JP2022512727A - 高抵抗性経内皮バリアを誘導する相乗的転写因子 - Google Patents

Abstract

本出願は、経内皮バリア完全性を増大させることができる転写因子に関する。更に、本出願は、そのような転写因子をコードするベクター、及びそのようなベクターを含む細胞の使用に関する。

Description

発明の分野
本出願は、経内皮バリア完全性の完全性を増大させることができる転写因子に関する。更に、本出願は、そのような転写因子をコードするベクター、及びそのようなベクターを含む細胞の使用に関する。

背景
内皮細胞（ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌ：ＥＣ）の発生は発生の初期に始まり、各段階がより特殊化したＥＣ型を発生させ、最終的には器官の血管新生が完全に機能的かつ特殊化したＥＣを発生させる、別々の発達段階を経る（Ｐｏｔｅｎｔｅ Ｍ、Ｍａｋｉｎｅｎ Ｔ．、「Ｎａｔｕｒｅ ｒｅｖｉｅｗｓ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｅｌｌ ｂｉｏｌｏｇｙ．」（２０１７年）第１８巻、第８号、第４７７～９４頁（非特許文献１）、Ｄｅｊａｎａ Ｅ、Ｈｉｒｓｃｈｉ ＫＫ．（２０１７年）第８巻、第１４３６１号（非特許文献２））。血液脳関門（ｂｌｏｏｄ－ｂｒａｉｎ ｂａｒｒｉｅｒ：ＢＢＢ）のＥＣは、タイトジャンクションの発現により非常に高い抵抗性バリアを形成するために特殊化している（Ｄｅｊａｎａ Ｅ、Ｔｏｕｒｎｉｅｒ－Ｌａｓｓｅｒｖｅ Ｅ、「Ｗｅｉｎｓｔｅｉｎ ＢＭ．「Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ ｃｅｌｌ．」（２００９年）第１６巻、第２号、第２０９～２１頁（非特許文献３））。転写因子は遺伝子発現及び発達の主要な調節因子の１つであり、初期の血管発達におけるそれらの役割は広く研究されている（Ｄｅ Ｖａｌ Ｓ、Ｂｌａｃｋ ＢＬ．、「Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ ｃｅｌｌ．」（２００９年）第１６巻、第２号、第１８０～９５頁（非特許文献４））が、臓器特異的分化における内皮細胞発達の転写調節はあまり理解されていない（例えば、ＢＢＢ（Ｄｅｊａｎａ Ｅ．（２０１０年）第１０７巻、第８号、第９４３～５２頁（非特許文献５）、Ｍｉｚｅｅ ＭＲ、Ｗｏｏｌｄｒｉｋ Ｄ、Ｌａｋｅｍａｎ ＫＡ、ｖａｎ ｈｅｔ Ｈｏｆ Ｂ、Ｄｒｅｘｈａｇｅ ＪＡ、Ｇｅｅｒｔｓ Ｄら、「Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ：ｔｈｅ ｏｆｆｉｃｉａｌ ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ．」（２０１３年）第３３巻、第４号、第１６６０～７１頁（非特許文献６）、Ｅｎｇｅｌｈａｒｄｔ Ｂ、Ｌｉｅｂｎｅｒ Ｓ．（２０１４年）第３５５巻、第３号、第６８７～９９頁（非特許文献７）））。

インビトロのＥＣバリアをモデリングするために存在する現在のモデルは高度に洗練されており、正確に再現することが難しく、創薬に適応することが困難である。したがって、例えば健康状態及び疾患状態におけるＢＢＢを研究するためのモデルとして、高抵抗性のインビトロ経内皮バリア完全性（ｔｒａｎｓｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｂａｒｒｉｅｒ ｉｎｔｅｇｒｉｔｙ：ＴＢＩ）を確立することができる大量のＥＣを生成するのに適したロバストな細胞培養方法に対する必要性が依然として存在する。

本発明者らは、以前に、ヒト多能性幹細胞を機能性内皮細胞に分化させるための簡単でスケーラブルな６日間プロトコルを確立した（Ｐａｔｓｃｈ Ｃ、Ｃｈａｌｌｅｔ－Ｍｅｙｌａｎ Ｌ、Ｔｈｏｍａ ＥＣ、Ｕｒｉｃｈ Ｅ、Ｈｅｃｋｅｌ Ｔ、Ｏ’Ｓｕｌｌｉｖａｎ ＪＦら、「Ｎａｔｕｒｅ ｃｅｌｌ ｂｉｏｌｏｇｙ．」（２０１５年）第１７巻、第８号、第９９４～１００３頁（非特許文献８））。

本明細書では、本発明者らは、インビトロの高抵抗性バリアを確立可能な内皮細胞（ＥＣ）を生成することができる転写因子の相乗的組合せを提供する。本明細書に記載されている転写因子の組合せは、とりわけ疾患モデリング又は創薬若しくは毒性学研究に使用することができる高バリア完全性を確立可能なＥＣを生成するため、直接的かつロバストなプロトコルにおいて使用することができる。

Ｐｏｔｅｎｔｅ Ｍ、Ｍａｋｉｎｅｎ Ｔ．、「Ｎａｔｕｒｅ ｒｅｖｉｅｗｓ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｅｌｌ ｂｉｏｌｏｇｙ．」（２０１７年）第１８巻、第８号、第４７７～９４頁 Ｄｅｊａｎａ Ｅ、Ｈｉｒｓｃｈｉ ＫＫ．（２０１７年）第８巻、第１４３６１号 Ｄｅｊａｎａ Ｅ、Ｔｏｕｒｎｉｅｒ－Ｌａｓｓｅｒｖｅ Ｅ、「Ｗｅｉｎｓｔｅｉｎ ＢＭ．「Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ ｃｅｌｌ．」（２００９年）第１６巻、第２号、第２０９～２１頁 Ｄｅ Ｖａｌ Ｓ、Ｂｌａｃｋ ＢＬ．、「Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ ｃｅｌｌ．」（２００９年）第１６巻、第２号、第１８０～９５頁 Ｄｅｊａｎａ Ｅ．（２０１０年）第１０７巻、第８号、第９４３～５２頁 Ｍｉｚｅｅ ＭＲ、Ｗｏｏｌｄｒｉｋ Ｄ、Ｌａｋｅｍａｎ ＫＡ、ｖａｎ ｈｅｔ Ｈｏｆ Ｂ、Ｄｒｅｘｈａｇｅ ＪＡ、Ｇｅｅｒｔｓ Ｄら、「Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ：ｔｈｅ ｏｆｆｉｃｉａｌ ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ．」（２０１３年）第３３巻、第４号、第１６６０～７１頁 Ｅｎｇｅｌｈａｒｄｔ Ｂ、Ｌｉｅｂｎｅｒ Ｓ．（２０１４年）第３５５巻、第３号、第６８７～９９頁 Ｐａｔｓｃｈ Ｃ、Ｃｈａｌｌｅｔ－Ｍｅｙｌａｎ Ｌ、Ｔｈｏｍａ ＥＣ、Ｕｒｉｃｈ Ｅ、Ｈｅｃｋｅｌ Ｔ、Ｏ’Ｓｕｌｌｉｖａｎ ＪＦら、「Ｎａｔｕｒｅ ｃｅｌｌ ｂｉｏｌｏｇｙ．」（２０１５年）第１７巻、第８号、第９９４～１００３頁

高い経内皮電気抵抗（ｔｒａｎｓｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｅｌｅｃｔｒｉｃａｌ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ：ＴＥＥＲ）を確立することができる細胞を作製するための方法であって、該細胞を少なくとも１つの転写因子と接触させる工程を含み、ここで、該細胞のコンフルエント単層が、該少なくとも１つの転写因子と接触しない細胞のコンフルエント単層と比較してより高い経内皮電気抵抗を確立する、方法が提供される。

一実施形態では、該少なくとも１つの転写因子は、ＴＡＬ１、ＳＯＸ１８、ＦＯＸＦ２、ＳＯＸ７、ＦＯＸＣ１、ＥＴＳ１、ＫＬＦ１１、ＬＭＯ２、及びＬＥＦ１からなる群から個別に選択される。

一実施形態では、該少なくとも１つの転写因子は、ＥＴＳ１、ＳＯＸ１８、及びＳＯＸ７からなる群から選択され、ここで、特に該転写因子は、ＥＴＳ１、ＳＯＸ１８、及びＳＯＸ７である。

一実施形態では、該転写因子は、（ｉ）ＥＴＳ１、ＳＯＸ１８、ＳＯＸ７、及びＴＡＬ１、又は（ｉｉ）ＥＴＳ１、ＳＯＸ１８、ＳＯＸ７、及びＬＥＦ１である。

一実施形態では、該最小１つの転写因子をコードする単離された核酸は、該細胞に導入される。

一実施形態では、該単離された核酸は、少なくとも１つの発現ベクターに含まれ、特に該少なくとも１つの発現ベクターは、ウイルスベクター、非ウイルスベクター、及びプラスミドベクターからなる群から個別に選択される。

一実施形態では、該細胞は、内皮細胞（ＥＣ）である。

一実施形態では、ＴＡＬ１、ＳＯＸ１８、ＦＯＸＦ２、ＳＯＸ７、ＦＯＸＣ１、ＥＴＳ１、ＫＬＦ１１、ＬＭＯ２、及びＬＥＦ１からなる群から選択される少なくとも１つの転写因子をコードする単離された核酸を含む、発現ベクターが提供される。

一実施形態では、該ベクターは、ウイルスベクター、非ウイルスベクター、又はプラスミドベクターである。

一実施形態では、該単離された核酸は、ＥＴＳ１、ＳＯＸ１８、及びＳＯＸ７からなる群から選択される少なくとも１つの該転写因子をコードし、特に、該単離された核酸は、該転写因子ＥＴＳ１、ＳＯＸ１８、及びＳＯＸ７をコードする。

一実施形態では、該単離された核酸は、該転写因子（ｉ）ＥＴＳ１、ＳＯＸ１８、ＳＯＸ７、及びＴＡＬ１、又は（ｉｉ）ＥＴＳ１、ＳＯＸ１８、ＳＯＸ７、及びＬＥＦ１をコードする。

一実施形態では、本明細書に記載の発現ベクターのうちの１つ以上を含む細胞が提供される。

一実施形態では、該細胞は、哺乳動物細胞、特にヒト細胞である。

一実施形態では、高いＴＥＥＲを確立することができる該細胞が、（ｉ）インビボ経内皮バリア完全性（ＴＢＩ）を増大させることができるか、又は（ｉｉ）内皮細胞（ＥＣ）のインビボＴＢＩを低減させることができる薬物候補を同定するために使用される、本明細書に記載の方法が提供される。一実施形態では、該方法は、
（ａ）高いＴＥＥＲを確立することができる細胞の単層を提供する工程；
（ｂ）該細胞を該薬物候補と接触させる工程；
（ｃ）該細胞を該薬物候補と接触させる前及び後におけるインビトロＴＥＥＲを測定する工程か、又は該薬物候補と接触させた該細胞のインビトロＴＥＥＲを測定し、かつ並行して、該薬物候補と接触させなかった細胞のインビトロＴＥＥＲを測定する工程であって、
ここで、（ｉ）該薬物候補と接触させなかった該細胞の該インビトロＴＥＥＲと比較して、該薬物候補と接触させた該細胞のより高いインビトロＴＥＥＲは、ＥＣのインビボＴＢＩを増大させることができる薬物を示し、（ｉｉ）該薬物候補と接触させなかった該細胞のインビトロＴＥＥＲと比較して、該薬物候補と接触した該細胞のより低いインビトロＴＥＥＲは、ＥＣのインビボＴＢＩを低減させることができる薬物を示す、工程
を含む。

内皮バリア抵抗性を促進する転写因子の同定。抵抗性測定の安定化後（１０時間）にＭＯＩ ８０アデノウイルスを加えた２４時間後の平均相対バリア抵抗性の測定；平均は３つの独立した実験による（図１Ａ）。有意な効果、又は２４時間でバリア抵抗性増大の傾向を示した転写因子に対するＥＣバリア抵抗性のリアルタイム測定を、ＥＣＩＳにより行った。バリア測定値が安定したら、処理後１０時間で値を正規化した。線は平均抵抗性を示す（図１Ｂ）。形質導入後４８時間での透過性のＦＩＴＣデキストラン測定；平均は３つの独立した実験からである（図１Ｃ）。ＥＣマーカ遺伝子（図１Ｄ、図１Ｅ、図１Ｆ），ＥＣバリアジャンクション形成遺伝子（図１Ｇ、図１Ｈ、図１Ｉ、図１Ｊ、図１Ｋ、図１Ｌ、図１Ｍ、図１Ｎ、図１Ｏ）、及びＥＣバリア形成に重要であると知られている遺伝子（図１Ｐ、図１Ｑ、図１Ｒ）の相対的ｍＲＮＡ発現。カラムは平均±標準偏差を示す。＊＝ｐ又はＦＤＲ＜０．０５、＊＊＝ｐ又はＦＤＲ＜０．０１、＊＊＝ｐ又はＦＤＲ＜０．００１。全ての処理を３回行った。 転写因子の組合せの過剰発現は内皮細胞バリア抵抗性を相乗的に誘導する。抵抗性測定の安定化後（１０時間）にＭＯＩ ２０アデノウイルスを加えた２４時間後の平均相対バリア抵抗性の測定；平均は３つの独立した実験による（図２Ａ）。形質導入後４８時間での透過性のＦＩＴＣデキストラン測定；平均は３つの独立した実験からである（図２Ｂ）。抵抗性測定の安定化後（１０時間）に、各ＭＯＩ ２０である４つのアデノウイルスの組合せを加えた２４時間後の平均相対バリア抵抗性の測定；平均は３つの独立した実験による（図２Ｃ）。ＴＦ（各ＭＯＩ ２０）の組合せに対するＥＣバリア抵抗性のリアルタイム測定。線は平均抵抗性を示し、影は標準偏差に対応する（図２Ｄ）。形質導入後４８時間での透過性のＦＩＴＣデキストラン測定；平均は３つの独立した実験による。カラムは平均±標準偏差を示す（図２Ｅ）。

引用文献

詳細な説明
本明細書で使用される場合、用語「限定培地」又は「既知組成培地」とは、全ての個別成分及びそれら各々の濃度が既知である細胞培養培地を指す。限定培地は組換え成分及び既知組成成分を含み得る。

本明細書で使用される場合、用語「分化すること」、「分化」、及び「分化する」とは、低分化細胞を体細胞に変換する、例えば多能性幹細胞をＥＣに変換するための１つ以上の工程を指す。多能性幹細胞のＥＣへの分化は本明細書に記載の方法によって達成される。

本明細書で使用される場合、「ＥＣ」と略される「内皮細胞」は、特異的表面マーカＣＤ１４４（分化クラスタ１４４、２型カドヘリン５又は血管内皮（ｖａｓｃｕｌａｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ：ＶＥ）カドヘリンとしても知られる、正式略称ＣＤＨ５）を発現し、内皮細胞の特徴すなわち毛細血管様管形成と、ＣＤ３１（分化クラスタ３１、正式略称ＰＥＣＡＭ１）、ｖＷＦ（フォンビルブランド因子、正式略称ＶＷＦ）、ＣＤ３４（分化クラスタ３４、正式略称ＣＤ３４）、ＣＤ１０５（分化クラスタ１０５、正式略称ＥＮＧ）、ＣＤ１４６（分化クラスタ３４、公式のシンボルＭＣＡＭ）、及びＶＥＧＦＲ－２（キナーゼ挿入ドメイン受容体（ＩＩＩ型受容体チロシンキナーゼ）、正式略称ＫＤＲ）の群から選択される１つ以上の更なる表面マーカの発現と、を有する細胞である。

「拡大培養用培地」とは、本明細書で使用される場合、単層上の内皮細胞を拡大培養及び継代培養するのに有用な、任意の既知組成培地を指す。

用語「増殖因子」とは、本明細書で使用される場合、細胞増殖を引き起こす生物学的に活性なポリペプチド又は小分子化合物を意味し、成長因子及びそれらの類似体の両方を含む。

本明細書で使用される「ハイ・スループット・スクリーニング」は、多数の異なる疾患モデル状態及び／又は化学化合物を並列及び／又は逐次的に分析及び比較することができることを意味するものと理解されよう。典型的には、そのようなハイ・スループット・スクリーニングは、マルチウェル・マイクロタイタ・プレート、例えば９６ウェルプレート若しくは３８４ウェルプレート、又は１５３６若しくは３４５６ウェルを有するプレートにおいて実施される。

「誘導用培地」とは、本明細書で使用される場合、単層上のＣＤ１４４ポジティブ（ＣＤ１４４＋）内皮細胞へのプライム細胞の誘導に有用である、任意の既知組成培地を指す。

「細胞の単層」とは、本明細書で使用される場合、非コンフルエント単一細胞及び／又は細胞集塊（例えば、胚様体）の培養とは対照的に、細胞が１つの単一フィルム内で接着基質に付着した個々の細胞として提供され、この場合、複数層内の細胞の固体塊が接着性基質に付着した様々な三次元形成を形成することを意味する。

