JP2021534753A - 経内皮バリア一体性の評価方法 - Google Patents

Abstract

本出願は、内皮細胞バリア組織の一体性を強化又は低下可能な薬剤候補の同定方法に関する。更に、本出願は、タイトジャンクション遺伝子転写レポーターを、経内皮バリア一体性のサロゲートマーカーとして使用することに関する。

Description

本出願は、内皮細胞バリア一体性を強化又は低下可能な薬剤候補の同定方法に関する。更に、本出願は、タイトジャンクション遺伝子転写レポーターを、経内皮バリア一体性のサロゲートマーカーとして使用することに関する。

血液網膜（ＢＲＢ）、及び血液脳バリア（ＢＢＢ）を形成する内皮細胞バリアは、ホメオスタシス、並びに、眼及び脳への毒性及び感染症の予防のために重要である（Ｅｎｇｅｌｈａｒｄｔ Ｂ，Ｌｉｅｂｎｅｒ Ｓ．Ｃｅｌｌ ａｎｄ ｔｉｓｓｕｅ ｒｅｓｅａｒｃｈ．２０１４；３５５（３）：６８７−９９（非特許文献1），Ｄｉａｚ−Ｃｏｒａｎｇｕｅｚ Ｍ，Ｒａｍｏｓ Ｃ，Ａｎｔｏｎｅｔｔｉ ＤＡ．Ｖｉｓｉｏｎ ｒｅｓｅａｒｃｈ．２０１７；１３９：１２３−３７（非特許文献2））。内皮細胞バリアの破壊は、いくつかの網膜疾患、例えば、家族性滲出性硝子体網膜症（Ｇｉｌｍｏｕｒ ＤＦ．Ｅｙｅ（Ｌｏｎｄｏｎ，Ｅｎｇｌａｎｄ）．２０１５；２９（１）：１−１４（非特許文献3））、加齢関連黄斑変性症及び糖尿病性網膜症（Ｋｌａａｓｓｅｎ Ｉ，Ｖａｎ Ｎｏｏｒｄｅｎ ＣＪ，Ｓｃｈｌｉｎｇｅｍａｎｎ ＲＯ．Ｐｒｏｇｒｅｓｓ ｉｎ ｒｅｔｉｎａｌ ａｎｄ ｅｙｅ ｒｅｓｅａｒｃｈ．２０１３；３４：１９−４８（非特許文献4））、並びに、脳神経系疾患（Ｚｈａｏ Ｚ，Ｎｅｌｓｏｎ ＡＲ，Ｂｅｔｓｈｏｌｔｚ Ｃ，Ｚｌｏｋｏｖｉｃ ＢＶ．Ｃｅｌｌ．２０１５；１６３（５）：１０６４−７８（非特許文献5））において示唆されている。内皮細胞（ＥＣ）は、高耐性の選択性マーカーを形成する、専用のひとまとまりのタイトジャンクション及びトランスポーター（Ｌｕｉｓｓｉｎｔ ＡＣ，Ａｒｔｕｓ Ｃ，Ｇｌａｃｉａｌ Ｆ，Ｇａｎｅｓｈａｍｏｏｒｔｈｙ Ｋ，Ｃｏｕｒａｕｄ ＰＯ．Ｆｌｕｉｄｓ ａｎｄ ｂａｒｒｉｅｒｓ ｏｆ ｔｈｅ ＣＮＳ．２０１２；９（１）：２３（非特許文献6））を発現する。

ＢＲＢ及びＢＢＢ由来の単離された一次ＥＣはインビトロで、インビボで発見された膜性質を速やかに喪失し、それ故、２Ｄ及び３Ｄで、インビボ条件を模倣した神経血管接合部由来の一次細胞と共に同時培養した複雑な系を用いた、いくつかの研究が存在した（Ｈｅｌｍｓ ＨＣ，Ａｂｂｏｔｔ ＮＪ，Ｂｕｒｅｋ Ｍ，Ｃｅｃｃｈｅｌｌｉ Ｒ，Ｃｏｕｒａｕｄ ＰＯ，Ｄｅｌｉ ＭＡ，ｅｔ ａｌ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｃｅｒｅｂｒａｌ ｂｌｏｏｄ ｆｌｏｗ ａｎｄ ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ．２０１６；３６（５）：８６２−９０（非特許文献7），Ｎｚｏｕ Ｇ，Ｗｉｃｋｓ ＲＴ，Ｗｉｃｋｓ ＥＥ，Ｓｅａｌｅ ＳＡ，Ｓａｎｅ ＣＨ，Ｃｈｅｎ Ａ，ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ｒｅｐｏｒｔｓ．２０１８；８（１）：７４１３（非特許文献8））。創薬に関する、一次細胞の主たる欠点は、その限定的な寿命と利用可能性である（Ｅｇｌｅｎ Ｒ，Ｒｅｉｓｉｎｅ Ｔ．２０１１；９（２）：１０８−２４（非特許文献9））。多能性幹細胞は、あらゆる種類の成熟細胞型に分化する能力を有しており（Ｚｈｕ Ｚ，Ｈｕａｎｇｆｕ Ｄ．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，Ｅｎｇｌａｎｄ）．２０１３；１４０（４）：７０５−１７（非特許文献10））、これらは、血液脳バリアのモデリングのために用いられている（Ｌｉｐｐｍａｎｎ ＥＳ，Ａｚａｒｉｎ ＳＭ，Ｋａｙ ＪＥ，Ｎｅｓｓｌｅｒ ＲＡ，Ｗｉｌｓｏｎ ＨＫ，Ａｌ−Ａｈｍａｄ Ａ，ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．２０１２；３０（８）：７８３−９１（非特許文献11），Ｃａｎｆｉｅｌｄ ＳＧ，Ｓｔｅｂｂｉｎｓ ＭＪ，Ｍｏｒａｌｅｓ ＢＳ，Ａｓａｉ ＳＷ，Ｖａｔｉｎｅ ＧＤ，Ｓｖｅｎｄｓｅｎ ＣＮ，ｅｔ ａｌ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｎｅｕｒｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．２０１７；１４０（６）：８７４−８８（非特許文献12））。これらの公開されているモデルの主たる欠点は、これらが非常に洗練されており正確に再現することが困難であるということで、これらを創薬に適合させるのが困難になっている。

したがって、経内皮バリア一体性（ＴＢＩ）のロバストで有意義なモデル、並びに、高耐性インビトロＴＢＩを、健常及び疾患を有する状態において、ＢＲＢ及びＢＢＢを研究するためのモデルとして確立可能な、多量のＥＣを生成するのに好適な、対応する細胞培養法が依然として必要とされている。

本発明者らは以前に、ヒト多能性幹細胞を機能性内皮細胞に分化させる、簡便かつ拡張性のある６日間プロトコルを確立している（Ｐａｔｓｃｈ Ｃ，Ｃｈａｌｌｅｔ−Ｍｅｙｌａｎ Ｌ，Ｔｈｏｍａ ＥＣ，Ｕｒｉｃｈ Ｅ，Ｈｅｃｋｅｌ Ｔ，Ｏ’Ｓｕｌｌｉｖａｎ ＪＦ，ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ ｃｅｌｌ ｂｉｏｌｏｇｙ．２０１５；１７（８）：９９４−１００３（非特許文献13））。

本明細書において、本発明者らは、新規の経路を発見し、特に、薬剤スクリーニング及び／又は開発状況において、内皮細胞破壊による疾患の治療を標的にすることができる、高ＴＢＩの内皮細胞のインビトロモデルを生成した。

Ｅｎｇｅｌｈａｒｄｔ Ｂ，Ｌｉｅｂｎｅｒ Ｓ．Ｃｅｌｌ ａｎｄ ｔｉｓｓｕｅ ｒｅｓｅａｒｃｈ．２０１４；３５５（３）：６８７−９９ Ｄｉａｚ−Ｃｏｒａｎｇｕｅｚ Ｍ，Ｒａｍｏｓ Ｃ，Ａｎｔｏｎｅｔｔｉ ＤＡ．Ｖｉｓｉｏｎ ｒｅｓｅａｒｃｈ．２０１７；１３９：１２３−３７ Ｇｉｌｍｏｕｒ ＤＦ．Ｅｙｅ（Ｌｏｎｄｏｎ，Ｅｎｇｌａｎｄ）．２０１５；２９（１）：１−１４ Ｋｌａａｓｓｅｎ Ｉ，Ｖａｎ Ｎｏｏｒｄｅｎ ＣＪ，Ｓｃｈｌｉｎｇｅｍａｎｎ ＲＯ．Ｐｒｏｇｒｅｓｓ ｉｎ ｒｅｔｉｎａｌ ａｎｄ ｅｙｅ ｒｅｓｅａｒｃｈ．２０１３；３４：１９−４８ Ｚｈａｏ Ｚ，Ｎｅｌｓｏｎ ＡＲ，Ｂｅｔｓｈｏｌｔｚ Ｃ，Ｚｌｏｋｏｖｉｃ ＢＶ．Ｃｅｌｌ．２０１５；１６３（５）：１０６４−７８ Ｌｕｉｓｓｉｎｔ ＡＣ，Ａｒｔｕｓ Ｃ，Ｇｌａｃｉａｌ Ｆ，Ｇａｎｅｓｈａｍｏｏｒｔｈｙ Ｋ，Ｃｏｕｒａｕｄ ＰＯ．Ｆｌｕｉｄｓ ａｎｄ ｂａｒｒｉｅｒｓ ｏｆ ｔｈｅ ＣＮＳ．２０１２；９（１）：２３ Ｈｅｌｍｓ ＨＣ，Ａｂｂｏｔｔ ＮＪ，Ｂｕｒｅｋ Ｍ，Ｃｅｃｃｈｅｌｌｉ Ｒ，Ｃｏｕｒａｕｄ ＰＯ，Ｄｅｌｉ ＭＡ，ｅｔ ａｌ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｃｅｒｅｂｒａｌ ｂｌｏｏｄ ｆｌｏｗ ａｎｄ ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ．２０１６；３６（５）：８６２−９０ Ｎｚｏｕ Ｇ，Ｗｉｃｋｓ ＲＴ，Ｗｉｃｋｓ ＥＥ，Ｓｅａｌｅ ＳＡ，Ｓａｎｅ ＣＨ，Ｃｈｅｎ Ａ，ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ｒｅｐｏｒｔｓ．２０１８；８（１）：７４１３ Ｅｇｌｅｎ Ｒ，Ｒｅｉｓｉｎｅ Ｔ．２０１１；９（２）：１０８−２４ Ｚｈｕ Ｚ，Ｈｕａｎｇｆｕ Ｄ．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，Ｅｎｇｌａｎｄ）．２０１３；１４０（４）：７０５−１７ Ｌｉｐｐｍａｎｎ ＥＳ，Ａｚａｒｉｎ ＳＭ，Ｋａｙ ＪＥ，Ｎｅｓｓｌｅｒ ＲＡ，Ｗｉｌｓｏｎ ＨＫ，Ａｌ−Ａｈｍａｄ Ａ，ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．２０１２；３０（８）：７８３−９１ Ｃａｎｆｉｅｌｄ ＳＧ，Ｓｔｅｂｂｉｎｓ ＭＪ，Ｍｏｒａｌｅｓ ＢＳ，Ａｓａｉ ＳＷ，Ｖａｔｉｎｅ ＧＤ，Ｓｖｅｎｄｓｅｎ ＣＮ，ｅｔ ａｌ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｎｅｕｒｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．２０１７；１４０（６）：８７４−８８ Ｐａｔｓｃｈ Ｃ，Ｃｈａｌｌｅｔ−Ｍｅｙｌａｎ Ｌ，Ｔｈｏｍａ ＥＣ，Ｕｒｉｃｈ Ｅ，Ｈｅｃｋｅｌ Ｔ，Ｏ’Ｓｕｌｌｉｖａｎ ＪＦ，ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ ｃｅｌｌ ｂｉｏｌｏｇｙ．２０１５；１７（８）：９９４−１００３

ｉ）インビボ経内皮バリア一体性（ＴＢＩ）を強化させること、又は、ｉｉ）内皮細胞（ＥＣ）のインビボＴＢＩを低下させることが可能な薬剤候補を同定するための、インビトロ法であって、
ａ）タイトジャンクション遺伝子プロモーターの制御下においてレポーター遺伝子を含むＥＣを提供するステップであって、ＥＣがレポーター遺伝子を発現する細胞に関して濃縮されているステップと、
ｂ）ＥＣを薬剤候補と接触させるステップと、
ｃ）ＥＣを薬剤候補と接触させる前後にインビトロＴＢＩを測定するステップ、又は、薬剤候補と接触したＥＣのインビトロＴＢＩを測定し、並行して、薬剤候補と接触していないＥＣのインビトロＴＢＩを測定するステップと
を含み、
（ｉ）薬剤候補と接触していないＥＣのインビトロＴＢＩと比較してより高い、薬剤候補と接触したＥＣのインビトロＴＢＩが、ＥＣのインビボＴＢＩを強化可能な薬剤であることを示し、（ｉｉ）薬剤候補と接触していないＥＣのインビトロＴＢＩと比較してより低い、薬剤候補と接触したＥＣのインビトロＴＢＩが、ＥＣのインビボＴＢＩを低下可能な薬剤であることを示す、方法を本明細書において提供する。

