JP2019058176A

JP2019058176A - 新規方法

Info

Publication number: JP2019058176A
Application number: JP2018218938A
Authority: JP
Inventors: レイクウォルフ; Reik Wolf; ピートジュリアン; Peat Julian; ホレティモシィ; Hore Timothy; クルエゲルクリステル; Krueger Christel
Original assignee: Babraham Institute
Current assignee: Babraham Institute
Priority date: 2012-12-17
Filing date: 2018-11-22
Publication date: 2019-04-18
Also published as: CN105051188A; GB201222693D0; JP2016500260A; EP2931881A1; CA2894822A1; US20190264223A1; US20160186207A1; AU2013366092A1; WO2014096800A1

Abstract

【課題】細胞の分化能を高める方法の提供。【解決手段】ＴＥＴファミリー遺伝子、その誘導体、またはそのフラグメントを細胞内へ導入するステップを含む、細胞の分化能を高める（例えば、全能性状態まで）方法。【選択図】図９

Description

本発明は、ＴＥＴファミリー遺伝子、その誘導体、またはそのフラグメントを細胞内へ
導入することにより、細胞の分化能を高める方法に関する。本発明はまた、高められた分
化能を有する細胞を調製するための方法およびキット、ならびに該細胞の使用にも関する
。

幹細胞の使用は、ヒト疾患の治療を急進的に変える可能性があると考えられている。幹
細胞は、高レベルの分化能および自己再生を有する、つまり複数の細胞種に分化すること
ができる、ということが知られている。この有利な特性は、臓器および組織の生成または
修復に使用できる可能性がある。

胚性幹（ＥＳ）細胞の分離が、幹細胞技術および研究に大躍進をもたらしている。ＥＳ
細胞は多能性であるため、それらを複数の細胞種に分化するように誘導することができ、
その後、例えば、科学的動物モデルまたは細胞移植療法に使用することができる。しかし
ながら、ＥＳ細胞は、疾患の治療において現在直面する大部分の問題に対する解決策とし
ては、未だ期待に応えていない。例えば、ＥＳ細胞の移植は、現在の臓器移植と同じよう
に、拒絶の問題に直面することが示されている。さらには、これらの細胞の使用は、ＥＳ
細胞の採取中に胚が破壊されるという視点で、倫理的問題を提起する。

近年、科学者は、患者自身の体細胞を多能性状態に脱分化させることを可能にするため
にＥＳ細胞に伴う倫理的問題を克服する誘導多能性幹（ｉＰＳ）細胞を生成する（国際公
開第２００７／０６９６６６号に記載されるように）方法を開発している。しかしながら
、ヒト、およびげっ歯類系統を除く他の哺乳動物からのｉＰＳ細胞およびＥＳ細胞は、ほ
ぼ全ての場合において、完全な多分化能の欠如に悩まされている。

さらには、いかなる種からの多能性細胞、ＥＳ、およびｉＰＳ細胞も、胚体外細胞系列
の組織を形成することができず、完全な生体を作るためには、ホスト胚盤胞に導入されな
ければならない。

国際公開第２０１０／０３７００１号は、幹細胞を再プログラムするために、ＴＥＴタ
ンパク質のファミリーを使用してＤＮＡのシトシンメチル化状態を調節および検出する方
法を記載している。

したがって、幹細胞技術での使用のために、全能性細胞などのより高い分化能を有する
細胞を生成するための方法が必要とされている。

本発明の第１の態様に従って、細胞の分化能を高める方法が提供され、該方法は、ＴＥ
Ｔファミリー遺伝子、その誘導体、またはそのフラグメントを細胞内へ導入するステップ
を含む。

本発明のさらなる態様に従って、ＴＥＴファミリー遺伝子、その誘導体、またはそのフ
ラグメントを細胞内へ導入するステップを含む、高められた分化能を有する細胞を調製す
る方法が提供される。

本発明のさらなる態様に従って、本明細書内で定義される方法により入手可能な高めら
れた分化能を有する細胞が提供される。

本発明のさらなる態様に従って、配列番号１１または１３のＴＥＴ３イソ型を含む核酸
が提供される。

本発明のさらなる態様に従って、本明細書内で定義される核酸を含むベクターが提供さ
れる。

本発明のさらなる態様に従って、細胞の分化能を高める方法において、本明細書内で定
義される核酸、または本明細書内で定義されるベクターの使用が提供される。

本発明のさらなる態様に従って、療法における使用のための、本明細書内で定義される
高められた分化能を有する細胞が提供される。

本発明のさらなる態様に従って、ＴＥＴファミリー遺伝子、その誘導体、またはそのフ
ラグメントを含有するベクターと、本明細書内で定義される方法に従ってキットを使用す
るための説明書とを含むキットが提供される。

５’Ｔｅｔ３遺伝子座の概略図。図面は一定の縮尺率ではない。点線は、複数のエクソンおよびイントロンを表す。矢印は、プロモーター使用解析に使用されるｑＲＴ−ＰＣＲプライマーの位置を示す（実施例の項を参照）。示される開始コドンは、全長ＴＥＴ３タンパク質とインフレームである。「Ｃａｔ」＝触媒ドメイン。

プロモーター使用およびＣＸＸＣコーディングエクソンの取り込み。転写レベルは、参照遺伝子Ａｔｐ５ｂおよびＨｓｐｃｂの平均と比較して示される。卵母細胞（単一の値を有する）を除き、示される値は、エラーバーとして示される範囲を有する２つの生物学的複製の平均である。ＥＢ：胚様体。

Ｔｅｔ３変異体１をトランスフェクトされたソート後の細胞におけるｑＰＣＲによる候補遺伝子の発現解析。転写レベルは、参照遺伝子Ａｔｐ５ｂおよびＨｓｐｃｂの平均と比較して示される。Ｍｕｔ：触媒的に不活性な突然変異体。

Ｔｅｔ３変異体１をトランスフェクトされたソート後の細胞におけるｑＰＣＲによる対照遺伝子の発現解析。転写レベルは、参照遺伝子Ａｔｐ５ｂおよびＨｓｐｃｂの平均と比較して示される。Ｍｕｔ：触媒的に不活性な突然変異体。

Ｔｅｔ３変異体３をトランスフェクトされたソート後の細胞におけるｑＰＣＲによる候補遺伝子の発現解析。転写レベルは、参照遺伝子Ａｔｐ５ｂおよびＨｓｐｃｂの平均と比較して示される。Ｍｕｔ：触媒的に不活性な突然変異体。

Ｔｅｔ３変異体１をトランスフェクトされたソート後の細胞における発現レベルの散布図。各点は、単一の遺伝子を表す。ｑＰＣＲにより検査される候補遺伝子（実施例４参照）および数個のファミリーメンバーは、黒で示され、いくつかの遺伝子例には矢印が付けられている。

Ｔｅｔ３変異体１触媒的突然変異体をトランスフェクトされたソート後の細胞における発現レベルの散布図。各点は、単一の遺伝子を表す。ｑＰＣＲにより検査される候補遺伝子（実施例４参照）および数個のファミリーメンバーは、黒で示され、いくつかの遺伝子例には矢印が付けられている。

Ｔｅｔ３変異体１を発現している胚性幹細胞における単細胞発現データの結果を示すヒートマップ。

ＴＥＴ３を発現する分集団中の全能性様細胞の割合を示すグラフ。

ＴＥＴ３発現の定量ＲＴ−ＰＣＲ解析。転写レベルは、Ｅ１４（＝１）と比較して示される。値は、２つの個別の複製の平均であり、エラーバーはその範囲を示す。

６日間の分化転換分析後のコロニー形態の位相差顕微鏡図。画像は、観察されたコロニー形態の範囲を代表するものである。

６日間の分化転換分析後のＣＤ４０発現のフローサイトメトリー解析。ＴＳ細胞培地内で６日間培養後、細胞をヤギα−ＣＤ４０一次抗体（Ｒ＆ＤＳｙｓｔｅｍｓ）で、次いで抗ヤギＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６４７二次抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で、染色した。Ａ：個々の細胞の、前方散乱幅（ＦＳＣ−Ｗ）の値をＹ軸上に、および６４０ｎｍ蛍光（すなわち、ＣＤ４０シグナル）をＸ軸上に示すドットプロット。ＣＤ４０陽性を判定する閾値、およびこのレベルを超える細胞のパーセンテージが示される。合計細胞集団におけるスチューデントのｔ検定は、Ｅ１４ＥＳ細胞と比較して、双方のＴＥＴ３過剰発現細胞株でＣＤ４０陽性細胞の非常に著しい増加を示す（どちらのケースもｐ＜０．０００１）。Ｂ．各細胞株内でＣＤ４０陽性と判定される細胞のパーセンテージの定量化。

本明細書内での「高められた分化能」への言及は、異なる細胞種へ分化するための増大
された能力を有する細胞を指す。全能性細胞は、最も高い分化能を有する細胞であること
が知られている。この後に多能性、複能性、少能性、次いで単能性細胞が続く。

