄酸激动剂是本领域公知的。
优选地，诱导培养基是补充RA的培养基。在一个此类实施方案中，诱导培养基补充50-200nM RA,优选100nM RA。
在一个实施方案中，诱导培养基补充RA和BMP7。
在一个实施方案中，诱导培养基额外包含1-5％血清，优选2.5％血清。其中可用的血清是例如本领域公知的胎牛血清。在另一实施方案中，诱导培养基补充氨基酸，例如，来自Sigma-Aldrich(目录号M7145)的非必需氨基酸溶液。
在另一实施方案中，诱导培养基额外包含β-巯基乙醇。
在一个实施方案中，上述方法的步骤c)包括在诱导培养基中温育细胞2天(48小时)。
在一个实施方案中，上述方法的步骤a)到c)一起花了6天。
在一个实施方案中，上述实施方案中所述的方法可用于将多能干细胞分化为足细胞。在一个实施方案中，任一上述实施方案中所述的方法额外包括步骤：
d)在适于足细胞增殖的条件下温育步骤c)的产物。
典型地，收获并在化学成分确定的增殖培养基中增殖步骤c)中获得的SWS+细胞。在一个实施方案中，步骤d)包括将步骤c)中获得的细胞在增殖培养基中温育24-168小时，优选48-96小时。
如本文所用的增殖培养基是补充生长因子和/或增强足细胞的增殖和存活的小分子的培养基。
在一个实施方案中，增殖培养基是化学补加培养基(SP培养基)。本文可用的SP培养基是例如DMEM/F12培养基(例如Invitrogen或Gibco Cat num.31331-028)或RPMI 1640(Gibco Cat num.61870-010)或DMEM培养基)。在一个实施方案中，增殖培养基补充2-10％血清，例如，2-10％胎牛血清。在一个实施方案中，增殖培养基补充Knock-out血清替代品(Knock-out serum replacement)(例如，来自Invitrogen,目录号10828028)。
在另一实施方案中，增殖培养基补充0.1-0.5mM RA,优选0.1mM RA。在另一实施方案中，增殖培养基补充10-200nM维生素D3,优选100nM维生素D3。在一个实施方案中，增殖培养基补充RA和维生素D3。在一个实施方案，增殖培养基进一步包含稳定的谷氨酰胺。在优选实施方案中，增殖培养基是补充10％血清,100nM维生素D3和0.1mM视黄酸的DMEM/F12培养基。
通过本文所述方法获得的肾前体细胞和足细胞可以扩增数代。
任一上述实施方案可以单个或组合存在。
在本发明的一个实施方案中，提供了产生患者特异性或健康个体特异性肾前体细胞或足细胞的方法。为此，用本文所述方法使从患者或健康个体得到的人诱导的多能干细胞(iPSCs)分化成肾前体细胞或足细胞。通过对从患者或健康个体获得的体细胞重编程序为多能干细胞，通过本领域已知的方法获得患者特异性人iPSCs。例如，成纤维细胞、角质形成细胞或脂肪细胞可以通过皮肤活组织检查从需要治疗的个体或健康个体获得并通过本领域已知的方法重编程序成经诱导的多能干细胞。适合作为经诱导的多能干细胞的其他体细胞是从血液样品获得的白细胞或从尿样获得的上皮细胞或其他细胞。患者特异性诱导的多能干细胞然后通过本文所述的方法分化成患者特异的或健康个体特异性肾前体细胞或足细胞。在本发明的另一方面，提供了通过前述方法任一项产生的肾前体细胞或足细胞群体。优选地，肾前体细胞或足细胞的群体是患者特异的，例如，来自从患病个体获得的iPSCs。在另一实施方案中，从健康个体获得肾前体细胞或足细胞的群体。