一実施形態において、ステップｃ）は、経内皮電気抵抗（ＴＥＥＲ）を測定することを含み、測定したＴＥＥＲは、インビトロＴＢＩを示す。

一実施形態において、ステップｃ）は、レポーター遺伝子の発現を測定することを含み、レポーター遺伝子の発現は、インビトロＴＢＩを示す。

一実施形態において、タイトジャンクション遺伝子は、ＣＬＤＮ５、オクルディン（ＯＣＬＮ）、及びＭＡＲＶＥＬＤ３からなる群から選択され、特に、タイトジャンクション遺伝子はＣＬＤＮ５である。

一実施形態において、ＥＣは多能性幹細胞から分化しており、特に多能性幹細胞はヒト細胞である。

一実施形態において、多能性幹細胞は、血管合併症と関連する疾患を患う対象に由来する。

一実施形態において、レポーター遺伝子をコードするポリヌクレオチドは、タイトジャンクション遺伝子の３’末端に挿入され、特に、（ｉ）タイトジャンクション遺伝子レポーター遺伝子融合タンパク質が発現するか、又は（ｉｉ）レポーター遺伝子が内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）から発現するか、又は（ｉｉｉ）タイトジャンクション遺伝子レポーター遺伝子融合タンパク質が発現し、その後、個別のタイトジャンクションタンパク質及びレポータータンパク質へとプロセシングされる。

一実施形態において、自己切断ペプチドをコードするポリヌクレオチドは、タイトジャンクション遺伝子とレポーター遺伝子との間に導入され、特に、自己切断ペプチドは、Ｐ２Ａ自己切断ペプチドである。

一つの実施形態において、タイトジャンクション遺伝子のプロモーターの活性化により、レポーター遺伝子の発現がもたらされる。

一実施形態において、細胞は、ステップａ）において蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）又は磁気活性化細胞選別（ＭＡＣＳ）により、レポーター遺伝子を発現する細胞に関して濃縮される。

一実施形態において、本明細書で提供される方法は、ハイスループットフォーマットで実施される。

一実施形態において、本明細書で提供される方法は、薬剤開発状況において分子をスクリーニングするために、特に、薬剤候補化合物ライブラリーをハイスループットスクリーニングするために使用される。

一実施形態において、本明細書に記載する方法のステップ１）ａ）に従い作製した細胞培養液を提供し、タイトジャンクション遺伝子を発現する細胞の割合は、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、又は９５％を超える。

一実施形態において、レポーター遺伝子を発現可能な細胞を提供し、レポーター遺伝子の発現は、タイトジャンクション遺伝子のプロモーターの制御下にあり、ＣＬＤＮ５、オクルディン（ＯＣＬＮ）、及びＭＡＲＶＥＬＤ３からなる群から選択される。

一実施形態において、血管合併症と関連する疾患の治療で使用するための、２−［３−（６−メチル−２−ピリジニル）−１Ｈ−ピラゾール−４−イル］−１，５−ナフチリジン、又は４−［４−［３−（２−ピリジニル）−１Ｈ−ピラゾール−４−イル］−２−ピリジニル］−Ｎ−（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−４−イル）−ベンズアミドを提供する。

ＣＬＤＮ５転写レポーターのゲノム編集。ＣＬＤＮ５−Ｐ２Ａ−ＧＦＰレポーターを生成するための標的法の概略図。ｓｇＲＮＡを、ＣＬＤＮ５の終止コドンの近傍に設計しながら、ドナーベクターを生成して、ｐｉｇｇｙＢａｃ反転末端反復（ＩＴＲ）を有する各末端において、２つのホモロジーアーム（ＨＡ）が隣接する、プロモーター非含有のＰ２Ａ−ＧＦＰ配列を運搬した。（ＬＨＡ−左ホモロジ−アーム、ＲＨＡ−右ホモロジーアーム、ＰＵＲＯ−ピューロマイシン、ｔＴＫ−切頭チミジンキナーゼ）。標的化は２つのステップで実施される。まず、Ｃａｓ９及びｓｇＲＮＡにより引き起こされた二本鎖切断が、ＣＬＤＮ５とドナーテンプレートとの間で相同組み換えにより修復され、その後、耐性カセットが切除のみのｐｉｇｇｙｂａｃトランスポーゼースにより取り除かれる（図１ａ）。ドナーベクターの概略マップ（図１ｂ）。ゲノム編集及びピューロマイシン選択後の、ＰＣＲ及びゲル電気泳動による、レポーターの一体化成功の検出（細胞プールゲノム編集−ピューロマイシン選択（ＣＰＧＰ））（図１ｃ）。ＰＣＲ及びゲル電気泳動による耐性カセットの切除成功の検出（細胞プール切除（ＣＰＥ））（図１ｄ）。ＰＣＲ及びゲル電気泳動によるクローンの確認（図１ｅ）。陽性クローンの、ＣＬＤＮ５座位のサンガー配列（図１ｆ）。 図１ａの説明を参照されたい。 図１ａの説明を参照されたい。 図１ａの説明を参照されたい。 図１ａの説明を参照されたい。 図１ａの説明を参照されたい。 ＣＬＤＮ５レポーターを含む、幹細胞由来の内皮細胞の生成及び性質決定。ＣＬＤＮ５−ＧＦＰ ＥＣ由来のＥＣの蛍光活性化細胞選別による、ＷＴ及びＣＬＤＮ５−ＧＦＰレポーター株の、内皮細胞へのヒト多能性幹細胞分化（図２ａ）。リアルタイムで観察された、ＧＦＰ＋及びＧＦＰ−選別細胞の、電気的細胞−基質インピーダンスの感知（図２ｂ）。質量分析及びＲＮＡ−ｓｅｑにより測定した、あるクローンの表示値、有意に上方又は下方制御されたタンパク質のスピアマン相関、及びそれぞれのｍＲＮＡ（図２ｃ）。ＣＬＤＮ５に対する（図２ｄ）、ＯＣＬＮ、ＭＡＲＶＥＬＤ３、及びＰＥＣＡＭ１に対する（図２ｅ）、並びに、ＶＥＧＦＡレセプター２（ＫＤＲ）に対する（図２ｆ）、相対的ＲＮＡ及びタンパク質発現。柱は平均±ＳＤを示す。＊＊＝ｐ＜０．０１、＊＊＊＝ｐ＜０．００１ 図２ａの説明を参照されたい。 図２ａの説明を参照されたい。 図２ａの説明を参照されたい。 図２ａの説明を参照されたい。 図２ａの説明を参照されたい。 ＣＬＤＮ５−ＧＦＰ＋ＥＣは、高内皮細胞バリアの機能性応答を示す。ＧＦＰ＋細胞を５０ｎｇ／ｍＬのＶＥＧＦＡで刺激し、電気的細胞−基質インピーダンスをリアルタイムで測定した（図３ａ）。ＶＥＧＦＡ処理の２日後に、細胞の相対的ＧＦＰ＋の割合をＦＡＣＳで測定した（図３ｂ）。細胞を２日間、５μＭのＳＵ１１２４８で処理し、ＧＦＰ＋細胞の割合を測定し（図３ｃ）、インピーダンスをリアルタイムで測定し（図３ｄ）、ＦＩＴＣ−デキストラン透過性を測定した（図３ｅ）。柱は平均±ＳＤを示す。＊＝ｐ＜０．００１ 図３ａの説明を参照されたい。 図３ａの説明を参照されたい。 図３ａの説明を参照されたい。 図３ａの説明を参照されたい。 図３ａの説明を参照されたい。 ＥＣバリア耐性を誘発する化合物の同定。化合物ライブラリーを、複製したプレートで試験した。５μＭにて化合物を使用し、ＧＦＰ＋細胞の割合を、処理の２日後に測定した（図４）。ＤＭＳＯにて、ＧＦＰ＋細胞の割合の、平均２倍の誘発にて、いくつかの標的クラス（例えばＴＧＦＢＲ阻害剤）にマッピングした６２個の化合物を同定した。 経内皮バリア一体性（ＴＢＩ）の救助。ＶＥＧＦＡによる候補化合物の同時処理時の、インピーダンスリアルタイム測定。ＧＦＰ＋細胞を５０ｎｇ／ｍＬのＶＥＧＦＡでインキュベートし、電気的細胞−基板インピーダンスをリアルタイムで測定した（図５）。Ｒｅｐｓｏｘ（１０μＭ）は、ＶＥＧＦＡ処理により誘発されたＴＢＩの喪失を救助する。柱は平均±ＳＤを示す。 図５−１の説明を参照されたい。

本明細書で使用する場合、用語「合成培地」、又は「化学合成培地」とは、全ての個別の成分、及びそれぞれの濃度が既知である細胞培養培地を意味する。合成培地は、組み換え、及び化学合成成分を含有してよい。

本明細書で使用する場合、用語「分化している」、「分化」、及び「分化する」とは、さほど分化していない細胞を体細胞に転換する、例えば、多能性幹細胞をＥＣに転換する、１つ以上のステップを意味する。多能性幹細胞のＥＣへの分化は、本明細書に記載する方法により達成される。

本明細書で使用する場合、「内皮細胞」、略して「ＥＣ」は、特異的表面マーカーＣＤ１４４（分化クラスター１４４、カドヘリン５、２型、又は血管内皮（ＶＥ）カドヘリン、公式記号ＣＤＨ５としても知られている）を発現し、内皮細胞の特徴、即ち、毛管形成、並びに、ＣＤ３１（分化クラスター３１、公式記号ＰＥＣＡＭ１）、ｖＷＦ（フォン・ウィルブラント因子、公式記号ＶＷＦ）、ＣＤ３４（分化クラスター３４、公式記号ＣＤ３４）、ＣＤ１０５（分化クラスター１０５、公式記号ＥＮＧ）、ＣＤ１４６（分化クラスター３４、公式記号ＭＣＡＭ）、及びＶＥＧＦＲ−２（キナーゼ挿入ドメインレセプター（ＩＩＩ型受容体型チロシンキナーゼ）、公式記号ＫＤＲ）からなる群から選択される、１つ以上の更なる表面マーカーの発現を有する細胞である。

本明細書で使用する場合、「増殖培地」とは、単一層での増殖、及び内皮細胞の継代に有用な、任意の化学合成培地を意味する。

「融合した」とは、成分（例えばタイトジャンクション遺伝子及びレポーター遺伝子）が、直接、又は１つ以上のペプチドリンカーを介してのいずれかにより、ペプチド結合によって結合されていることを意味する。

本明細書で使用する場合、用語「ＧＷ７８８３８８」は、４−［４−［３−（２−ピリジニル）−１Ｈ−ピラゾール−４−イル］−２−ピリジニル］−Ｎ−（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−４−イル）−ベンズアミドを意味する。

本明細書で使用する場合、用語「増殖因子」とは、細胞増殖を引き起こす、生物学的に活性なポリペプチド又は低分子化合物を意味し、増殖因子及びそれらの類似体の両方を含む。

本明細書で使用する場合、「ハイスループットスクリーニング」とは、多数の異なる疾患モデル状態及び／又は化合物を、本明細書で記載される新規のアッセイにより、並行及び／又は連続して、分析及び比較可能であることを意味するものと理解されなければならない。典型的には、そのようなハイスループットスクリーニングは、複数ウェルのマイクロタイタープレートにて、例えば９６ウェルプレート、又は３８４ウェルプレート、又は１５３６若しくは３４５６ウェルを有するプレートにて実施される。

本明細書で使用する場合、「誘導培地」とは、単一層にて、プライム化細胞をＣＤ１４４陽性（ＣＤ１４４＋）内皮細胞に誘導するのに有用な、任意の化学合成培地を意味する。

「多能性細胞の単一層」とは、本明細書で使用する場合、多層膜中で細胞の固体塊が、接着性基質に結合した、様々な３次元フォーメーションを形成する細胞集塊又は胚様体を培養するのとは対照的に、多能性幹細胞が、１つの単一フィルム内で接着性基質に結合した単一細胞内で提供されることを意味する。

本明細書で使用する場合、「多能性培地」とは、多能性を維持しながら、単一層に単一細胞として多能性幹細胞を結合するのに有用な、任意の化学合成培地を意味する。有用な多能性培地は当該技術分野において周知であり、本明細書でもまた記載されている。本明細書に記載した特定の実施形態において、多能性培地は、以下の増殖因子：塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ、線維芽細胞増殖因子２、ＦＧＦ２としても示される）、及びトランスフォーミング増殖因子β（ＴＧＦβ）のうちの少なくとも１つを含有する。

本明細書で使用する場合、用語「リプログラミング」とは、体細胞をさほど分化していない細胞に転換するために、例えば、線維芽細胞、脂肪細胞、ケラチノサイト、又は白血球を多能性幹細胞に転換するために、必要な１つ以上のステップを意味する。「リプログラミング」細胞とは、本明細書に記載した体細胞をリプログラミングすることで由来される細胞を意味する。