一実施形態において、細胞の分化能は、真の多能性状態のような、多能性状態まで高め
られる。

本明細書内での「多能性」への言及は、複数種の細胞へと分化する可能性を有する細胞
を指す。多能性細胞は胚体外細胞へ分化できないため、多能性細胞単独では、胎児または
成体に発達することはできないという点において、これらの細胞は、全能性細胞よりも制
限されている。したがって、完全な生体を作るためには、ドナー胚盤胞細胞を使用しなけ
ればならない。

本明細書内に記載される場合、ｉＰＳ細胞を生成する方法は当該技術分野において既知
であるが、これらの細胞は、それらのドナー体細胞のエピジェネティックな記憶を保持す
るために、完全な多分化能が欠如していることが示されている（Ｋｉｍｅｔａｌ．（
２０１１）Ｎａｔｕｒｅ４６７，ｐ．２８５−２９０）。したがって、これらの細胞は
、複数の細胞種へと分化するための、生来の多能性細胞と同一の能力を有しないために、
真の多能性であると見なされていない。

したがって、本明細書内での「真の多能性状態」への言及は、複数の細胞種へと分化す
るための、生来の多能性細胞と同一の能力を有する、すなわち、完全な多能性である細胞
を指す。特に、真の／完全な多能性細胞は、胚の３つの胚葉、すなわち、内胚葉、中胚葉
、または外胚葉のいずれにも分化できる。

一実施形態において、細胞の分化能は、全能性状態に高められる。

したがって、本発明のさらなる態様に従って、細胞を全能性状態へ再プログラムする方
法が提供され、該方法は、ＴＥＴファミリー遺伝子、その誘導体、またはそのフラグメン
トを細胞内へ導入するステップを含む。

本明細書内での「全能性」への言及は、胚体外組織を含む細胞をはじめとする、全種類
の細胞へと分化する可能性を有する細胞を指す。したがって、全能性細胞は、ホストによ
り作られる胚盤胞細胞の使用を必要とすることなく、完全な生体へと発達することができ
るという利点を有する。「全能性」細胞への言及は、「全能性様」細胞、すなわち、全能
性細胞との高い類似度、例えば、全能性細胞との高い転写性またはエピジェネティックな
類似度を有する細胞を含むことを理解されたい（分化全能性の獲得をもたらす遺伝子発現
シフトを記載している、Ｍａｃｆａｒｌａｎｅｔａｌ．（２０１２）Ｎａｔｕｒｅ
４８７，ｐ．５７−６３を参照）。さらには、本明細書内で使用される場合の「全能性」
または「全能性様」細胞への言及は、多能性細胞よりも高い分化能を有する細胞を指す。

本明細書内での「体細胞」への言及は、生殖細胞および未分化幹細胞を除いた、生体の
身体を構成するいかなる種類の細胞をも指す。したがって、体細胞は、例えば、皮膚細胞
、心臓細胞、筋肉細胞、骨細胞、または血液細胞を含む。

細胞が特定の細胞種（例えば、皮膚、筋肉、血液等）へと分化すると、それらは異なる
細胞種になる能力（または可能性）を失う。したがって、細胞を所望の細胞種へと操作で
きるように、多能または全能分化能の状態に戻るように細胞を再プログラムすることが有
利である。

本明細書内での「再プログラム」への言及は、細胞が分化の異なる状態へと再変換され
るプロセスを指す。本明細書内に記載される発明は、細胞を全能性状態へと再プログラム
し、それによってその分化能および複数の細胞種へと分化する能力を増大させる。

現在の幹細胞技術は、ＥＳ細胞およびｉＰＳ細胞の使用に依存する。しかしながら、こ
れらの細胞種はどちらも、いくつかの短所を有する。例えば、ｉＰＳ細胞は、生来の多能
性細胞内には存在しない、それらのドナー体細胞のエピジェネティックな記憶を保持する
ことが示されている（Ｋｉｍｅｔａｌ．（２０１１）Ｎａｔｕｒｅ４６７，ｐ．２
８５−２９０）。さらには、ヒト、およびげっ歯類系統を除く他の哺乳動物からのＥＳお
よびｉＰＳ細胞は、真の多能性ではないことが示されている。本発明は、細胞の分化能の
状態を、例えば全能性状態に増大させて、ヒトＥＳおよびｉＰＳ細胞に伴うこれらの問題
を克服する方法を提供する。

本明細書に示されるように、ＴＥＴファミリー遺伝子（例えば、Ｔｅｔ３遺伝子）の使
用は、細胞培養物中の全能性様幹細胞の数を増加させることができる（図９参照）。全能
性様幹細胞のこの分集団は、栄養膜様細胞に分化形質転換する能力によって評価されるよ
うに、高められた分化能を有することが示されている（実施例７参照）。したがって、こ
れらの細胞は、ドナー胚盤胞細胞を必要とすることなく、栄養膜などの胚体外組織を形成
することができる。

一実施形態において、本細胞は多能性細胞である。別の実施形態において、本細胞は体
細胞である。

一実施形態において、多能性細胞は哺乳動物からである。さらなる実施形態において、
哺乳動物はヒトである。

多能性細胞は、様々な供与源、例えば、胚性幹（ＥＳ）細胞または誘導多能性幹（ｉＰ
Ｓ）細胞から入手することができ、それらは市販されており、または国際公開第２００７
／０６９６６６号に記載される方法を使用して入手してもよい。一実施形態において、多
能性細胞は誘導多能性幹（ｉＰＳ）細胞である。別の実施形態において、多能性細胞は胚
性幹（ＥＳ）細胞である。さらなる実施形態において、胚性幹（ＥＳ）細胞はＥ１４胚性
幹（ＥＳ）細胞である。

哺乳類のテンイレブントランスロケーション（ＴＥＴ）ファミリーは、３つのタンパク
質（ＴＥＴ１、ＴＥＴ２、およびＴＥＴ３）を含有し、それら全てが、それらのＣ末端触
媒ドメイン間で高い相同性を共有する（Ｉｙｅｒｅｔａｌ．（２００９）Ｃｅｌｌ
Ｃｙｃｌｅ８，ｐ．１６９８−１７１０）。それらは全て、５−メチルシトシン（５ｍ
Ｃ）を５−ヒドロキシメチルシトシン（５ｈｍＣ）として知られるＤＮＡメチル化の別の
形態へと変換することが示されている。５ｈｍＣの機能は依然として不明であるが、メチ
ル基を除去することにより（すなわち、脱メチル化を介して）、遺伝子発現を調節すると
考えられている。この３つのタンパク質は、かなり異なる発現プロファイルを有し、これ
までの研究では、胚性幹（ＥＳ）細胞におけるＴＥＴ１、造血発生および癌におけるＴＥ
Ｔ２、および接合体におけるＴＥＴ３の役割が示されている。特に、ＴＥＴ３は、低レベ
ルのＴＥＴ１およびＴＥＴ２と比べて、卵母細胞および受精接合体内で高度に発現するこ
とが分かっている（Ｇｕｅｔａｌ．（２０１１）Ｎａｔｕｒｅ４７７，ｐ．６０６
−６１０；Ｗｏｓｓｉｄｌｏｅｔａｌ．（２０１１）Ｎａｔｕｒｅ２，ｐ．２４１
）。３つのタンパク質ファミリー間の機能の違いは、依然として不明である。

細胞を多分化能に再プログラムする主な態様は、それらのエピジェネティックランドス
ケープ、特にそれらのＤＮＡメチル化プロファイルを変えることである。脱メチル化プロ
セスの一部として、５−メチルシトシンはＴＥＴタンパク質の触媒機能を媒介して酸化さ
れる。したがって、ＴＥＴタンパク質の異所性発現は、ＤＮＡメチル化マークを再設定す
ることにより、体細胞から多能性細胞への再プログラムを促進することができる（Ｃｏｓ
ｔａｅｔａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ４９５，ｐ．３７０−３７４，国際公開第２０１０
／０３７００１号）。さらには、ＴＥＴ１およびＴＥＴ２の発現は、多能性細胞内で高く
、ＤＮＡ中の酸化５−メチルシトシン残留物のレベルも高い。

しかしながら、本発明者らは、ＴＥＴタンパク質（例えば、ＴＥＴ３）の発現が細胞の
分化能を全能性状態へと高めることができるという驚くべき発見をした。この分化能向上
は、再プログラム中に体細胞に影響を与えるとも見られている。予想外に、この分化能向
上は、ＴＥＴタンパク質の触媒機能に依存せず、したがって、ＤＮＡ脱メチル化につなが
らない。したがって、分化能の分化全能性への拡張は、ＴＥＴタンパク質のこれまで説明
されていなかった機能である。

本明細書内での「ＴＥＴファミリー遺伝子」への言及は、テンイレブントランスロケー
ション（ＴＥＴ）ファミリーの３つのタンパク質、ＴＥＴ１、ＴＥＴ２、またはＴＥＴ３
のうちの１つをコードする遺伝子を指す。そのような言及は、少なくとも７０％、少なく
とも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５
％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、またはそれ以上の、ＴＥＴ１、ＴＥＴ２、ま
たはＴＥＴ３、特にヒトＴＥＴ１、ＴＥＴ２、またはＴＥＴ３との配列同一性を有する遺
伝子を含む。

