JP2016529891A - 多能性幹細胞の複数能力を有する腎前駆細胞への分化のための方法 - Google Patents
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Abstract
Description
本出願は、多能性幹細胞(PSC)を、Six2を発現する定義された複数能力を有する腎前駆細胞へ分化させるための方法に関する。これらの腎前駆細胞は、完全に機能的な、かつ完全に分化した有足細胞へ分化することができる。さらに、本出願は、化学的に定義された培地による誘導の連鎖的な段階に基づいて、ヒト胚性幹細胞(ESC)および人工多能性幹細胞(iPSC)を、Six2を発現する定義された腎前駆細胞および有足細胞へ分化させるための方法に関する。
腎細胞は、基礎研究、疾患モデル、組織工学、薬物スクリーニング、およびインビトロ毒性学において使用される。腎臓は、高度に分化して複雑化した構造を有し、体液の重量オスモル濃度、体液と電解質のバランスの調節、酸-塩基のバランスの調節、代謝老廃物および外来化学物質の排出、ならびに、血圧および赤血球生成を制御するホルモンの産生などの、多くの生理学的過程において中心的な役割を有する。腎臓は、ひとたび損傷を受けると、その機能を回復することはめったにない。腎細胞(例えば、有足細胞および尿細管細胞)は、急性壊死後にある程度まで再生することができる。しかしながら、腎臓は、一般的に、慢性腎疾患を有する患者において再生せず(Humphreys and Bonventre, 2007)、末期腎不全をもたらす。慢性腎疾患(CKD)は、西洋諸国において成人人口の11%に影響を及ぼす、罹患率および死亡率の大きな原因である。CKDを有する人々は、生活の質の実質的な損失に苦しむ。移植用のドナー腎は永続的に不足しているため、この疾患によって引き起こされる薬剤経済学的負担は、非常に大きい。
以下の段階を含む、多能性幹細胞を、SIX2を発現する腎前駆細胞へ分化させるための方法が、本明細書において提供される:
(a)多能性培地中に単層の多能性幹細胞を提供する段階、
(b)グリコーゲン合成酵素キナーゼ3(Gsk3a-b)の低分子阻害剤を補給した刺激培地中で該細胞をインキュベートする段階、
(c)誘導培地中で、該刺激された細胞のインキュベートによって分化を誘導する段階。
(d)有足細胞の増殖に適する条件下で段階(c)の生成物をインキュベートする段階
をさらに含む。
本発明は、先行技術プロトコルと比較して、より短い量の時間(6日)で、かつ有意に増大した収率(最大95%の収率の、マーカー遺伝子SIX2、SALL1、およびWT1を発現する腎前駆細胞)で、多能性幹細胞を定義された後腎間充織腎前駆段階へ分化させるための改善された方法を提供する。腎前駆細胞は、SIX2、SALL1、およびWT1を発現し、これらはすべて、後腎間充織の重要なマーカーである。SIXホメオボックス2(NCBI Gene ID: 10736)としても公知であるSIX2は、ショウジョウバエ属(Drosophila)の「sineoculis」ホメオボックスタンパク質に相同のタンパク質をコードする脊椎動物遺伝子ファミリーのメンバーである。コードされるタンパク質は、後腎の発生に重要な役割を有する転写因子である。SIX2は、後腎間充織の重要なマーカーである(例えば、Nishinakamura et al, 2011およびChai et al, 2013を参照されたい)。SALL1(完全な名称:SALL1 sal様1(ショウジョウバエ属)[ホモ・サピエンス(ヒト)]NCBI Gene ID: 6299)は、TBS;HSAL1;Sal-1;ZNF794としても公知である。この遺伝子によってコードされるタンパク質は、亜鉛フィンガー転写リプレッサーであり、間充織中の多分化能ネフロン前駆体において高発現している(Nishinakamura et al, 2011)。WT1(完全な名称:ウィルムス腫瘍1、GUD;AWT1;WAGR;WT33;NPHS4;WIT-2;EWS-WTとしても公知である、NCBI Gene ID:7490)は、C末端に4個の亜鉛フィンガーモチーフを、およびN末端にプロリン/グルタミンに富むDNA結合ドメインを含有する転写因子をコードする。これは、泌尿生殖器系の正常な発生において不可欠な役割を有し、ウィルムス腫瘍を有する患者の小さなサブセットにおいて変異している。WT1は、後腎間充織の重要なマーカーである(例えば、Chai et al, 2013を参照されたい)。
(a)多能性培地中に単層の多能性幹細胞を提供する段階、
(b)グリコーゲン合成酵素キナーゼ3(Gsk3a-b)の低分子阻害剤を補給した刺激培地中で該細胞をインキュベートする段階、
(c)誘導培地中で、該刺激された細胞のインキュベートによって分化を誘導する段階。
(d)有足細胞の増殖に適する条件下で段階(c)の生成物をインキュベートする段階
をさらに含む。
CP21R7:3-(3-アミノ-フェニル)-4-(1-メチル-1H-インドール-3-イル)-ピロール-2,5-ジオン(本明細書において「化合物21」とも呼ばれる;例えば、L. Gong et al; Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters 20 (2010), 1693-1696を参照されたい)。
多能性培地:Y27632 ROCKキナーゼ阻害剤(市販、例えば、Tocris bioscienceのカタログ番号:1254)を補給したTeSR1。
(i)StemPro Accutase(Invitrogen)を用いるhPSCコロニーの酵素による解離の前に、細胞を1時間、10μM ROCK阻害剤Y27632と共にプレインキュベートした。cm2あたり37.000個の単一hPSCを、10μM ROCK-30阻害剤を補給したTeSR1培地中で、増殖因子を低減させたMatrigel(BD bioscience)コーティングされた細胞培養プレート上にプレーティングした。