用語「核酸」は、ポリヌクレオチドにより構成されるプリン塩基及びピリミジン塩基を含む塩基の組成物並びに／又は配列に関する。これにより、該塩基は、ポリペプチド及び／又はタンパク質（例えば、転写因子）をコードする核酸の一次構造を表す。用語「核酸」とは、本明細書では、ポリヌクレオチド（複数可）及び核酸分子という用語と同義に使用される。本明細書では、核酸という用語は、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ＲＮＡ、ＤＮＡの合成形態、及びこれらの分子のうちの２つ以上を含む混合ポリマーを含む。加えて、核酸という用語は、センス鎖及びアンチセンス鎖の両方を含む。その上、本明細書に説明される核酸は、当業者に容易に理解されるように、非天然の又は誘導体化されたヌクレオチド塩基を含有することができる。

「単離された核酸」分子又は「単離されたポリヌクレオチド」は、その天然環境から取り出された核酸分子、ＤＮＡ、又はＲＮＡを意図する。例えば、ベクターにおいて含有されるポリペプチドをコードする組換えポリヌクレオチドは、本発明の目的のために単離されていると考えられる。単離されたポリヌクレオチドの更なる例としては、異種性宿主細胞において維持された組換えポリヌクレオチド、又は溶液中の精製された（部分的に又は実質的に）、ポリヌクレオチドが挙げられる。単離されたポリヌクレオチドは、元々ポリヌクレオチド分子を含有する細胞において含有されているポリヌクレオチド分子を含むが、ポリヌクレオチド分子は、染色体外に存在するか、又はその天然の染色体位置とは異なる染色体位置に存在する。

「少なくとも１つの転写因子をコードする核酸」とは、本発明の転写因子（又はその断片及び／又は変異体）をコードする１つ以上の核酸分子を指し、単一のベクター又は別個のベクター内のかかる核酸分子（複数可）を含み、かかる核酸分子（複数可）は宿主細胞内の１つ以上の場所に存在する。

「多能性培地」とは、本明細書で使用される場合、その多能性を維持しながら単層上に単一細胞として多能性幹細胞を付着させるために有用である、任意の既知組成培地を指す。有用な多能性培地は、本明細書にも記載される当技術分野で周知である。本明細書に記載の特定の実施形態では、多能性培地は、以下の成長因子：塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂａｓｉｃ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ：ｂＦＧＦ、線維芽細胞増殖因子２（Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ ２：ＦＧＦ２）としても示される）及びトランスフォーミング増殖因子β（ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ β：ＴＧＦβ）のうちの少なくとも１つを含む。

用語「再プログラミング」とは、本明細書で使用される場合、例えば、線維芽細胞、脂肪細胞、ケラチノサイト、又は白血球を多能性幹細胞に変換するために体細胞を低分化細胞へと変換するのに必要である、１以上の工程を指す。「再プログラムされた」細胞とは、本明細書で使用される場合、体細胞を再プログラムすることによって誘導される細胞を指す。

用語「小分子」又は「小化合物」又は「小分子化合物」とは、本明細書で使用される場合、合成されるか又は自然界で見出されるかのいずれかであり、一般的に１０，０００グラム／モル未満、任意に５，０００グラム／モル未満、及び任意に２，０００グラム／モル未満の分子量を有する有機又は無機分子を指す。

用語「体細胞」とは、本明細書で使用される場合、生殖系細胞（例えば、精子及び卵子、それらが作られる細胞（生殖母細胞））及び未分化幹細胞ではない生物体を形成する任意の細胞を指す。

用語「幹細胞」とは、本明細書で使用される場合、自己複製能を有する細胞を指す。「未分化幹細胞」とは、本明細書で使用される場合、多様な細胞型に分化する能力を有する幹細胞を指す。「多能性幹細胞」とは、本明細書で使用される場合、複数の細胞型の細胞を生じ得る幹細胞を指す。多能性幹細胞（ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ：ＰＳＣ）は、ヒト胚性幹細胞（ｈｕｍａｎ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ：ｈＥＳＣ）及びヒト人工多能性幹細胞（ｈｕｍａｎ ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ：ｈｉＰＳＣ）を含む。ヒト人工多能性幹細胞は、再プログラム化された体細胞から、例えば、当該技術分野で公知でありかつ本明細書で更に記載される方法による、４つの規定因子（Ｓｏｘ２、Ｏｃｔ４、Ｋｌｆ４、ｃ－Ｍｙｃ）の形質導入によって誘導することができる。該ヒト体細胞は健康な個体又は患者から得ることができる。これらのドナー細胞は任意の適切な供給源から得ることができる。本明細書においては、人体に侵襲的な処置を行うことなく、ドナー細胞、例えばヒト皮膚細胞、血液細胞、又は尿試料から得られ得る細胞の単離を可能にする供給源が好ましい。

ヒト細胞が好ましいが、本明細書に記載される方法はまた、霊長類、齧歯類（例えば、ラット、マウス、ウサギ）、及びイヌ細胞などの非ヒト細胞にも適用可能である。

用語「高抵抗性経内皮バリア」とは、本明細書で使用される場合、インビトロ及びインビボの内皮細胞の機能的特徴を指す。内皮細胞（ＥＣ）は血管内腔と周辺組織との間の半選択的バリアとして作用し、物質の通過及び白血球細胞の血流への出入りを制御する。この高抵抗性経内皮バリアの完全性は、本明細書では、「経内皮バリア完全性」又は「ＴＢＩ」と称される。バリア機能の喪失は健康状態及び疾患状態において観察され、例えば、治癒、血管新生、及び慢性炎症は、一時的又は永久的なＴＢＩの喪失と一致し得る。ＴＢＩは、本明細書に記載され（例えば、多能性細胞からのＥＣ培養）、そして当該技術分野において既知（例えば、短期初代細胞培養）の適当な条件下において作製されたＥＣの単層によってインビトロでモデル化することができる（例えば、ＥＣ培養）。ＴＢＩ、例えばインビトロＴＢＩは、当該技術分野で既知の方法（例えば、ＴＥＥＲ及びＦＩＴＣデキストラン透過性の測定）及び本明細書に記載の方法を用いて測定することができる。用語「インビトロＴＢＩ」とは、本明細書で使用される場合、インビトロＥＣ培養物のＴＢＩを指し、ここで、該ＴＢＩは、培養物中の細胞単層を横切って、例えば、単層下の培養容器表面と細胞単層上の細胞培養培地との間で測定される（従来の２次元細胞培養装置）。したがって、用語「インビボＴＢＩ」とは、本明細書で使用される場合、インビボＥＣのＴＢＩを指し、ここで、該ＴＢＩは、血管内腔と周辺組織との間で確立及び／又は決定（例えば、測定）される。

用語「経内皮電気抵抗」又は「ＴＥＥＲ」とは、本明細書で使用される場合、ＥＣ単層の細胞培養におけるタイト・ジャンクション・ダイナミクスの完全性の定量測定を指す。ＴＥＥＲはインビトロバリアのモデルシステムの文脈で広く受け入れられているパラメータである（Ｓｒｉｎｉｖａｓａｎ Ｂ．、Ｋｏｌｌｉ ＡＲ、Ｅｓｃｈ ＭＢ、Ａｂａｃｉ ＨＥ、Ｓｈｕｌｅｒ ＭＬ、Ｈｉｃｋｍａｎ ＪＪ．、「Ｊ Ｌａｂ Ａｕｔｏｍ．」（２０１５年）第２０巻、第２号、第１０７～１２６頁）。一実施形態では、細胞単層の電気抵抗又はインピーダンスは、バリア完全性の定量測定である。非侵襲的技術であるため、ＴＥＥＲは、短期、中期、又は長期の細胞培養における反復又はリアルタイム測定に特に適している。ＴＥＥＲ測定は、適切な周波数スペクトルにわたるオーム抵抗又はインピーダンスの測定に基づいてもよい。一実施形態では、細胞単層は、上部（頂端部）及び下部（基底外側部）区画を画定する半透過性フィルタインサート上で培養される。一実施形態では、頂端部区画に配置された第１の電極と基底外側部区画に配置された第２の電極とは、細胞単層によって分離される。一実施形態では、矩形波の交流（ａｌｔｅｒｎａｔｉｎｇ ｃｕｒｒｅｎｔ：ＡＣ）電圧信号が印加される。一実施形態では、周波数２００～３００ＨｚのＡＣが印加される。一実施形態では、直径２５０μｍである円形の金電極を覆う細胞上のインピーダンスは、２５０Ｈｚで測定される。

この文脈においては、本発明者らは驚くべきことに、ある種の転写因子、特に本明細書に記載されているような転写因子の組合せが、内皮細胞（ＥＣ）において強いＴＢＩを誘導することを見出した。そのような転写因子と接触した細胞、特にＥＣは、例えば、そのような細胞の単層を通る分子及びイオンの通過を制限する高抵抗性経内皮バリアを形成することができるようになる。この文脈においては、本発明は、高抵抗性経内皮バリアを形成／確立することができる細胞、特にＥＣを提供する。本明細書に記載された方法に従って作製された本明細書に記載の細胞は、とりわけ、細胞培養物、特に、経内皮バリア完全性が特徴である（例えば、ＴＢＩの破綻は疾患又はＢＢＢ完全性に起因する）、健康状態又は疾患状態の細胞培養モデルを確立するために使用され得る。一実施形態では、本明細書に記載される細胞培養物は、医薬品開発の設定において使用される。本明細書に記載の方法で作製される細胞培養物の例示的な使用は、薬物候補に対する細胞／組織のインビボ応答の予測である。概念実証として、ＥＣを本明細書に記載の転写因子の組合せ（例えば、ＴＡＬ１、ＳＯＸ１８、ＦＯＸＦ２、ＳＯＸ７、ＦＯＸＣ１、ＥＴＳ１、ＫＬＦ１１、ＬＭＯ２、ＬＥＦ１、及びこれらの組合せ）と接触させたところ、経内皮電気抵抗（ＴＥＥＲ）の著しい増大が観察された（例えば、図１Ｂ、図２Ｃ、図２Ｄ、図２Ｅ参照）。ＴＥＥＲは、例えば細胞の単層を横切るイオンの動きと相関し、そうしてＴＢＩと相関する。この文脈においては、高いＴＥＥＲは、本明細書で更に記載されるように、確立された高抵抗性経内皮バリアと相関する。本明細書に提供されるこのデータ及び更なるデータは、本明細書に記載される特異的転写因子及びその組合せが、ＴＢＩ（例えば、ＴＥＥＲ又はＦＩＴＣデキストラン透過性によって測定）を相乗的に誘導することができ、高抵抗性経内皮バリアを形成／確立することができる細胞を産生するのに有用であることを実証する。本明細書に記載される転写因子、そのような転写因子をコードする発現ベクター、及びそのような発現ベクターを含む細胞は、とりわけ、健康及び疾患におけるＥＣのロバストかつ有意なモデルを生成するために有用である。このような細胞培養モデルは、化学ライブラリをプロファイリングして、内皮バリアの完全性を増大させるか、又はバリア破壊の喪失を防止する化合物を発見するための方法で使用することができる。

転写因子と接触する細胞を本明細書で提供する。転写因子に応答して、細胞は、例えば当該技術分野で周知でありかつ本明細書に記載されるように、ＴＥＥＲを測定する（リアルタイムで）ことによって測定され得る、増大した経内皮バリア完全性を確立する。したがって、本明細書に記載の転写因子又は本明細書に記載の転写因子の組合せと接触した細胞は、高抵抗性経内皮バリアを形成することができるようになる。好ましい実施形態では、細胞（複数可）は、内皮細胞（複数可）である。更なる実施形態では、細胞（複数可）は、本明細書に記載されるように、転写因子との接触に応答してインビボ内皮細胞特性を確立及び／又は維持する。

一実施形態では、細胞は、少なくとも１つの転写因子と接触される。一実施形態では、転写因子は、ＴＡＬ１、ＳＯＸ１８、ＦＯＸＦ２、ＳＯＸ７、ＦＯＸＣ１、ＥＴＳ１、ＫＬＦ１１、ＬＭＯ２、及びＬＥＦ１からなる群から選択される。一実施形態では、細胞は、ＴＡＬ１、ＳＯＸ１８、ＦＯＸＦ２、ＳＯＸ７、ＦＯＸＣ１、ＥＴＳ１、ＫＬＦ１１、ＬＭＯ２、及びＬＥＦ１からなる群から選択される２つの転写因子と接触される。一実施形態では、細胞は、ＴＡＬ１、ＳＯＸ１８、ＦＯＸＦ２、ＳＯＸ７、ＦＯＸＣ１、ＥＴＳ１、ＫＬＦ１１、ＬＭＯ２、及びＬＥＦ１からなる群から選択される３つの転写因子と接触される。一実施形態では、細胞は、ＴＡＬ１、ＳＯＸ１８、ＦＯＸＦ２、ＳＯＸ７、ＦＯＸＣ１、ＥＴＳ１、ＫＬＦ１１、ＬＭＯ２、及びＬＥＦ１からなる群から選択される４つの転写因子と接触される。一実施形態では、細胞は、ＴＡＬ１、ＳＯＸ１８、ＦＯＸＦ２、ＳＯＸ７、ＦＯＸＣ１、ＥＴＳ１、ＫＬＦ１１、ＬＭＯ２、及びＬＥＦ１からなる群から選択される５つの転写因子と接触される。特定の一実施形態では、転写因子は、ＥＴＳ１、ＳＯＸ１８、及びＳＯＸ７である。好ましい実施形態では、転写因子は、（ｉ）ＥＴＳ１、ＳＯＸ１８、ＳＯＸ７、及びＴＡＬ１、又は（ｉｉ）ＥＴＳ１、ＳＯＸ１８、ＳＯＸ７、及びＬＥＦ１、最も好ましくはＥＴＳ１、ＳＯＸ１８、ＳＯＸ７、及びＴＡＬ１である。

一実施形態では、少なくとも１つの転写因子は、細胞へ導入される。転写因子は、当該技術分野で周知の方法及び本明細書に記載の方法によって、細胞、例えばＥＣに導入することができる。一実施形態では、転写因子は、単離された核酸によってコードされる。一実施形態では、少なくとも１つの転写因子をコードする単離された核酸は、細胞に導入される。一実施形態では、単離された核酸は、少なくとも１つのポリヌクレオチドを含む。一実施形態では、少なくとも１つの転写因子をコードする単離された核酸は、少なくとも１つの発現ベクター中に含まれる。一実施形態では、細胞、例えば内皮細胞は、少なくとも１つの発現ベクターと接触され、特に該少なくとも１つの発現ベクターは、ウイルスベクター、非ウイルスベクター、及びプラスミドベクターからなる群から個別に選択される。一実施形態では、１、２、３、４、又は５つの発現ベクターが細胞（例えば、ＥＣ）に導入される。一実施形態では、１つの発現ベクター、特にウイルスベクターが、細胞に導入される。一実施形態では、２つの発現ベクターが細胞に導入され、ここで、該発現ベクターは、ウイルスベクター、非ウイルスベクター、及びプラスミドベクターからなる群から個別に選択される。一実施形態では、３つの発現ベクターが細胞に導入され、ここで、該発現ベクターは、ウイルスベクター、非ウイルスベクター、及びプラスミドベクターからなる群から個別に選択される。一実施形態では、４つの発現ベクターが細胞に導入され、ここで、該発現ベクターは、ウイルスベクター、非ウイルスベクター、及びプラスミドベクターからなる群から個別に選択される。一実施形態では、５つの発現ベクターが細胞に導入され、ここで、該発現ベクターは、ウイルスベクター、非ウイルスベクター、及びプラスミドベクターからなる群から個別に選択される。好ましい実施形態では、転写因子は、ウイルスベクター、非ウイルスベクター、及びプラスミドベクター、特にウイルスベクターからなる群から選択される１つの発現ベクターに含まれる、単離された核酸によってコードされる。

本発明の更なる態様は、本発明にかかる１つ又はいくつかの転写因子をコードする単離された核酸（ポリヌクレオチド）及びベクター（例えば、発現ベクター）である。一実施形態では、該発現ベクターは、ＴＡＬ１、ＳＯＸ１８、ＦＯＸＦ２、ＳＯＸ７、ＦＯＸＣ１、ＥＴＳ１、ＫＬＦ１１、ＬＭＯ２、及びＬＥＦ１からなる群から選択される少なくとも１つの転写因子をコードする単離された核酸を含む。特定の一実施形態では、単離された核酸は、転写因子ＥＴＳ１、ＳＯＸ１８、及びＳＯＸ７をコードする。好ましい実施形態では、単離された核酸は、転写因子は（ｉ）ＥＴＳ１、ＳＯＸ１８、ＳＯＸ７、及びＴＡＬ１、又は（ｉｉ）ＥＴＳ１、ＳＯＸ１８、ＳＯＸ７、及びＬＥＦ１、最も好ましくはＥＴＳ１、ＳＯＸ１８、ＳＯＸ７、及びＴＡＬ１をコードする。