本明細書で使用する場合、用語「Ｒｅｐｓｏｘ」とは、２−［３−（６−メチル−２−ピリジニル）−１Ｈ−ピラゾール−４−イル］−１，５−ナフチリジンを意味する。

本明細書で使用する場合、用語「低分子」、又は「小化合物」、又は「低分子化合物」とは、一般的に、１０，０００グラム／モル未満、所望により５，０００グラム／モル未満、及び所望により２，０００グラム／モル未満の分子量を有する、合成したか、又は自然で見いだされるかのいずれかである、有機又は無機分子を意味する。

本明細書で使用する場合、用語「体細胞」とは、生殖細胞系細胞（例えば、精子及び卵子、即ちそれらが作製される細胞（生殖母細胞））、並びに未分化幹細胞ではない、生命体の体を形成する任意の細胞を意味する。

本明細書で使用する場合、用語「幹細胞」とは、自己複製能を有する細胞を意味する。本明細書で使用する場合、「未分化幹細胞」とは、多様な範囲の細胞型に分化する能力を有する幹細胞を意味する。本明細書で使用する場合、「多能性幹細胞」とは、複数の細胞型の細胞を発生させることが可能な幹細胞を意味する。多能性幹細胞（ＰＳＣ）としては、ヒト胚幹細胞（ｈＥＳＣ）、及びヒト人工多能性幹細胞（ｈｉＰＳＣ）が挙げられる。ヒト人工多能性幹細胞は、例えば、当該技術分野において既知であり、更に本明細書で記載される方法によって、４つの定義された因子（Ｓｏｘ２、Ｏｃｔ４、Ｋｌｆ４、ｃ−Ｍｙｃ）を形質導入することより、リプログラミング体細胞から由来することができる。上記ヒト体細胞は、健常な個体から、又は患者から入手することができる。これらのドナー細胞は、任意の好適な源から入手することができる。本明細書においては、ヒトの体にて侵襲性手順を伴わずに、ドナー細胞の単離が可能な源、例えばヒトの皮膚細胞、血液細胞、又は尿サンプルから入手可能な細胞が好ましい。ヒト多能性幹細胞が好ましいものの、方法は、霊長類、げっ歯類（例えばラット、マウス、ウサギ）、及びイヌ多能性幹細胞などの、非ヒト多能性幹細胞にもまた適用可能である。

本明細書で使用する場合、用語「経内皮バリア一体性」、略して「ＴＢＩ」とは、インビトロ及びインビボでの、内皮細胞の機能的特徴を意味する。内皮細胞（ＥＣ）は、血管腔と周囲の組織との間で、半選択性バリアとして機能し、物質の通過、及び、白血球の、血流内外への移動を制御する。バリア機能の喪失、即ち、ＴＢＩの喪失は健常状態及び疾患状態にて観察される、例えば、傷の治癒、脈管化、及び慢性炎症は、一時的、又は永遠のＴＢＩ喪失と一致する。ＴＢＩは、本明細書に記載した、及び、当該技術分野において公知の、適切な条件下で産生したＥＣ（例えばＥＣ培養液）の単一層（例えば、短期間初代細胞培養物）によりインビトロでモデリングすることができる。ＴＢＩ、例えばインビトロＴＢＩは、（例えば、ＴＥＥＲ及びＦＩＴＣ−デキストラン透過性を測定する）当該技術分野において既知の方法により、並びに、本明細書に記載のとおりに測定することができる。本明細書で使用する場合、用語「インビトロＴＢＩ」とは、インビトロ内皮細胞培養液のＴＢＩを意味し、ＴＢＩは、培養液中の細胞単一層にまたがって、例えば、（古典的な２Ｄウェル培養設定における）単一層の下の培養血管表面と、細胞の単一層の上の細胞培養培地との間で、測定される。したがって、本明細書で使用する場合、用語「インビボＴＢＩ」とは、インビボでの内皮細胞のＴＢＩを意味し、ＴＢＩは、脈管腔と周囲組織との間で確立及び／又は測定（例えば計測）される。

驚くべきことに、タイトジャンクション遺伝子転写レポーターが、ＴＢＩのサロゲートマーカーとしての役割を果たすことができる、即ち、レポーター遺伝子の発現がＴＢＩに相関することを、本発明者らは発見した。更に、レポーター遺伝子の発現を使用して、インビトロで高ＴＢＩを確立可能な細胞を選択し、これを濃縮することができる。本明細書に記載した方法で作製した細胞培養物を使用して、本明細書で示すように、本明細書の薬剤候補に対するインビボ応答を予想することができる。コンセプトの証明として、レポーター遺伝子陽性細胞を、強力な血管透過性因子である血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦＡ）でインビボ処理すると、ＴＢＩの急激な喪失が観察され（図３ａ）、興味深いことに、レポーター遺伝子陽性細胞の減少が観察された。広範なチロシンキナーゼ受容体（ＳＵ１１２４８）阻害剤による処理によって、レポーター遺伝子陽性細胞の強化がもたらされ、ＶＥＧＦＡと共に、チロシンキナーゼ阻害剤によって細胞を同時処理することで、ＴＢＩの破壊が防止された（図３ｃ）。本明細書に記載したタイトジャンクション遺伝子転写レポーターが、ＥＣ ＴＢＩに対するサロゲートマーカーとして使用可能であることを、本データ、及び、本明細書で更に提供されるデータは示す。本明細書に記載したレポーター構築物、及び、このようなレポーター構築物を含む細胞がとりわけ、化学的ライブラリーをプロファイリングして、高内皮バリア一体性を誘発する、又は、バリア破壊の喪失を防止する方法に有用である。

したがって、ｉ）インビボ経内皮バリア一体性（ＴＢＩ）を強化させること、又は、ｉｉ）内皮細胞（ＥＣ）のインビボＴＢＩを低下させることが可能な薬剤候補を同定するための、インビトロ法であって、
ａ）タイトジャンクション遺伝子プロモーターの制御下においてレポーター遺伝子を含むＥＣを提供するステップであって、特に、ＥＣがレポーター遺伝子を発現する細胞に関して濃縮されているステップと、
ｂ）ＥＣを薬剤候補と接触させるステップと、
ｃ）ＥＣを薬剤候補と接触させる前後にインビトロＴＢＩを測定するステップ、又は、薬剤候補と接触したＥＣのインビトロＴＢＩを測定し、並行して、薬剤候補と接触していないＥＣのインビトロＴＢＩを測定するステップと
を含み、
（ｉ）薬剤候補と接触していないＥＣのインビトロＴＢＩと比較してより高い、薬剤候補と接触したＥＣのインビトロＴＢＩが、ＥＣのインビボＴＢＩを強化可能な薬剤であることを示し、（ｉｉ）薬剤候補と接触していないＥＣのインビトロＴＢＩと比較してより低い、薬剤候補と接触したＥＣのインビトロＴＢＩが、ＥＣのインビボＴＢＩを低下可能な薬剤であることを示す、方法を本明細書において提供する。

理論に束縛されるものではないが、本発明はとりわけ、ＴＢＩの細胞培養モデルを提供し、ＥＣのインビトロＴＢＩを評価して、内皮細胞のインビボＴＢＩにおける、薬剤候補の効果を確立及び／又は予想する。したがって、好適な薬剤候補を、本明細書で提供する方法に従い選択することができる。

驚くほど高いＴＢＩを有するＴＢＩモデルを本明細書において提供し、ＥＣは、タイトジャンクション遺伝子プロモーターの制御下にてレポーター遺伝子を含み、レポーター遺伝子は、タイトジャンクション遺伝子プロモーターの活性に、作用可能に結合する。

本明細書で使用する場合、「タイトジャンクション遺伝子プロモーター」とは、タイトジャンクション遺伝子に作用可能に結合した遺伝子プロモーターを意味する。タイトジャンクション遺伝子プロモーターの活性化により、関連するタイトジャンクション遺伝子の発現（転写及び翻訳）がもたらされる。したがって、例えば、レポーター遺伝子をコードするＤＮＡのタイトジャンクション遺伝子座位への挿入、又は、レポーター遺伝子をコードするＤＮＡの、タイトジャンクション遺伝子をコードするＤＮＡ配列との融合による、レポーター遺伝子の、タイトジャンクション遺伝子プロモーターとの作用可能な結合により、タイトジャンクション遺伝子プロモーターの活性化の際の、レポーター遺伝子の発現がもたらされる。レポーターを遺伝子座位に挿入する方法、及び／又は、レポーター遺伝子をプロモーターと作用可能に結合する方法は、当技術分野において既知であり、本明細書でも記載されている。

本明細書で使用する場合、「レポーター遺伝子」は、発現をアッセイすることができる遺伝子を意味する。好ましい一実施形態において、レポーター遺伝子は、タンパク質をコードする遺伝子であり、その産生及び検出が、報告されるべきタイトジャンクションプロモーターの活性を（間接的に）検出するためのサロゲートとして使用される。好適なレポーター遺伝子は、当該技術分野において公知であり、例えば、固有の蛍光を有するタンパク質（例えば蛍光タンパク質）が挙げられる。このようなタンパク質の発現は、レポーター遺伝子を発現可能な細胞（例えばＥＣ培養液）からの蛍光シグナルを測定することにより、（例えばリアルタイムで）便利に検出又は監視することができる。この目標に向かい、本明細書に記載した方法は、レポーター遺伝子の発現レベルを測定することを含み、レポーター遺伝子の発現レベルは、タイトジャンクション遺伝子の発現を示し、そのために、ＴＢＩ用のサロゲートマーカーとして使用される。好ましい一実施形態では、レポーター遺伝子の発現は蛍光を測定することにより決定され、蛍光（例えばＧＦＰ蛍光）のレベルは、ＴＢＩを示す。

「内在性蛍光を有するタンパク質」という用語は、スペクトル特性又は物理的特性の変化を呈する野生型蛍光タンパク質及び変異体を含む。本用語は、タンパク質内の非修飾のチロシン基、トリプトファン基、ヒスチジン基及びフェニルアラニン基の蛍光寄与にのみ起因する弱い蛍光を呈するタンパク質を含まない。内在性蛍光を有するタンパク質は、当技術分野で公知であり、例えば、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）、青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ、Ｈｅｉｍ ｅｔ ａｌ．１９９４，１９９６）、ＣＦＰとしても公知のシアン蛍光変異形（Ｈｅｉｍ ｅｔ ａｌ．１９９６、Ｔｓｉｅｎ １９９８）、ＹＦＰとしても公知の黄色蛍光変異形（Ｏｒｍｏ ｅｔ ａｌ．１９９６、Ｗａｃｈｔｅｒ ｅｔ ａｌ．１９９８）、サファイアとして公知の紫色励起性緑色蛍光変異形（Ｔｓｉｅｎ １９９８、Ｚａｐａｔａ−Ｈｏｍｍｅｒ ｅｔ ａｌ．２００３）、及び高感度緑色蛍光タンパク質又はＥＧＦＰとして公知のシアン励起性緑色蛍光変異形（Ｙａｎｇ ｅｔ ａｌ．１９９６）である。しかし、触媒活性を検出可能な酵素もまた想到される。このような酵素の非限定例としては、ルシフェラーゼ、βガラクトシダーゼ、アルカリホスファターゼがある。ルシフェラーゼとは、分子量（ＭＷ）が６１ｋＤａの単量体酵素である。ルシフェラーゼは、触媒因子として作用し、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）及びＭｇ２＋の存在下でＤ−ルシフェリンをルシフェニルアデニラートへ転化することができる。加えて、ピロリン酸（ＰＰｉ）及びアデノシン一リン酸（ＡＭＰ）は、副産物として生じる。次に、中間体であるルシフェリルアデニラートは、オキシルシフェリン、二酸化炭素（ＣＯ２）及び光へ酸化される。オキシルシフェリンとは、反応から放出された光によって照度計に置いて定量的に測定することができる生物発光産物である。ルシフェラーゼレポーターアッセイは、市販されており、当技術分野で公知であり、例えば、ルシフェラーゼ１０００アッセイシステム及びＯＮＥ−Ｇｌｏ（商標）ルシフェラーゼアッセイシステムである。

本発明の例示的実施形態において、コンセプトの証明として、レポーター遺伝子ＧＦＰがＣＬＤＮ５遺伝子の３’末端に挿入される、ＣＬＤＮ５転写レポーターを提供する。レポーター遺伝子は、高バリア機能、即ちＴＢＩの内皮細胞のサロゲートマーカーとしての役割を果たす（図１ａを参照）。レポーターｈＰＳＣ株がＥＣに分化することができ、例えば、２０％の、ＥＣのＧＦＰ＋集団が生成される。細胞は更に、本明細書に記載するようにＧＦＰ＋及びＧＦＰ−集団に分類したＦＡＣＳであることができ、ここでは、ＧＦＰ＋ＥＣのバリア耐性の有意な強化が、ＧＦＰ−ＥＣと比較して観察される（図２ａ及び２ｂを参照）。