患者来源的肾前体细胞或足细胞代表疾病相关的体外模型，用于研究肾病的病理生理学，像急性肾功能衰竭/急性肾损伤、奥尔波特综合征、血管紧张肽抗体和局灶性节段性肾小球硬化症、APOL1突变、CFHR5肾病、巴特综合征、塌陷性肾小球病、糖尿病和与CMV相关的糖尿病性肾病、法布里病、肾小球疾病、HIV相关肾病(HIVAN)、脂蛋白肾小球病、狼疮肾病、狼疮肾炎、膜性增生性肾小球肾炎、结节性肾小球硬化、感染后肾小球肾炎、链球菌感染后肾小球肾炎。在一个实施方案中，通过该方法得到的肾前体细胞或足细胞用于筛选逆转、抑制或预防肾细胞功能障碍引起的肾病的化合物，所述肾病为例如慢性肾疾病(CDK)、局灶性节段性肾小球硬化症(FSGS)、膜性增生性肾小球肾炎、多囊肾病(PKD)和与2型糖尿病相关的糖尿病肾病。优选地，通过本文所述的本发明方法获得的肾前体细胞或足细胞来自患病的受试者。在另一实施方案中，通过该方法获得的肾前体细胞或足细胞用于筛选和评估新靶标和用于治疗糖尿病和糖尿病性肾病的化合物。优选地，通过本文所述的本发明的方法获得的肾前体细胞或足细胞来自受肾疾病影响的个体，所述肾疾病像例如慢性肾疾病(CDK)、局灶性节段性肾小球硬化症(FSGS)、膜性增生性肾小球肾炎、多囊肾病(PKD)和与2型糖尿病相关的糖尿病肾病。分化来自患病受试者的肾前体细胞和/或足细胞代表在人背景范例中早期评估药物安全性的独特机会。在另一实施方案中，通过该方法获得的足细胞用作肾单位的体外模型。
本发明提供了为患者供应来自具有相同的HLA类型的健康个体的适于移植的特定足细胞或相容细胞的方法，所述细胞均在无异物条件下得到。“无异物培养条件”指包含仅仅人和重组来源组分的培养基和用于附着的基质。从而，防止了与异种病原体污染的风险并且肾细胞安全用于再生性药物。用本文所述的方法使患者特异性诱导的多能干细胞(iPSCs)向患者特异性足细胞的分化代表了产生自体来源的足细胞的容易获得和可再生的技术。在细胞治疗中自体和/或相容性细胞的使用相对于非自体细胞的使用提供了主要优点，非自体细胞可能受到免疫学排斥。相反，自体细胞不可能引起显著的免疫应答。
在本发明的另一方面，设想产生患者特异性肾前体细胞或足细胞的生物库。在一个实施方案中，产生了包含从健康个体或/或患者获得的肾前体细胞或足细胞的不同群体的生物库。本文所用的术语“生物库”指从不同个体或物种采集的生物样品文库。样本和相关数据的存档集合意在用于研究目的，目的是处理与血管并发症相关的疾病。在另一实施方案中，生物库用于血管再生性药物方法。
在另一方面，本发明提供了治疗组合物，其包含通过任一前述方法产生的肾前体细胞或足细胞或包含任一前述细胞群体。优选地，治疗组合物还包含生理学相容的溶液，包括例如，具有5％人血清白蛋白的磷酸缓冲盐水。该治疗组合物可用于治疗、预防或稳定肾疾病，如慢性肾疾病(CDK)、局灶性节段性肾小球硬化症(FSGS)、膜性增生性肾小球肾炎、多囊肾病(PKD)和与2型糖尿病相关的糖尿病肾病。例如，成纤维细胞、角质形成细胞或脂肪细胞可以通过皮肤活组织检查从需要治疗的个体或健康个体获得并通过本领域已知的方法("Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by definedfactors."Takahashi等人,2007,Cell131,861-72)重编程序成经诱导的多能干细胞。适合作为经诱导的多能干细胞的其他体细胞是从血液样品获得的白细胞或从尿样获得的上皮细胞或其他细胞。患者特异的经诱导的多能干细胞然后通过本文所述的方法分化成足细胞，收获并导入个体以治疗所述疾病。通过本发明的方法产生的肾前体细胞或足细胞可以用于置换或辅助患病或受损组织的正常功能。
本发明的另一实施方案是肾前体细胞或足细胞的生物库用于治疗肾疾病的用途。生物库优选包含从具有一些HLA类型的患者或健康个体获得的肾前体细胞或足细胞。将从健康供体获得的细胞移植到具有相容HLA类型到需要治疗的个体避免了通常与异种细胞移植相关的排斥反应的严重问题。通常，通过施用免疫抑制剂或抗排斥药物如环孢菌素防止或减少了排斥。然而，此类药物具有显著的不利副作用，例如，免疫抑制、致癌性质、肾毒性以及非常昂贵。本发明消除了，或至少显著减少了对抗排斥药物如环孢菌素、imulan、FK-506、糖皮质激素和雷帕霉素和其衍生物的需要。