本発明は、ＴＥＴファミリー遺伝子のフラグメントを使用する方法も含む。そのような
フラグメントは、通常、少なくとも５アミノ酸長のタンパク質をコードする。好ましい実
施形態において、それらは、６〜１０、１１〜１５、１６〜２５、２６〜５０、５１〜７
５、７６〜１００、または１０１〜２５０または２５０〜５００、５００〜１０００、１
０００〜１５００または１５００〜２０００のアミノ酸のタンパク質をコードしてもよい
。フラグメントは、除去される１つ以上のアミノ酸を有する配列、例えば、Ｃ末端短縮タ
ンパク質、を含んでもよい。フラグメントはまた、例えば、ＣＸＸＣ（ＤＮＡ結合）ドメ
インまたは触媒ドメインのないフラグメントなど、特定のドメインなしでタンパク質をコ
ードする核酸を含んでもよい。

「ＴＥＴファミリー誘導体」への言及は、ＴＥＴファミリータンパク質のタンパク質変
異体をコードする核酸を指し、それは元の遺伝子とは異なる核酸配列を有するが、形状、
構造、および／または機能において等価であると見なされるタンパク質を生成する。化学
的に類似するアミノ酸配列の生成をもたらす変化は、本発明の範囲内に含まれる。本発明
のポリペプチドの変異体は、例えば、突然変異により、自然発生してもよく、または、例
えば、アミノ酸の置換で当該技術分野において周知の、部位特異的突然変異誘発などのポ
リペプチド工学技術を用いて作製してもよい。

本発明のＴＥＴファミリー遺伝子の核酸配列における変化は、アミノ酸配列内に保存的
変化または置換をもたらすことができる。したがって、本発明は、保存的変化または置換
を有するポリペプチドを含む。本発明は、対象のＴＥＴファミリータンパク質の活性を損
なわない保存的置換がなされる配列を含む。

本発明の発明者らは、酵素のＴＥＴファミリーメンバー（特にＴＥＴ３）の導入が、例
えば、全能性状態への、細胞の分化能の増大を引き起こすという驚くべき発見をした。

一実施形態において、ＴＥＴファミリー遺伝子、その誘導体、またはそのフラグメント
は、ＴＥＴ２もしくはＴＥＴ３遺伝子、その誘導体、またはそのフラグメントである。さ
らなる実施形態において、ＴＥＴファミリー遺伝子、その誘導体、またはそのフラグメン
トは、ＴＥＴ３遺伝子、その誘導体、またはそのフラグメントである。依然としてさらな
る実施形態において、ＴＥＴファミリー遺伝子、その誘導体、またはそのフラグメントは
、ＴＥＴ３、特にヒトＴＥＴ３である。

一実施形態において、ＴＥＴファミリー遺伝子、その誘導体、またはそのフラグメント
は、配列番号１１、１２、または１３、特に配列番号１１または１３より選択されるＴＥ
Ｔ３イソ型である。一実施形態において、ＴＥＴファミリー遺伝子、その誘導体、または
そのフラグメントは、配列番号１１のＴＥＴ３イソ型である（Ｔｅｔ３変異体１）。別の
実施形態において、ＴＥＴファミリー遺伝子、その誘導体、またはそのフラグメントは、
配列番号１３のＴＥＴ３イソ型である（Ｔｅｔ３変異体３）。

ＴＥＴファミリー遺伝子、その誘導体、またはそのフラグメントは、少なくとも７０％
、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なく
とも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、またはそれ以上の、配列番号１１ま
たは１３との配列同一性を含んでもよい。

一実施形態において、導入ステップは、ＴＥＴファミリー遺伝子、その誘導体、または
そのフラグメントを含有するベクターを細胞にトランスフェクトすることを含む。さらな
る実施形態において、ベクターはトランスポゾンベクターである。

当該技術分野において既知の技術を使用して、標的配列酸をホスト細胞内へ導入するた
めにベクターが使用される（例えば、本明細書に記載される実施例３を参照）。ベクター
は、標的配列の転写および翻訳を制御する様々な調節配列を含有してもよい。ベクターの
例としては、ウィルスベクター、トランスポゾンベクター、プラスミドベクター、または
コスミドベクターが挙げられる。

本発明において使用される可能性のあるベクターは、様々な供給業者から、例えば、Ｉ
ｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｉｎｃ．（例えば、Ｇａｔｅｗａｙ（登録商標）Ｃｌｏｎｉｎｇ
Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、ＡｍｅｒｓｈａｍＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．、およ
びＰｒｏｍｅｇａ，Ｉｎｃ．から市販されている。

トランスポゾンベクターは、「カットアンドペースト」機構を使用して標的配列をベク
ターおよび染色体間で移動させるために、トランスポゾンとして知られる可動遺伝因子を
利用する。トランスポゾンベクターの例としては、ＰｉｇｇｙＢａｃベクター（Ｓｙｓｔ
ｅｍＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、またはＥＺ−Ｔｎ５（商標）Ｔｒａｎｓｐｏｓｏｎ
Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎベクター（Ｉｌｌｕｍｉｎａ，Ｉｎｃ．）が挙げられる。

ウィルスベクターは、遺伝子組換えウィルス内部のＤＮＡまたはＲＮＡからなる。ウィ
ルスベクターは、標的配列をホスト細胞ゲノムに統合するために使用してもよい（すなわ
ち、統合ウィルスベクター）。ウィルスベクターの例としては、アデノウィルスベクター
、アデノウィルス随伴ベクター、レトロウィルスベクター、またはレンチウィルスベクタ
ー（例えば、ＨＩＶ）が挙げられる。

プラスミドベクターは、ほぼ円形の二本鎖ＤＮＡからなる。プラスミドベクターは、大
部分の組換えベクターのように、対象のＤＮＡフラグメントが容易に挿入されることを可
能にする数個の一般的に使用される制限部位を含有する短領域である、マルチクローニン
グサイト（ＭＣＳ）を有する。

本明細書での「トランスフェクション」への言及は、標的配列を発現できるようにベク
ターをホスト細胞に導入するプロセスを指す。ベクターをホスト細胞にトランスフェクト
する方法としては、当該技術分野において周知の方法であるエレクトロポレーション、ソ
ノポレーション、または光学トランスフェクションが挙げられる。

本発明では、他の種類のトランスフェクション、例えば、ナノテクノロジーを使用する
粒子に基づく方法、を想定してもよいことに留意すべきである。一実施形態において、Ｔ
ＥＴファミリー遺伝子、その誘導体、またはそのフラグメントは、ナノ粒子に付着される
。次いで、ナノ粒子は、例えば、細胞の核に直接ナノ粒子を送達する「遺伝子銃」（また
は「微粒子銃粒子送達システム」）の使用を介して、細胞にトランスフェクトするために
使用することができる。

ベクターが細胞内にトランスフェクトされると、細胞は標的配列を発現するように誘導
され得る。特定のベクター、例えば、トランスポゾンベクターは、ベクターから標的配列
を切除して、それを標的配列が発現されるホスト細胞のゲノムへと送達するために、切除
に基づく方法を使用し得る。切除に基づく方法の例としては、ｐｉｇｇｙＢＡＣ技術、Ｓ
ｌｅｅｐｉｎｇＢｅａｕｔｙ（ＳＢ）トランスポゾン、ＬＩＮＥ１（Ｌ１）レトロトラ
ンスポゾン、またはＣｒｅｌｏｘＰ組換えが挙げられる。

切除に基づく方法は、標的配列をホストゲノムへ送達するために、トランスポゾンを使
用してもよい。ｐｉｇｇｙＢＡＣトランスポゾンは、再プログラムプロセスに影響を与え
る可能性のあるいかなる外因性ＤＮＡ残存物をも残さずに、標的配列を切除することがで
きるという特定の利点を有する。

本発明のさらなる態様に従って、ＴＥＴファミリー遺伝子、その誘導体、またはそのフ
ラグメントを細胞内へ導入するステップを含む、再プログラムされた全能性細胞を調製す
る方法が提供される。

一実施形態において、本細胞は多能性細胞である。

別の実施形態において、本細胞は体細胞である。さらなる実施形態において、本細胞が
体細胞であるとき、本方法は、Ｏｃｔ３／４遺伝子、Ｓｏｘ２遺伝子、Ｋｌｆ４遺伝子、
およびｃ−Ｍｙｃ遺伝子を体細胞内へ導入するステップをさらに含む。

本明細書に定義される方法を、体細胞（例えば、患者から入手した体細胞）を多能性ま
たは全能性状態へ誘導するために使用してもよい。これは、１つのステップ内で、または
体細胞を多能性状態に誘導してから、次いで全能性状態に誘導することにより、達成して
もよいということを理解されたい。例えば、山中因子などの既存の過剰発現システムと共
同したＴＥＴ（例えば、ＴＥＴ３）過剰発現は、本質的に１つの実験ステップ内における
体細胞からの全能性細胞の誘導を可能にする。