本明細書に記載されるように、レポーター遺伝子の発現は、タイトジャンクションタンパク質の発現に作用可能に結合する。本発明の例示的実施形態において、コンセプトの証明として、ＣＬＤＮ５遺伝子レポーターが融合タンパク質として発現した後、個別のタイトジャンクションタンパク質及びレポータータンパク質へとプロセシングされる、ＣＬＤＮ５転写レポーターを提供する。個別のタンパク質へのプロセシングは、タイトジャンクション遺伝子、例えばＣＬＤＮ５が、結合したレポーターポリペプチドによって、相互作用の潜在的な妨害又は崩壊なく、その細胞機能を発揮するという利点を有する。したがって、本発明の好ましい実施形態において、タイトジャンクション遺伝子レポーター遺伝子融合タンパク質が発現し、その後、個々別々のタンパク質へとプロセシングされる。後のこのプロセシングは例えば、タイトジャンクション遺伝子とレポーター遺伝子との間に自己切断ペプチドを導入することにより成し遂げることができる。

しかし、当技術分野において既知の他のシステムもまた、好ましくは同じ遺伝子座位からのレポーター遺伝子及びタイトジャンクション遺伝子を発現するのに有用であり、例えば、内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）を当該技術分野において使用し、１つのプロモーターから２つのタンパク質を発現する。

したがって、本明細書に記載した方法は、ＥＣ集団の生成を、高発現の（ａ）タイトジャンクション遺伝子と、（ａ）タイトジャンクション遺伝子の発現度合いを評価するためのレポーター機能と共に組み合わせて、高ＴＢＩを有する細胞培養モデルを確立する。これは特に、ハイスループットスクリーニング、例えば薬剤試験、薬剤に応答する組織バリア機能の評価のために、標準化細胞培養液を確立するのに有用である。レポーター遺伝子、例えばＧＦＰの測定値を使用して、スクリーニングのために、及びその後、それ自体のスクリーニングプロセス中の読み出し（評価可能なシグナル）として、細胞培養系を確立することができる。理論に束縛されるものではないが、導入されたレポーター遺伝子がサロゲートマーカーである、タイトジャンクション遺伝子の発現は、バリア機能、例えばＴＢＩの一体性又は破壊を示す。

本発明の別のバリエーションにおいて、ＴＢＩは当該技術分野において既知の方法により直接測定される。本発明のそのような実施形態において、レポーター遺伝子を主に、又は優先して使用して、タイトジャンクション遺伝子が高く発現する細胞に関してＥＣ集団を濃縮することができる。得られた濃縮細胞集団をその後使用して、ＴＢＩの細胞培養モデルを確立することができる。薬剤候補の適用前後の測定は、バリア機能、例えば、当該技術分野において周知であるように、経内皮電気抵抗若しくはＦＩＴＣデキストラン可動性、又は、バリア一体性若しくは破壊の他の測定値を直接評価する方法により達成される。したがって、特定の一実施形態において、ステップｃ）が、経内皮電気抵抗（ＴＥＥＲ）を測定することを含み、測定したＴＥＥＲがＴＢＩを示す、本明細書に記載した方法を提供する。ハイスループットモードでＴＥＥＲを測定可能なシステムは、例えば、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ製の、ＥＣＩＳ Ｚ−ゼータシステムであり、これは、９６ウェルアレイプレートを使用して、薬剤スクリーニング設定においてＴＥＥＲを確立することができる。

本明細書に記載されるように、レポーター遺伝子は、好ましくは、レポーター遺伝子をタイトジャンクション遺伝子の遺伝子座位に組み込むことにより、タイトジャンクション遺伝子プロモーターに作用可能に結合する。具体的には、遺伝子編集、例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９遺伝子編集システムを使用することにより、レポーター遺伝子をＥＣのゲノムに組み込むことができる。タイトジャンクション遺伝子は、当技術分野において既知であり、高耐性バリア機能を確立するか、又は高耐性バリア機能を確立できないＥＣ集団における発現パターンに従い、更に選択することができる。バリア機能は、本明細書に記載するとおりに測定することができる。本発明の特定の実施形態において、タイトジャンクション遺伝子は、ＣＬＤＮ５、オクルディン（ＯＣＬＮ）、及びＭＡＲＶＥＬＤ３からなる群から選択され、特に、タイトジャンクション遺伝子はＣＬＤＮ５である。

本発明の方法のステップａ）で提供するＥＣは、当該技術分野において公知の手順に従い、インビトロで作製することができる。多能性幹細胞由来のＥＣが、本発明の目的のために特に有用である。多能性幹細胞は自己複製性を有し、成熟した哺乳類の体の、あらゆる主要な細胞型に分化することができる。多能性幹細胞は、標準化した細胞培養条件にて多量に産生することが可能であるため、本発明の方法のために特に有用である。したがって、好ましくは、ＥＣは多能性幹細胞から分化する。一実施形態において、ＥＣは胚幹細胞から分化する。別の実施形態において、ＥＣは人工多能性幹細胞（ＩＰＳＣ）から分化する。一実施形態において、ＩＰＳＣはリプログラミング体細胞から生成される。体細胞をＩＰＳＣにリプログラミングすることは、ＩＰＳＣの性質の維持に関与する特定の遺伝子を導入することにより達成することができる。体細胞のＩＰＳＣへのリプログラミングに好適な遺伝子としては、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、及びＣ−Ｍｙｃ、並びにこれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。一実施形態において、リプログラミングのための遺伝子はＯｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、及びＣ−Ｍｙｃである。体細胞をＮＰＣに分化転換するための遺伝子の組み合わせは、参照により本明細書に含まれている、国際公開第２０１２／０２２７２５号に記載されている。

内部器官、皮膚、骨、血液、及び結合組織は全て、体細胞から作製される。ＩＰＳＣを作成するのに使用した体細胞としては、線維芽細胞、脂肪細胞、及びケラチノサイトが挙げられるが、これらに限定されず、皮膚生検から入手することができる。他の好適な体細胞は、白血球、血液サンプルから入手した赤芽球細胞、又は、血液若しくは尿サンプルから入手し、当該技術分野において既知の方法により、及び本明細書に記載したとおりに、ＩＰＳＣにリプログラミングした、上皮細胞若しくはその他の細胞である。体細胞は、健常な個体から、又は疾患を有する個体から入手することができる。一実施形態において、体細胞は、疾患を患う対象（例えばヒト対象）に由来する。一実施形態において、疾患は、血管合併症と関連している（例えば、糖尿病性網膜症及び／又はウェット型ＡＭＤと関連した血管合併症に類似する、又はこれと同一である）。本明細書に記載したリプログラミングのための遺伝子を、当該技術分野において既知の方法により、リプログラミングベクターによる細胞への送達、又は、低分子による上記遺伝子の活性化、のいずれかにより、体細胞に導入する。リプログラミングの方法はとりわけ、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、プラスミド及びトランスポゾン、マイクロＲＮＡ、低分子、修飾ＲＮＡ、メッセンジャーＲＮＡ、及び組み換えタンパク質を含む。一実施形態において、本明細書に記載した遺伝子の送達のためにレンチウイルスを使用する。別の実施形態において、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、及びＣ−Ｍｙｃを、センダイウイルス粒子を用いて体細胞に送達する。加えて、体細胞を、少なくとも１種の低分子の存在下にて培養することができる。一実施形態において、上記低分子は、プロテインキナーゼの、Ｒｈｏ関連コイルドコイル形成プロテインセリン／スレオニンキナーゼ（ＲＯＣＫ）ファミリーの阻害剤を含む。ＲＯＣＫ阻害剤の非限定例としては、ファスジル（１−（５−イソキノリンスルホニル）ホモピペラジン）、チアゾビビン（Ｎ−ベンジル−２−（ピリミジン−４−イルアミノ）チアゾール−４−カルボキサミド）、及びＹ−２７６３２（（＋）−（Ｒ）−ｔｒａｎｓ−４−（１−アミノエチル）−Ｎ−（４−ピリジル）シクロ−ヘキサンカルボキサミドジヒドロクロリド）が含まれる。

多能性幹細胞の定義された単一層を提供することは、得られる培養液の再現性及び効率のために好ましい。一実施形態において、多能性幹細胞の単一層は、酵素により、細胞を単一細胞に解離させ、これらを接着性基質、例えばプレコートしたマトリゲルプレート（例えば、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅから認定されたＢＤ Ｍａｔｒｉｇｅｌ ｈＥＳＣ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから認定されたＧｅｌｔｒｅｘ ｈＥＳＣ、Ｃｏｒｎｉｎｇ製のＳｙｎｔｈｅｍａｘ）にもたらすことにより作製することができる。単一細胞への解離に好適な酵素の例としては、アキュターゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、トリプシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ＴｒｙｐＬｅ Ｅｘｐｒｅｓｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）が挙げられる。一実施形態において、１ｃｍ２当たり２００００〜６００００個の細胞を、接着性基質上でプレーティングする。本明細書で使用する培地は、単一層内で単一細胞として、多能性幹細胞を結合及び増殖させるのを促進する、多能性培地である。一実施形態において、多能性培地は、プロテインキナーゼの、Ｒｈｏ関連コイルドコイル形成プロテインセリン／スレオニンキナーゼ（ＲＯＣＫ）の低分子阻害剤（本明細書において、ＲＯＣＫキナーゼ阻害剤と呼ばれる）を補充した、無血清培地である。

したがって、一実施形態において、上記方法のステップａ）は、多能性幹細胞の単一層を多能性培地に提供することを含み、上記多能性培地は、ＲＯＣＫキナーゼ阻害剤を補充した、無血清培地である。

多能性幹細胞の基質への結合に好適な無血清培地の例は、Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ製のｍＴｅＳＲ１又はＴｅＳＲ２、ＲｅｐｒｏＣＥＬＬ製のＰｒｉｍａｔｅ ＥＳ／ｉＰＳ細胞培地、及び、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製のＳｔｅｍＰｒｏ ｈＥＳＣ ＳＦＭ、Ｌｏｎｚａ製のＸ−ＶＩＶＯである。本明細書で有用なＲＯＣＫキナーゼ阻害剤の例は、ファスジル（１−（５−イソキノリンスルホニル）ホモピペラジン）、チアゾビビン（Ｎ−ベンジル−２−（ピリミジン−４−イルアミノ）チアゾール−４−カルボキサミド）、及び、Ｙ２７６３２（（＋）−（Ｒ）−ｔｒａｎｓ−４−（１−アミノエチル）−Ｎ−（４−ピリジル）シクロヘキサンカルボキサミドジヒドロクロリド、例えば、カタログ番号：Ｔｏｃｒｉｓｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ製の１２５４）である。一実施形態において、多能性培地は、２〜２０μＭのＹ２７６３２、好ましくは５〜１０μＭのＹ２７６３２を補充した無血清培地である。別の実施形態において、多能性培地は、２〜２０μＭのファスジルを補充した無血清培地である。別の実施形態において、多能性培地は、０．２〜１０μＭのチアゾビビンを補充した無血清培地である。

一実施形態において、上記方法のステップａ）は、多能性幹細胞の単一層を多能性培地に提供すること、及び、上記単一層を多能性培地にて１日（２４時間）増殖させることを含む。別の実施形態において、上記方法のステップａ）は、多能性幹細胞の単一層を多能性培地に提供すること、及び、上記単一層を多能性培地で１８時間〜３０時間、好ましくは２３〜２５時間増殖させることを含む。

別の実施形態において、上記方法のステップａ）は、多能性幹細胞の単一層を、ＲＯＣＫキナーゼ阻害剤を補充した無血清培地である多能性培地に提供すること、及び、上記単一層を多能性培地にて１日（２４時間）増殖させることを含む。別の実施形態において、上記方法のステップａ）は、多能性幹細胞の単一層を、ＲＯＣＫキナーゼ阻害剤を補充した無血清培地である多能性培地に提供すること、及び、上記単一層を多能性培地で１８時間〜３０時間、好ましくは２３〜２５時間増殖させることを含む。

一実施形態において、細胞をプライミング培地と接触させて、分化を誘発する。一実施形態において、細胞を、βカテニン及び／又はＷｎｔシグナル伝達及び／又はヘッジホッグ（ＨＨ）シグナル伝達を活性化する低分子を補充したプライミング培地と接触させ、プライミングした細胞を誘導培地でインキュベートすることにより、分化を誘発する。一実施形態において、βカテニン及び／又はＷｎｔシグナル伝達及び／又はヘッジホッグ（ＨＨ）シグナル伝達を活性化する低分子は、グリコーゲンシンターゼキナーゼ３（Ｇｓｋ３ａ−ｂ）の低分子阻害剤、ＣＤＣ様キナーゼ１（Ｃｌｋ１−２−４）の低分子阻害剤、マイトジェン活性化タンパク質キナーゼ１５（Ｍａｐｋ１５）の低分子阻害剤、二重特異性チロシン−（Ｙ）−リン酸化制御キナーゼ（Ｄｙｒｋ１ａ−ｂ ４）の低分子阻害剤、サイクリン依存性キナーゼ１６（Ｐｃｔｋ１−３ ４）の低分子阻害剤、βカテニン（又はγカテニン）のスムーズンド（ＳＭＯ）活性化因子及び制御因子、並びに、同時活性因子タンパク質ＣＢＰ（ＣＲＥＢ結合タンパク質）及びｐ３００（Ｅ１Ａ結合タンパク質ｐ３００）の群から選択される。