そのような転写因子のポリペプチド配列（複数可）はＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ－Ｐｒｏｔデータベースにあり、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｕｎｉｐｒｏｔ．ｏｒｇ／ｕｎｉｐｒｏｔから検索できる。ヒト転写因子の例示的な特定の参照が本明細書に提供される。（ヒト）ＴＡＬ１（Ｔ細胞急性リンパ性白血病タンパク質１）の配列（複数可）は、Ｓｗｉｓｓ－ＰｒｏｔデータベースエントリＰ１７５４２（エントリバージョン１８７、シーケンスバージョン２）から取得できる。（ヒト）ＳＯＸ１８（転写因子ＳＯＸ－１８）の配列（複数可）は、Ｓｗｉｓｓ－ＰｒｏｔデータベースエントリＰ３５７１３（エントリバージョン１６８、シーケンスバージョン２）から取得できる。（ヒト）ＦＯＸＦ２（フォークヘッドボックスタンパク質Ｆ２）の配列（複数可）は、Ｓｗｉｓｓ－ＰｒｏｔデータベースエントリＱ１２９４７（エントリバージョン１４９、シーケンスバージョン２）から取得できる。（ヒト）ＳＯＸ７（転写因子ＳＯＸ－７）の配列（複数可）は、Ｓｗｉｓｓ－ＰｒｏｔデータベースエントリＱ９ＢＴ８１（エントリバージョン１４４、シーケンスバージョン１）から取得できる。（ヒト）ＦＯＸＣ１（フォークヘッドボックスタンパク質Ｃ１）の配列（複数可）は、Ｓｗｉｓｓ－ＰｒｏｔデータベースエントリＱ１２９４８（エントリバージョン１８４、シーケンスバージョン３）から取得できる。（ヒト）ＥＴＳ１（タンパク質Ｃ－ｅｔｓ－１）の配列（複数可）は、Ｓｗｉｓｓ－ＰｒｏｔデータベースエントリＰ１４９２１（エントリバージョン２０３、シーケンスバージョン１）から取得できる。（ヒト）ＫＬＦ１１（クルッペル様因子１１）の配列（複数可）は、Ｓｗｉｓｓ－ＰｒｏｔデータベースエントリＯ１４９０１（エントリバージョン１７１、シーケンスバージョン２）から取得できる。（ヒト）ＬＭＯ２（Ｒｈｏｍｂｏｔｉｎ－２）の配列（複数可）は、Ｓｗｉｓｓ－ＰｒｏｔデータベースエントリＰ２５７９１（エントリバージョン１７８、シーケンスバージョン１）から取得できる。（ヒト）ＬＥＦ１（リンパ系エンハンサー結合因子１）の配列（複数可）は、Ｓｗｉｓｓ－ＰｒｏｔデータベースエントリＱ９ＵＪＵ２（エントリバージョン１７７、シーケンスバージョン１）から取得できる。

本明細書に記載される少なくとも１つの転写因子をコードする単離された核酸は、従来の手順を用いて（例えば、本明細書中に記載される遺伝子転写因子に特異的に結合することができるオリゴヌクレオチドプローブを用いることによって）容易に単離され、配列決定され得るか、又は組換え方法によって産生され得るか、又は化学合成によって得られ得る。本発明の転写因子の例示的ポリヌクレオチド配列（複数可）は、ＮＣＢＩデータベースで入手可能であり、ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖから検索することができる。ヒト転写因子の例示的な特定の参照が本明細書に提供される。（ヒト）ＴＡＬ１（Ｔ細胞急性リンパ性白血病タンパク質１）をコードする核酸配列は、ＮＣＢＩデータベースエントリＮＰ＿００１２７４２７６．１から取得できる。（ヒト）ＳＯＸ１８（転写因子ＳＯＸ－１８）をコードする核酸配列は、ＮＣＢＩデータベースエントリＮＰ＿０６０８８９．１から取得できる。（ヒト）ＦＯＸＦ２（フォークヘッドボックスタンパク質Ｆ２）をコードする核酸配列は、ＮＣＢＩデータベースエントリＮＰ＿００１４４３．１から取得できる。（ヒト）ＳＯＸ７（転写因子ＳＯＸ－７）をコードする核酸配列は、ＮＣＢＩデータベースエントリＮＰ＿１１３６２７．１から取得できる。（ヒト）ＦＯＸＣ１（フォークヘッドボックスタンパク質Ｃ１）をコードする核酸配列は、ＮＣＢＩデータベースエントリＮＰ＿００１４４４．２から取得できる。（ヒト）ＥＴＳ１（タンパク質Ｃ－ｅｔｓ－１）をコードする核酸配列は、ＮＣＢＩデータベースエントリＮＰ＿００１１３７２９２．１から取得できる。（ヒト）ＫＬＦ１１（クルッペル様因子１１）をコードする核酸配列は、ＮＣＢＩデータベースエントリＮＰ＿００１１７１１８７．１から取得できる。（ヒト）ＬＭＯ２（Ｒｈｏｍｂｏｔｉｎ－２）をコードする核酸配列は、ＮＣＢＩデータベースエントリＮＰ＿００１１３５７８７．１から取得できる。（ヒト）ＬＥＦ１（リンパ系エンハンサー結合因子１）をコードする核酸配列は、ＮＣＢＩデータベースエントリＮＰ＿００１１２４１８５．１から取得できる。

本明細書に記載される少なくとも１つの転写因子をコードする単離された核酸は、宿主細胞における更なるクローニング、導入、及び／又は発現のために単離され、１つ以上のベクターに挿入され得る。形質移入又は形質導入、すなわち形質転換（真核）細胞に適切なベクターは、当該技術分野で周知であり、本明細書に記載されている。本発明の１つ又はいくつかの転写因子をコードする単離された核酸は、制御配列の制御下にあり得る。例えば、本発明の転写因子の発現誘導を可能にするプロモーター、転写エンハンサー、及び／又は配列を採用してもよい。本発明の文脈において、単離された核酸は、構成プロモーター又は誘導性プロモーターの制御下で発現する。適切なプロモーターは、例えば、ＣＭＶプロモーター、ＵｂｉＣプロモーターＰＧＫ、ＥＦ１Ａプロモーター、ＣＡＧＧプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＣＯＰＩＡプロモーター、ＡＣＴ５Ｃプロモーター、ＴＲＥプロモーター、Ｏｃｔ３／４プロモーター、又はＮａｎｏｇプロモーターである。本発明はまた、したがって、（ａ）本発明に記載の単離された核酸を含むベクター（複数可）に関する。特定の実施形態では、ベクターは、ウイルスベクター、非ウイルスベクター、及びプラスミドベクターである。一実施形態では、該ベクターは、真核細胞を形質転換（例えば、形質移入又は形質導入）することができる。一実施形態では、ベクターは、真核細胞を形質導入することができる。用語「ベクター」とは、本明細書において、導入されている宿主細胞において（すなわち、形質導入された細胞において）自己複製することができる環状又は線状の核酸分子に関する。選択が所望の機能に依存するであろう多くの適切なベクターは、分子生物学における当業者に公知であり、プラスミド、コスミド、ウイルス、バクテリオファージ及び遺伝子工学において従来より使用されている他のベクターを含む。当業者に周知である方法は、種々のプラスミドベクターを構築するために使用することができ、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（同所）及びＡｕｓｕｂｅｌ、「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ」、Ｇｒｅｅｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ及びＷｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、ニューヨクーク（１９８９年）、（１９９４年）において説明されている技術を参照されたい。あるいは、本発明の単離された核酸（ポリヌクレオチド）及びベクターは、標的細胞への送達のためにリポソーム内へと再構成することができる。更に、クローニングベクターを使用して、ＤＮＡの個々の配列を単離することができる。関連する配列は、特定のポリペプチドの発現を必要とする発現ベクター内へと移すことができる。典型的なクローニングベクターは、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ、ｐＧＥＭ、ｐＵＣ９、ｐＢＲ３２２、ｐＧＡ１８及びｐＧＢＴ９を含む。典型的な発現ベクターは、ｐＴＲＥ、ｐＣＡＬ－ｎ－ＥＫ、ｐＥＳＰ－１、ｐＯＰ１３ＣＡＴを含む。

この文脈においては、本発明はまた、（ａ）本明細書で定義される１つ以上の転写因子をコードする該単離された核酸に動作可能に連結された制御配列である、単離された核酸（ポリヌクレオチド）を含むベクター（複数可）に関する。このような制御配列（制御要素）は、当業者に公知であり、プロモーター、スプライスカセット、翻訳開始コドン、ベクター（複数可）内へインサートを導入するための翻訳及び挿入部位を含むことができる。本発明の文脈において、単離された核酸は、真核細胞又は原核細胞における発現を可能にする発現制御配列へ作用するように連結される。ベクター（複数可）は、本明細書に定義されるような転写因子（複数可）をコードする単離された核酸を含む発現ベクター（複数可）であると想定される。作用可能に連結されたとは、そのように説明される構成要素が、意図する様式で機能することができる関係性にある事実を指す。コード配列へ作用可能に連結された制御配列は、コード配列の発現が制御配列と互換性のある条件下で達成されるような方法でライゲートされる。制御配列がプロモーターである場合、二本鎖核酸が好ましくは使用されることは当業者に明白である。一実施形態では、ベクターは、ポリシストロニックである。

発現は、好ましくは翻訳可能なｍＲＮＡへの単離された核酸（ポリヌクレオチド）の転写を含む。原核細胞及び／又は真核細胞における発現を確保する調節エレメントは、当業者に周知である。真核細胞の場合において、細胞は普通、転写の開始を確保するプロモーターと、任意に、転写の終結及び転写産物の安定化を確保するポリＡシグナルとを含む。原核宿主細胞における発現を可能にする考えられ得る調節エレメントは、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉにおけるＰＬプロモーター、ｌａｃプロモーター、ｔｒｐプロモーター若しくはｔａｃプロモーターを含み、真核宿主細胞における発現を可能にする調節エレメントの例は、酵母におけるＡＯＸ１プロモーター若しくはＧＡＬ１プロモーターであり、又は哺乳動物細胞及び他の動物細胞におけるＣＭＶプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＲＳＶプロモーター（ラウス肉腫ウイルス）、ＣＭＶエンハンサー、ＳＶ４０エンハンサー若しくはグロビンイントロンである。

転写の開始の原因となる要素のほかに、このような調節エレメントはまた、ポリヌクレオチドの下流に、ＳＶ４０－ポリＡ部位又はｔｋ－ポリＡ部位のような、転写終結シグナルも含むことができる。更に、使用される発現系に応じて、ポリペプチドを細胞区画へ差し向けることができる、又はポリペプチドを培地中へと分泌することができる、リーダ配列をコードするシグナルペプチドは、列挙された核酸配列のコード配列へ付加されてもよく、当技術分野で周知である。

本発明の文脈において、発現制御配列は、真核細胞を形質転換することができるベクター中の真核生物プロモーターシステムであるが、原核細胞の制御配列も使用され得る。ベクターが適切な細胞に取り込まれると、該細胞は、ヌクレオチド配列の発現に適した条件下で維持される。更なる調節エレメントは、転写及び翻訳エンハンサーを含み得る。本発明の上記のベクターは、選択可能及び／又はスコアリング可能なマーカを更に含み得る。形質転換した細胞の選択に有用である選択可能なマーカ遺伝子、例えば、アミノグリコシド、ネオマイシン、カナマイシン、及びパロマイシン（Ｈｅｒｒｅｒａ－Ｅｓｔｒｅｌｌａ、「ＥＭＢＯ Ｊ．２」（１９８３年）第９８７～９９５頁）に対する耐性を付与するｎｐｔ、及びハイグロマイシン（Ｍａｒｓｈ、「Ｇｅｎｅ」第３２巻（１９８４年）第４８１～４８５頁）に対する抵抗性を付与するｈｙｇｒｏ。更なる選択可能な遺伝子、すなわち、細胞がトリプトファンの代わりにインドールを利用できるようにするｔｒｐＢ；細胞がヒスチジンの代わりにヒスチノールを利用できるようにするｈｉｓＤ（Ｈａｒｔｍａｎ、「Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ」第８５巻（１９８８年）第８０４７頁）；細胞が、オルニチンデカルボキシラーゼ阻害剤に抵抗性を与えるマンノース（国際公開第９４／２０６２７号）及びＯＤＣ（オルニチンデカルボキシラーゼ）、ブラスチシジンＳ（Ｔａｍｕｒａ、「Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．」第５９巻（１９９５年）第２３３６～２３３８年）に抵抗性を与える２－（ジフルオロメチル）－ＤＬ－オルニチン、ＤＦＭＯ（ＭｃＣｏｎｌｏｇｕｅ（１９８７年）「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ」中、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ編）又はＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｔｅｒｒｅｕｓ由来のデアミナーゼを利用できるようにするマンノース－６－リン酸イソメラーゼが報告されている。

有用なスコラブルマーカも当業者には公知であり、市販されている。有利には、該マーカは、ルシフェラーゼ（Ｇｉａｃｏｍｉｎ、「Ｐｌ．Ｓｃｉ．１１６」（１９９６年）第５９～７２頁；Ｓｃｉｋａｎｔｈａ、「Ｊ．Ｂａｃｔ．」第１７８巻（１９９６年）第１２１頁、緑色蛍光タンパク質（Ｇｅｒｄｅｓ、「ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．」第３８９巻（１９９６年）第４４～４７頁）、又はβ－グルクロニダーゼ（Ｊｅｆｆｅｒｓｏｎ、「ＥＭＢＯ Ｊ．」第６巻（１９８７年）第３９０１～３９０７頁）をコードする遺伝子である。この実施形態は、引用されたベクターを含有する細胞、組織、及び生物体の単純かつ迅速なスクリーニングへ特に有用である。

記載された単離された核酸及びベクター（複数可）は、細胞への直接導入若しくはリポソームを介した導入、又はウイルスベクター（例えば、アデノウイルス、レトロウイルス）のために設計され得る。本発明の文脈において、該細胞は、ＥＣ又はＥＣの前駆体であることが好ましい。

上記に従って、本発明は、本明細書中に定義される少なくとも１つの転写因子をコードする単離された核酸を含む、ベクター、特に、遺伝子工学において従来使用されるプラスミド、コスミド、及びウイルスベクターを誘導する方法に関する。特定の実施形態では、転写因子（複数可）は、ＴＡＬ１、ＳＯＸ１８、ＦＯＸＦ２、ＳＯＸ７、ＦＯＸＣ１、ＥＴＳ１、ＫＬＦ１１、ＬＭＯ２、及びＬＥＦ１からなる群から個別に選択される。本発明の文脈において、該ベクターは、発現ベクター、及び／又は遺伝子導入若しくはターゲティングベクターである。レトロウイルス、ワクシニアウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、又はウシパピローマウイルスなどのウイルスに由来する発現ベクターは、標的細胞集団への上述の核酸又はベクターの送達に使用され得る。

本発明はまた、本明細書に記載されるようなベクターで形質転換又は形質移入された細胞を提供する。該細胞は、上述のベクターの少なくとも１つを、該細胞又はその前駆細胞へ導入することによって作製することができる。本明細書に記載されるような前記少なくとも１つのベクターの存在は、細胞が本発明に従って形質移入されたことを示す。細胞（例えば、ＥＣ）又はその前駆細胞の中に導入される説明された単離された核酸又はベクター（複数可）は、細胞のゲノム内へと組み込むことができるか又は染色体外で維持することができるかのいずれかであり得る。