例えば、山中因子を導入することにより（すなわち、国際公開第２００７／０６９６６
６号に記載されているような、Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、およびｃ−Ｍｙｃ遺
伝子）、体細胞を多能性状態に誘導するために、当該技術分野において広く利用される方
法がある。これらの因子を、ｗｗｗ．ａｄｄｇｅｎｅ．ｏｒｇより入手可能なプラスミド
２０９５９（ＰＢ−ＴＥＴ−ＭＫＯＳ）などの４つの因子を含有するベクターを使用して
導入してもよい。したがって、本明細書に記載される方法を使用して、ＴＥＴファミリー
遺伝子、その誘導体、またはそのフラグメントを含有するベクターおよびＯｃｔ３／４、
Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、およびｃ−Ｍｙｃ遺伝子を含有するベクターを体細胞にコトランス
フェクトすることにより、体細胞を全能性状態に再プログラムしてもよい。

本明細書内での「再プログラムされた全能性細胞」への言及は、ＴＥＴファミリー遺伝
子、その誘導体、またはそのフラグメントの導入を介してその分化能を増大させることに
より、全能性状態に誘導された細胞を指す。

対象の核酸配列をホスト細胞内へ導入する方法は、当該技術分野において周知である。
例えば、１つの基本プロトコルは、以下のステップを伴う。
ａ）核酸標的配列（例えば、ＴＥＴファミリー遺伝子、その誘導体、またはそのフラグ
メント）の増幅、
ｂ）標的配列のベクター（例えば、ウィルスベクター）への組換え、
ｃ）選択可能マーカー（例えば、緑色蛍光タンパク質）を使用した、成功した組換えの
識別、
ｄ）組換えベクターのホスト細胞（例えば、多能性細胞または体細胞）へのトランスフ
ェクション、
ｅ）標的配列のホスト細胞ゲノムへの統合（例えば、ｐｉｇｇｙＢＡＣ技術を使用）、
ｆ）選択可能マーカー（例えば、ピューロマイシン）を使用した、成功した統合の識別
、
ｇ）標的配列の発現の誘導（例えば、ドキシサイクリンを使用）、および
ｈ）標的配列の発現に成功した再プログラムされた全能性細胞の選択（例えば、フロー
サイトメトリーを使用）。

一実施形態において、本方法は、ＴＥＴファミリー遺伝子、その誘導体、またはそのフ
ラグメントの導入後に、細胞を培養するステップをさらに含む。

遺伝子、その誘導体、またはそのフラグメントを細胞へと導入した後、細胞が分化全能
性を獲得し繁殖するのに十分な時間にわたって細胞を培養する。例えば、培養は、細胞培
養用の一皿あたり、１〜１００千の細胞密度、例えば、約５０千で継続することができる
。

高められた分化能細胞または再プログラムされた全能性細胞を、例えば、１２時間以上
、例えば１日以上、培養することにより、全能性または多能性細胞を調製するのに適切な
培地、例えば、胚性幹細胞のための培地（例えば、ヒトＥＳ細胞のための培地）を使用す
ることにより、入手してもよい。本明細書に記載される方法は、２日間以上、例えば５日
間以上、７日間以上、および１０日間以上、連続した培養を必要とし得る。

一実施形態において、本方法は、ＴＥＴファミリー遺伝子、その誘導体、またはそのフ
ラグメントを過剰発現させる１つ以上の細胞を選択するステップをさらに含む。

一実施形態において、その１つ以上の細胞は、マーカー遺伝子を使用して選択される。

一実施形態において、マーカー遺伝子は、薬剤耐性遺伝子、蛍光性タンパク質遺伝子、
色素産生酵素遺伝子、またはそれらの組み合わせから選択することができる。さらなる実
施形態において、マーカー遺伝子は、薬剤耐性遺伝子、または蛍光性タンパク質遺伝子で
ある。

薬剤耐性遺伝子の例としては、ピューロマイシン耐性遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子
、ネオマイシン耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子、ま
たはクロラムフェニコール耐性遺伝子が挙げられる。細胞は、相応しい薬剤を含有する培
地（すなわち、選択培地）上で培養され、薬剤耐性遺伝子を取り込み、かつ発現する細胞
のみが生き残る。したがって、選択培地を使用して細胞を培養することにより、薬剤耐性
遺伝子を含む細胞を容易に選択することが可能である。

蛍光性タンパク質遺伝子の例としては、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）遺伝子、黄色蛍
光性タンパク質（ＹＦＰ）遺伝子、赤色蛍光性タンパク質（ＲＦＰ）遺伝子、またはエク
オリン遺伝子が挙げられる。蛍光性タンパク質遺伝子を発現している細胞は、蛍光顕微鏡
を使用して検出することができ、かつフローサイトメーターなどの細胞選別機を使用して
選択することができる。蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）は、蛍光性タンパク質を発現し
ている細胞を選択するために使用することができる、特殊な種類のフローサイトメトリー
である。

一実施形態において、１つ以上の細胞は、フローサイトメトリーを使用して選択される
。

色素産生酵素遺伝子の例としては、β−ガラクトシダーゼ遺伝子、β−グルクロニダー
ゼ遺伝子、アルカリホスファターゼ遺伝子、または分泌アルカリホスファターゼＳＥＡＰ
遺伝子が挙げられる。これらの色素産生酵素遺伝子を発現している細胞は、マーカー遺伝
子を発現している細胞が検出可能な色（例えば、青白画面試験では青色）を生成するよう
に、相応しい色素産生基質（例えば、β−ガラクトシダーゼにはＸ−ｇａｌ）を適用する
ことにより、検出することができる。

本明細書に記載される全てのマーカー遺伝子は、当業者に周知である。例えば、そのよ
うなマーカー遺伝子を含有するベクターは、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｉｎｃ．（例えば、
Ｇａｔｅｗａｙ（登録商標）ＣｌｏｎｉｎｇＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、Ａｍｅｒｓｈａ
ｍＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．、およびＰｒｏｍｅｇａ，Ｉｎｃ．から市販され
ている。

本発明のさらなる態様に従って、本明細書内で定義される方法により入手可能な再プロ
グラムされた全能性細胞が提供される。

本発明のさらなる態様に従って、細胞を全能性状態に再プログラムする方法において、
本明細書内で定義される核酸、または本明細書内で定義されるベクターの使用が提供され
る。

本発明の高められた分化能細胞または再プログラムされた全能性細胞は、例えば、医療
産業、化学産業、および農産業において、複数の用途がある。

本発明の高められた分化能細胞または再プログラムされた全能性細胞は、細胞または組
織再生など、療法に使用することができる。ヒトＥＳおよびｉＰＳ細胞は、未感作多分化
能のマーカーを示さないため、細胞置換療法においておよび疾患のモデルとしてのそれら
の利用には限りがある。本発明は、多能性細胞をこの問題を克服することができるより高
いレベルの分化能へと移行することができる。

本発明の高められた分化能細胞または再プログラムされた全能性細胞は、家畜の生成、
および大型動物モデルにおいて使用することができる。大型動物におけるクローニングお
よび遺伝子操作のための現方法は、改変された細胞の低い自己再生力により制限される体
細胞核移植（ＳＣＮＴ）技術に依存している。大型動物モデルにおけるＥＳおよびｉＰＳ
細胞の開発は、ヒトＥＳおよびｉＰＳ細胞において観察される同じ分化能の欠如（上記の
ように）に悩まされている。本発明は、極めて重要なこととして繁殖することができ、か
つ培養中に操作することができる真の多能性または全能性細胞の生成を提供し、家畜およ
び疾患の大型動物モデルにおける遺伝子操作を能率化する。「大型動物」には、イヌ、ブ
タ、ヒツジ、ヤギ、ウシ、およびウマなどが含まれる。

本発明の高められた分化能細胞または再プログラムされた全能性細胞は、薬剤スクリー
ニングに使用できる。例えば、細胞は、分化した細胞に付与して生理活性または毒性を評
価するための化合物または薬をテストするために、対象の体細胞、組織、または臓器に分
化され得る。

本発明のさらなる態様に従って、療法に使用するための、本明細書内で定義される再プ
ログラムされた全能性細胞が提供される。

一実施形態において、療法は、組織再生を含む。

本明細書内での「組織再生」への言及は、病気にかかったおよび損傷した臓器および組
織の機能を、失ったまたは損傷した組織を再形成することにより修復する療法を指す。

幹細胞は、複数種の組織に発達する能力を有するため、疾患または傷害を治療するため
にこれらの細胞を損傷した組織内へ導入することができる。本発明の高められた分化能細
胞または再プログラムされた全能性細胞を治療に使用できる疾患または傷害の例としては
、貧血症、自己免疫疾患（例えば、関節炎、炎症性腸疾患、クローン病、糖尿病、多発性
硬化症）、先天性欠損症、視覚消失、悪性腫瘍、循環器疾患（例えば、うっ血性心不全、
心筋梗塞、卒中）、硬変症、聴覚消失、変性疾患（例えば、パーキンソン病）、遺伝障害
、移植片対宿主病、免疫不全、不妊症、虚血、リソソーム蓄積症、筋損傷（例えば、心臓
損傷）、神経損傷（例えば、脳損傷、脊椎損傷）、神経変性疾患（例えば、アルツハイマ
ー病、痴呆症、ハンチントン病）、視力障害、および創傷治癒が挙げられる。