关于本发明的治疗方法，肾前体细胞或足细胞向哺乳动物的施用不意在局限于具体施用方式、剂量或给药频率；本发明设想所有施用方式，包括肌内、静脉内、关节内、损伤内、皮下或足以提供足以预防或治疗疾病的剂量的任何其他途径。肾前体细胞或足细胞可以以单次剂量或多次剂量施用于哺乳动物。当施用多次剂量时，剂量可以彼此相隔例如一周、一月、一年或十年。在施用所述细胞之前、期间或之后施用一种或多种生长因子、激素、白介素、细胞因子、小分子或其他细胞以使它们进一步偏向具体细胞类型。
如本文所用当术语“分化”指将较少分化的细胞转化成体细胞，例如，将多能干细胞转化成肾前体细胞或足细胞的一个或多个步骤。通过本文所述的方法实现多能干细胞向肾前体细胞或足细胞的分化。
如本文所用的术语“干细胞”指能够自我更新的细胞。如本文所用的“未分化的干细胞”指能够分化成不同细胞类型的干细胞。如本文所用，如本文所用的“多能干细胞”指可以产生多种细胞类型的细胞的干细胞。多能干细胞(PSCs)包括人胚胎干细胞(hESCs)和人诱导的多能干细胞(hiPSCs)。人诱导的多能干细胞可以来自重新编程的体细胞，例如，通过用本领域已知的方法转导四种确定的因子(Sox2,Oct4,Klf4,c-Myc)。人体细胞可以得自健康个体或患者。这些供体细胞可以从任何合适来源容易地获得。本文优选的是允许分离供体细胞而对人体没有侵入性操作的来源，例如，人皮肤细胞、血细胞或可从尿样得到的细胞。尽管优选人多能干细胞，但是该方法也可应用于非人多能干细胞，如灵长类、啮齿动物(例如，大鼠、小鼠、兔)或狗多能干细胞。
如本文所用，“肾前体细胞”或“后肾间充质肾前体阶段的细胞”是分化成后肾间充质阶段并且表达至少细胞标记物SIX2的细胞，并且在优选实施方案中，还表达细胞标记物SALL1和WT1。如本文所用的肾前体细胞的特征是多能阶段和间介中胚层阶段标记基因像PAX 2,BRY和/或LIM1的下调。这些细胞具有分化成所有肾细胞的能力，包括产生足细胞的能力。
如本文所用的“间介中胚层细胞”是表达一种或多种细胞标记物BRY,LIM1和PAX2并且不表达或仅以非常低水平表达SIX2,SALL1和WT1的细胞。
如本文所用的“标记物的下调”指标记基因和其基因产物的表达水平的下降。该术语可以指在一个分化阶段与另一个分化阶段相比，某种标记基因和其基因产物表达水平降低。“标记物的下调”也可以指细胞中标记基因和其基因产物的完全消除，例如，不再能够检测到标记基因和其基因产物的表达。
如本文所用的“标记物的上调”指标记基因和其基因产物的表达水平的增加。该术语可以指在一个分化阶段与另一个分化阶段相比，某种标记基因和其基因产物表达水平升高。“标记物的上调”也可以指标记基因和其基因产物的表达从不(可检测的)表达到标记基因和其基因产物的低、中或高水平表达。
“标记物的表达”指某种基因转录成mRNA并且通常随后翻译成蛋白质(其基因产物)，其在细胞中发挥某种功能。标记物的表达可以通过本领域已知的方法在RNA水平或蛋白质水平上检测和定量。本文优选的是在蛋白质水平上检测标记物的表达，例如，通过用结合标记物的抗体测试某种蛋白质的存在。
“足细胞”是位于肾脏中的一种细胞类型并且也称作肾小球上皮细胞。足细胞具有特征性细胞表型：它们由主体和从其分枝的细的延伸物组成并且具有特征性的长的突起小块，或“足突出”。如本文所用的“足细胞”是表达至少特异性表面标记物podocin并且表达选自α-辅肌动蛋白-4、WT1、synaptopodin或nephrin的一种或多种其他表面标记物/细胞标记物的细胞。其中优选的是成熟足细胞，即，不表达标记物PAX2的足细胞。