好ましくは、上記グリコーゲンシンターゼキナーゼ３（Ｇｓｋ３ａ−ｂ）阻害剤は、ピロリジンジオン系ＧＳＫ３阻害剤である。本明細書で使用する場合、「ピロリジンジオン系ＧＳＫ３阻害剤」は、低いＩＣ_５０値を有する、ＧＳＫ３α及びＧＳＫ３βの、選択的細胞透過性ＡＴＰ競合阻害剤に関する。一実施形態において、ピロリジンジオン系ＧＳＫ３阻害剤は、ＳＢ２１６７６３（３−（２，４−ジクロロフェニル）−４−（１−メチル−１Ｈ−インドール−３−イル）−１Ｈ−ピロール−２、５−ジオン）、ＳＢ４１５２８６（３−［（３−クロロ−４−ヒドロキシフェニル）アミノ］−４−（２−ニトロフェニル）−１Ｈ−ピロール−２，５−ジオン）、Ｎ^６−｛２−［４−（２，４−ジクロロ−フェニル）−５−イミダゾール−１−イル−ピリミジン−２−イルアミノ］−エチル｝−３−ニトロ−ピリジン−２，６−ジアミン２ＨＣｌ、３−イミダゾ［１，２−ａ］ピリジン−３−イル−４−［２−（モルホリン−４−カルボニル）−１，２，３，４−テトラヒドロ−［１，４］ジアゼピノ［６，７，１−ｈｉ］インドール−７−イル］−ピロール−２，５−ジオン、ケンパウロン（９−ブロモ−７，１２−ジヒドロ−インドロ［３，２−ｄ］［１］ベンズアゼピン−６（５Ｈ）−オン）、ＣＨＩＲ９９０２１（９−ブロモ−７，１２−ジヒドロ−ピリド［３’，２’：２，３］アゼピノ［４，５−ｂ］インドール−６（５Ｈ）−オン）、及び３−（３−アミノ−フェニル）−４−（１−メチル−１Ｈ−インドール−３−イル）−ピロール−２，５−ジオン（ＣＰ２１Ｒ７、本明細書では「化合物２１」とも呼ばれる；例えばＬ．Ｇｏｎｇ ｅｔ ａｌ；Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ＆Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｌｅｔｔｅｒｓ ２０（２０１０），１６９３−１６９６を参照）からなる群から選択される。好ましい実施形態では、上記ピロリジンジオン系ＧＳＫ３阻害剤はＣＰ２１Ｒ７である。

一実施形態において、上記ＣＤＣ様キナーゼ１（Ｃｌｋ１−２−４）阻害剤は、ベンゾチアゾール、及び３−フルオロ−Ｎ−［１−イソプロピル−６−（１−メチル−ピペリジン−４−イルオキシ）−１，３−ジヒドロ−ベンゾイミダゾール−（２Ｅ）−イリデン］−５−（４−メチル−１Ｈ−ピラゾール−３−スルホニル）−ベンズアミドを含む群から選択される。

一実施形態において、上記マイトジェン活性化タンパク質キナーゼ１５（Ｍａｐｋ１５）阻害剤は、４−（４−フルオロフェニル）−２−（４−メチルスルフィニルフェニル）−５−（４−ピリジル）−１Ｈ−イミダゾール（ＳＢ２０３５８０）、及び５−イソキノリンスルホンアミド（Ｈ−８９）を含む群から選択される。

一実施形態において、上記二重特異性チロシン−（Ｙ）−リン酸化反応制御キナーゼ（Ｄｙｒｋ１ａ−ｂ ４）阻害剤は、６−［２−アミノ−４−オキソ−４Ｈ−チアゾール−（５Ｚ）−イリデンメチル］−４−（テトラヒドロ−ピラン−４−イルオキシ）−キノリン−３−カルボニトリルを含む群から選択される。

一実施形態において、上記スムーズ化活性化因子はプルモルファミン（２−（１−ナフトキシ）−６−（４−モルホリノアニリノ）−９−シクロヘキシルプリン）である。

βカテニン（又はγカテニン）と、同時活性化因子タンパク質ＣＢＰ（ＣＲＥＢ結合タンパク質）及びｐ３００（Ｅ１Ａ結合タンパク質ｐ３００）との相互作用の制御因子の例は、ＩＱ−１（２−（４−アセチル−フェニルアゾ）−２−［３，３−ジメチル−３，４−ジヒドロ−２Ｈ−イソキノリン−（１Ｅ）−イリデン］−アセトアミド、及びＩＣＧ−００１（（６Ｓ、９ａＳ）−６−（４−ヒドロキシ−ベンジル）−８−ナフタレン−１−イルメチル−４，７−ジオキソ−ヘキサヒドロ−ピラジノ［１，２−ａ］ピリミジン−１−カルボン酸ベンジルアミド（国際公開第２００７０５６５９３号）である。

一実施形態において、プライミング培地に、トランスフォーミング増殖因子β（ＴＧＦβ）の低分子阻害剤を補充する。一実施形態において、ＴＧＦβの低分子阻害剤はＳＢ４３１５４２である。

一実施形態において、上記方法のステップａ）は、上記細胞をプライミング培地で、約２〜約４日間（約４８時間〜約９６時間）インキュベートすることを含む。一実施形態において、上記方法のステップａ）は、上記細胞をプライミング培地で、約３日間（約７２時間）インキュベートすることを含む。

一実施形態において、上記プライミング培地は、インスリン、トランスフェリン、及びプロゲステロンを補充した無血清培地である。一実施形態において、上記無血清培地に、１０〜５０μｇ／ｍＬのインスリン、１０〜１００μｇ／ｍＬのトランスフェリン、及び１０〜５０ｎＭのプロゲステロン、好ましくは３０〜５０μｇ／ｍＬのインスリン、２０〜５０μｇ／ｍＬのトランスフェリン、及び１０〜３０ｎＭのプロゲステロンを補充する。プライミングに好適な無血清培地の例は、Ｎ２Ｂ２７培地（Ｎ２Ｂ２７は、Ｎ２及びＢ２７（共にＧｉｂｃｏ製）を補充した、ＤＭＥＭ／Ｆ１２（Ｇｉｂｃｏ，Ｐａｉｓｌｅｙ，ＵＫ）の１：１混合物である）、Ｎ３培地（ＤＭＥＭ／Ｆ１２（Ｇｉｂｃｏ，Ｐａｉｓｌｅｙ，ＵＫ）、２５μｇ／ｍＬのインスリン、５０μｇ／ｍＬのトランスフェリン、３０ｎＭの亜セレン酸ナトリウム、２０ｎＭのプロゲステロン、１００ｎＭのプトレシン（Ｓｉｇｍａ））、又は、ＮｅｕｒｏＣｕｌｔ（登録商標）ＮＳ−Ａ増殖培地（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）である。一実施形態において、上記プライミング培地は、インスリン、トランスフェリン、プロゲステロン、並びに、βカテニン（カドヘリン関連タンパク質、β１；ヒト遺伝子名ＣＴＮＮＢ１）経路、及び／又はＷｎｔ受容体シグナリング経路、及び／又はヘッジホッグ（ＨＨ）シグナル伝達経路を活性化する低分子を補充した無血清培地である。上記低分子は、３−（２，４−ジクロロフェニル）−４−（１−メチル−１Ｈ−インドール−３−イル）−１Ｈ−ピロール−２、５−ジオン（ＳＢ２１６７６３）、３−［（３−クロロ−４−ヒドロキシフェニル）アミノ］−４−（２−ニトロフェニル）−１Ｈ−ピロール−２，５−ジオン（ＳＢ４１５２８６）、Ｎ^６−｛２−［４−（２，４−ジクロロ−フェニル）−５−イミダゾール−１−イル−ピリミジン−２−イルアミノ］−エチル｝−３−ニトロ−ピリジン−２，６−ジアミン２ＨＣｌ、３−イミダゾ［１，２−ａ］ピリジン−３−イル−４−［２−（モルホリン−４−カルボニル）−１，２，３，４−テトラヒドロ−［１，４］ジアゼピノ［６，７，１−ｈｉ］インドール−７−イル］−ピロール−２，５−ジオン、９−ブロモ−７，１２−ジヒドロ−インドロ［３，２−ｄ］［１］ベンズアゼピン−６（５Ｈ）−オン（ケンパウロン）、９−ブロモ−７，１２−ジヒドロ−ピリド［３’，２’：２，３］アゼピノ［４，５−ｂ］インドール−６（５Ｈ）−オン（ＣＨＩＲ９９０２１）、３−（３−アミノ−フェニル）−４−（１−メチル−１Ｈ−インドール−３−イル）−ピロール−２，５−ジオン（ＣＰ２１Ｒ７、本明細書では「化合物２１」とも呼ばれる）、ベンゾチアゾール、３−フルオロ−Ｎ−［１−イソプロピル−６−（１−メチル−ピペリジン−４−イルオキシ）−１，３−ジヒドロ−ベンゾイミダゾール−（２Ｅ）−イリデン］−５−（４−メチル−１Ｈ−ピラゾール−３−スルホニル）−ベンズアミド、４−（４−フルオロフェニル）−２−（４−メチルスルフィニルフェニル）−５−（４−ピリジル）−１Ｈ−イミダゾール（ＳＢ２０３５８０）、５−イソキノリンスルホンアミド（Ｈ−８９）、６−［２−アミノ−４−オキソ−４Ｈ−チアゾール−（５Ｚ）−イリデンメチル］−４−（テトラヒドロ−ピラン−４−イルオキシ）−キノリン−３−カルボニトリル、２−（１−ナフトキシ）−６−（４−モルホリノアニリノ）−９−シクロヘキシルプリン（プルモルファミン）、２−（４−アセチル−フェニルアゾ）−２−［３，３−ジメチル−３，４−ジヒドロ−２Ｈ−イソキノリン−（１Ｅ）−イリデン］−アセトアミド（ＩＱ−１）、及びＩＣＧ−００１（（６Ｓ，９ａＳ）−６−（４−ヒドロキシ−ベンジル）−８−ナフタレン−１−イルメチル−４，７−ジオキソ−ヘキサヒドロ−ピラジノ［１，２−ａ］ピリミジン−１−カルボン酸ベンジルアミドを含む群から選択されるのが好ましい。

別の実施形態において、上記方法のステップａ）は、上記細胞をプライミング培地でインキュベートすることを含み、上記プライミング培地は、ＣＰ２１Ｒ７（３−（３−アミノ−フェニル）−４−（１−メチル−１Ｈ−インドール−３−イル）−ピロール−２，５−ジオン）を補充した無血清培地である。上記プライミング培地は、好ましくは０．５〜４μＭのＣＰ２１Ｒ７（３−（３−アミノ−フェニル）−４−（１−メチル−１Ｈ−インドール−３−イル）−ピロール−２，５−ジオン）が補充され、最も好ましくは１〜２μＭのＣＰ２１Ｒ７（３−（３−アミノ−フェニル）−４−（１−メチル−１Ｈ−インドール−３−イル）−ピロール−２，５−ジオン）が補充される。別の実施形態において、上記方法のステップａ）は、上記細胞をプライミング培地でインキュベートすることと、上記細胞を２〜４日間（４８時間〜９６時間）増殖させることと、を含み、上記プライミング培地は、ＣＰ２１Ｒ７（３−（３−アミノ−フェニル）−４−（１−メチル−１Ｈ−インドール−３−イル）−ピロール−２，５−ジオン）を補充した無血清培地である。別の実施形態において、上記方法のステップａ）は、上記細胞をプライミング培地でインキュベートすることと、上記細胞を３日間（７２時間）インキュベートすることと、を含み、上記プライミング培地は、ＣＰ２１Ｒ７（３−（３−アミノ−フェニル）−４−（１−メチル−１Ｈ−インドール−３−イル）−ピロール−２，５−ジオン）を補充した無血清培地である。

一実施形態において、プライミング培地は、１０〜５０μｇ／ｍＬのインスリン、１０〜１００μｇ／ｍＬのトランスフェリン、及び、０．５〜４μＭのＣＰ２１Ｒ７（３−（３−アミノ−フェニル）−４−（１−メチル−１Ｈ−インドール−３−イル）−ピロール−２，５−ジオン）を補充した１０〜５０μＭのプロゲステロンを含有する無血清培地である。

一実施形態において、プライミング培地は更に、組み換え骨形成タンパク質−４（ＢＭＰ４）を含む。好ましい一実施形態において、プライミング培地は、１０〜５０μｇ／ｍＬのインスリン、１０〜１００μｇ／ｍＬのトランスフェリン、及び、０．５〜４μＭのＣＰ２１Ｒ７（３−（３−アミノ−フェニル）−４−（１−メチル−１Ｈ−インドール−３−イル）−ピロール−２，５−ジオン）を補充した１０〜５０ｎＭのプロゲステロン、及び、１０〜５０ｎｇ／ｍＬの組み換え骨形成タンパク質−４（ＢＭＰ４）を含有する無血清培地である。