本発明のさらなる態様に従って、ＴＥＴファミリー遺伝子、その誘導体、またはそのフ
ラグメントを含有するベクターと、本明細書に定義される方法に従ってキットを使用する
ための説明書とを含むキットが提供される。

本キットは、本方法の実行のための１つ以上の物品および／または試薬を含み得る。例
えば、本明細書内に記載される方法において使用するためのＴＥＴファミリー遺伝子、そ
の誘導体、もしくはそのフラグメント、オリゴヌクレオチドプローブおよび／または一対
の増幅プライマーは、分離された形態で提供され得、例えば、内容物が外部環境から守ら
れているバイアルのような好適な容器に入った、キットの一部であり得る。本キットは、
例えば、ＰＣＲでの核酸の使用のための説明書を含み得る。核酸をＰＣＲ中で使用するこ
とを意図したキットは、ポリメラーゼ、ヌクレオチド、バッファ溶液等などの、反応に必
要とされる１つ以上の他の試薬を含み得る。

一実施形態において、本キットは、少なくとも１つの多能性細胞をさらに含む。別の実
施形態において、本キットは、少なくとも１つの体細胞をさらに含む。

一実施形態において、本キットは、細胞の培養のための培地と、本明細書に定義される
方法に従って高められた分化能細胞または再プログラムされた全能性細胞を調製するため
の説明書とをさらに含む。

本発明のさらなる態様に従って、細胞を多能性状態に再プログラムする方法を提供し、
該方法は、ＴＥＴ３遺伝子、その誘導体、またはそのフラグメントを細胞内へ導入するス
テップを含む。一実施形態において、本細胞は体細胞である。

本方法は、細胞を全能性状態に再プログラムするための、本明細書内で定義されるのと
同じ方法ステップを含み得ることを理解されたい。ＴＥＴ３の細胞への導入は、分化能に
おける変化、例えば、多能性状態をもたらす。したがって、ＴＥＴ３の体細胞への導入は
、誘導多能性幹細胞の高められた生成を引き起こす。

以下の研究は、本発明を例示する。

実施例１：Ｔｅｔ３転写変異体の識別
Ｔｅｔ３遺伝子構造の初期のアノテーションは、ＲｅｆＳｅｑ（受託番号：ＮＭ＿１８
３１３８）により提供された。しかしながら、このアノテーションからの大きな上流オー
プンリーディングフレームは、それが恐らく不完全であることを示した。エクソン１およ
び３のコーディングに特化したプライマーを有するＧｅｎｅＲａｃｅｒキット（Ｉｎｖｉ
ｔｒｏｇｅｎ）を使用して、ｃＤＮＡ末端の５’増幅を、ＥＳ細胞および体細胞組織内で
実施した（表１）。この解析は、「カノニカル（Ｃａｎｏｎｉｃａｌ）」および「下流」
と名付けられる２つのプロモーターを識別した。

卵母細胞（Ｓｍａｌｌｗｏｏｄｅｔａｌ．（２０１１）Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．４３
，ｐ．８１１−８１４）、ＥＳ細胞（Ｃｌｏｏｎａｎｅｔａｌ．，２００８）、およ
び複数の体細胞組織（Ｃｌｏｏｎａｎｅｔａｌ．（２００８）Ｎａｔ．Ｍｅｔｈｏｄ
ｓ５，ｐ．６１３−６１９；ＧｅｎＢａｎｋからのＥＳＴ）からの高スループットＲＮ
Ａ配列決定（ＲＮＡ−ｓｅｑ）データの検査は、卵母細胞（所定の「卵母細胞」）に使用
が制限されると思われる追加の上流プロモーターの存在を提示した。

上流プロモーターは、卵母細胞、ひいては接合体のための機構を提供して、高レベルの
ＴＥＴ３を蓄積し、次いで、他の組織中でのもっと低いレベルの生成へと切り替わること
ができる。加えて、卵母細胞固有のエクソン内には、残りのＴＥＴ３タンパク質とインフ
レームである翻訳開始部位が存在する。この小さなペプチドは、卵母細胞中のＴＥＴ３の
機能を変えることに幾らかの役割を果たし得る。ＲＮＡ−ｓｅｑデータはまた、卵母細胞
内に生成された転写には、ＣＸＸＣドメインをコードするＴｅｔ３遺伝子の最初のエクソ
ンが、主として欠如していることも示す。このドメインは、ＣｐＧアイランドへの結合を
介してタンパク質を目標に定めるのに重要な、ＤＮＡシトシン−５−メチルトランスフェ
ラーゼ１（ＤＮＭＴ１）、およびメチル−ＣｐＧ結合ドメインタンパク質１（ＭＢＤ１）
などの、他のエピジェネティックな修飾物質中に相同染色体を保有する。近年の研究では
、ＴＥＴ１ＣＸＸＣドメインが、非メチル化シトシンに加えて、５−メチルシトシン（
５ｍＣ）および５−ヒドロキシメチルシトシン（５ｈｍＣ）を結合する能力があることを
提示している。このように、このドメインの差分取り込みは、卵母細胞と他の組織との間
のＴＥＴ３タンパク質において機能変異をもたらし得る。「下流」プロモーターから生成
された転写は、ＣＸＸＣコーディングエクソンが欠如し、卵母細胞ではなく細胞における
タンパク質変異を可能にするということも注目すべきである。

実施例２：組織固有の転写変異の解析
推定上の卵母細胞プロモーターの特殊性を確証するため、および異なる細胞種内のＣＸ
ＸＣコーディングエクソン１の包含を調査するため、プライマーを、図１に示されるよう
に、３つのプロモーターのそれぞれとエクソン１またはエクソン３いずれかとの間に（表
２を参照）設計した。実際には、前者はＣＸＸＣコーディングエクソンを含有する転写を
取り込み、後者はこのエクソンが欠如する転写を取り込む。したがって、ＣＸＸＣ（−）
変異体のみを生成できる下流プロモーターの例外はあるが、各プロモーターの、それぞれ
ＣＸＸＣ（＋）またはＣＸＸＣ（−）変異体と呼ばれるものが存在する。

Ｔｒｉｚｏｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）およびＤＮＡ−ｆｒｅｅＫｉｔ（Ａｍｂｉｏ
ｎ）で処理したＤＮａｓｅを使用して、Ｅ１４胚様体、Ｅ１４ＥＳ細胞、皮質、小脳、
肺、および脾臓からＲＮＡを抽出した。オリゴ（ｄＴ）プライマーを使用して、Ｓｕｐｅ
ｒＳｃｒｉｐｔＩＩＩＦｉｒｓｔＳｔｒａｎｄＳｙｎｔｈｅｓｉｓＳｙｓｔｅｍ
（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）でｃＤＮＡを調製した。

ＳｔｒａｔａｇｅｎｅＭｘ３００５Ｐリアルタイムシステム（Ａｇｉｌｅｎｔ）上で
、ＢｒｉｌｌｉａｎｔＩＩＳＹＢＲＧｒｅｅｎｑＰＣＲＭａｓｔｅｒＭｉｘ
試薬（Ａｇｉｌｅｎｔ）を使用して、定量ＰＣＲを実施した。０．５サイクル未満の較差
を確実にするために、技術的複製のＣｔ値を検査した。次いで、これらの複製を平均し、
ΔＣｔ法（Ｐｆａｆｆｌ（２００４）ＲｅａｌＴｉｍｅＰＣＲ，ｐ．６３−８２）を
使用して、２つの参照遺伝子、Ａｔｐ５ｂおよびＨｓｐｃｂの平均に対して正規化した。
その結果を、図２にまとめる。

このデータは、卵母細胞プロモーターの有意義な使用は、検査した組織の中でも卵母細
胞に限られることを確証し、専ら卵母細胞のみがこのプロモーターを用いるということを
さらに示す。これは、卵母細胞中で観察されるＴＥＴ３の高発現がプロモーター使用の働
きであることを示す。

加えて、卵母細胞中の９８％を超えるＴＥＴ３転写は、ＣＸＸＣコーディングエクソン
が欠如している。これは、卵母細胞エクソンのエクソン１との接合が短縮されたタンパク
質をもたらすことを示す生物情報学的解析と一致する。対照的に、他の細胞種は、カノニ
カルおよび下流プロモーターを使用して、ＣＸＸＣコーディングエクソンを有するおよび
有しない双方の転写を生成する。このように、卵母細胞、したがって接合体に存在するＴ
ＥＴ３タンパク質は、固有のコード配列を含有し、ＣＸＸＣエクソン包含のほぼ完全な欠
如において他の検査された組織とはさらに対照を成す。これらの転写特性は、全能性細胞
中のＴＥＴ３の固有の役割に関連し得る。