この文脈においては、高いＴＥＥＲを確立することができる細胞が提供され、該細胞を少なくとも１つの転写因子と接触させる工程を含み、ここで、該細胞のコンフルエント単層が、該少なくとも１つの転写因子と接触しない細胞のコンフルエント単層と比較してより高いＴＥＥＲを確立する。理論に縛られることなく、高抵抗性経内皮バリアを形成することができる細胞とは、高経内皮電気抵抗（ＴＥＥＲ）を確立することができる細胞である。一実施形態では、本明細書で提供される転写因子と接触した本発明にかかる細胞は、コンフルエント細胞単層を形成する際に高いＴＥＥＲを確立することができる。一実施形態では、少なくとも１つの転写因子と接触した細胞のコンフルエント単層は、少なくとも１つの転写因子と接触していない細胞のコンフルエント単層と比較して、より高いＴＥＥＲを確立することができる。一実施形態では、本明細書に記載の少なくとも１つの転写因子を発現する細胞のコンフルエント単層は、少なくとも１つの転写因子を発現しない細胞のコンフルエント単層と比較して、より高いＴＥＥＲを確立することができる。一実施形態では、ＴＡＬ１、ＳＯＸ１８、ＦＯＸＦ２、ＳＯＸ７、ＦＯＸＣ１、ＥＴＳ１、ＫＬＦ１１、ＬＭＯ２、及びＬＥＦ１からなる群から選択される少なくとも１つの転写因子を発現する細胞のコンフルエント単層は、少なくとも１つの転写因子を発現しない細胞のコンフルエント単層と比較して、より高いＴＥＥＲを確立することができる。一実施形態では、ＴＡＬ１、ＳＯＸ１８、ＦＯＸＦ２、ＳＯＸ７、ＦＯＸＣ１、ＥＴＳ１、ＫＬＦ１１、ＬＭＯ２、及びＬＥＦ１からなる群から選択される少なくとも１つの転写因子を発現する細胞のコンフルエント単層のＴＥＥＲは、少なくとも１つの転写因子を発現しない細胞のコンフルエント単層のＴＥＥＲと比較して、１．１倍、１．２倍、１．３倍、１．４倍、１．５倍、１．６倍、１．７倍、１．８倍、１．９倍、２倍、５倍、又は１０倍高い。一実施形態では、転写因子ＥＴＳ１、ＳＯＸ１８、及びＳＯＸ７を発現する細胞のコンフルエント単層のＴＥＥＲは、少なくとも１つの転写因子を発現しない細胞のコンフルエント単層のＴＥＥＲと比較して、１．２倍、１．３倍、１．４倍、１．５倍、１．６倍、１．７倍、１．８倍、１．９倍、２倍、５倍、又は１０倍高い。好ましい実施形態では、転写因子は、（ｉ）ＥＴＳ１、ＳＯＸ１８、ＳＯＸ７、及びＴＡＬ１、又は（ｉｉ）ＥＴＳ１、ＳＯＸ１８、ＳＯＸ７、及びＬＥＦ１、最も好ましくはＥＴＳ１、ＳＯＸ１８、ＳＯＸ７、及びＴＡＬ１である。

一実施形態では、高いＴＥＥＲを形成することができる細胞は、哺乳動物細胞である。一実施形態では、細胞は、齧歯類細胞、特にマウス細胞又はラット細胞である。好ましい実施形態では、細胞は、ヒト細胞である。

好ましい実施形態では、細胞は、内皮細胞（ＥＣ）である。ＥＣは当該技術分野で周知のプロトコルに従ってインビトロで作製することができる。本発明の目的のためには、多能性幹細胞に由来するＥＣが特に有用である。多能性幹細胞は自己再生特性を有し、成体哺乳動物体の全ての主要な細胞型で分化できる。多能性幹細胞は標準化された細胞培養条件下において大量に産生することができる。したがって、好ましい実施形態では、ＥＣは、多能性幹細胞から分化する。一実施形態では、ＥＣは、胚性幹細胞から分化する。別の実施形態では、ＥＣは、人工多能性幹細胞（ＩＰＳＣ）から分化する。一実施形態では、ＩＰＳＣは、再プログラムされた体細胞から生成される。ＩＰＳＣへの体細胞の再プログラミングは、ＩＰＳＣ特性の維持に関与する特異的遺伝子を導入することによって達成できる。ＩＰＳＣへの体細胞の再プログラミングに適した遺伝子として、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、及びＣ－Ｍｙｃ、並びにそれらの組合せが挙げられる、これらに限定されない。一実施形態では、再プログラミング用の遺伝子は、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、及びＣ－Ｍｙｃである。

内臓、皮膚、骨、血液、及び結合組織は全て体細胞からできている。ＩＰＳＣを生成するために使用される体細胞として、限定されるものではないが、線維芽細胞、脂肪細胞、及びケラチノサイトが挙げられ、皮膚生検から得ることができる。他の適切な体細胞は、白血球、血液試料若しくは上皮細胞から得られる赤芽球細胞、又は血液若しくは尿試料から得られる他細胞であり、当該技術分野で周知の方法及び本明細書で記載するようなＩＰＳＣにより再プログラムされる。体細胞は健康な個体又は罹患した個体から得ることができる。一実施形態では、体細胞は、疾患に罹患する対象（例えば、ヒト対象）に由来する。一実施形態では、疾患は、血管合併症（例えば、糖尿病性網膜症及び／又は滲出型ＡＭＤに関連する血管合併症と類似又は同一）に関連している。本明細書に記載の再プログラミングのための遺伝子は、再プログラミングベクターを介して細胞に送達することによって、又は小分子を介して該遺伝子を活性化することによってのいずれかで、当該技術分野で周知の方法によって体細胞へ導入される。再プログラミングの方法としては、とりわけ、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、プラスミド及びトランスポゾン、マイクロＲＮＡ、小分子、修飾ＲＮＡ、メッセンジャＲＮＡ、並びに組換えタンパク質が挙げられる。一実施形態では、レンチウイルスは、本明細書に記載されるように、遺伝子の送達に使用される。別の実施形態では、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、及びＣ－Ｍｙｃは、センダイウイルス粒子を用いて体細胞に送達される。その上、体細胞は、少なくとも１つの小分子の存在下で培養することができる。一実施形態では、該小分子は、タンパク質キナーゼのＲｈｏ関連コイルドコイル形成タンパク質セリン／スレオニンキナーゼ（Ｒｈｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｃｏｉｌｅｄ－ｃｏｉｌ ｆｏｒｍｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｅｒｉｎｅ／ｔｈｒｅｏｎｉｎｅ ｋｉｎａｓｅ：ＲＯＣＫ）ファミリの阻害剤を含む。－ＲＯＣＫ阻害剤の非限定的な例として、Ｆａｓｕｄｉｌ（１－（５－イソキノリンスルホニル）ホモピペラジン）、Ｔｈｉａｚｏｖｉｖｉｎ（Ｎ－ベンジル－２－（ピリミジン－４－イルアミノ）チアゾール－４－カルボキサミド）、及びＹ－２７６３２（（＋）－（Ｒ）－トランス－４－（１－アミノエチル）－Ｎ－（４－ピリジル）シクロ－ヘキサンカルボキサミドジヒドロクロリド）が挙げられる。

規定された多能性幹細胞の単層を提供することは、得られる培養物の再現性及び効率に好ましい。一実施形態では、多能性幹細胞の単層は、細胞を単細胞へと酵素的に解離させ、それらを予め被覆されたマトリゲルプレート（例えば、ＢＤ Ｍａｔｒｉｇｅｌ ｈＥＳＣ－ｑｕａｌｉｆｉｅｄ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ製）、Ｇｅｌｔｒｅｘ ｈＥＳＣ－ｑｕａｌｉｆｉｅｄ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製）、Ｓｙｎｔｈｅｍａｘ（Ｃｏｒｎｉｎｇ製））などの接着性基質上に移動させることによって作製することができる。単一細胞への解離に適した酵素の例としては、Ａｃｃｕｔａｓｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、Ｔｒｙｐｓｉｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ＴｒｙｐＬｅ Ｅｘｐｒｅｓｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）が挙げられる。一実施形態では、２００００～６００００個／ｃｍ２の細胞が、接着性基質上にプレーティングされる。本明細書で使用される培地は、単層の単一細胞として多能性幹細胞の付着及び増殖を促進する多能性培地である。一実施形態では、多能性培地は、タンパク質キナーゼのＲｈｏ関連コイルドコイル形成タンパク質セリン／スレオニンキナーゼ（ＲＯＣＫ）ファミリ（本明細書ではＲＯＣＫキナーゼ阻害剤と称する）の小分子阻害剤を補充した無血清培地である。

したがって、一実施形態では、本明細書に記載される方法は、多能性培地中に多能性幹細胞の単層を提供することを含み、ここで、該多能性培地は、ＲＯＣＫキナーゼ阻害剤を補充した無血清培地である。

多能性幹細胞を基質に付着させるのに適した無血清培地の例は、ｍＴｅＳＲ１又はＴｅＳＲ２（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、霊長類ＥＳ／ｉＰＳ細胞用培地（ＲｅｐｒｏＣＥＬＬ）、及びＳｔｅｍＰｒｏ ｈＥＳＣ ＳＦＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、Ｘ－ＶＩＶＯ（Ｌｏｎｚａ）である。本明細書における有用なＲＯＣＫキナーゼ阻害剤の例は、Ｆａｓｕｄｉｌ（１－（５－イソキノリンスルホニル）ホモピペラジン）、Ｔｈｉａｚｏｖｉｖｉｎ（Ｎ－ベンジル－２－（ピリミジン－４－イルアミノ）チアゾール－４－カルボキサミド）、及びＹ２７６３２（（＋）－（Ｒ）－トランス－４－（１－アミノエチル）－Ｎ－（４－ピリジル）シクロ－ヘキサンカルボキサミドジヒドロクロリド、例えば、カタログ番号１２５４（Ｔｏｃｒｉｓ ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）である。一実施形態では、多能性培地は、２～２０μＭのＹ２７６３２、好ましくは５～１０μＭのＹ２７６３２が補充された無血清培地である。別の実施形態では、多能性培地は、２～２０μＭのＦａｓｕｄｉｌが補充された無血清培地である。別の実施形態では、多能性培地は、０．２～１０μＭのＴｈｉａｚｏｖｉｖｉｎが補充された無血清培地である。

一実施形態では、本明細書に記載の方法は、多能性培地中に多能性幹細胞の単層を提供することと、多能性培地中で該単層を１日間（２４時間）増殖させることと、を含む。別の実施形態では、本明細書に記載の方法は、多能性培地中に多能性幹細胞の単層を提供することと、多能性培地中で該単層を１８時間～３０時間、好ましくは２３～２５時間増殖させることと、を含む。

別の実施形態では、本明細書に記載する方法は、多能性培地中に多能性幹細胞の単層を提供することを含み、ここで、該多能性培地は、ＲＯＣＫキナーゼ阻害剤を補充した無血清培地であり、該単層を多能性培地中で１日間（２４時間）増殖させる。別の実施形態では、本明細書に記載する方法は、多能性培地中に多能性幹細胞の単層を提供することを含み、ここで、該多能性培地は、ＲＯＣＫキナーゼ阻害剤を補充した無血清培地であり、該単層を多能性培地中で１８時間～３０時間、好ましくは２３～２５時間増殖させる。

一実施形態では、細胞をプライミング用培地と接触させて分化を誘導する。一実施形態では、細胞は、β－カテニン及び／又はＷｎｔシグナル伝達及び／又はヘッジホッグ（ＨＨ）シグナル伝達を活性化し、誘導用培地中でプライム細胞をインキュベートすることによって分化を誘導する小分子を補充したプライミング用培地と接触される。一実施形態では、β－カテニン及び／又はＷｎｔシグナル伝達及び／又はヘッジホッグ（ＨＨ）シグナル伝達を活性化する小分子は、グリコーゲンシンターゼキナーゼ３（Ｇｓｋ３ａ－ｂ）の小分子阻害剤、ＣＤＣ様キナーゼ１（Ｃｌｋ１－２－４）の小分子阻害剤、マイトジェン活性化プロテインキナーゼ１５（Ｍａｐｋ１５）の小分子阻害剤、二重特異性チロシン（Ｙ）リン酸化制御キナーゼ（Ｄｙｒｋ１ａ－ｂ ４）の小分子阻害剤、サイクリン依存性キナーゼ１６（Ｐｃｔｋ１－３ ４）の小分子阻害剤、β－カテニン（又はγ－カテニン）とコアクチベータタンパク質ＣＢＰ（ＣＲＥＢ結合タンパク質）及びｐ３００（Ｅ１Ａ結合タンパク質ｐ３００）との間の相互作用のスムーズンド（ＳＭＯ）アクチベータ並びにモジュレータの群から選択される。

好ましくは、該グリコーゲンシンターゼキナーゼ３（Ｇｓｋ３ａ－ｂ）阻害剤はピロリジンジオン系ＧＳＫ３阻害剤である。「ピロリジンジオン系ＧＳＫ３阻害剤」は、本明細書で使用される場合、低いＩＣ_５０値を有するＧＳＫ３α及びＧＳＫ３βの選択的細胞透過性ＡＴＰ競合阻害剤に関する。一実施形態では、ピロリジンジオン系ＧＳＫ３阻害剤は、ＳＢ２１６７６３（３－（２，４－ジクロロフェニル）－４－（１－メチル－１Ｈ－インドール－３－イル）－１Ｈ－ピロール－２，５－ジオン）、ＳＢ４１５２８６（３－［（３－クロロ－４－ヒドロキシフェニル）アミノ］－４－（２－ニトロフェニル）－１Ｈ－ピロール－２，５－ジオン）、Ｎ^６－｛２－［４－（２，４－ジクロロ－フェニル）－５－イミダゾール－１－イル－ピリミジン－２－イルアミノ］－エチル｝－３－ニトロ－ピリジン－２，６－ジアミン２ＨＣｌ、３－イミダゾ［１，２－ａ］ピリジン－３－イル－４－［２－（モルホリン－４－カルボニル）－１，２，３，４－テトラヒドロ－［１，４］ジアゼピノ［６，７，１－ｈｉ］インドール－７－イル］－ピロール－２，５－ジオン、Ｋｅｎｐａｕｌｌｏｎｅ（９－ブロモ－７，１２－ジヒドロ－インドロ－［３，２－ｄ］［１］ベンズアゼピン－６（５Ｈ）－オン）、ＣＨＩＲ９９０２１（９－ブロモ－７，１２－ジヒドロ－ピリド［３′，２′：２，３］アゼピノ［４，５－ｂ］インドール－６（５Ｈ）－オン）、及び（３－（３－アミノ－フェニル）－４－（１－メチル－１Ｈ－インドール－３－イル）－ピロール－２，５－ジオン（ＣＰ２１Ｒ７、本明細書では「化合物２１」とも称する；例えば、Ｌ．Ｇｏｎｇら、「Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ＆Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｌｅｔｔｅｒｓ」第２０巻（２０１０年）第１６９３～１６９６頁を参照）からなる群から選択される。好ましい実施形態では、該ピロリジンジオン系ＧＳＫ３阻害剤は、ＣＰ２１Ｒ７である。

一実施形態では、該ＣＤＣ様キナーゼ１（Ｃｌｋ１－２－４）阻害剤は、ベンゾチアゾール及び３－フルオロ－Ｎ－［１－イソプロピル－６－（１－メチル－ピペリジン－４－イルオキシ）－１，３－ジヒドロ－ベンゾイミダゾール－（２Ｅ）－イリデン］－５－（４－メチル－１Ｈ－ピラゾール－３－スルホニル）－ベンズアミドを含む群から選択される。

一実施形態では、該マイトジェン活性化タンパク質キナーゼ１５（Ｍａｐｋ１５）阻害剤は、４－（４－フルオロフェニル）－２－（４－メチルスルフィニルフェニル）－５－（４－ピリジル）－１Ｈ－イミダゾール（ＳＢ２０３５８０）及び５－イソキノリンスルホンアミド（Ｈ－８９）を含む群から選択される。

一実施形態では、該二重特異性チロシン－（Ｙ）－リン酸化調節キナーゼ（Ｄｙｒｋ１ａ－ｂ ４）阻害剤は、６－［２－アミノ－４－オキソ－４Ｈ－チアゾール－（５Ｚ）－イリデンメチル］－４－（テトラヒドロ－ピラン－４－イルオキシ）－キノリン－３－カルボニトリルを含む群から選択される。

一実施形態では、該スムーズンドアクチベータは、Ｐｕｒｍｏｒｐｈａｍｉｎｅ（２－（１－ナフトキシ）－６－（４－モルホリノアニリノ）－９－シクロヘキシルプリンである。

β－カテニン（又はγ－カテニン）と、コアクチベータタンパク質ＣＢＰ（ＣＲＥＢ結合タンパク質）及びｐ３００（Ｅ１Ａ結合タンパク質ｐ３００）との間の相互作用のモジュレータの例は、ＩＱ－１（２－（４－アセチル－フェニルアゾ）－２－［３，３－ジメチル－３，４－ジヒドロ－２Ｈ－イソキノリン－（１Ｅ）－イリデン］－アセトアミド、及びＩＣＧ－００１（（６Ｓ，９ａＳ）－６－（４－ヒドロキシ－ベンジル）－８－ナフタレン－１－イルメチル－４，７－ジオキソ－ヘキサヒドロ－ピラジノ［１，２－ａ］ピリミジン－１－カルボン酸ベンジルアミド（国際公開第２００７０５６５９３号）である。

一実施形態では、プライミング用培地は、形質転換増殖因子β（ＴＧＦβ）の小分子阻害剤で補充される。一実施形態では、ＴＧＦβの小分子阻害剤は、ＳＢ４３１５４２である。

一実施形態では、本明細書に記載の方法は、該細胞をプライミング用培地中で約２～約４日間（約４８時間～約９６時間）インキュベートすることを含む。一実施形態では、上記の方法の工程（ａ）は、該細胞をプライミング用培地中で約３日間（約７２時間）インキュベートすることを含む。