一実施形態において、細胞を誘導培地と接触させて、分化を進行させる。内皮細胞の組み換え誘導のために、上記誘導培地に、ＶＥＧＦ（＝血管内皮増殖因子）、又は胎盤様増殖因子１（ＰＬＧＦ−１）、及び低分子アデニル酸シクラーゼ活性化因子を補充する。一実施形態において、上記低分子アデニル酸シクラーゼ活性化因子は、ＰＫＡ／ＰＫＩシグナル伝達経路の活性化をもたらす。一実施形態において、上記低分子アデニラーゼ活性剤は、フォルスコリン（（３Ｒ）−（６ａアルファＨ）ドデカヒドロ−６β，１０α，１０ｂα−トリヒドロキシ−３β，４ａβ，７，７，１０ａβ−ペンタメチル−１−オキソ−３−ビニル−１Ｈ−ナフト［２，１−ｂ］ピラン−５ベータ−イルアセテート）、８−ブロモ−ｃＡＭＰ（８−ブロモアデノシン−３’，５’−環状モノホスフェート）、及びアドレノメデュリンを含む群から選択される。一実施形態において、上記誘導培地は、ヒト血清アルブミン、エタノールアミン、トランスフェリン、インスリン、及びハイドロコルチゾンを補充した無血清培地である。誘導に好適な無血清培地の例は、ＳｔｅｍＰｒｏ−３４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、主要成分；ヒト血清アルブミン、Ｈｕｍａｎ Ｅｘ−Ｃｙｔｅ（登録商標）などの脂質剤、及びエタノールアミン、若しくはこれらの混合物、ヒト亜鉛インスリン、ハイドロコルチゾン、鉄飽和移動２−メルカプトエタノール、並びにＤ，Ｌ−酢酸トコフェロール、又はこれらの誘導体若しくは混合物）、並びにＸ−ＶＩＶＯ１０及び１５（Ｌｏｎｚａ）である。

一実施形態において、上記誘導培地は、ヒト血清アルブミン、エタノールアミン、トランスフェリン、インスリン、及びハイドロコルチゾン、並びに１〜１０μＭのフォルスコリン、及び５〜１００ｎｇ／ｍＬのＶＥＧＦ−Ａを補充した無血清培地である。別の実施形態において、誘導培地は、ＶＥＧＦ−Ａ（３０〜７０ｎｇ／ｍＬ）、又は胎盤様増殖因子１（ＰＬＧＦ−１）（３０〜７０ｎｇ／ｍＬ）を補充したＳｔｅｍＰｒｏ−３４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製）を含む。

一実施形態において、上記方法のステップａ）は、ＶＥＧＦ−Ａ又は胎盤様増殖因子１（ＰＬＧＦ−１）、及び低分子アデニル酸シクラーゼ活性化因子を補充した誘導培地で上記プライミングした細胞をインキュベートすることにより、内皮細胞への分化を誘発することを含み、上記低分子アデニル酸シクラーゼ活性化因子は、フォルスコリン、８−ブロモ−ｃＡＭＰ、及びアドレノメデュリンの群から選択される。一実施形態において、誘導培地は、１〜１０μＭのフォルスコリン、及び５〜１００ｎｇ／ｍＬのＶＥＧＦ−Ａ、好ましくは２μＭのフォルスコリン、及び５０ｎｇ／ｍＬのＶＥＧＦ−Ａを補充した無血清培地である。

別の実施形態において、上記方法のステップａ）は、ＶＥＧＦ−Ａ又は胎盤様増殖因子１（ＰＬＧＦ−１）、及び低分子アデニル酸シクラーゼ活性化因子を補充した誘導培地で上記プライミングした細胞を１日インキュベートすることにより、内皮細胞への分化を誘発することを含む。

別の実施形態において、上記方法のステップａ）は、ＶＥＧＦ−Ａ又は胎盤様増殖因子１（ＰＬＧＦ−１）、及び低分子アデニル酸シクラーゼ活性化因子を補充した誘導培地で上記プライミングした細胞を、１８時間〜４８時間、好ましくは２２時間〜３６時間インキュベートすることにより、内皮細胞への分化を誘発することを含む。

一実施形態において、上記方法のステップａ）は、上記細胞を誘導培地で約１８時間〜約４８時間インキュベートすることを含む。一実施形態において、上記方法のステップａ）は、上記細胞を誘導培地で約２４時間インキュベートすることを含む。

プライミング及び誘導の後、ＥＣを更に拡大し、多量の細胞を作製することができる。したがって、更なる実施形態において、上記本発明の方法は更に、内皮細胞の増殖に好適な条件下にて、ステップａ）の生成物をインキュベートすることを含む。内皮細胞の増殖に好適な上記条件は、レポーター遺伝子（例えばＧＦＰ）に対して陽性な細胞を回収することと、これらを、化学合成拡大培地で拡大することと、を含むのが好ましい。本明細書で使用する場合、「回収すること」とは、接着性基質からの、酵素による細胞の解離、及びその後の、新規の培地での再懸濁に関する。好ましい一実施形態では、細胞を、本明細書に記載するように回収した後でソートする。一実施形態において、上記拡大培地は、ＶＥＧＦ−Ａを補充した無血清培地である。内皮細胞の拡大に好適な無血清培地の例は、８ｎｇ／ｍＬのＦＧＦ−２、５０ｎｇ／ｍＬのＶＥＧＦ、及び１０μＭのＳＢ４３１５４２（４−（４−ベンゾ［１，３］ジオキソール−５−イル−５−ピリジン−２−イル−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）−ベンズアミド）を補充した、ＳｔｅｍＰｒｏ−３４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ＥＧＭ２（Ｌｏｎｚａ）、及びＤＭＥＭ／Ｆ１２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）である。内皮細胞は、接着性培養条件で培養されるのが好ましい。一実施形態において、拡大培地には５〜１００ｎｇ／ｍＬのＶＥＧＦ−Ａが補充される。別の実施形態において、拡大培地は、５〜１００ｎｇ／ｍＬ、好ましくは５０ｎｇ／ｍＬのＶＥＧＦ−Ａが補充されたＳｔｅｍＰｒｏ−３４である。

タイトジャンクション遺伝子プロモーターの制御下でレポーター遺伝子を含む、本発明に従ったＥＣは、レポーター遺伝子を発現する細胞に関して濃縮することができ、これは、タイトジャンクション遺伝子の発現を示すであろう。異なる細胞選別及び濃縮法が、当技術分野において既知である。細胞選別法の例としては、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）及び磁気活性化細胞選別（ＭＡＣＳ）を含むフローサイトメトリーが挙げられる。好ましい実施形態では、ＥＣは、レポーター遺伝子、例えばＧＦＰを、細胞内で発現する。しかし、ＥＣの細胞表面に部分的、又は完全に位置するレポータータンパク質もまた想到され、例えば、レポーター遺伝子は、細胞表面標識、並びにそれぞれの選別及び濃縮技術（例えばＭＡＣＳ）にアクセス可能な細胞外部分を含む膜貫通タンパク質をコードする。培養液中で、ＧＦＰ陽性細胞は、全細胞の４０％未満〜最大６０％以上、好ましくは、全細胞の３０％未満〜最大８０％以上、最も好ましくは全細胞の最大９０％超、濃縮することができることを、本明細書で提示したフローサイトメトリー分析は示した。本明細書で記載するように、ＧＦＰ陽性画分内の細胞の大部分は、典型的なＥＣモルホロジーを示した。特に、濃縮画分は、経内皮電気抵抗（ＴＥＥＲ）の強化を示した。

本明細書に記載する方法により入手した内皮細胞を、いくつかの継代のために増殖させることができ、培養は十分に特徴付けられている。本明細書に記載する方法により入手した内皮細胞のアリコートを、再現可能に冷凍及び解凍することが可能である。解凍した細胞を更に、本明細書に記載のとおりに増殖させて、化合物スクリーニングに必要なスループットを確立するのに特に好適な、所望の数の細胞に到達させることができる。

本発明の方法に従い作製した細胞は、経内皮バリア機能の確立又は喪失が関係している、病理学的、又は非病理学的条件のインビトロモデルを確立するのに有用である。特定の実施形態では、ｉ）インビボ経内皮バリア一体性（ＴＢＩ）を強化させること、又は、ｉｉ）内皮細胞（ＥＣ）のインビボＴＢＩを低下させることが可能な薬剤候補を同定するための、インビトロ法であって、
ａ）タイトジャンクション遺伝子プロモーターの制御下においてレポーター遺伝子を含むＥＣを提供するステップであって、ＥＣがレポーター遺伝子を発現する細胞に関して濃縮されているステップと、
ｂ）ＥＣを薬剤候補と接触させて、ＥＣを薬剤候補と接触支える前後にインビトロＴＢＩを測定するステップ、又は、ＥＣを薬剤候補と接触させて、薬剤候補と接触したＥＣのインビトロＴＢＩを測定し、並行して、薬剤候補と接触していないＥＣのインビトロＴＢＩを測定するステップと、の連続ステップを含み、
（ｉ）薬剤候補と接触していないＥＣのインビトロＴＢＩと比較してより高い、薬剤候補と接触したＥＣのインビトロＴＢＩが、ＥＣのインビボＴＢＩを強化可能な薬剤であることを示し、（ｉｉ）薬剤候補と接触していないＥＣのインビトロＴＢＩと比較してより低い、薬剤候補と接触したＥＣのインビトロＴＢＩが、ＥＣのインビボＴＢＩを低下可能な薬剤であることを示す、方法を提供する。

更なる実施形態において、経内皮バリア一体性（ＴＢＩ）の破壊又は喪失に関連する疾患を患う個体に、インビボ適用のための薬剤候補を選択するインビトロ法であって、
ａ）タイトジャンクション遺伝子プロモーターの制御下においてレポーター遺伝子を含むＥＣを提供するステップであって、ＥＣがレポーター遺伝子を発現する細胞に関して濃縮されているステップと、
ｂ）ＥＣを薬剤候補と接触させて、ＥＣを薬剤候補と接触支える前後のインビトロＴＢＩを測定するステップ、又は、ＥＣを薬剤候補と接触させて、薬剤候補と接触したＥＣのインビトロＴＢＩを測定し、並行して、薬剤候補と接触していないＥＣのインビトロＴＢＩを測定するステップと、の連続ステップを含み、
薬剤候補と接触していないＥＣのインビトロＴＢＩと比較してより高い、薬剤候補と接触したＥＣのインビトロＴＢＩを有する薬剤候補が、薬剤候補のインビボ適用のために選択される、方法を提供する。

本明細書で記載するように、本発明の方法は、タイトジャンクション形成が強化した、したがって、バリア一体性が強化した細胞の収率が強化した、ＥＣ培養液を提供する。一実施形態において、本明細書に記載するインビトロ法のステップａ）に従い作製した細胞培養液を提供する。本明細書で使用し、記載する細胞培養液は、本明細書に記載するレポーター遺伝子を発現するＥＣに関して濃縮されているのが好ましい。したがって、本明細書で使用して、記載する細胞培養液は、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％を超える、又は、９９％超の、レポーター遺伝子を発現するＥＣを含む。好ましい実施形態において、本明細書において提供する細胞培養液は、９０％超の、レポーター遺伝子を発現するＥＣ、最も好ましくは、９５％を超える、レポーター遺伝子を発現するＥＣを含む。理論に束縛されるものではないが、レポーター遺伝子の発現は、レポーター遺伝子の発現を制御するタイトジャンクション遺伝子の発現と相関する。したがって、本発明は、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％を超える、又は、９９％超のＥＣが、タイトジャンクション遺伝子、例えばＣＬＤＮ５、ＯＣＬＮ、及びＭＡＲＶＥＬＤ３を発現する、ＥＣ細胞培養液を提供する。好ましい実施形態において、本明細書において提供する細胞培養液は、９０％超の、ＣＮＤＮ５を発現するＥＣ、最も好ましくは、９５％を超える、ＣＮＤＮ５を発現するＥＣを含む。