要するに、本明細書内に提示されるデータは、Ｔｅｔ３遺伝子座から生成される３つの
主な転写変異体を識別する（表３参照）。

実施例３：ＥＳ細胞中のＴｅｔ３変異体のクローニングおよび過剰発現
Ｔｅｔ３変異体配列を、Ｇａｔｅｗａｙシステム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用し、
数個の中間ベクターを介して誘導性過剰発現ベクターへクローン化した。クローン化配列
に対して、ＩＲＥＳ−ＥＧＦＰ３’をさらに含有したｐｉｇｇｙＢＡＣシステム（Ｄｉ
ｎｇｅｔａｌ．（２００５）Ｃｅｌｌ１２２，ｐ．４７３−４８３；Ｗｉｌｓｏｎ
ｅｔａｌ．（２００７）Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．１５，ｐ．１３９−１４５）（以後ｐＢ
ＡＣと呼ぶ）を使用してゲノム取り込みを可能にするように設計された過剰発現ベクター
を使用した。

全能性細胞に対するその制限を仮定し、初期過剰発現解析のために変異体１（配列番号
１１）を選択した。

Ｅ１４ＥＳ細胞を、１５％ＦＢＳ（ＦｅｔａｌＢｏｖｉｎｅＳｅｒｕｍ、ＥＳ細
胞試験済、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、１×ＭＥＭ非必須アミノ酸（Ｇｉｂｃｏ）、１×Ｐ
ｅｎｉｃｉｌｌｉｎ−Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ（Ｇｉｂｃｏ）、０．０５ｍＭのＢ−メ
ルカプトエタノール（１：１０００、Ｇｉｂｃｏ）、および１０３ユニット／ｍｌのＬＩ
Ｆ（ＬｅｕｋｅｍｉａＩｎｈｉｂｉｔｏｒｙＦａｃｔｏｒ、ＥＳＧＲＯ、Ｍｉｌｌｉ
ｐｏｒｅ）で補足されたＤＭＥＭ（Ｌ−Ｇｌｕｔａｍｉｎｅ、４５００ｍｇ／ＬのＤ−Ｇ
ｌｕｃｏｓｅ、１１０ｍｇ／ＬのＳｏｄｉｕｍＰｙｒｕｖａｔｅ；Ｇｉｂｃｏを有する
）中、０．１％ゼラチン皮膜プレート内で、５％ＣＯ２を有する加湿雰囲気において３７
℃で培養した。培地は毎日変更され、細胞は、選択下のときを除き、示されるように分割
されて準密集（ｓｕｂｃｏｎｆｌｕｅｎｃｅ）に達した。

ＦｕＧＥＮＥ６．０（Ｒｏｃｈｅ）を使用して、各２μｇのｐＢＡＣ構成物およびｐ
ｉｇｇｙＢＡＣシステムの他の化合物、つまり、ｐｉｇｇｙＢＡＣトランスポゼースおよ
びピューロマイシン選択可能ｒｔＴＡトランス活性化因子をコードするプラスミドを１ｘ
１０６Ｅ１４ＥＳ細胞にトランスフェクトした。トランスフェクションの翌日、１μ
ｇ／ｍＬのピューロマイシンの培地への添加を介して選択を行い、その後維持した。

細胞の選択の前日、ＴＥＴ３および緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）の同時発現を誘導す
るため、１μｇ／ｍＬのドキシサイクリンを添加して培地を培養した。細胞をトリプシン
処理してろ過し、次いで、標準フローサイトメトリー技術を使用して、別々のＧＦＰ陽性
（ＧＦＰ＋）およびＧＦＰ陰性（ＧＦＰ−）集団に分類した。

実施例４：予備的な遺伝子発現解析
ＤＮＡ／ＲＮＡＡｌｌＰｒｅｐＭｉｃｒｏＫｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）、およびＤＮ
Ａ−ｆｒｅｅＫｉｔ（Ａｍｂｉｏｎ）を使用して処理したＤＮａｓｅを使用して、ソー
ト後の細胞からＲＮＡを抽出した。ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＩＩＩＦｉｒｓｔＳｔ
ｒａｎｄＳｙｎｔｈｅｓｉｓＳｙｓｔｅｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して、１
μｇのＲＮＡからｃＤＮＡを調製した。

以前の研究は、ＥＳ細胞の小集団（「二細胞ＥＳ細胞」と呼ばれる）が、全能性二細胞
胚ステージで接合子ゲノム活性化に関連する遺伝子を上方制御し、かつ胚体外系列に寄与
する能力などの分化全能性の特徴を示すことを示している（Ｍａｃｆａｒｌａｎｅｔ
ａｌ．（２０１２）Ｎａｔｕｒｅ４８７，ｐ．５７−６３）。ＴＥＴ３の発現が卵母細
胞および接合体に大きく制限されること、ならびにこのステージで固有のイソ型として存
在することを前提として、ＥＳ細胞中のＴＥＴ３過剰発現が、この集団を拡大または強化
するという仮説を立てた。したがって、以下の候補は、二細胞ステージおよび二細胞ＥＳ
細胞中におけるそれらの観察される上方制御を基に選択した（Ｍａｃｆａｒｌａｎｅｔ
ａｌ．（２０１２）Ｎａｔｕｒｅ４８７，ｐ．５７−６３）：ＭｕＥＲＶ−Ｌ、Ｚｓ
ｃａｎ４ｃ、Ｆｇｆ５、Ｔｂｘ３、Ｆｂｘｏ１５、Ｐｒａｍｅｌ７、Ｍｂｄ５、Ｃａｌｃ
ｏｃｏ２、Ｇｍ４３４０、Ｚｆｐ３５２、Ｓｐ１１０、Ｔｄｐｏｚ２、Ｔｃｓｔｖ３。

加えて、ＥＳ細胞中で発現されるが上方制御されることが予期されない数個の遺伝子を
、対照群として選択した：Ｔｅｔ１、Ｔｃｌ１、Ｏｏｅｐ。

Ｔｅｔ３転写を検査し、その過剰発現を検証した。

これらの遺伝子それぞれのプライマーは、定量ＲＴ−ＰＣＲ用に設計され、可能であれ
ばイントロン−エクソン境界に及ぶ（表４参照）。

Ｃ１０００ＴｏｕｃｈＣＦＸ３８４ＲｅａｌＴｉｍｅＳｙｓｔｅｍ（Ｂｉｏ
Ｒａｄ）でＢｒｉｌｌｉａｎｔＩＩＳＹＢＲＧｒｅｅｎｑＰＣＲＭａｓｔｅｒ
Ｍｉｘ試薬（Ａｇｉｌｅｎｔ）を使用して、定量ＰＣＲを実施した。０．５サイクル未
満の較差を確実にするために、技術的複製のＣｔ値を検査した。次いで、これらの複製を
平均し、ΔＣｔ法（Ｐｆａｆｆｌ（２００４）Ｒｅａｌ−ｔｉｍｅＰＣＲ，ｐ．６３−
８２）を使用して、２つの参照遺伝子、Ａｔｐ５ｂおよびＨｓｐｃｂの平均に対して正規
化した。Ｔｅｔ３変異体１の結果を、図３（候補遺伝子）および図４（対照遺伝子）に、
Ｔｅｔ３変異体３の結果を、図５（候補遺伝子）にまとめる。

Ｔｅｔ３は、所望に応じてＧＦＰ陽性細胞で上方制御される。驚くほどに、検査された
全ての候補遺伝子は、発現がおよそ１０倍上方制御されるものを数個含めたＴｅｔ３変異
体１およびその触媒的に不活性な対を発現している細胞中で、増加した発現を示す一方で
、対照遺伝子は比較的安定している。大きな発現変化は、集団全体にわたるより控えめな
上方制御というよりも、細胞の分集団内で発生し、包括的発現解析により薄められるもの
であると思われる。いずれの場合においても、このデータは、ＴＥＴ３過剰発現細胞の高
められた分化能をもたらす全能性二細胞ステージの転写プログラムへのシフトを支持して
いる。

実施例５：ｍＲＮＡ−ｓｅｑによるゲノムワイド遺伝子発現解析
伝令ＲＮＡを、ＤｙｎａｂｅａｄｓｍＲＮＡＰｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎＫｉｔ（
Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して、合計２μｇのＲＮＡから分離し、ＲＮＡＦｒａｇ
ｍｅｎｔａｔｉｏｎＲｅａｇｅｎｔ（Ａｍｂｉｏｎ）でフラグメント化した。Ｓｕｐｅ
ｒＳｃｒｉｐｔＩＩＩＦｉｒｓｔＳｔｒａｎｄＳｙｎｔｈｅｓｉｓＳｙｓｔｅ
ｍおよび３μｇμｌ−１ランダムヘキサマー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてファース
トストランドｃＤＮＡ合成を行い、その後、ＤＮＡポリメラーゼＩおよびＲＮａｓｅＨ
を用いてセカンドストランド合成を行った。精製後、ＰＥ２．０上にＳａｎｇｅｒインデ
ックスを有するペアエンドアダプター、およびＮＥＢＮｅｘｔＤＮＡＬｉｂｒａｒｙ
ＰｒｅｐＭａｓｔｅｒＭｉｘＳｅｔｆｏｒＩｌｌｕｍｉｎａ（ＮＥＢ）を使
用して、配列決定ライブラリを二本鎖ｃＤＮＡから作成した。試料を、Ｉｌｌｕｍｉｎａ
Ｈｉ−Ｓｅｑ２０００の１つの列上にシングルエンド５０ｂｐプロトコルで配列決定
し、インデックスされる各試料のために取得される配列決定リード数を、表５に示す。伝
令ＲＮＡ−Ｓｅｑデータを、Ｅｎｓｅｍｂｌリリース６１からの遺伝子モデルと併せて、
ＴｏｐＨａｔ（ｖ１．４．１，ｏｐｔｉｏｎｓ−ｇ１）を使用して、マウスゲノム（ア
センブリＮＣＢＩＭ３７）に配置した。