一実施形態では、該プライミング用培地は、インスリン、トランスフェリン、及びプロゲステロンが補充された無血清培地である。一実施形態では、該無血清培地は、インスリン１０～５０μｇ／ｍｌ、トランスフェリン１０～１００μｇ／ｍｌ、及びプロゲステロン１０～５０ｎＭ、好ましくはインスリン３０～５０μｇ／ｍｌ、トランスフェリン２０～５０μｇ／ｍｌ、及びプロゲステロン１０～３０ｎＭが補充される。プライミングに適した無血清培地の例は、Ｎ２Ｂ２７培地（Ｎ２Ｂ２７はＤＭＥＭ／Ｆ１２（Ｇｉｂｃｏ、英国ペイズリー州）にＮ２及びＢ２７（どちらもＧｉｂｃｏ）を補充した１：１混合物である）、Ｎ３培地（ＤＭＥＭ／Ｆ１２（Ｇｉｂｃｏ、英国ペイズリー州）、インスリン２５μｇ／ｍｌ、トランスフェリン５０μｇ／ｍｌ、亜セレン酸ナトリウム３０ｎＭ、プロゲステロン２０ｎＭ、プトレシン１００ｎＭ（Ｓｉｇｍａ）で構成）、又はＮｅｕｒｏＣｕｌｔ（登録商標）ＮＳ－Ａ増殖培地（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）である。一実施形態では、該プライミング用培地は、インスリン、トランスフェリン、プロゲステロン、並びにβ－カテニン（カドヘリン関連タンパク質β１；ヒト遺伝子名ＣＴＮＮＢ１）経路及び／又はＷｎｔ受容体シグナル伝達経路及び／又はヘッジホッグ（ＨＨ）シグナル伝達経路を活性化する小分子を補充した、無血清培地である。好ましくは、該小分子は、３－（２，４－ジクロロフェニル）－４－（１－メチル－１Ｈ－インドール－３－イル）－１Ｈ－ピロール－２，５－ジオン（ＳＢ２１６７６３）、３－［（３－クロロ－４－ヒドロキシフェニル）アミノ］－４－（２－ニトロフェニル）－１Ｈ－ピロール－２，５－ジオン（ＳＢ４１５２８６）、Ｎ^６－｛２－［４－（２，４－ジクロロ－フェニル）－５－イミダゾール－１－イル－ピリミジン－２－イルアミノ］－エチル｝－３－ニトロ－ピリジン－２，６－ジアミン２ＨＣｌ、３－イミダゾ［１，２－ａ］ピリジン－３－イル－４－［２－（モルホリン－４－カルボニル）－１，２，３，４－テトラヒドロ－［１，４］ジアゼピノ［６，７，１－ｈｉ］インドール－７－イル］－ピロール－２，５－ジオン、９－ブロモ－７，１２－ジヒドロ－インドロ［３，２－ｄ］［１］ベンズアゼピン－６（５Ｈ）－オン（Ｋｅｎｐａｕｌｌｏｎｅ）、９－ブロモ－７，１２－ジヒドロ－ピリド［３′，２′：２，３］アゼピノ［４，５－ｂ］インドール－６（５Ｈ）－オン（ＣＨＩＲ９９０２１）、３－（３－アミノ－フェニル）－４－（１－メチル－１Ｈ－インドール－３－イル）－ピロール－２，５－ジオン（ＣＰ２１Ｒ７、本明細書では「化合物２１」とも称される）、ベンゾチアゾール、３－フルオロ－Ｎ－［１－イソプロピル－６－（１－メチル－ピペリジン－４－イルオキシ）－１，３－ジヒドロ－ベンゾイミダゾール－（２Ｅ）－イリデン］－５－（４－メチル－１Ｈ－ピラゾール－３－スルホニル）－ベンズアミド、４－（４－フルオロフェニル）－２－（４－メチルスルフィニルフェニル）－５－（４－ピリジル）－１Ｈ－イミダゾール（ＳＢ２０３５８０）、５－イソキノリンスルホンアミド（Ｈ－８９）、６－［２－アミノ－４－オキソ－４Ｈ－チアゾール－（５Ｚ）－イリデンメチル］－４－（テトラヒドロ－ピラン－４－イルオキシ）－キノリン－３－カルボニトリル、２－（１－ナフトキシ）－６－（４－モルホリノアニリノ）－９－シクロヘキシルプリン（Ｐｕｒｍｏｒｐｈａｍｉｎｅ）、２－（４－アセチル－フェニルアゾ）－２－［３，３－ジメチル－３，４－ジヒドロ－２Ｈ－イソキノリン－（１Ｅ）－イリデン］－アセトアミド（ＩＱ－１）、及びＩＣＧ－００１（（６Ｓ，９ａＳ）－６－（４－ヒドロキシ－ベンジル）－８－ナフタレン－１－イルメチル－４，７－ジオキソ－ヘキサヒドロ－ピラジノ［１，２－ａ］ピリミジン－１－カルボン酸ベンジルアミドを含む群から選択される。

別の実施形態では、本明細書に記載される方法は、プライミング用培地中で該細胞をインキュベートすることを含み、ここで、該プライミング用培地は、ＣＰ２１Ｒ７（３－（３－アミノ－フェニル）－４－（１－メチル－１Ｈ－インドール－３－イル）－ピロール－２，５－ジオン）を補充した無血清培地である。好ましくは、該プライミング用培地に０．５～４μＭのＣＰ２１Ｒ７（３－（３－アミノ－フェニル）－４－（１－メチル－１Ｈ－インドール－３－イル）－ピロール－２，５－ジオン）、最も好ましくは１～２μＭのＣＰ２１Ｒ７（３－（３－アミノ－フェニル）－４－（１－メチル－１Ｈ－インドール－３－イル）－ピロール－２，５－ジオン）を補充する。別の実施形態では、上記の方法の工程（ａ）は、プライミング用培地中で該細胞をインキュベートすることを含み、ここで、該プライミング用培地は、ＣＰ２１Ｒ７（３－（３－アミノ－フェニル）－４－（１－メチル－１Ｈ－インドール－３－イル）－ピロール－２，５－ジオン）を補充した無血清培地であり、該細胞を２～４日間（４８時間～９６時間）増殖させる。別の実施形態では、上記の方法の工程（ａ）は、プライミング用培地中で該細胞をインキュベートすることを含み、ここで、該プライミング用培地は、ＣＰ２１Ｒ７（３－（３－アミノ－フェニル）－４－（１－メチル－１Ｈ－インドール－３－イル）－ピロール－２，５－ジオン）を補充した無血清培地であり、該細胞を３日間（７２時間）インキュベートさせる。

一実施形態では、プライミング用培地は、インスリン１０～５０μｇ／ｍｌ、トランスフェリン１０～１００μｇ／ｍｌ、及びプロゲステロン１０～５０ｎＭを含有し、０．５～４μＭのＣＰ２１Ｒ７（３－（３－アミノ－フェニル）－４－（１－メチル－１Ｈ－インドール－３－イル）－ピロール－２，５－ジオン）を補充した、無血清培地である。

一実施形態では、プライミング用培地は、組換え骨形成タンパク質－４（ｂｏｎｅ ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎ－４：ＢＭＰ４）を更に含む。好ましい一実施形態では、プライミング用培地は、インスリン１０～５０μｇ／ｍｌ、トランスフェリン１０～１００μｇ／ｍｌ、及びプロゲステロン１０～５０ｎＭを含有し、０．５～４μＭのＣＰ２１Ｒ７（３－（３－アミノ－フェニル）－４－（１－メチル－１Ｈ－インドール－３－イル）－ピロール－２，５－ジオン）及び１０～５０ｎｇ／ｍｌの組換え骨形成タンパク質－４（ＢＭＰ４）を補充した、無血清培地である。一実施形態では、プライミング用培地は、１μＭのＣＰ２１Ｒ７及び２５ｎｇ／ｍｌのＢＭＰ４を含む。

一実施形態では、細胞を誘導用培地と接触させて、分化を進める。内皮細胞の優勢な誘導のためには、該誘導用培地を、ＶＥＧＦ（＝血管内皮増殖因子（Ｖａｓｃｕｌａｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ））又は胎盤様増殖因子１（ｐｌａｃｅｎｔａ－ｌｉｋｅ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ １：ＰＬＧＦ－１）及び小分子アデニル酸シクラーゼアクチベータで補充する。一実施形態では、該小分子アデニル酸シクラーゼアクチベータは、ＰＫＡ／ＰＫＩシグナル伝達経路の活性化をもたらす。一実施形態では、該小分子アデニル酸アクチベータは、フォルスコリン（（３Ｒ）－（６ａαＨ）ドデカヒドロ－６β，１０α，１０ｂα－トリヒドロキシ－３β，４ａβ，７，７、１０ａβ－ペンタメチル－１－オキソ－３－ビニル－１Ｈ－ナフト［２，１－ｂ］ピラン－５β－イルアセテート）、８－ブロモ－ｃＡＭＰ（８－ブロモアデノシン－３’，５’－環状モノホスフェート）、及びアドレノメデュリンを含む群から選択される。一実施形態では、該誘導用培地は、ヒト血清アルブミン、エタノールアミン、トランスフェリン、インスリン、及びヒドロコルチゾンが補充された無血清培地である。誘導に適した無血清培地の例は、ＳｔｅｍＰｒｏ－３４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、主成分：ヒト血清アルブミン、ヒトＥｘ－Ｃｙｔｅ（登録商標）及びエタノールアミンなどの脂質剤又はこれらの混合物、ヒト亜鉛インスリン、ヒドロコルチゾン、鉄飽和転移性２－メルカプトエタノール、及びＤ，Ｌ－トコフェロール酢酸エステル又はこれらの誘導体若しくは混合物）、並びにＸ－ＶＩＶＯ１０及び１５（Ｌｏｎｚａ）である。

一実施形態では、該誘導用培地は、ヒト血清アルブミン、エタノールアミン、トランスフェリン、インスリン、及びヒドロコルチゾン、並びに１～１０μＭのフォルスコリン及び５～１００ｎｇ／ｍｌのＶＥＧＦ－Ａが補充された、無血清培地である。別の実施形態では、誘導用培地は、３０～７０ｎｇ／ｍｌのＶＥＧＦ－Ａ又は３０～７０ｎｇ／ｍｌの胎盤様増殖因子１（ＰＬＧＦ－１）が補充された、ＳｔｅｍＰｒｏ－３４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含む。

一実施形態では、本明細書に記載される方法は、ＶＥＧＦ－Ａ又は胎盤様増殖因子１（ＰＬＧＦ－１）及び小分子アデニル酸シクラーゼアクチベータを補充した誘導用培地中で該プライム細胞をインキュベートすることによってＥＣへの分化を誘導することを含み、ここで、該小分子アデニル酸シクラーゼアクチベータは、フォルスコリン、８－ブロモ－ｃＡＭＰ、及びアドレノメデュリンの群から選択される。一実施形態では、誘導用培地は、１～１０μＭのフォルスコリン及び５～１００ｎｇ／ｍｌのＶＥＧＦ－Ａ、好ましくは２μＭのフォルスコリン及び５０ｎｇ／ｍｌのＶＥＧＦ－Ａを補充した、無血清培地である。

別の実施形態では、本明細書に記載される方法は、ＶＥＧＦ－Ａ又は胎盤様増殖因子１（ＰＬＧＦ－１）及び小分子アデニル酸シクラーゼアクチベータを補充した誘導用培地中で該プライム細胞を１日間インキュベートすることによって、ＥＣへの分化を誘導することを含む。

別の実施形態では、本明細書に記載される方法は、ＶＥＧＦ－Ａ又は胎盤様増殖因子１（ＰＬＧＦ－１）及び小分子アデニル酸シクラーゼアクチベータを補充した誘導用培地中で該プライム細胞を１８時間～４８時間、好ましくは２２時間～３６時間インキュベートすることによって、ＥＣへの分化を誘導することを含む。

一実施形態では、本明細書に記載の方法は、該細胞を誘導用培地中で約１８時間～約４８時間インキュベートすることを含む。一実施形態では、本明細書に記載の方法は、該細胞を誘導用培地中で約２４時間インキュベートすることを含む。

プライミング及び誘導後、ＥＣを更に拡大培養して、大量の細胞を産生することができる。したがって、更なる実施形態では、本発明の方法は、ＥＣの増殖に適した条件下においてプライミング及び誘導の産物をインキュベートすることを更に含む。内皮細胞の増殖に適した該条件は、内皮マーカにポジティブな細胞を採取し、既知組成拡大培養用培地でそれらを拡大培養させることを更に含み得る。本明細書で使用される「収穫」とは、接着性基質からの細胞の酵素的解離、及びその後の新しい培地への再懸濁に関する。好ましい一実施形態では、細胞は、本明細書に記載されるように、収穫後に仕分けられる。一実施形態では、該拡大培養用培地は、ＶＥＧＦ－Ａを補充した無血清培地である。ＥＣの拡大培養に適した無血清培地の例は、８ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ－２、５０ｎｇ／ｍｌのＶＥＧＦ、及び１０μＭのＳＢ４３１５４２（４－（４－ベンゾ［１，３］ジオキソール－５－イル－５－ピリジン－２－イル－１Ｈ－イミダゾール－２－イル）－ベンズアミド）を補充した、ＳｔｅｍＰｒｏ－３４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ＥＧＭ２（Ｌｏｎｚａ）、及びＤＭＥＭ／Ｆ１２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）である。好ましくは、ＥＣは、付着培養条件で培養される。一実施形態では、拡大培養用培地は、５～１００ｎｇ／ｍｌのＶＥＧＦ－Ａで補充される。別の実施形態では、拡大培養用培地は、５～１００ｎｇ／ｍｌのＶＥＧＦ－Ａ、好ましくは５０ｎｇ／ｍｌで補充されたＳｔｅｍＰｒｏ－３４である。

本明細書に記載の方法によって得られた細胞（例えば、ＥＣ）は、いくつかの継代にわたって拡大培養させることができ、培養は充分に特徴付けられている。本明細書に記載された方法によって得られたＥＣのアリコートを再現性よく凍結及び解凍することができる。解凍された細胞は、本明細書に記載されるように更に拡大培養されて、化合物スクリーニングに必要なスループットを確立するのに特に適した所望の数の細胞に到達することができる。

本発明の一実施形態では、患者に特異的又は健康な個体に特異的なＥＣを生成するための方法。これは、遺伝子突然変異に関連する疾患状態について特に望ましいが、しかしながら、患者特異的疾患モデルはまた、疾患状態に関連する遺伝子突然変異がない場合、又は遺伝子突然変異との関連が不明であるか若しくは確立されるべきである場合にも、関連し得る。この目的に向かって、患者又は健康な個体から得られたヒト人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）を本明細書に記載の方法において使用する。該患者特異的ヒトｉＰＳＣは、当該技術分野で公知の方法により、そして患者又は健康な個体から得られた体細胞を多能性幹細胞に再プログラミングすることによって、本明細書で更に記載されるように得ることができる。例えば、線維芽細胞、ケラチノサイト、又は脂肪細胞は、治療を必要とする個体又は健康な個体から皮膚生検によって得ることができ、当該技術分野で周知の方法及び本明細書で更に記載するように、人工多能性幹細胞へと再プログラムすることができる。人工多能性幹細胞の供給源として好適な他の体細胞は、血液試料から得られる白血球細胞、又は尿試料から得られる上皮細胞若しくは他の細胞である。次いで、患者特異的な人工多能性幹細胞を、本明細書に記載の方法によって、患者特異的な疾患を有するＥＣ又は健康なＥＣへと分化させる。本発明の別の態様では、上記の方法のいずれかによって生成されたＥＣの集団が提供される。好ましくは、ＥＣの集団は患者特異的であり、すなわち、疾患を有する個体から得られたｉＰＳＣに由来する。別の実施形態では、該ＥＣの集団は、健康な個体から得られる。患者由来ＥＣは、２型糖尿病及び１型糖尿病、滲出型ＡＭＤ、メタボリックシンドローム、並びに重度肥満のような疾患に対する血管合併症の病態生理を研究するための疾患関連インビトロモデルを代表する。一実施形態では、この方法によって得られるＥＣは、ＥＣの機能障害によって引き起こされる血管合併症、例えば、２型糖尿病及び１型糖尿病、滲出型ＡＭＤ、メタボリックシンドローム、重度肥満、高コレステロール血症、高血圧、冠動脈疾患、腎症、網膜症、腎不全、組織虚血、慢性低酸素症、アテローム性動脈硬化症、並びに薬物誘導毒性によって引き起こされる組織浮腫などによって起こる血管合併症を、逆転させる、阻害する、又は予防する化合物のスクリーニングに使用される。好ましくは、本明細書に記載される本発明の方法によって得られる該ＥＣは、疾患を有する対象に由来する。疾患対象からＥＣを区別することは、ヒトのバックグラウンドパラダイムにおいて薬物安全性を早期に評価するためのユニークな機会を意味する。