本発明の文脈では、高インビトロＴＢＩとは、ＴＢＩ、例えば、本明細書で記載するレポーター遺伝子のＴＥＥＲ又は発現と相関するパラメータの、より高い値が、参照条件（例えば、薬剤候補と接触していないＥＣ培養液）における細胞培養液と比較して、対象の細胞培養液（例えば、薬剤候補と接触したＥＣ培養液）に対して測定されることを意味する。一実施形態において、薬剤候補と接触したＥＣ培養液の測定インビトロＴＢＩは、薬剤候補と接触していないＥＣ培養液の測定インビトロＴＢＩと比較して高い、特に、薬剤候補と接触していないＥＣ培養液の測定インビトロＴＢＩと比較して、少なくとも約１．５倍、２倍、３倍、４倍、５倍、又は１０倍高い。一実施形態において、薬剤候補と接触したＥＣ培養液の測定インビトロＴＢＩは、薬剤候補と接触していないＥＣ培養液の測定インビトロＴＢＩと比較して低い、特に、薬剤候補と接触していないＥＣ培養液の測定インビトロＴＢＩと比較して、少なくとも約１．５倍、２倍、３倍、４倍、５倍、又は１０倍低い。一実施形態において、本明細書に記載する方法のステップｃ）は、経内皮電気抵抗（ＴＥＥＲ）を測定することを含み、測定したＴＥＥＲは、インビトロＴＢＩを示す。一実施形態において、薬剤候補と接触したＥＣ培養液の測定ＴＥＥＲは、薬剤候補と接触していないＥＣ培養液の測定ＴＥＥＲと比較して高い、特に、薬剤候補と接触していないＥＣ培養液の測定ＴＥＥＲと比較して、少なくとも約１．５倍、２倍、３倍、４倍、５倍、又は１０倍高い。一実施形態において、薬剤候補と接触したＥＣ培養液の測定ＴＥＥＲは、薬剤候補と接触していないＥＣ培養液の測定ＴＥＥＲと比較して低い、特に、薬剤候補と接触していないＥＣ培養液の測定ＴＥＥＲと比較して、少なくとも約１．５倍、２倍、３倍、４倍、５倍、又は１０倍低い。一実施形態において、レポーター遺伝子は蛍光タンパク質（例えばＧＦＰ）であり、薬剤候補と接触したＥＣ（例えばＥＣ培養液）の測定蛍光は、薬剤候補と接触していないＥＣ（例えばＥＣ培養液）の測定蛍光と比較して高い、特に、薬剤候補と接触していないＥＣ（例えばＥＣ培養液）の蛍光と比較して、少なくとも約１．５倍、２倍、３倍、４倍、５倍、又は１０倍高い。一実施形態において、レポーター遺伝子は蛍光タンパク質（例えばＧＦＰ）であり、薬剤候補と接触したＥＣ（例えばＥＣ培養液）の測定蛍光は、薬剤候補と接触していないＥＣ（例えばＥＣ培養液）の測定蛍光と比較して低い、特に、薬剤候補と接触していないＥＣ（例えばＥＣ培養液）の蛍光と比較して、少なくとも約１．５倍、２倍、３倍、４倍、５倍、又は１０倍低い。ＴＥＥＲ及び蛍光を測定する手段は、当技術分野において周知であり、本明細書でも記載されている。

本発明の一実施形態において、高ＴＢＩを有する、患者特異的、又は健常な個体特異的なＥＣの生成方法を提供する。これは特に、遺伝変異と関連する病状に望ましいものの、患者特異的な疾患モデルは、病状と遺伝変異が関連しない場合において、又は、遺伝変異への関連が未知である、若しくは確立されているはずがない場合においても、関連性を有する可能性がある。この目標に向かい、患者又は健常な個体から入手したヒト人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）を、本明細書に記載する方法で使用する。上記患者特異的なヒトｉＰＳＣは、当該技術分野において既知の方法により、及び、患者又は健常な個体から入手した体細胞を、多能性幹細胞にリプログラミングすることにより、本明細書で更に記載するとおりに、入手することができる。例えば、線維芽細胞、ケラチノサイト、又は脂肪細胞を、治療を必要とする個体、又は健常な個体の皮膚生検より入手し、当該技術分野において既知の方法により、及び、本明細書で更に記載するように、人工多能性幹細胞にリプログラミングすることができる。人工多能性幹細胞の源として好適なその他の体細胞は、血液サンプル若しくは上皮細胞から入手した白血球細胞、又は尿サンプルから入手したその他の細胞である。次に、患者特異的な人工多能性幹細胞を、本明細書に記載する方法により、患者特異的な、疾患を有する、又は健常なＥＣに分化させる。本発明の別の態様では、前述の方法のいずれかにより作製したＥＣの集団を提供する。ＥＣの集団は患者特異的である、即ち、疾患を有する個体から入手したｉＰＳＣに由来するのが好ましい。別の実施形態において、上記ＥＣの集団は、健常な個体から入手される。患者由来のＥＣは、２型及び１型糖尿病、Ｗｅｔ ＡＭＤ、メタボリックシンドローム、並びに重度肥満などの疾患に関する、血管合併症の病態生理学を研究するための、疾患に関係するインビトロモデルを提示する。一実施形態において、本方法により入手したＥＣを、例えば、２型及び１型糖尿病、Ｗｅｔ ＡＭＤ、メタボリックシンドローム、重度肥満、高コレステロール血症、高血圧、冠動脈疾患、腎症、網膜症、腎臓不全、組織虚血、慢性低酸素症、アテローム性動脈硬化症、並びに、薬剤が誘発する毒性により引き起こされる組織浮腫により引き起こされる血管合併症の内皮細胞の機能障害により引き起こされる血管合併症を逆転、阻害、又は予防するための化合物をスクリーニングするために使用される。本明細書で記載する本発明の方法により入手した上記ＥＣは、疾患を有する対象に由来するのが好ましい。疾患を有する対象由来のＥＣを分化させることにより、ヒトバックグラウンドパラダイムにて、薬剤を早期に評価する独自の機会が提示される。

別の実施形態において、本方法により入手したＥＣを、血液網膜バリア（ＢＲＢ）、及び／又は血液脳バリア（ＢＢＢ）のインビトロモデルとして使用する。

一実施形態は、本発明に従った方法により入手したＥＣ培養液を使用して、薬剤候補の有効性を測定することである。培養液は、健常な個体から、及び／又は疾患を有する個体から由来することができ、本明細書に記載したＥＣ培養液を使用して実施する有効性及び／又は毒性研究の結果を一体化して、薬剤候補の、疾患及び／又は治療法に関係する生理学的効果を予想することができる。一実施形態において、薬剤候補のインビトロ有効性プロファイルを評価し、好ましい有効性プロファイルを有する薬剤候補を、更なる開発のために選択する。更なる開発は、非ヒト霊長類種における薬剤候補のインビボ試験、及び／又は、ヒトにおけるインビボ試験を含むことができる。

例示的実施形態：
実施形態１．ｉ）インビボ経内皮バリア一体性（ＴＢＩ）を強化させること、又は、ｉｉ）内皮細胞（ＥＣ）のインビボＴＢＩを低下させることが可能な薬剤候補を同定するための、インビトロ法であって、
ａ）タイトジャンクション遺伝子プロモーターの制御下においてレポーター遺伝子を含むＥＣを提供するステップであって、特に、ＥＣがレポーター遺伝子を発現する細胞に関して濃縮されているステップと、
ｂ）ＥＣを薬剤候補と接触させるステップと、
ｃ）ＥＣを薬剤候補と接触させる前後にインビトロＴＢＩを測定するステップ、又は、薬剤候補と接触したＥＣのインビトロＴＢＩを測定し、並行して、薬剤候補と接触していないＥＣのインビトロＴＢＩを測定するステップと
を含み、
（ｉ）薬剤候補と接触していないＥＣのインビトロＴＢＩと比較してより高い、薬剤候補と接触したＥＣのインビトロＴＢＩが、ＥＣのインビボＴＢＩを強化可能な薬剤であることを示し、（ｉｉ）薬剤候補と接触していないＥＣのインビトロＴＢＩと比較してより低い、薬剤候補と接触したＥＣのインビトロＴＢＩが、ＥＣのインビボＴＢＩを低下可能な薬剤であることを示す、方法。

実施形態２．ステップａ）におけるＥＣが、細胞の単一層、特に、細胞のコンフルエント単一層として提供される、実施形態１に記載の方法。

実施形態３．ステップａ）におけるＥＣが、細胞培養液支持体上、特にマルチウェルプレート上、より具体的には、２４ウェルプレート、９６ウェルプレート、３８４ウェルプレート、又は１５３６ウェルプレートからなる群から選択されるマルチウェルプレート上に提供される、実施形態１又は２のいずれか１つに記載の方法。

実施形態４．ステップｃ）が、経内皮電気抵抗（ＴＥＥＲ）を測定することを含み、測定したＴＥＥＲは、インビトロＴＢＩを示す、実施形態１〜３のいずれか１つに記載の方法。

実施形態５．ステップｃ）が、レポーター遺伝子の発現を測定することを含み、レポーター遺伝子の発現は、インビトロＴＢＩを示す、実施形態１〜３のいずれか１つに記載の方法。

実施形態６．タイトジャンクション遺伝子が、ＣＬＤＮ５、オクルディン（ＯＣＬＮ）、及びＭＡＲＶＥＬＤ３からなる群から選択され、特に、タイトジャンクション遺伝子はＣＬＤＮ５である、実施形態１〜５のいずれか１つに記載の方法。

実施形態７．ＥＣが多能性幹細胞から分化する、実施形態１〜６のいずれか１つに記載の方法。

実施形態８．多能性幹細胞が胚幹細胞又は人工多能性幹細胞である、実施形態１〜７のいずれか１つに記載の方法。

実施形態９．多能性幹細胞がヒト細胞である、実施形態１〜８のいずれか１つに記載の方法。

実施形態１０．多能性幹細胞が、血管合併症と関連する疾患を患う対象に由来する、実施形態１〜９のいずれか１つに記載の方法。

実施形態１１．ステップａ）が、多能性幹細胞を、βカテニン及び／又はＷｎｔシグナル伝達及び／又はヘッジホッグ（ＨＨ）シグナル伝達を活性化する低分子を補充したプライミング培地でインキュベートすることと、プライミングした細胞を誘導培地でインキュベートすることにより、分化を誘発することと、を含む、実施形態７〜１０のいずれか１つに記載の方法。

実施形態１２．βカテニン及び／又はＷｎｔシグナル伝達及び／又はヘッジホッグ（ＨＨ）シグナル伝達を活性化する低分子が、グリコーゲンシンターゼキナーゼ３（Ｇｓｋ３ａ−ｂ）の低分子阻害剤、ＣＤＣ様キナーゼ１（Ｃｌｋ１−２−４）の低分子阻害剤、マイトジェン活性化タンパク質キナーゼ１５（Ｍａｐｋ１５）の低分子阻害剤、二重特異性チロシン−（Ｙ）−リン酸化制御キナーゼ（Ｄｙｒｋ１ａ−ｂ ４）の低分子阻害剤、サイクリン依存性キナーゼ１６（Ｐｃｔｋ１−３ ４）の低分子阻害剤、βカテニン（又はγカテニン）のスムーズンド（ＳＭＯ）活性化因子及び制御因子、並びに、同時活性因子タンパク質ＣＢＰ（ＣＲＥＢ結合タンパク質）及びｐ３００（Ｅ１Ａ結合タンパク質ｐ３００）からなる群から選択される、実施形態１１に記載の方法。

実施形態１３．プライミング培地に、トランスフォーミング増殖因子β（ＴＧＦβ）の低分子阻害剤を補充する、実施形態１１又は１２のいずれか１つに記載の方法。

実施形態１４．ＴＧＦβの低分子阻害剤がＳＢ４３１５４２である、実施形態１３に記載の方法。

実施形態１５．ステップａ）が、細胞をプライミング培地で２〜４日、特に３日インキュベートすることを含む、実施形態１１〜１４のいずれか１つに記載の方法。

実施形態１６．ステップａ）のプライミング培地が、インスリン、トランスフェリン、及びプロゲステロンを補充した無血清培地である、実施形態１１〜１５のいずれか１つに記載の方法。

実施形態１７．ステップａ）のβカテニン及び／又はＷｎｔシグナル伝達及び／又はヘッジホッグ（ＨＨ）シグナル伝達を活性化する低分子が３−（３−アミノ−フェニル）−４−（１−メチル−１Ｈ−インドール−３−イル）−ピロール−２，５−ジオン（ＣＰ２１Ｒ７）である、実施形態１１〜１６のいずれか１つに記載の方法。

実施形態１８．ステップａ）のプライミング培地が更に、組み換え骨形成タンパク質−４（ＢＭＰ４）を含む、実施形態１１〜１７のいずれか１つに記載の方法。

実施形態１９．プライミング培地が、１０〜５０μｇ／ｍＬのインスリン、１０〜１００μｇ／ｍＬのトランスフェリン、及び、０．５〜４μＭのＣＰ２１Ｒ７（３−（３−アミノ−フェニル）−４−（１−メチル−１Ｈ−インドール−３−イル）−ピロール−２，５−ジオン）を補充した１０〜５０ｎＭのプロゲステロン、及び、１０〜５０ｎｇ／ｍＬの組み換え骨形成タンパク質−４（ＢＭＰ４）を含有する無血清培地であり、特に、プライミング培地が１μＭのＣＰ２１Ｒ７及び２５ｎｇ／ｍＬのＢＭＰ４を含む、実施形態１１〜１８のいずれか１つに記載の方法。

実施形態２０．誘導培地が、ＶＥＧＦ−Ａ（血管内皮成長因子）、又は胎盤様増殖因子１（ＰＬＧＦ−１）、及び低分子アデニル酸シクラーゼ活性化因子を補充した無血清培地である、実施形態１１〜１９のいずれか１つに記載の方法。

実施形態２１．低分子アデニレート活性剤が、フォルスコリン（（３Ｒ）−（６ａアルファＨ）ドデカヒドロ−６β、１０α、１０ｂα−トリヒドロキシ−３ベータ、４ａβ、７，７，１０ａβ−ペンタメチル−１−オキソ−３−ビニル−１Ｈ−ナフト［２，１−ｂ］ピラン−５ベータ−イルアセテート）、８−ブロモ−ｃＡＭＰ（８−ブロモアデノシン−３’，５’−環状モノホスフェート）、及びアドレノメデュリンを含む群から選択される、実施形態２０に記載の方法。