予備的な解析において、上記のｑＰＣＲデータ中最大上方制御を示した候補遺伝子は、
それらの遺伝子ファミリーの数個のメンバーと一緒に上方制御を検査した：Ｐｒａｍｅｌ
３、Ｐｒａｍｅｌ５、Ｐｒａｍｅｌ７、Ｓｐ１１０、Ｔｄｐｏｚ１、Ｔｄｐｏｚ３、Ｔｄ
ｐｏｚ４、Ｔｄｐｏｚ５、Ｔｅｔ３、Ｚｆｐ３５２、Ｚｓｃａｎ４ｃ、Ｚｓｃａｎ４ｄ、
Ｚｓｃａｎ４ｅ、Ｚｓｃａｎ４ｆ、およびＺｓｃａｎ４−ｐｓ２。

ＧＦＰ陽性および陰性細胞を、ＳｅｑＭｏｎｋｖ０．２３．１を使用して、散布図お
よび上記の強調された遺伝子リストで比較した（図６および７）。ここでも、Ｔｅｔ３は
、予測通りにＧＦＰ陽性細胞中で強く上方制御される。驚くほどに、この解析は、候補遺
伝子およびそれらのファミリーメンバーが、不偏的ゲノムワイド配列決定により識別され
る最も上方制御された遺伝子であることを示す。ｑＰＣＲデータと一致して、Ｔｅｔ３変
異体１またはその触媒的に不活性な対の過剰発現は、遺伝子発現に同様の作用を与え、酸
化酵素機能がより「全能性様」の転写プログラムへのシフトを必要としないことを示す。

実施例６：全能性様分集団の解析
胚性幹細胞培養物は、遺伝子発現および発生能に関して異質である。それらは、異なる
マーカー遺伝子の発現を特徴とする分集団に分類することができる。個々の細胞は、異な
る発現パターンを繰り返し、異なる分集団間を移動する。分集団の存在量は、同じ胚性幹
細胞培養物内で比較的安定している。野生型ＥＳ細胞においては、細胞の極一部（５％）
が、超早期未着床胚の発現プロファイル特徴を示す。これらの細胞は、大部分のＥＳ細胞
と比べて拡大した分化能表現型を有し、および、それらは、凝集実験においてＥＳ細胞が
胚体外系列に寄与する非常に珍しいケースの原因であると考えられる。

Ｔｅｔ３変異体１を発現しているＥＳ細胞中の全能性様分集団の存在量を評価した。個
々のＧＦＰ−およびＧＦＰ＋細胞からのｃＤＮＡを、ＳＭＡＲＴｅｒｃＤＮＡ増幅（Ｃ
ｌｏｎｔｅｃｈ）を有するＣ１システム（Ｆｌｕｉｄｉｇｍ）を使用して、分離した。Ｅ
ｖａＧｒｅｅｎｑＰＣＲケミストリ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を使用したＢｉｏｍａｒｋＨ
Ｄマイクロフルイディスクシステム（Ｆｌｕｉｄｉｇｍ）を用いて、安定状態の発現レベ
ルを解析した。以下の遺伝子を、全能性様分集団のマーカーとして使用した（表６内に太
字で強調表示される）：Ｚｓｃａｎ４ｃ、ＭｕＥＲＶ−Ｌ、Ａｒｇ２、Ｄｕｂ２ａ、Ｔｃ
ｓｔｖ３、Ｌｇａｌｓ４。

これらの遺伝子それぞれのプライマーは、定量ＲＴ−ＰＣＲ用に設計され、可能であれ
ばイントロン−エクソン境界に及ぶ（表６参照）。

単細胞発現データを、ＳＩＮＧｕＬＡＲＡｎａｌｙｓｉｓＴｏｏｌｓｅｔ２．０
（Ｆｌｕｉｄｉｇｍ）を使用して解析し、無監督クラスタリングの結果を、色が明るいほ
どより高い発現を示すヒートマップとして示す（図８）。遺伝子が水平方向にクラスター
化される。全能性様状態のためのマーカー遺伝子は密接に関係しており、太字で強調表示
される。個々の細胞は垂直方向にクラスター化される。密接に関連した細胞の分集団は、
全能性様マーカー遺伝子（水平ボックスにより強調表示される）の非常に高い発現レベル
を示すため、「全能性様」分集団と指定された。このカテゴリに入る細胞の割合は、Ｔｅ
ｔ３変異体１の発現時に劇的に上昇する。ＴＥＴ３の発現がないまたは非常に低い細胞中
では、わずか５％の細胞がこの分集団の一部である一方で、ＴＥＴ３を発現している細胞
中では、この割合は４０％まで増加する（図９）。したがって、この集団にわたって観察
される全能性様発現プロファイルへのシフトは、全能性様分集団の劇的な拡大が媒介する
。

実施例７：分化転換分析による高められた分化能の論証
ＥＳ細胞は、栄養膜などの胚体外組織ではなく、胚の多くの異なる細胞種を作成するこ
とができるため、多能性である。栄養膜幹（ＴＳ）細胞培養に使用される成長条件におい
て栄養膜様細胞を形成する能力は、こうして、拡大した分化能のインビトロアッセイを提
供する（Ｎｇｅｔａｌ．（２００８）ＮａｔＣｅｌｌＢｉｏｌ．１０，１２８０
−１２９０）。この試験は、野生型Ｅ１４ＥＳ細胞と、Ｔｅｔ３変異体１（Ｔｅｔ３ク
ローン２およびＴｅｔ３クローン７と呼ばれる）を恒常的に過剰発現している２つのＥＳ
細胞株とに適用される。正の対照として、Ｒａｓ導入遺伝子（ｉＲａｓと呼ばれる）を過
剰発現させるか、著しい分化転換を経ることで知られるＯｃｔ４発現（ＺＨＢＴｃ４と呼
ばれる）が欠如しているか、のいずれかの遺伝子改変細胞株を、並行して試験した（Ｎｉ
ｗａｅｔａｌ．（２０００）Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．２４，３７２−３７６；Ｎｉｗａ
ｅｔａｌ．（２００５）Ｃｅｌｌ１２３，９１７−９２９）。

任意の観察される変化をＴＥＴ３発現のレベルに関連付けるために、ｑＲＴ−ＰＣＲ解
析を、本明細書内で先に記載した野生型Ｅ１４ＥＳ細胞および２つのＴｅｔ３過剰発現
ＥＳ細胞株で実施した（図１０）。Ｔｅｔ３クローン７は、Ｔｅｔ３クローン２よりおよ
そ２倍多くＴＥＴ３を発現し、これら双方の細胞株は、Ｅ１４細胞と比べて著しく増加し
たＴｅｔ３転写レベルを有する。

分化転換分析
２０％ＦＢＳで補足されたＲＰＭＩ１６４０、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム、５０
Ｕ／ｍＬのペニシリン−ストレプトマイシン、および０．０５ｍＭのＢ−メルカプトエタ
ノールからなるＴＳベース培地を、２日間細胞培養皿上で照射を受けたマウス胚繊維芽（
ＭＥＦ）細胞とのインキュベーションにより条件付け、０．２２μｍフィルタを通過させ
た。完全ＴＳ細胞培地は、７０％条件付け培地、３０％ＴＳベース培地、２０ｎｇ／ｍ
Ｌのβ−胎児成長因子、および１μｇ／ｍＬのヘパリンを組み合わせることにより調製し
た。

完全ＴＳ細胞培地での６日間の培養後、形態（図１１）、およびＴＳ細胞マーカーＣＤ
４０のフローサイトメトリー解析により（図１２）、分化転換を評価した。

代表的な位相差画像の検査は、Ｅ１４細胞中では主として欠如していたＴＥＴ３過剰発
現細胞株中のＺＨＢＴｃ４細胞の栄養膜様形態への著しいシフトを明らかにしている。こ
の作用は、Ｔｅｔ３クローン７細胞株中でより際立っていた。

ＣＤ４０は、ＴＳ細胞とＥＳ細胞の区別のための確立したマーカーである（Ｒｕｇｇ−
Ｇｕｎｎｅｔａｌ．（２０１２）Ｃｅｌｌ２２，８８７−９０１）。フローサイト
メトリー解析は、ＴＥＴ３過剰発現時のＣＤ４０陽性細胞数の明白な増加を示している。
細胞集団全体の統計的試験は、Ｅ１４ＥＳ細胞と比較して双方のＴＥＴ３過剰発現細胞
株の非常に著しい変化を確証している（スチューデントのｔ検定；双方のケースでｐ＜０
．０００１）。ここでも、変化はＴｅｔ３クローン７細胞株中でより広範にわたり、ＣＤ
４０陽性細胞のレベルは、正の対照ｉＲａｓ細胞株で観察されるものとほぼ同等に達して
いる。