Podocin是在肾小球通透性的调节中起作用并且作为质膜和细胞骨架之间的接头起作用的肾小球蛋白。它由NPHS2(全名nephrosis 2,特发性的,类固醇抗性的(podocin),NCBI基因ID 7827,也称作PDCN或SRN1)编码。
α辅肌动蛋白属于血影蛋白基因超家族，其代表一组不同的细胞骨架蛋白，包括α和β血影蛋白和肌养蛋白。α肌动蛋白是在不同细胞类型中具有多种作用的肌动蛋白结合蛋白。在非肌细胞中，沿着微丝束和粘着型连接发现细胞骨架同种型，在那里它参与肌动蛋白与膜的结合。相反，骨骼肌、心肌和平滑肌同种型位于Z膜和类似的致密体，在那里它们帮助锚定肌纤维肌动蛋白丝。该基因编码非肌肉的α肌动蛋白同种型，其浓缩在细胞质中并且被认为参与转移过程。该基因中的突变已经与局灶性节段性肾小球硬化症关联。α辅肌动蛋白-4由ACTN4(全名辅肌动蛋白,α4,NCBI基因ID 81,也称作FSGS；FSGS1；ACTININ-4)编码。
Synaptopodin是肌动蛋白相关的蛋白质，其可以在基于肌动蛋白的细胞形状和运动性中起作用。名称synaptopodin来自该蛋白质与突触后密集区和树突棘和与肾足细胞的结合。该蛋白质由SYNPO(NCBI Gene ID11346)编码。
Nephrin是细胞粘附分子的免疫球蛋白家族成员，其在肾脏中的肾小球过滤屏障中发挥功能。该基因主要在肾组织中表达，并且该蛋白质是在肾小球足细胞的裂孔隔膜中发现的1型跨膜蛋白。认为裂孔隔膜作为超滤膜发挥功能以排除白蛋白和尿形成中的其他血浆大分子。它由Nphs1,也称作CNF,NPHN或nephrin(NCBI Gene ID 4868)编码。该基因中的突变导致Finnish型先天性肾病1，特征是严重的蛋白尿和裂孔隔膜和足突的丧失。
如本文所用，“肾病”涉及由肾细胞的损伤、丧失或功能障碍引起的任何疾病。肾病的实例是慢性肾疾病(CDK)、局灶性节段性肾小球硬化症(FSGS)、膜性增生性肾小球肾炎、多囊肾病(PKD)和与2型糖尿病相关的糖尿病肾病。其他实例是急性肾功能衰竭/急性肾损伤、奥尔波特综合征、血管紧张肽抗体和局灶性节段性肾小球硬化症、APOL1突变、CFHR5肾病、巴特综合征、塌陷性肾小球病、糖尿病和与CMV相关的糖尿病性肾病、法布里病、肾小球疾病、HIV相关肾病(HIVAN)、脂蛋白肾小球病、狼疮肾病、狼疮肾炎、膜性增生性肾小球肾炎、结节性肾小球硬化、感染后肾小球肾炎、链球菌感染后肾小球肾炎。
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实施例
材料和方法
CP21R7:3-(3-氨基-苯基)-4-(1-甲基-1H-吲哚-3-基)-吡咯-2,5-二酮(本文中也称作“化合物21”；见例如L.Gong et al；Bioorganic&Medicinal Chemistry Letters 20(2010),1693-1696)。
Figure BDA0000888571870000251
细胞培养:
多能培养基:补充Y27632 ROCK激酶抑制剂的TeSR1(可从例如Tocris bioscience商购，目录号:1254)。
引发培养基:DMEM:F12(1:1)plus Glutamax(Invitrogen)和Neurobasal培养基(N2B27培养基)的1:1混合物，具有N2和B27补充物(全部Invitrogen),具有1μM CP21R7(Roche)和25ng/ml BMP4(Prepotech)。
诱导培养基:DMEM:F12 plus Glutamax(Invitrogen)培养基，补充2.5％FBS(Lifetechnologies)0.1mM非必需氨基酸混合物(NEAA),0.1mM b-ME,100nM视黄酸(Sigma)和50ng/ml BMP7(Prepotech)。