別の実施形態では、この方法によって得られたＥＣを血液網膜関門（ｂｌｏｏｄ－ｒｅｔｉｎａｌ ｂａｒｒｉｅｒ：ＢＲＢ）及び／又は血液脳関門（ＢＢＢ）のインビトロモデルとして使用する。本発明の方法に従って産生された細胞は、経内皮バリア機能（例えば、ＴＢＩ）の確立又は喪失が関連する病理的又は非病理的状態のインビトロモデルを確立するのに有用である。特定の実施形態では、（ｉ）インビボ経内皮バリア完全性（ＴＢＩ）を増大させることができるか又は（ｉｉ）内皮細胞（ＥＣ）のインビボＴＢＩを低減させることができる薬物候補を同定するためのインビトロ方法であって、
（ａ）高い経内皮電気抵抗（ＴＥＥＲ）を確立できるＥＣを提供する工程；
（ｂ）該ＥＣを該薬物候補と接触させ、該ＥＣを該薬物候補と接触させる前及び後におけるインビトロＴＥＥＲを測定する工程か、又は該ＥＣを該薬物候補と接触させ、該薬物候補と接触させた該ＥＣのインビトロＴＥＥＲを測定し、かつ並行して、該薬物候補と接触させなかったＥＣのインビトロＴＥＥＲを測定する工程であって、
ここで、（ｉ）該薬物候補と接触させなかった該ＥＣの該インビトロＴＥＥＲと比較して、該薬物候補と接触させた該ＥＣのより高いインビトロＴＥＥＲは、ＥＣのインビボＴＢＩを増大させることができる薬物を示し、（ｉｉ）該薬物候補と接触させなかった該ＥＣのインビトロＴＥＥＲと比較して、該薬物候補と接触した該ＥＣのより低いインビトロＴＥＥＲは、ＥＣのインビボＴＢＩを低減させることができる薬物を示す、工程
からなる方法が提供される。

更なる実施形態では、経内皮バリア完全性（ＴＢＩ）の破壊又は喪失と関連する疾患に罹患する個体へのインビボ適用のための薬物候補を選択するインビトロ方法であって、
（ａ）高い経内皮電気抵抗（ＴＥＥＲ）を確立できるＥＣを提供する工程；
（ｂ）該ＥＣを該薬物候補と接触させ、該ＥＣを該薬物候補と接触させる前及び後におけるインビトロＴＥＥＲを測定する工程か、又は該ＥＣを該薬物候補と接触させ、該薬物候補と接触させた該ＥＣのインビトロＴＥＥＲを測定し、かつ並行して、該薬物候補と接触させなかったＥＣのインビトロＴＥＥＲを測定する工程であって、
ここで、該薬物候補と接触させなかった該ＥＣの該インビトロＴＥＥＲと比較して、該薬物候補と接触させた該ＥＣのより高いインビトロＴＥＥＲを有する薬物候補を、該薬物候補のインビボ適用のために選択する、工程
からなる方法が提供される。

本明細書に記載され、薬物候補を同定するための方法において使用されるような高いＴＥＥＲを確立することができるＥＣは、本明細書に記載される１つ以上の発現ベクターを含む。一実施形態では、薬物候補を選択するための本明細書に記載された方法の工程（ａ）におけるＥＣは、細胞の単層として、特に細胞のコンフルエント単層として提供される。ＴＡＬ１、ＳＯＸ１８、ＦＯＸＦ２、ＳＯＸ７、ＦＯＸＣ１、ＥＴＳ１、ＫＬＦ１１、ＬＭＯ２、及びＬＥＦ１からなる群から選択される少なくとも１つの転写因子をコードする核酸を含む、少なくとも１つの発現ベクターを含むＥＣのコンフルエント単層は、高いＴＥＥＲを確立することができる。特定の実施形態では、コンフルエント単層を形成する細胞は、転写因子ＥＴＳ１、ＳＯＸ１８、及びＳＯＸ７を発現する。好ましい実施形態では、細胞は、転写因子（ｉ）ＥＴＳ１、ＳＯＸ１８、ＳＯＸ７、及びＴＡＬ１、又は（ｉｉ）ＥＴＳ１、ＳＯＸ１８、ＳＯＸ７、及びＬＥＦ１、最も好ましくはＥＴＳ１、ＳＯＸ１８、ＳＯＸ７、及びＴＡＬ１を発現する。

本発明の文脈において、ＴＢＩと相関するパラメータ、例えばＴＥＥＲは、目的の細胞培養物（例えば、薬物候補と接触させたＥＣ培養物）について、参照条件（例えば、ＥＣ培養物が薬物候補と接触していない）における細胞培養物と比較して測定される。一実施形態では、薬剤候補と接触させたＥＣ培養物の測定されたインビトロＴＥＥＲは、薬物候補と接触させていないＥＣ培養物の測定されたインビトロＴＥＥＲと比較して高く、特に、薬物候補と接触させていないＥＣ培養物の測定されたインビトロＴＥＥＲと比較して、少なくとも約１．１倍、１．２倍、１．３倍、１．４倍、１．５倍、１．６倍、１．７倍、１．８倍、１．９倍、２倍、５倍、又は１０倍高い。一実施形態では、薬剤候補と接触させたＥＣ培養物の測定されたインビトロＴＥＥＲは、薬物候補と接触させていないＥＣ培養物の測定されたインビトロＴＥＥＲと比較して低く、特に、薬物候補と接触させていないＥＣ培養物の測定されたインビトロＴＥＥＲと比較して、少なくとも約１．１倍、１．２倍、１．３倍、１．４倍、１．５倍、１．６倍、１．７倍、１．８倍、１．９倍、２倍、５倍、又は１０倍低い。

ＴＥＥＲは当該技術分野で周知の方法及び本明細書で提供される方法によって測定することができる。一実施形態では、ＴＥＥＲは、リアルタイムで測定される。一実施形態では、細胞のコンフルエント単層の複素インピーダンススペクトル（Ｚ、Ｒ、Ｃ）は、金電極上で測定される。一実施形態では、ＴＥＥＲは、制御されたガス環境においてリアルタイムで測定される。一実施形態では、ＴＥＥＲは、多電極アレイ上で測定される。一実施形態では、ＴＥＥＲは、８ウェル、１６ウェル、２４ウェル、又は９６ウェル多電極アレイ、好ましくは９６ウェル多電極アレイで測定される。一実施形態では、ＴＥＥＲは、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ製のＥＣＩＳ Ｚ－Ｔｈｅｔａシステムで、好ましくは９６ウェルの多電極アレイ上で測定される。

したがって、一実施形態は、薬物候補の有効性を特にハイ・スループット・モードで決定するための、本発明にかかる方法によって得られたＥＣ培養物の使用である。培養物は、健康な個体及び／又は罹患した個体に由来してもよく、本明細書に記載されるようにＥＣ培養物を用いて実施される効力及び／又は毒性研究の結果は、薬物候補の疾患及び／又は治療に関連する生理学的効果を予測するために統合することができる。一実施形態では、薬物候補のインビトロ有効性プロファイルが評価され、好ましい有効性プロファイルを有する薬物候補は更なる開発のために選択される。更なる開発は、非ヒト霊長類種における薬物候補のインビボ試験、及び／又はヒトにおけるインビボ試験を含み得る。

例示的な実施形態
１．高い経内皮電気抵抗（ＴＥＥＲ）を確立することができる細胞を作製するための方法であって、該細胞を少なくとも１つの転写因子と接触させる工程を含み、ここで、該細胞のコンフルエント単層が、該少なくとも１つの転写因子と接触しない細胞のコンフルエント単層と比較してより高い経内皮電気抵抗を確立する、方法。

２．該少なくとも１つの転写因子が、ＴＡＬ１、ＳＯＸ１８、ＦＯＸＦ２、ＳＯＸ７、ＦＯＸＣ１、ＥＴＳ１、ＫＬＦ１１、ＬＭＯ２、及びＬＥＦ１からなる群から個別に選択される、実施形態１の方法。

３．該少なくとも１つの転写因子が、ＥＴＳ１、ＳＯＸ１８、及びＳＯＸ７からなる群から選択される、実施形態１又は２のいずれか一つの方法。

４．該転写因子が、（ｉ）ＥＴＳ１、ＳＯＸ１８、ＳＯＸ７、及びＴＡＬ１、又は（ｉｉ）ＥＴＳ１、ＳＯＸ１８、ＳＯＸ７、及びＬＥＦ１である、実施形態１～３のいずれか一つの方法。

５．該少なくとも１つの転写因子をコードする単離された核酸が、該細胞に導入される、実施形態１～４のいずれか一つの方法。

６．該単離された核酸が、転写因子ＥＴＳ１、ＳＯＸ１８、及びＳＯＸ７をコードする、実施形態５の方法。

７．該単離された核酸が、該転写因子（ｉ）ＥＴＳ１、ＳＯＸ１８、ＳＯＸ７、及びＴＡＬ１、又は（ｉｉ）ＥＴＳ１、ＳＯＸ１８、ＳＯＸ７、及びＬＥＦ１をコードする、実施形態５又は６のいずれか一つの方法。

８．該単離された核酸が、少なくとも１つの発現ベクターに含まれる、実施形態１～７のいずれか一つの方法。

９．該少なくとも１つの発現ベクターが、ウイルスベクター、非ウイルスベクター、及びプラスミドベクターからなる群から個別に選択される、実施形態８の方法。

１０．１、２、３、又は４つの発現ベクターが、該細胞に導入される、実施形態１～９のいずれか一つの方法。

１１．該細胞が、哺乳動物細胞、特にヒト細胞である、実施形態１～１０のいずれか一つの方法。

１２．該細胞が、内皮細胞（ＥＣ）である、実施形態１～１１のいずれか一つの方法。

１３．該細胞が、多能性幹細胞、特に胚性幹細胞又は人工多能性幹細胞から生成される、実施形態１～１２のいずれか一つの方法。

１４．β－カテニン及び／又はＷｎｔシグナル伝達及び／又はヘッジホッグ（ＨＨ）シグナル伝達を活性化する小分子を補充したプライミング用培地中で該多能性幹細胞をインキュベートすることと、誘導用培地中でプライム細胞をインキュベートすることで分化を誘導することと、を含む、実施形態１３の方法。

１５．該β－カテニン及び／又はＷｎｔシグナル伝達及び／又はヘッジホッグ（ＨＨ）シグナル伝達を活性化する該小分子が、グリコーゲンシンターゼキナーゼ３（Ｇｓｋ３ａ－ｂ）の小分子阻害剤、ＣＤＣ様キナーゼ１（Ｃｌｋ１－２－４）の小分子阻害剤、マイトジェン活性化プロテインキナーゼ１５（Ｍａｐｋ１５）の小分子阻害剤、二重特異性チロシン（Ｙ）リン酸化制御キナーゼ（Ｄｙｒｋ１ａ－ｂ ４）の小分子阻害剤、サイクリン依存性キナーゼ１６（Ｐｃｔｋ１－３ ４）の小分子阻害剤、β－カテニン（又はγ－カテニン）とコアクチベータタンパク質ＣＢＰ（ＣＲＥＢ結合タンパク質）及びｐ３００（Ｅ１Ａ結合タンパク質ｐ３００）との間の相互作用のスムーズンド（ＳＭＯ）アクチベータ並びにモジュレータからなる群から選択される、実施形態１４の方法。

１６．プライミング用培地が、形質転換増殖因子β（ＴＧＦβ）の小分子阻害剤で補充される、実施形態１４又は１５のいずれか一つの方法。

１７．該ＴＧＦβの小分子阻害剤が、ＳＢ４３１５４２である、実施形態１６の方法。

１８．該プライミング用培地中の該細胞を、２～４日間、特に３日間インキュベートすることを含む、実施形態１４～１７のいずれか一つの方法。

１９．工程（ａ）の該プライミング用培地が、インスリン、トランスフェリン、及びプロゲステロンで補充された無血清培地である、実施形態１４～１８のいずれか一つの方法。

２０．工程（ａ）の該β－カテニン及び／又はＷｎｔシグナル伝達及び／又はヘッジホッグ（ＨＨ）シグナル伝達を活性化する該小分子が、３－（３－アミノ－フェニル）－４－（１－メチル－１Ｈ－インドール－３－イル）－ピロール－２，５－ジオン（ＣＰ２１Ｒ７）である、実施形態１４～１９のいずれか一つの方法。

２１．工程（ａ）の該プライミング用培地が、組換え骨形成タンパク質－４（ＢＭＰ４）を更に含む、実施形態１４～２０のいずれか一つの方法。

２２．該プライミング用培地が、インスリン１０～５０μｇ／ｍｌ、トランスフェリン１０～１００μｇ／ｍｌ、及びプロゲステロン１０～５０ｎＭを含有し、０．５～４μＭのＣＰ２１Ｒ７（３－（３－アミノ－フェニル）－４－（１－メチル－１Ｈ－インドール－３－イル）－ピロール－２，５－ジオン）及び１０～５０ｎｇ／ｍｌの組換え骨形成タンパク質－４（ＢＭＰ４）を補充した、無血清培地であって、特にここで、該プライミング用培地が、１μＭのＣＰ２１Ｒ７及び２５ｎｇ／ｍｌのＢＭＰ４を含む、実施形態１４～２１のいずれか一つの方法。

２３．該誘導用培地が、ＶＥＧＦ－Ａ（血管内皮増殖因子）又は胎盤様増殖因子１（ＰＬＧＦ－１）及び小分子アデニル酸シクラーゼアクチベータで補充された無血清培地である、実施形態１４～２２のいずれかの方法。

２４．該小分子アデニル酸アクチベータが、フォルスコリン（（３Ｒ）－（６ａαＨ）ドデカヒドロ－６β，１０α，１０ｂα－トリヒドロキシ－３β，４ａβ，７，７、１０ａβ－ペンタメチル－１－オキソ－３－ビニル－１Ｈ－ナフト［２，１－ｂ］ピラン－５β－イルアセテート）、８－ブロモ－ｃＡＭＰ（８－ブロモアデノシン－３’，５’－環状モノホスフェート）、及びアドレノメデュリンを含む群から選択される、実施形態２３の方法。

２５．該誘導用培地が、１～１０μＭのフォルスコリン及び５～１００ｎｇ／ｍｌのＶＥＧＦ－Ａ、特に２００ｎｇ／ｍｌのＶＥＧＦ及び２μＭのフォルスコリンを補充した無血清培地である、実施形態１４～２４のいずれか一つの方法。

２６．該誘導用培地中の該細胞を、１８時間～４８時間インキュベートすることを含む、実施形態１４～２５のいずれか一つの方法。

２７．該ＥＣの増殖に適した拡大培養用培地中で、工程（ａ）の該生成物をインキュベートすることを更に含む、実施形態１～２６のいずれか一つの方法。

２８．該拡大培養用培地が、ＶＥＧＦ－Ａ、特に５０ｎｇ／ｍｌのＶＥＧＦ－Ａで補充される、実施形態２７の方法。

２９．該多能性幹細胞が、血管合併症と関連する疾患に罹患している対象に由来する、実施形態１３～２８のいずれか一つの方法。

３０．該単離された核酸が、少なくとも１つのポリヌクレオチドを含む、実施形態１～２９のいずれか一つの方法。

３１．該細胞を凍結、保存、及び／又は再解凍することを更に含み、ここで、該細胞が生存可能なままである、実施形態１～３０のいずれか一つの方法。

３２．ＴＡＬ１、ＳＯＸ１８、ＦＯＸＦ２、ＳＯＸ７、ＦＯＸＣ１、ＥＴＳ１、ＫＬＦ１１、ＬＭＯ２、及びＬＥＦ１からなる群から選択される少なくとも１つの転写因子をコードする単離された核酸を含む、発現ベクター。

３３．該単離された核酸が、該転写因子ＥＴＳ１、ＳＯＸ１８、及びＳＯＸ７をコードする、実施形態３２の発現ベクター。

３４．該単離された核酸が、該転写因子（ｉ）ＥＴＳ１、ＳＯＸ１８、ＳＯＸ７、及びＴＡＬ１、又は（ｉｉ）ＥＴＳ１、ＳＯＸ１８、ＳＯＸ７、及びＬＥＦ１をコードする、実施形態３２又は３３のいずれか一つの発現ベクター。

３５．ウイルスベクター、非ウイルスベクター、及びプラスミドベクターからなる群から選択される、実施形態３２～３４のいずれか一つの発現ベクター。

３６．実施形態３２～３５のいずれか一つの２つ以上の個別の発現ベクターを含む、キット。

３７．該発現ベクターが、該転写因子ＥＴＳ１、ＳＯＸ１８、及びＳＯＸ７をコードする、実施形態３６のキット。

３８．該発現ベクターが、該転写因子（ｉ）ＥＴＳ１、ＳＯＸ１８、ＳＯＸ７、及びＴＡＬ１、又は（ｉｉ）ＥＴＳ１、ＳＯＸ１８、ＳＯＸ７、及びＬＥＦ１をコードする、実施形態３６又は３７のいずれか一つのキット。