このデータは、ＥＳ細胞中のＴＥＴ３の過剰発現が、栄養膜様状態に分化形質転換する
能力の強力な向上をもたらすことを示し、発生能の増進を示す。さらには、この分化能の
拡張は、細胞が受け取るＴＥＴ３量と関連があり、双方の解析において、より高いＴＥＴ
３発現を有する細胞株（クローン７）がより大きな作用を示した。

このデータは、ＥＳ細胞中のＴＥＴ３の過剰発現が、栄養膜様状態に分化形質転換する能力の強力な向上をもたらすことを示し、発生能の増進を示す。さらには、この分化能の拡張は、細胞が受け取るＴＥＴ３量と関連があり、双方の解析において、より高いＴＥＴ３発現を有する細胞株（クローン７）がより大きな作用を示した。
本件出願は、以下の構成の発明を提供する。
（構成１）
細胞の分化能を高める方法であって、ＴＥＴファミリー遺伝子、その誘導体、またはそのフラグメントを前記細胞内へ導入するステップを含む、方法。
（構成２）
前記細胞が全能性状態まで高められる、構成１に記載の方法。
（構成３）
前記細胞が、真の多能性状態のような、多能性状態まで高められる、構成１に記載の方法。
（構成４）
前記ＴＥＴファミリー遺伝子、その誘導体、またはそのフラグメントが、ＴＥＴ２またはＴＥＴ３である、構成１〜３のいずれか一項に記載の方法。
（構成５）
前記ＴＥＴファミリー遺伝子、その誘導体、またはそのフラグメントが、ＴＥＴ３である、構成１〜４のいずれか一項に記載の方法。
（構成６）
前記ＴＥＴファミリー遺伝子、その誘導体、またはそのフラグメントが、配列番号１１または１３のＴＥＴ３イソ型である、構成１〜５のいずれか一項に記載の方法。
（構成７）
前記細胞が、胚性幹（ＥＳ）細胞、特にＥ１４胚性幹（ＥＳ）細胞、などの多能性細胞である、構成１、２、または４〜６のいずれか一項に記載の方法。
（構成８）
前記細胞が体細胞である、構成１〜６のいずれか一項に記載の方法。
（構成９）
前記導入ステップが、前記ＴＥＴファミリー遺伝子、その誘導体、またはそのフラグメントを含有するベクターを前記細胞にトランスフェクトすることを含む、構成１〜８のいずれか一項に記載の方法。
（構成１０）
前記ベクターがトランスポゾンベクターである、構成９に記載の方法。
（構成１１）
高められた分化能を有する細胞を調製する方法であって、ＴＥＴファミリー遺伝子、その誘導体、またはそのフラグメントを細胞内へ導入するステップを含む、方法。
（構成１２）
前記細胞が、胚性幹（ＥＳ）細胞、特にＥ１４胚性幹（ＥＳ）細胞、などの多能性細胞である、構成１１に記載の方法。
（構成１３）
前記細胞が体細胞である、構成１１に記載の方法。
（構成１４）
Ｏｃｔ３／４遺伝子、Ｓｏｘ２遺伝子、Ｋｌｆ４遺伝子、およびｃ−Ｍｙｃ遺伝子を前記体細胞内へ導入するステップをさらに含む、構成１３に記載の方法。
（構成１５）
前記ＴＥＴファミリー遺伝子、その誘導体、またはそのフラグメントの導入後、前記細胞を培養するステップをさらに含む、構成１１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
（構成１６）
前記ＴＥＴファミリー遺伝子、その誘導体、またはそのフラグメントを過剰発現させる１つ以上の細胞を選択するステップをさらに含む、構成１１〜１５のいずれか一項に記載の方法。
（構成１７）
前記１つ以上の細胞がフローサイトメトリーを使用して選択される、構成１６に記載の方法。
（構成１８）
構成１〜１７のいずれか一項に定義される方法によって入手可能な、高められた分化能を有する細胞。
（構成１９）
配列番号１１または１３のＴＥＴ３イソ型を含む核酸。
（構成２０）
構成１９に記載の核酸を含むベクター。
（構成２１）
細胞の分化能を高める方法における、構成１９に記載の前記核酸、または構成２０に記載の前記ベクターの使用。
（構成２２）
療法に使用するための、構成１８に記載の高められた分化能を有する細胞。
（構成２３）
前記療法が組織再生を含む、構成２２に記載の使用のための高められた分化能を有する細胞。
（構成２４）
ＴＥＴファミリー遺伝子、その誘導体、またはそのフラグメントを含有するベクターと、構成１〜１７のいずれか一項に定義される方法に従ってキットを使用するための説明書とを含むキット。
（構成２５）
胚性幹（ＥＳ）細胞、特にＥ１４胚性幹（ＥＳ）細胞などの少なくとも１つの多能性細胞をさらに含む、構成２４に記載のキット。
（構成２６）
少なくとも１つの体細胞をさらに含む、構成２４に記載のキット。
（構成２７）
前記細胞を培養するための培地と、構成１〜１７のいずれか一項に定義される方法に従って、前記高められた分化能を有する細胞を調製するための説明書とをさらに含む、構成２５または構成２６に記載のキット。

Claims

細胞の分化能を高める方法であって、ＴＥＴファミリー遺伝子、その誘導体、またはそ
のフラグメントを前記細胞内へ導入するステップを含む、方法。
前記細胞が全能性状態まで高められる、請求項１に記載の方法。
前記細胞が、真の多能性状態のような、多能性状態まで高められる、請求項１に記載の
方法。
前記ＴＥＴファミリー遺伝子、その誘導体、またはそのフラグメントが、ＴＥＴ２また
はＴＥＴ３である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
前記ＴＥＴファミリー遺伝子、その誘導体、またはそのフラグメントが、ＴＥＴ３であ
る、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
前記ＴＥＴファミリー遺伝子、その誘導体、またはそのフラグメントが、配列番号１１
または１３のＴＥＴ３イソ型である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
前記細胞が、胚性幹（ＥＳ）細胞、特にＥ１４胚性幹（ＥＳ）細胞、などの多能性細胞
である、請求項１、２、または４〜６のいずれか一項に記載の方法。
前記細胞が体細胞である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
前記導入ステップが、前記ＴＥＴファミリー遺伝子、その誘導体、またはそのフラグメ
ントを含有するベクターを前記細胞にトランスフェクトすることを含む、請求項１〜８の
いずれか一項に記載の方法。
前記ベクターがトランスポゾンベクターである、請求項９に記載の方法。
高められた分化能を有する細胞を調製する方法であって、ＴＥＴファミリー遺伝子、そ
の誘導体、またはそのフラグメントを細胞内へ導入するステップを含む、方法。
前記細胞が、胚性幹（ＥＳ）細胞、特にＥ１４胚性幹（ＥＳ）細胞、などの多能性細胞
である、請求項１１に記載の方法。
前記細胞が体細胞である、請求項１１に記載の方法。
Ｏｃｔ３／４遺伝子、Ｓｏｘ２遺伝子、Ｋｌｆ４遺伝子、およびｃ−Ｍｙｃ遺伝子を前
記体細胞内へ導入するステップをさらに含む、請求項１３に記載の方法。
前記ＴＥＴファミリー遺伝子、その誘導体、またはそのフラグメントの導入後、前記細
胞を培養するステップをさらに含む、請求項１１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
前記ＴＥＴファミリー遺伝子、その誘導体、またはそのフラグメントを過剰発現させる
１つ以上の細胞を選択するステップをさらに含む、請求項１１〜１５のいずれか一項に記
載の方法。
前記１つ以上の細胞がフローサイトメトリーを使用して選択される、請求項１６に記載
の方法。
請求項１〜１７のいずれか一項に定義される方法によって入手可能な、高められた分化
能を有する細胞。
配列番号１１または１３のＴＥＴ３イソ型を含む核酸。
請求項１９に記載の核酸を含むベクター。
細胞の分化能を高める方法における、請求項１９に記載の前記核酸、または請求項２０
に記載の前記ベクターの使用。
療法に使用するための、請求項１８に記載の高められた分化能を有する細胞。
前記療法が組織再生を含む、請求項２２に記載の使用のための高められた分化能を有す
る細胞。
ＴＥＴファミリー遺伝子、その誘導体、またはそのフラグメントを含有するベクターと
、請求項１〜１７のいずれか一項に定義される方法に従ってキットを使用するための説明
書とを含むキット。
胚性幹（ＥＳ）細胞、特にＥ１４胚性幹（ＥＳ）細胞などの少なくとも１つの多能性細
胞をさらに含む、請求項２４に記載のキット。
少なくとも１つの体細胞をさらに含む、請求項２４に記載のキット。
前記細胞を培養するための培地と、請求項１〜１７のいずれか一項に定義される方法に
従って、前記高められた分化能を有する細胞を調製するための説明書とをさらに含む、請
求項２５または請求項２６に記載のキット。