足细胞增殖培养基:DMEM:F12 plus Glutamax(Invitrogen)，补充10％FBS(Invitrogen),0.1mM视黄酸(Sigma)和100nM维生素D3(Sigma)。
人ESCs:SA001,LOT CA001于2001年3月20日在
Figure BDA0000888571870000261
University andCellartis AB Arvid Wallgrens Backe 20,SE-413 46
Figure BDA0000888571870000262
SWEDEN分离，遵守瑞典所有适用的法律并且得到
Figure BDA0000888571870000263
University和Uppsala University的地方研究道德委员会的批准。胚胎来源：冷冻，IVF的剩余物。供者机密性：为了保护供者的隐私和秘密，已经去除了与胚胎供体相关的所有标识符。从而，不能获得供者的信息。值得注意的是，捐赠并没有导致供者的任何金钱获取。我们批准用hESCs工作和得到不同的细胞系。负责的伦理委员会(Ethikkommission beider Basel)和联邦公共健康办公室批准了我们的研究计划(Ref-No:R-FP-S-1-0002-0000)。
人iPSCs：目录号：来自SBI System Biosciences的SC101A-1货号110218-FF/来自Life technologies
Figure BDA0000888571870000264
Episomal hiPSC Line的目录号：A13777。
人多能干细胞常规地培养在hESC-合格的Matrigel(BD Bioscience)中TeSR1培养基(Stem cell Technologies)中。培养物每4-6天用StemPro Accutase(Invitrogen)传代。为了增加存活力，在酶解离前1小时，TeSR1培养基补充10μM ROCK-抑制剂。
1.多能干细胞分化成足细胞的方法
(i)在使用StemPro Accutase(Invitrogen)对hPSC集落进行酶解离前，将细胞用10μM ROCK-抑制剂Y27632预温育1小时。将37,000单个hPSCs/cm2平板接种在生长因子减少的Matrigel(BD bioscience)包被的细胞培养板上补充10μM ROCK-30抑制剂的TeSR1培养基中。
(ii)在第1天，附着培养基交换成补充1μM化合物21(CP21R7)和25ng/ml BMP4(R&DSystems)的N2B27(Gibco)培养基。不改变培养基的情况下，细胞培养额外的3天。
(iii)在第4天，引发培养基交换成补充100nM视黄酸(Sigma,R2625)和50ng/mlBMP7(Peprotech)的DMEMF12(Gibco)培养基。不改变培养基的情况下，细胞培养额外的2天。
(iv)在第6天，细胞用accutase溶液解离并以40000-50000个细胞/cm2的密度平板接种在胶原蛋白I包被的平板上补充0.1mM视黄酸(Sigma,R2625)和100nM维生素D3(Sigma)的DMEMF12(Gibco)培养基中额外7天。每隔一天改变增殖培养基。
2.用于定量的免疫化学分析和基于图像的高内容分析(HCA)