３９．実施形態３２～３５のいずれか一つの発現ベクター、又は実施形態３６～３８のいずれか一つのキットの該発現ベクターを含む、細胞。

４０．該細胞が、内皮細胞である、実施形態３９の細胞。

４１．該細胞が、哺乳動物細胞、特にヒト細胞である、実施形態３９又は４０のいずれか一つの細胞。

４２．該細胞が、多能性幹細胞、特に胚性幹細胞又は人工多能性幹細胞から生成される、実施形態３９～４１のいずれか一つの細胞。

４３．高いＴＥＥＲを確立することができる前記細胞が、（ｉ）インビボ経内皮バリア完全性（ＴＢＩ）を増大させることができるか、又は（ｉｉ）内皮細胞のインビボＴＢＩを低減させることができる薬物候補を同定するために使用される、請求項１～３１のいずれか一項に記載の方法。

４４．
（ａ）高いＴＥＥＲを確立することができる細胞の単層を提供する工程；
（ｂ）該細胞を該薬物候補と接触させる工程；
（ｃ）該細胞を該薬物候補と接触させる前及び後におけるインビトロＴＥＥＲを測定する工程か、又は該薬物候補と接触させた該細胞のインビトロＴＥＥＲを測定し、かつ並行して、該薬物候補と接触させなかった細胞のインビトロＴＥＥＲを測定する工程であって、
ここで、（ｉ）該薬物候補と接触させなかった該細胞の該インビトロＴＥＥＲと比較して、該薬物候補と接触させた該細胞のより高いインビトロＴＥＥＲは、ＥＣのインビボＴＢＩを増大させることができる薬物を示し、（ｉｉ）該薬物候補と接触させなかった該細胞のインビトロＴＢＩと比較して、該薬物候補と接触した該細胞のより低いインビトロＴＥＥＲは、ＥＣのインビボＴＢＩを低減させることができる薬物を示す、工程
を含む、請求項４３に記載の方法。

４５．高ＴＥＥＲを確立することができる該細胞が、実施形態３２～３５のいずれか一つの発現ベクター、又は実施形態３６～３８のキットのいずれかの発現ベクターのうちの少なくとも１つを含む、実施形態４４の方法。

４６．工程（ａ）における該細胞が、細胞培養支持体上、特にマルチウェルプレート上、より具体的には、２４ウェルプレート、９６ウェルプレート、３８４ウェルプレート、又は１５３６ウェルプレートからなる群から選択されるマルチウェルプレート上に提供される、実施形態４３～４５のいずれか一つの方法。

４７．該ＴＥＥＲが、インビトロＴＢＩを示す、実施形態４３～４６のいずれか一つの方法。

４８．ハイ・スループット・モードで実行される、実施形態４３～４７のいずれか一つの方法。

４９．医薬品開発の設定において、特に薬物候補化合物ライブラリのハイ・スループット・スクリーニング用に薬物分子をスクリーニングするために使用される、実施形態４３～４８のいずれか一つの方法。

５０．（ｉ）インビボ経内皮バリア完全性（ＴＢＩ）を増大させることができるか又は（ｉｉ）内皮細胞のインビボＴＢＩを低減させることができる薬物候補を同定するための方法であって、
（ａ）請求項３９～４２のいずれか一項に記載の細胞の単層を提供する工程；
（ｂ）該細胞を該薬物候補と接触させる工程；
（ｃ）該細胞を該薬物候補と接触させる前及び後におけるインビトロＴＥＥＲを測定する工程か、又は該薬物候補と接触させた該細胞のインビトロＴＥＥＲを測定し、かつ並行して、該薬物候補と接触させなかった細胞のインビトロＴＥＥＲを測定する工程であって、
ここで、（ｉ）該薬物候補と接触させなかった該細胞の該インビトロＴＥＥＲと比較して、該薬物候補と接触させた該細胞のより高いインビトロＴＥＥＲは、ＥＣのインビボＴＢＩを増大させることができる薬物を示し、（ｉｉ）該薬物候補と接触させなかった該細胞のインビトロＴＥＥＲと比較して、該薬物候補と接触した該細胞のより低いインビトロＴＥＥＲは、ＥＣのインビボＴＢＩを低減させることができる薬物を示す、工程
を含む、方法。

５１．本明細書で上に記載されるとおりの発明。

材料及び方法
ヒトＰＳＣの培養及び分化
ｈＰＳＣ株ＳＡ００１（Ｅｎｇｌｕｎｄ ＭＣ、Ｃａｉｓａｎｄｅｒ Ｇ、Ｎｏａｋｓｓｏｎ Ｋ、Ｅｍａｎｕｅｌｓｓｏｎ Ｋ、Ｌｕｎｄｉｎ Ｋ、Ｂｅｒｇｈ Ｃら、「Ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｃｅｌｌｕｌａｒ＆ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ ｂｉｏｌｏｇｙ Ａｎｉｍａｌ．（２０１０年）第４６巻、第３～４号、第２１７～３０頁、Ｃｅｌｌａｒｔｉｓ ＡＢ）は、記載のように（Ｐａｔｓｃｈ Ｃ、Ｃｈａｌｌｅｔ－Ｍｅｙｌａｎ Ｌ、Ｔｈｏｍａ ＥＣ、Ｕｒｉｃｈ Ｅ、Ｈｅｃｋｅｌ Ｔ、Ｏ’Ｓｕｌｌｉｖａｎ ＪＦら、「Ｎａｔ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．」（２０１５年）第１７巻、第８号、第９９４～１００３頁）、いくつかの改変を加えて分化させた：５０ｎｇ／ｍＬのＶＥＧＦＡを有するＳｔｅｍＰｒｏからなる拡大培養用培地は、第一分裂のみのために細胞上で維持されている。第二分裂から、ＶａｓｃｕＬｉｆｅ ＶＥＧＦ Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ Ｍｅｄｉｕｍ Ｃｏｍｐｌｅｔｅ Ｋｉｔ（ＬｉｆｅＬｉｎｅ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を用いて細胞を培養した。培地に加えられた補充物の最終組成は、１０％ＦＢＳ、４ｍＭのＬ－グルタミン、０．７５Ｕ／ｍＬの硫酸ヘパリン、５ｎｇ／ｍＬのＦＧＦ－２、５ｎｇ／ｍＬのＥＧＦ、５ｎｇ／ｍＬのＶＥＧＦＡ、１５ｎｇ／ｍＬのＩＧＦ１、１μｇ／ｍＬのヘミスコハク酸ヒドロコルチゾン、５０μｇ／ｍＬのアスコルビン酸であった。ＳＢ４３１５４２（１０μＭ）を培地に補充した。

アデノウイルス産生
ＧＦＰを発現するいくつかのプロモーター（ＵｂｉＣ、Ｅ１Ｆα、及びＣＭＶ）を、異なる感染多重度（ｍｕｌｔｉｐｌｉｃｉｔｙ ｏｆ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ：ＭＯＩ）のアデノウイルスで試験した（データ示さず）。ＵｂｉＣプロモーターをＭＯＩ ８０での転写因子の過剰発現に対して選択した。ＵｂｉＣプロモーターの下流に続き、ポリアデニル化ＯＲＦ配列を有するＧＦＰの３’配列がクローニングされた。Ｅ１及びＥ３欠損アデノウイルスゲノムをコードするＳＩＲ－ＢＡＣ－Ａｄ５を持つＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＤＨ１０Ｂにおいて、形質転換及び組換えによりバクテリア人工染色体を作製した。感染性組換えアデノウイルス粒子は、線状コンストラクトをＨＥＫ２９３細胞に形質移入し、続いてＡｄｅｎｏＯＮＥ精製キットを用いて複製能を有するアデノウイルスを精製することによって作製した。

公表された遺伝子発現データセットの分析
ＥＣ、平滑筋細胞、及びＰＤＧＦＲα由来の単一細胞発現データからの正規化カウント発現を、ＧＥＯからダウンロードした（ＧＳＥ９８８１６、（Ｖａｎｌａｎｄｅｗｉｊｃｋ Ｍ、Ｈｅ Ｌ、Ｍａｅ ＭＡ、Ａｎｄｒａｅ Ｊ、Ａｎｄｏ Ｋ、Ｄｅｌ Ｇａｕｄｉｏ Ｆら、「Ｎａｔｕｒｅ．」（２０１８年）第５５４巻、第７６９３号、第４７５～８０頁））。選択された転写因子の平均発現を有する単一細胞発現バイオリン図を、Ｒパッケージｇｇｐｌｏｔ２を用いてプロットした。単一細胞発現データにおけるＣＬＤＮ５に対する遺伝子発現の相関は、ＧＥＯ（ＧＳＥ４７０６７（Ｎｏｌａｎ ＤＪ、Ｇｉｎｓｂｅｒｇ Ｍ、Ｉｓｒａｅｌｙ Ｅ、Ｐａｌｉｋｕｑｉ Ｂ、Ｐｏｕｌｏｓ ＭＧ、Ｊａｍｅｓ Ｄら、「Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ ｃｅｌｌ．」（２０１３年）第２６巻、第２号、第２０４～１９頁）、ＧＳＥ３５８０２（Ｔａｍ ＳＪ、Ｒｉｃｈｍｏｎｄ ＤＬ、Ｋａｍｉｎｋｅｒ ＪＳ、Ｍｏｄｒｕｓａｎ Ｚ、Ｍａｒｔｉｎ－ＭｃＮｕｌｔｙ Ｂ、Ｃａｏ ＴＣら、「Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ ｃｅｌｌ．」（２０１２年）第２２巻、第２号、第４０３～１７頁、ＧＳＥ４８２０９（Ｃｏｐｐｉｅｌｌｏ Ｇ、Ｃｏｌｌａｎｔｅｓ Ｍ、Ｓｉｒｅｒｏｌ－Ｐｉｑｕｅｒ ＭＳ、Ｖａｎｄｅｎｗｉｊｎｇａｅｒｔ Ｓ、Ｓｃｈｏｏｒｓ Ｓ、Ｓｗｉｎｎｅｎ Ｍら、「Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ．」（２０１５年）第１３１巻、第９号、第８１５～２６頁））からダウンロードしたＲ Ｒａｗ Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ発現ファイルのＰｅａｒｓｏｎ相関を用いて実施し、Ｐａｒｔｅｋ Ｇｅｎｏｍｉｃ Ｓｕｉｔｅを用いて分析した。プローブセットのデータを次のように正規化した：ＧＣ補正及びプローブ配列バイアスのためにプレバックグラウンド調整を行い、続いてＲＭＡバックグラウンド補正及びクオンタイル正規化を行った。正規化したプローブセットデータをｌｏｇ２変換し、メディアンポリッシュ（ｍｅｄｉａｎ ｐｏｌｉｓｈ）法により要約した。差次的発現をＡＮＯＶＡモデルにより決定した。Ｎｏｌａｎらの研究（Ｎｏｌａｎ ＤＪ、Ｇｉｎｓｂｅｒｇ Ｍ、Ｉｓｒａｅｌｙ Ｅ、Ｐａｌｉｋｕｑｉ Ｂ、Ｐｏｕｌｏｓ ＭＧ、Ｊａｍｅｓ Ｄら、「Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ ｃｅｌｌ．」（２０１３年）第２６巻、第２号、第２０４～１９頁）では、脳内皮細胞を他のいくつかの組織と比較し、ランクに基づくメタ分析ツールであるＲａｎｋＰｒｏｄＩｔ（Ｌａｉｎｇ Ｅ、Ｓｍｉｔｈ ＣＰ．、「ＢＭＣ ｒｅｓｅａｒｃｈ ｎｏｔｅｓ．」（２０１０年）第３巻、第２２１頁）を使用して、コンセンサス脳ＥＣ遺伝子シグネチャを作成した。

細胞溶解及びＲＮＡ単離
培養ＥＣを、３５０μＬのＲＬＴ溶解緩衝液（Ｑｉａｇｅｎ）＋β－メルカプトエタノール（１％）を用いて溶解し、続いて室温で１分間ボルテックスし、瞬間凍結した。ＲＮＡは、ＤＮＡｓｅ Ｉ消化によるＤＮＡ除去を伴う自動化Ｍａｘｗｅｌｌ Ｔｏｔａｌ ＲＮＡ精製キット（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて細胞溶解物から単離した。

ＲＮＡシーケンシング及び分析
全ＲＮＡをオリゴ（ｄＴ）捕捉及び濃縮に供し、得られたｍＲＮＡ画分を使用して、ｃｃＤＮＡライブラリを構築した。シーケンシングは、試料当たり５０塩基対のおよそ３０００万読取りを生成する標準プロトコル（ＴｒｕＳｅｑ Ｓｔｒａｎｄｅｄ Ｔｏｔａｌ ＲＮＡ Ｌｉｂｒａｒｙ、Ｉｌｌｕｍｉｎａ）を用いて、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＨｉＳｅｑプラットフォームで行った。読取りをＳＴＡＲ（Ｄｏｂｉｎ Ａ、Ｄａｖｉｓ ＣＡ、Ｓｃｈｌｅｓｉｎｇｅｒ Ｆ、Ｄｒｅｎｋｏｗ Ｊ、Ｚａｌｅｓｋｉ Ｃ、Ｊｈａ Ｓら、「Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ．」（２０１３年）第２９巻、第１号、第１５～２１頁）を用いてヒトゲノム（ｈｇ１９／Ｒｅｆｓｅｑ）にマッピングし、ＨｔＳｅｑ（Ａｎｄｅｒｓ Ｓ、Ｐｙｌ ＰＴ、Ｈｕｂｅｒ Ｗ．、「Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ．」（２０１５年）第３１巻、第２号、第１６６～９頁）のユニオンモードを用いて計数を行った。差次的発現をＤＥＳｅｑ２を用いて行った（Ｄｏｂｉｎ Ａ、Ｄａｖｉｓ ＣＡ、Ｓｃｈｌｅｓｉｎｇｅｒ Ｆ、Ｄｒｅｎｋｏｗ Ｊ、Ｚａｌｅｓｋｉ Ｃ、Ｊｈａ Ｓら、「Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ．」（２０１３年）第２９巻、第１号、第１５～２１頁）。遺伝子セット濃縮分析は、ＧＳＥＡ（Ｓｕｂｒａｍａｎｉａｎ Ａ、Ｔａｍａｙｏ Ｐ、Ｍｏｏｔｈａ ＶＫ、Ｍｕｋｈｅｒｊｅｅ Ｓ、Ｅｂｅｒｔ ＢＬ、Ｇｉｌｌｅｔｔｅ ＭＡら、「Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ．」（２００５年）第１０２巻、第４３号、第１５５４５～５０頁）を用い、Ｈａｌｌｍａｒｋｓ ＭｓｉｇＤｂデータベース（Ｌｉｂｅｒｚｏｎ Ａ、Ｂｉｒｇｅｒ Ｃ、「Ｔｈｏｒｖａｌｄｓｄｏｔｔｉｒ Ｈ、Ｇｈａｎｄｉ Ｍ、Ｍｅｓｉｒｏｖ ＪＰ、Ｔａｍａｙｏ Ｐ．、「Ｃｅｌｌ Ｓｙｓｔ．」（２０１５年）第１巻、第６号、第４１７～２５頁）を用い、１５より小さな遺伝子セット及び５００より大きな遺伝子セットを無視したデフォルト条件に従って上方制御された遺伝子から下方制御された遺伝子への倍率変化でソートした遺伝子リストによる加重分析を用いて、実施した。