細胞を、4%パラホルムアルデヒドを含有するPBSで20分間、室温で固定化した。PBSで細胞を3回洗浄した後、細胞を次に、5% BSA溶液(ブロッキング緩衝液)で60分間ブロッキングした。細胞内抗原について探測する場合は、0.5% Triton-Xを、ブロッキング緩衝液中に含めた。試料を、2% BSA溶液中に希釈した一次抗体で一晩、4℃で染色し、続いて、適切な二次抗体と1時間、室温でインキュベートした。核を、DAPIによって5分間、室温で染色した。Operetta High Content Imaging System(Perkielmer)およびそれに続くコンピュータベースの画像分析(ImageJ、Javaベースの画像加工処理プログラム)によって、蛍光を獲得し、分析した。適切なフィルターを用いて、同一視野から別々の画像を獲得し、jpgファイルとしてエクスポートした。
有足細胞は、炎症誘発性刺激に応答して、IL-8、Rantes、MIP-1b、およびMCP1を含む特定のサイトカインを発現する。Bio-Plex Pro Cytokine, Chemokine and Growth factor assay(Biorad, M50-0KCAF0Y)。一晩の血清飢餓後、hiPS由来有足細胞を、2種の異なる濃度のTNFa(1および5 ng/ml)に24時間曝露した。処理後、上清を回収して使用し、Bio-Plex Pro Cytokine, Chemokine and Growth factor assay kit(Biorad, M50-0KCAF0Y)を用いてサイトカイン、ケモカイン、および増殖因子の放出を定量化した。アッセイは、製造業者の指示に従って行った。分化システムが真の有足細胞を生成するか否かを判定するために、iPS由来有足細胞を炎症誘発性TNFaでチャレンジし、サイトカインおよびケモカインの放出について解析した。セクレトーム解析により、TNF-α処理時に(図8)、初代ヒト有足細胞(Saleem et al., JASN, 2002;データは示されていない)に匹敵する、用量依存様式でのIL-8、Rantes、MIP-1b、およびMCP1の上清濃度の増大が、明らかに示された。
Claims (21)
- 以下の段階を含む、多能性幹細胞を、SIX2を発現する腎前駆細胞へ分化させるための方法:
(a)多能性培地中に単層の多能性幹細胞を提供する段階、
(b)グリコーゲン合成酵素キナーゼ3(Gsk3a-b)の低分子阻害剤を補給した刺激培地中で該細胞をインキュベートする段階、
(c)誘導培地中で、該刺激された細胞のインキュベートによって分化を誘導する段階。 - 腎前駆細胞が、さらなるマーカー遺伝子であるWT1および/またはSALL1を発現する、請求項1記載の方法。
- グリコーゲン合成酵素キナーゼ3(Gsk3a-b)の低分子阻害剤が、3-(3-アミノ-フェニル)-4-(1-メチル-1H-インドール-3-イル)-ピロール-2,5-ジオンである、請求項1または2記載の方法。
- 段階(a)の多能性培地が、タンパク質キナーゼのRho結合コイルドコイル形成タンパク質セリン/スレオニンキナーゼファミリーの阻害剤(ROCKキナーゼ阻害剤)を補給した無血清培地である、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
- ROCKキナーゼ阻害剤が、1-(5-イソキノリンスルホニル)ホモピペラジン、N-ベンジル-2-(ピリミジン-4-イルアミノ)チアゾール-4-カルボキサミド、および(+)-(R)-トランス-4-(1-アミノエチル)-N-(4-ピリジル)シクロ-ヘキサンカルボキサミドジヒドロクロリドの群から選択される、請求項4記載の方法。
- 段階(b)の刺激培地が、インスリン、トランスフェリン、およびプロゲステロンを補給した無血清培地である、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
- 段階(b)の刺激培地が、組換え骨形態形成タンパク質-4(BMP4)をさらに含む、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
- 段階(a)が、18時間〜30時間の、多能性培地における細胞のインキュベートを含む、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
- 段階(b)が、2〜4日間の、刺激培地における細胞のインキュベートを含む、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
- 段階(c)が、18時間〜48時間の、誘導培地における細胞のインキュベートを含む、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
- 誘導培地が、組換え骨形態形成タンパク質-7(BMP7)を補給した無血清培地である、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
- 誘導培地が、レチノイン酸を補給した無血清培地である、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
- (d)有足細胞の増殖に適する条件下で段階(c)の生成物をインキュベートする段階
をさらに含む、前記請求項のいずれか一項記載の方法。 - 多能性幹細胞が人工多能性幹細胞である、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
- 人工多能性幹細胞がヒト細胞である、請求項14記載の方法。
- 人工多能性幹細胞が、腎疾患を患う対象から得られたものである、請求項14または15記載の方法。
- 前記請求項のいずれか一項記載の方法によって得られた、SIX2を発現する腎前駆細胞または分化した有足細胞。
- 請求項1〜16のいずれか一項記載の方法によって得られた、SIX2を発現する腎前駆細胞または分化した有足細胞のバイオバンク。
- 腎疾患のためのインビトロモデルとしての、請求項17記載の細胞または請求項18記載のバイオバンクの細胞の使用。
- 請求項17記載の細胞または請求項18記載のバイオバンクの細胞を含む、治療用組成物。
- 本質的に本明細書に記載される、方法および使用。
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