细胞用含有4％低聚甲醛的PBS在室温下固定20分钟。用PBS三次洗涤后，细胞用5％BSA溶液(封闭缓冲液)封闭60分钟。当探测细胞内抗原时，在封闭缓冲液中包括0.5％Triton-X。将样品用2％BSA中稀释的初级抗体在4℃下过夜染色，接着与合适的二级抗体在室温温育1小时。细胞核通过DAPI在室温染色5分钟。通过Operetta高内容成像系统(Perkielmer)获取荧光并分析，接着进行基于计算机的图像分析(ImageJ,基于Java的图像处理程序)。使用合适的过滤器获得来自相同视野的单独图像并输出为jpg文件。
将初级抗体用于工作的表
Figure BDA0000888571870000271
Figure BDA0000888571870000281
3.iPSCs-来源的足细胞的功能表征
应答促炎刺激，足细胞表达特定细胞因子，包括IL-8,Rantes,MIP-1b和MCP1。Bio-Plex Pro细胞因子、趋化因子和生长因子测定(Biorad,M50-0KCAF0Y)。过夜血清饥饿后，hiPS来源的足细胞暴露在两种不同浓度的TNFa(1和5ng/ml)下24小时。处理后，收集上清液并用于用Bio-Plex Pro细胞因子、趋化因子和生长因子测定试剂盒(Biorad,M50-0KCAF0Y)定量细胞因子、趋化因子和生长因子释放。按照生产商的说明书进行测定。为了确定分化系统是否产生真正的足细胞，我们用促炎TNFa攻击iPS来源的足细胞并分析细胞因子和趋化因子释放。分泌组(Secretome)分析清楚地表明当进行TNF-α处理时(图8)，与原代人足细胞相比，IL-8,Rantes,MIP-1b和MCP1的上清液浓度以依赖剂量的方式增加(Saleem等人,JASN,2002；数据未显示)。

Claims (9)

1.将诱导的多能干细胞分化成表达SIX2的肾前体细胞的方法，该方法包括步骤：
a)在多能培养基中提供多能干细胞单层，
b)在补充有糖原合酶激酶3的小分子抑制剂和重组骨形态发生蛋白-4的引发培养基中温育细胞，其中所述糖原合酶激酶3的小分子抑制剂是3-(3-氨基-苯基)-4-(1-甲基-1H-吲哚-3-基)-吡咯-2,5-二酮，
c)通过在诱导培养基中温育引发的细胞诱导分化，其中所述诱导培养基是补充有重组骨形态发生蛋白-7和视黄酸的无血清培养基；
其中
步骤a)包括在多能培养基中温育细胞18小时到30小时，
步骤b)包括在引发培养基中温育细胞2到4天，
步骤c)包括在诱导培养基中温育细胞18到48小时；
并且
(i)所述糖原合酶激酶3的小分子抑制剂的浓度为0.5-4μM；
(ii)所述重组骨形态发生蛋白-4的浓度为10-50ng/ml；
(iii)所述重组骨形态发生蛋白-7的浓度为20-80ng/ml；
(iv)所述视黄酸的浓度为50-200nM。
2.权利要求1的方法，其中所述肾前体细胞表达额外的标记基因WT1和/或SALL1。
3.权利要求1或2的方法，其中步骤a)的多能培养基是无血清培养基，该无血清培养基补充有Rho-相关的卷曲螺旋形成蛋白丝氨酸/苏氨酸激酶家族蛋白激酶的抑制剂。
4.权利要求3的方法，其中所述Rho-相关的卷曲螺旋形成蛋白丝氨酸/苏氨酸激酶家族蛋白激酶的抑制剂选自1-(5-异喹啉磺酰基)高哌嗪)、N-苄基-2-(嘧啶-4-基氨基)噻唑-4-甲酰胺)和(+)-(R)-反式-4-(1-氨基乙基)-N-(4-吡啶基)环己烷甲酰胺二盐酸盐)。
5.权利要求1或2的方法，其中步骤b)的引发培养基是补充胰岛素、转铁蛋白和孕酮的无血清培养基。
6.权利要求1或2的方法，其额外包括步骤
d)在适合足细胞增殖的条件下温育步骤c)的产物。
7.权利要求1或2的方法，其中所述诱导的多能干细胞是人细胞。
8.权利要求1或2的方法，其中所述诱导的多能干细胞从患有肾病的受试者获得。
9.权利要求1或2的方法，其还包括产生表达SIX2的肾前体细胞或经分化的足细胞的生物库。
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