実施例１
ｈＰＳＣ－ＥＣと、高経内皮バリア抵抗性のＥＣとを区別できる転写因子を同定するために、異なるマウス血管床の公開発現データセットを分析した（Ｔａｍ ＳＪ、Ｒｉｃｈｍｏｎｄ ＤＬ、Ｋａｍｉｎｋｅｒ ＪＳ、Ｍｏｄｒｕｓａｎ Ｚ、Ｍａｒｔｉｎ－ＭｃＮｕｌｔｙ Ｂ、Ｃａｏ ＴＣら、「Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ ｃｅｌｌ．」（２０１２年）第２２巻、第２号、第４０３～１７頁、Ｃｏｐｐｉｅｌｌｏ Ｇ、Ｃｏｌｌａｎｔｅｓ Ｍ、Ｓｉｒｅｒｏｌ－Ｐｉｑｕｅｒ ＭＳ、Ｖａｎｄｅｎｗｉｊｎｇａｅｒｔ Ｓ、Ｓｃｈｏｏｒｓ Ｓ、Ｓｗｉｎｎｅｎ Ｍら、「Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ．」（２０１５年）第１３１巻、第９号、第８１５～２６頁、Ｎｏｌａｎ ＤＪ、Ｇｉｎｓｂｅｒｇ Ｍ、Ｉｓｒａｅｌｙ Ｅ、Ｐａｌｉｋｕｑｉ Ｂ、Ｐｏｕｌｏｓ ＭＧ、Ｊａｍｅｓ Ｄら、「Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ ｃｅｌｌ．」（２０１３年）第２６巻、第２号、第２０４～１９頁）。全ての転写因子に対する脳ＥＣと他の血管床のＥＣとの間の試験（Ｒａｖａｓｉ Ｔ、Ｓｕｚｕｋｉ Ｈ、Ｃａｎｎｉｓｔｒａｃｉ ＣＶ、Ｋａｔａｙａｍａ Ｓ、Ｂａｊｉｃ ＶＢ、Ｔａｎ Ｋら、「Ｃｅｌｌ．」（２０１０年）第１４０巻、第５号、第７４４～５２頁）における、倍率変化発現を計算した。脳のＥＣにおいて高度に上方制御された（＞２ＦＣ）転写因子を同定した。次に、脳ＥＣ（分析した１４４５の細胞（Ｖａｎｌａｎｄｅｗｉｊｃｋ Ｍ、Ｈｅ Ｌ、Ｍａｅ ＭＡ、Ａｎｄｒａｅ Ｊ、Ａｎｄｏ Ｋ、Ｄｅｌ Ｇａｕｄｉｏ Ｆら、「Ｎａｔｕｒｅ．」（２０１８年）第５５４巻、第７６９３号、第４７５～８０頁））からの最近の単一細胞発現プロファイリング試験からの遺伝子発現データを再分析し、内皮細胞バリア抵抗性を仲介する重要なタイトジャンクションである、ＣＬＤＮ５の高発現を同定した。ＣＬＤＮ５の遺伝子発現は、活性転写因子を予測するために使用できる遺伝子シグネチャを同定するため、単一細胞脳ＥＣにおける他の遺伝子と相関した。最も相関の高い遺伝子を使用して、ｅｎｒｉｃｈＲに組み込まれているＴｒａｎｓｆａｃ及びＪａｓｐｅｒ分析を用いて転写因子の活性を予測した。ｈＰＳＣ－ＥＣを単一選択転写因子（ＭＯＩ ８０アデノウイルス）で形質導入し、経内皮抵抗性をＥＣＩＳを用いて測定した。ＥＣバリアの有意な誘導は、ＴＡＬ１及びＳＯＸ１８の過剰発現と、バリア安定化から２４時間後のＦＯＸＦ２、ＳＯＸ７、ＦＯＸＣ１、ＥＴＳ１、ＫＬＦ１１、ＬＭＯ２、及びＬＥＦ１に対するバリアの増加傾向と、により観察された（図１Ａ）。ＴＡＬ１は、ＳＯＸ１８に続いて、バリア抵抗性に対して最も速い作用を示した（図１Ｂ）。ＥＴＳ１はバリアを誘導することができたが、より遅い速度であった（図１Ｂ）。ＦＩＴＣデキストラン透過性アッセイを用いて、ＳＯＸ１８、ＳＯＸ７、ＥＴＳ１、及びＬＥＦ１に対して最も強いバリア活性を示した（図１Ｃ）。ＴＡＬ１の効果が既に減少している処置４８時間後にアッセイを行ったため、ＴＡＬ１については効果が観察されなかった（図１Ｃ）。処置から４８時間後にＲＮＡシーケンシング分析を行い、過剰発現した転写因子の高い上方制御を測定した。次に、ＥＣバリア誘導に関連する経路に着目して、Ｈａｌｌｍａｒｋｓ ＭｓｇＤＢデータベースを用いるＧＳＥＡ分析を行った。ヘッジホッグシグナル伝達の濃縮は全ての転写因子に観察され、Ｗｎｔシグナル伝達はＫＬＦ１１を除く全ての転写因子を過剰発現させた際に観察された。ＥＴＳ１及びＦＯＸＦ２は、他の転写因子の上流に作用することを示唆する最も多数の経路を誘導している。加えて、ＥＴＳ１及びＴＡＬ１は広汎な血管新生を促進することができた。ＫＬＦ１１は増殖を誘導できる唯一の転写因子であった。次に、経路の個々のメンバに注目した。ＳＯＸ１８及びＳＯＸ７は、しばしば、同じ遺伝子（Ｗｎｔ、ヘッジホッグ、及びＮｏｔｃｈシグナル伝達）を誘導し、それらが同じネットワークで作用することを示唆した。マーカＥＣ遺伝子に注目すると、ＫＬＦ１１、ＦＯＸＣ１、及びＫＬＦ１１は、ＶＥＧＦＲ２、ＶＥＧＦＲ１、及びＣＤ３４を下方制御することが明らかとなり（図１Ｄ、図１Ｅ、図１Ｆ）、ＥＣ表現型を変化させるため、ＥＣバリア誘導に適していない可能性が示唆された。次に、経内皮細胞バリアの形成に関与するタイトジャンクションの発現を分析した。ＦＯＸＦ２、ＦＯＸＣ１、及びＫＬＦ１１によるＶＥ－カドヘリンの下方制御が観察されたが、ＳＯＸ１８、ＴＡＬ１、ＳＯＸ７、及びＬＥＦ１はそれを誘導することができた。ＳＯＸ７は、ＰＥＣＡＭ１、ＧＪＡ１、ＥＳＡＭ、及びＪＡＭ２を誘導できた（図１Ｈ、図１Ｉ、図１Ｈ、図１Ｍ）。ＳＯＸ１８は、ＪＡＭ２及びＭＡＲＶＥＬＤ２の発現を誘導できた（図１Ｍ、図１Ｏ）。ＥＴＳ１はＣＬＤＮ５発現を誘導できる唯一の転写因子であった（図１Ｎ）。高抵抗性バリアはＰＬＶＡＰの発現が低く（Ｚｈｏｕ Ｙ、「Ｎａｔｈａｎｓ Ｊ．」（２０１４年）第３１巻、第２号、第２４８～５６頁）、ＭＦＳＤ２Ａ（Ｂｅｎ－Ｚｖｉ Ａ、Ｌａｃｏｓｔｅ Ｂ、Ｋｕｒ Ｅ、Ａｎｄｒｅｏｎｅ ＢＪ、Ｍａｙｓｈａｒ Ｙ、Ｙａｎ Ｈら、「Ｎａｔｕｒｅ．」（２０１４年）第５０９巻、第５０７頁）及びＴＮＦＲＳＦ２１（Ｔａｍ ＳＪ、Ｒｉｃｈｍｏｎｄ ＤＬ、Ｋａｍｉｎｋｅｒ ＪＳ、Ｍｏｄｒｕｓａｎ Ｚ、Ｍａｒｔｉｎ－ＭｃＮｕｌｔｙ Ｂ、Ｃａｏ ＴＣら、「Ｄｅａｔｈ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ ＤＲ６ ａｎｄ ＴＲＯＹ ｒｅｇｕｌａｔｅ ｂｒａｉｎ ｖａｓｃｕｌａｒ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．」、「Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ ｃｅｌｌ．」（２０１２年）第２２巻、第２号、第４０３～１７頁）の発現が高かった。本明細書に示したデータは、ＳＯＸ１８、ＳＯＸ７、及びＴＡＬ１がＰＬＶＡＰを強く下方制御することを示す（図１Ｐ）。ＭＦＳＤ２ＡはＳＯＸ１８により強く誘導されたが、一方でＴＮＦＲＳＦ２１は、ＳＯＸ１８、ＴＡＬ１、ＦＯＸＣ１、ＥＴＳ１、及びＬＥＦ１により誘導された（図１Ｑ、図１Ｒ）。

実施例２
転写因子はネットワークで働くので（Ｎｅｐｈ Ｓ、Ｓｔｅｒｇａｃｈｉｓ ＡＢ、Ｒｅｙｎｏｌｄｓ Ａ、Ｓａｎｄｓｔｒｏｍ Ｒ、Ｂｏｒｅｎｓｔｅｉｎ Ｅ、Ｓｔａｍａｔｏｙａｎｎｏｐｏｕｌｏｓ ＪＡ．、「Ｃｅｌｌ．」（２０１２年）第１５０巻、第６号、第１２７４～８６頁）、他の因子と組み合わせてより低レベルの転写因子（ＭＯＩ ２０）を用いる可能性を検討した。最初に、ＭＯＩ ２０で単一転写因子を過剰発現させ、抵抗性を評価した。抵抗性の安定化後２４時間ではいかなる有意な誘導も観察できなかった（図２Ａ）。リアルタイムＥＣＩＳ測定では、バリア抵抗性の顕著な誘導は観察されず、バリア誘導に対するＳＯＸ１８の傾向のみが観察された。ＦＩＴＣデキストランアッセイでは、ＳＯＸ１８はＥＣバリア透過性の有意な低下を引き起こしたが、ＴＡＬ１はその効果が４８時間かけて低下するにつれて透過性を増加させることが見出された（図２Ｂ）。次に、いずれの単一の因子としてもバリアを誘導することを示した転写因子（ＳＯＸ１８、ＴＡＬ１）、又はＥＣバリアの形成に関与する遺伝子を誘導することができる転写因子（ＥＴＳ１、ＬＥＦ１、ＳＯＸ７）を組み合わせた。抵抗性は、ＬＥＦ１又はＴＡＬ１と固定因子を組み合わせることにより抵抗の安定化後２４時間で測定し、バリア抵抗性の有意な増加を両方の組合せで観察した（図２Ｃ）。リアルタイムＥＣＩＳは、ＥＴＳ１＋ＳＯＸ１８＋ＳＯＸ７＋ＴＡＬ１の組合せが相乗的にバリアを誘導できることを示した。最高の誘導は１．７倍であった。これは４因子（ＭＯＩ ２０）の付加的な組合せよりも高く、またＭＯＩ ８０の単一因子の過剰発現よりも高かった。ＦＩＴＣデキストランの透過性の有意な低減が両方の組合せで観察された。最後に、転写因子の組合せがＷｎｔシグナル伝達を強力に誘導できることを同定する、ｑＲＴ－ＰＣＲを実施した（ＭＡＲＶＥＫＤ２、ＴＳＰＡＮ１２、ＴＮＦＲＳＦ１９、及びＡＸＩＮ２の上方制御並びにＡＰＣＤＤ１の下方制御；データ示さず）。

転写因子間のコンビナトリアルな相互作用は細胞型の分化に重要である（Ｒａｖａｓｉ Ｔ、Ｓｕｚｕｋｉ Ｈ、Ｃａｎｎｉｓｔｒａｃｉ ＣＶ、Ｋａｔａｙａｍａ Ｓ、Ｂａｊｉｃ ＶＢ、Ｔａｎ Ｋら、「Ｃｅｌｌ．」（２０１０年）第１４０巻、第５号、第７４４～５２頁、Ｎｅｐｈ Ｓ、Ｓｔｅｒｇａｃｈｉｓ ＡＢ、Ｒｅｙｎｏｌｄｓ Ａ、Ｓａｎｄｓｔｒｏｍ Ｒ、Ｂｏｒｅｎｓｔｅｉｎ Ｅ、Ｓｔａｍａｔｏｙａｎｎｏｐｏｕｌｏｓ ＪＡ．、「Ｃｅｌｌ．」（２０１２年）第１５０巻、第６号、第１２７４～８６頁）。本研究では、ＥＣバリア抵抗性を誘導するために相乗的に作用する転写因子の組合せを同定した。インビトロのＥＣバリアをモデリングするために存在する現在のモデルは高度に洗練されており、正確に再現することが難しく、創薬に適応することが困難である。４つの転写因子の単純な組合せを使用して、ＥＣ破壊を伴う疾患の治療のための新規経路及び分子標的を見出すために用いることが可能な高バリア抵抗性のＥＣのインビトロモデルを作製することができる。

Claims (16)

1. 高い経内皮電気抵抗（ｔｒａｎｓｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｅｌｅｃｔｒｉｃａｌ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ：ＴＥＥＲ）を確立することができる細胞を作製するための方法であって、前記細胞を少なくとも１つの転写因子と接触させる工程を含み、ここで、前記細胞のコンフルエント単層が、前記少なくとも１つの転写因子と接触しない細胞のコンフルエント単層と比較してより高い経内皮電気抵抗を確立する、方法。
2. 前記少なくとも１つの転写因子が、ＴＡＬ１、ＳＯＸ１８、ＦＯＸＦ２、ＳＯＸ７、ＦＯＸＣ１、ＥＴＳ１、ＫＬＦ１１、ＬＭＯ２、及びＬＥＦ１からなる群から個別に選択される、請求項１に記載の方法。
3. 前記少なくとも１つの転写因子が、ＥＴＳ１、ＳＯＸ１８、及びＳＯＸ７からなる群から選択される、請求項１又は２のいずれか一項に記載の方法。
4. 前記転写因子が、（ｉ）ＥＴＳ１、ＳＯＸ１８、ＳＯＸ７、及びＴＡＬ１、又は（ｉｉ）ＥＴＳ１、ＳＯＸ１８、ＳＯＸ７、及びＬＥＦ１である、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
5. 前記少なくとも１つの転写因子をコードする単離された核酸が、前記細胞に導入される、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。
6. 前記単離された核酸が、少なくとも１つの発現ベクターに含まれ、特に、前記少なくとも１つの発現ベクターが、ウイルスベクター、非ウイルスベクター、及びプラスミドベクターからなる群から個別に選択される、請求項５に記載の方法。
7. 前記細胞が、内皮細胞（ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌ：ＥＣ）である、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。
8. ＴＡＬ１、ＳＯＸ１８、ＦＯＸＦ２、ＳＯＸ７、ＦＯＸＣ１、ＥＴＳ１、ＫＬＦ１１、ＬＭＯ２、及びＬＥＦ１からなる群から選択される少なくとも１つの転写因子をコードする単離された核酸を含む、発現ベクター。
9. ウイルスベクター、非ウイルスベクター、又はプラスミドベクターである、請求項８に記載の発現ベクター。
10. 前記単離された核酸が、前記転写因子ＥＴＳ１、ＳＯＸ１８、及びＳＯＸ７をコードする、請求項８又は９のいずれか一項に記載の発現ベクター。
11. 前記単離された核酸が、前記転写因子（ｉ）ＥＴＳ１、ＳＯＸ１８、ＳＯＸ７、及びＴＡＬ１、又は（ｉｉ）ＥＴＳ１、ＳＯＸ１８、ＳＯＸ７、及びＬＥＦ１をコードする、請求項８～１０のいずれか一項に記載の発現ベクター。
12. 請求項８～１１のいずれか一項に記載の発現ベクターのうちの１つ以上を含む、細胞。
13. 前記細胞が、哺乳動物細胞、特にヒト細胞である、請求項１２に記載の細胞。
14. 高いＴＥＥＲを確立することができる前記細胞が、（ｉ）インビボ経内皮バリア完全性（ｔｒａｎｓｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｂａｒｒｉｅｒ ｉｎｔｅｇｒｉｔｙ：ＴＢＩ）を増大させることができるか、又は（ｉｉ）内皮細胞のインビボＴＢＩを低減させることができる薬物候補を同定するために使用される、請求項１～７のいずれか一項に記載の方法。
15. （ａ）高いＴＥＥＲを確立することができる細胞の単層を提供する工程；
    （ｂ）前記細胞を前記薬物候補と接触させる工程；
    （ｃ）前記細胞を前記薬物候補と接触させる前及び後におけるインビトロＴＥＥＲを測定する工程か、又は前記薬物候補と接触させた前記細胞のインビトロＴＥＥＲを測定し、かつ並行して、前記薬物候補と接触させなかった細胞のインビトロＴＥＥＲを測定する工程であって、
    ここで、（ｉ）前記薬物候補と接触させなかった前記細胞の前記インビトロＴＥＥＲと比較して、前記薬物候補と接触させた前記細胞のより高いインビトロＴＥＥＲは、ＥＣのインビボＴＢＩを増大させることができる薬物を示し、（ｉｉ）前記薬物候補と接触させなかった前記細胞のインビトロＴＥＥＲと比較して、前記薬物候補と接触した前記細胞のより低いインビトロＴＥＥＲは、ＥＣのインビボＴＢＩを低減させることができる薬物を示す、工程
    を含む、請求項１４に記載の方法。
16. （ｉ）インビボ経内皮バリア完全性（ＴＢＩ）を増大させることができるか又は（ｉｉ）内皮細胞のインビボＴＢＩを低減させることができる薬物候補を同定するための方法であって、
    （ａ）請求項１２又は１３のいずれか一項に記載の細胞の単層を提供する工程；
    （ｂ）前記細胞を前記薬物候補と接触させる工程；
    （ｃ）前記細胞を前記薬物候補と接触させる前及び後におけるインビトロＴＥＥＲを測定する工程か、又は前記薬物候補と接触させた前記細胞のインビトロＴＥＥＲを測定し、かつ並行して、前記薬物候補と接触させなかった細胞のインビトロＴＥＥＲを測定する工程であって、
    ここで、（ｉ）前記薬物候補と接触させなかった前記細胞の前記インビトロＴＥＥＲと比較して、前記薬物候補と接触させた前記細胞のより高いインビトロＴＥＥＲは、ＥＣのインビボＴＢＩを増大させることができる薬物を示し、（ｉｉ）前記薬物候補と接触させなかった前記細胞のインビトロＴＥＥＲと比較して、前記薬物候補と接触した前記細胞のより低いインビトロＴＥＥＲは、ＥＣのインビボＴＢＩを低減させることができる薬物を示す、工程
    を含む、方法。

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