実施形態２２．誘導培地が、１〜１０μＭのフォルスコリン、及び５〜１００ｎｇ／ｍＬのＶＥＧＦ−Ａ、特に２００ｎｇ／ｍＬのＶＥＧＦ及び２μＭのフォルスコリンを補充した無血清培地である、実施形態１１〜２１のいずれか１つに記載の方法。

実施形態２３．ステップａ）が、細胞を誘導培地で１８時間〜４８時間インキュベートすることを含む、実施形態１１〜２２のいずれか１つに記載の方法。

実施形態２４．ステップａ）の生成物を、ＥＣの増殖に好適な拡大培地でインキュベートすることを更に含む、実施形態１〜２３のいずれか１つに記載の方法。

実施形態２５．拡大培地にＶＥＧＦ−Ａ、特に５０ｎｇ／ｍＬのＶＥＧＦ−Ａが補充される、実施形態２４に記載の方法。

実施形態２６．レポーター遺伝子をコードするポリヌクレオチドが、タイトジャンクション遺伝子の３’末端に挿入され、特に、（ｉ）タイトジャンクション遺伝子レポーター遺伝子融合タンパク質が発現するか、又は（ｉｉ）レポーター遺伝子が内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）から発現するか、又は（ｉｉｉ）タイトジャンクション遺伝子レポーター遺伝子融合タンパク質が発現し、その後、個別のタイトジャンクションタンパク質及びレポータータンパク質へとプロセシングされる、実施形態１〜２５のいずれか１つに記載の方法。

実施形態２７．自己切断ペプチドをコードするポリヌクレオチドが、タイトジャンクション遺伝子とレポーター遺伝子との間に導入され、特に、自己切断ペプチドは、Ｐ２Ａ自己切断ペプチドである、実施形態２６（ｉｉｉ）に記載の方法。

実施形態２８．タイトジャンクション遺伝子のプロモーターの活性化により、レポーター遺伝子の発現がもたらされる、実施形態１〜２７のいずれか１つに記載の方法。

実施形態２９．レポーター遺伝子が発光タンパク質、特に蛍光タンパク質をコードする、実施形態１〜２８のいずれか１つに記載の方法。

実施形態３０．レポーター遺伝子が緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）をコードする、実施形態１〜２９のいずれか１つに記載の方法。

実施形態３１．細胞が、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）に又は磁気活性化細胞選別（ＭＡＣＳ）により、ステップａ）においてレポーター遺伝子を発現する細胞に関して濃縮される、実施形態１〜３０のいずれか１つに記載の方法。

実施形態３２．細胞を増殖培地と接触させる前に、細胞を、レポーター遺伝子を発現する細胞に関して濃縮する、実施形態２４〜３１のいずれか１つに記載の方法。

実施形態３３．ハイスループットフォーマットで実施される、実施形態１〜３２のいずれか１つに記載の方法。

実施形態３４．薬剤開発状況において分子をスクリーニングするために、特に、薬剤候補化合物ライブラリーをハイスループットスクリーニングするために使用される、実施形態１〜３３のいずれか１つに記載の方法。

実施形態３５．特に、タイトジャンクション遺伝子を発現する細胞の割合が３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、又は９５％を超える、実施形態１〜３４のいずれか１つのステップ１）ａ）に従い作製した細胞培養液。

実施形態３６．レポーター遺伝子の発現が、タイトジャンクション遺伝子のプロモーターの制御下にある、レポーター遺伝子を発現可能な細胞。

実施形態３７．細胞がレポーター遺伝子をコードするポリヌクレオチドを含み、レポーター遺伝子をコードするポリヌクレオチドが、タイトジャンクション遺伝子の３’末端に挿入される、実施形態３６に記載の細胞。

実施形態３８．細胞が、タイトジャンクション遺伝子とレポーター遺伝子との間で、（ｉ）タイトジャンクション遺伝子レポーター遺伝子融合タンパク質、又は（ｉｉ）自己切断ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含み、特に、自己切断ペプチドがＰ２Ａ自己切断ペプチドである、実施形態３６又は３７のいずれか１つに記載の細胞。

実施形態３９．タイトジャンクション遺伝子のプロモーターの活性化により、レポーター遺伝子の発現がもたらされる、実施形態３６〜３８のいずれか１つに記載の細胞。

実施形態４０．タイトジャンクション遺伝子が、ＣＬＤＮ５、オクルディン（ＯＣＬＮ）、及びＭＡＲＶＥＬＤ３からなる群から選択され、特に、タイトジャンクション遺伝子はＣＬＤＮ５である、実施形態３６〜３９のいずれか１つに記載の細胞。

実施形態４１．レポーター遺伝子が発光タンパク質をコードしており、特に、レポーター遺伝子が蛍光タンパク質をコードしており、より具体的には、レポーター遺伝子が緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）をコードしている、実施形態３６〜４０のいずれか１つに記載の細胞。

実施形態４２．血管合併症と関連する疾患の治療で使用するための、２−［３−（６−メチル−２−ピリジニル）−１Ｈ−ピラゾール−４−イル］−１，５−ナフチリジン。

実施形態４３．血管合併症と関連する疾患の治療で使用するための、４−［４−［３−（２−ピリジニル）−１Ｈ−ピラゾール−４−イル］−２−ピリジニル］−Ｎ−（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−４−イル）−ベンズアミド。

実施形態４４．疾患が、２型及び１型糖尿病、糖尿病性網膜症、Ｗｅｔ ＡＭＤ、メタボリックシンドローム、重度肥満、高コレステロール血症、高血圧、冠動脈疾患、腎症、網膜症、腎臓不全、組織虚血、慢性低酸素症、アテローム性動脈硬化症、並びに、薬剤が誘発する毒性により引き起こされる組織浮腫からなる群から選択される、実施形態４２に記載の使用のための２−［３−（６−メチル−２−ピリジニル）−１Ｈ−ピラゾール−４−イル］−１，５−ナフチリジン。

実施形態４５．疾患が、２型及び１型糖尿病、糖尿病性網膜症、Ｗｅｔ ＡＭＤ、メタボリックシンドローム、重度肥満、高コレステロール血症、高血圧、冠動脈疾患、腎症、網膜症、腎臓不全、組織虚血、慢性低酸素症、アテローム性動脈硬化症、並びに、薬剤が誘発する毒性により引き起こされる組織浮腫からなる群から選択される、実施形態４３に記載の使用のための４−［４−［３−（２−ピリジニル）−１Ｈ−ピラゾール−４−イル］−２−ピリジニル］−Ｎ−（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−４−イル）−ベンズアミド。

実施形態４６．疾患が糖尿病性網膜症又はＷｅｔ ＡＭＤである、実施形態４４に記載の使用のための２−［３−（６−メチル−２−ピリジニル）−１Ｈ−ピラゾール−４−イル］−１，５−ナフチリジン。

実施形態４７．疾患が糖尿病性網膜症又はＷｅｔ ＡＭＤである、実施形態４５に記載の使用のための４−［４−［３−（２−ピリジニル）−１Ｈ−ピラゾール−４−イル］−２−ピリジニル］−Ｎ−（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−４−イル）−ベンズアミド。

実施形態４８．血管合併症と関連する疾患の治療のための医薬を製造するための、２−［３−（６−メチル−２−ピリジニル）−１Ｈ−ピラゾール−４−イル］−１，５−ナフチリジンの使用。

実施形態４９．血管合併症と関連する疾患の治療のための医薬を製造するための、４−［４−［３−（２−ピリジニル）−１Ｈ−ピラゾール−４−イル］−２−ピリジニル］−Ｎ−（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−４−イル）−ベンズアミドの使用。

実施形態５０．疾患が、２型及び１型糖尿病、糖尿病性網膜症、Ｗｅｔ ＡＭＤ、メタボリックシンドローム、重度肥満、高コレステロール血症、高血圧、冠動脈疾患、腎症、網膜症、腎臓不全、組織虚血、慢性低酸素症、アテローム性動脈硬化症、並びに、薬剤が誘発する毒性により引き起こされる組織浮腫からなる群から選択される、実施形態４８又は４９のいずれか１つに記載の使用。

実施形態５１．疾患が糖尿病性網膜症又はＷｅｔ ＡＭＤである、実施形態５０に記載の使用。

実施形態５２．個体における疾患の治療方法であって、上記個体に、２−［３−（６−メチル−２−ピリジニル）−１Ｈ−ピラゾール−４−イル］−１，５−ナフチリジンを薬学的に許容される形態で含む、治療に有効な量の組成物を投与することを含む、方法。

実施形態５３．個体における疾患の治療方法であって、上記個体に、４−［４−［３−（２−ピリジニル）−１Ｈ−ピラゾール−４−イル］−２−ピリジニル］−Ｎ−（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−４−イル）−ベンズアミドを薬学的に許容される形態で含む、治療に有効な量の組成物を投与することを含む、方法。

実施形態５４．上記疾患が、２型及び１型糖尿病、糖尿病性網膜症、Ｗｅｔ ＡＭＤ、メタボリックシンドローム、重度肥満、高コレステロール血症、高血圧、冠動脈疾患、腎症、網膜症、腎臓不全、組織虚血、慢性低酸素症、アテローム性動脈硬化症、並びに、薬剤が誘発する毒性により引き起こされる組織浮腫からなる群から選択される、実施形態５２又は５３のいずれか１つに記載の方法。

実施形態５５．疾患が糖尿病性網膜症又はＷｅｔ ＡＭＤである、請求項５４に記載の方法。

実施形態５６．上述の発明。

材料及び方法
ヒトＰＳＣの培養及び分化。ヒトＥＳＣ株のＳＡ００１（Ｚｅｔｔｅｒｑｖｉｓｔ ＡＶ，Ｂｌａｎｃｏ Ｆ，Ｏｈｍａｎ Ｊ，Ｋｏｔｏｖａ Ｏ，Ｂｅｒｇｌｕｎｄ ＬＭ，ｄｅ Ｆｒｕｔｏｓ Ｇａｒｃｉａ Ｓ，ｅｔ ａｌ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｄｉａｂｅｔｅｓ ｒｅｓｅａｒｃｈ．２０１５；２０１５：４２８４７３．）を、Ｃｅｌｌａｒｔｉｓ ＡＢ（Ｅｎｇｌｕｎｄ ＭＣ，Ｃａｉｓａｎｄｅｒ Ｇ，Ｎｏａｋｓｓｏｎ Ｋ，Ｅｍａｎｕｅｌｓｓｏｎ Ｋ，Ｌｕｎｄｉｎ Ｋ，Ｂｅｒｇｈ Ｃ，ｅｔ ａｌ．Ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｃｅｌｌｕｌａｒ＆ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ ｂｉｏｌｏｇｙ Ａｎｉｍａｌ．２０１０；４６（３−４）：２１７−３０．）から入手した。細胞株のマイコプラズマ汚染を日常的に試験すると、本研究を通して陰性であった。ＳＴＲ分析、ｇ分染法、及びＩｌｌｕｍｉｎａ ＳＮＰアレイ（Ｏｍｎｉ Ｅｘｐｒｅｓｓ）によりＳＡ００１株を試験した。ＣＬＤＮ５−Ｐ２Ａ−ＧＦＰ挿入の際に、ＳＴＲ分析、ｇ分染法、及びＩｌｌｕｍｉｎａ ＳＮＰアレイ（Ｏｍｎｉ Ｅｘｐｒｅｓｓ）を繰り返した。Ａｃｃｕｔａｓｅ（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて細胞を日常的に継代し、１：１０〜１：１５の希釈にて、細胞の小さな凝集塊としてリプレーティングした。分化のために、Ａｃｃｕｔａｓｅを用いてｈＰＳＣを解離させた。以下のとおりの、いくらかの修正と共に、記載のとおりに、分化手順を続けた（Ｐａｔｓｃｈ Ｃ，Ｃｈａｌｌｅｔ−Ｍｅｙｌａｎ Ｌ，Ｔｈｏｍａ ＥＣ，Ｕｒｉｃｈ Ｅ，Ｈｅｃｋｅｌ Ｔ，Ｏ’Ｓｕｌｌｉｖａｎ ＪＦ，ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ ｃｅｌｌ ｂｉｏｌｏｇｙ．２０１５；１７（８）：９９４−１００３．）：５０ｎｇ／ｍＬのＶＥＧＦＡと共にＳｔｅｍＰｒｏからなる拡大培地を、最初の分裂のためだけに細胞上で保持した。２回目の分裂からは、ＶａｓｃｕＬｉｆｅ ＶＥＧＦ内皮培地完全キット（ＬｉｆｅＬｉｎｅ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を用いて、細胞を培養した。培地に添加した補充物質の最終組成物は、１０％ ＦＢＳ、４ｍＭ Ｌ−グルタミン、０．７５Ｕ／ｍＬ 硫酸ヘパリン、５ｎｇ／ｍＬ ＦＧＦ−２、５ｎｇ／ｍＬ ＥＧＦ、５ｎｇ／ｍＬ ＶＥＧＦＡ、１５ｎｇ／ｍＬ ＩＧＦ１、１μｇ／ｍＬ コハク酸ヒドロコルチゾン、５０μｇ／ｍＬ アスコルビン酸であった。ＳＢ４３１５４２（１０μＭ）を培地に補充した。培地を２日に１回交換した。継代５〜継代９まで、細胞に実験を行った。

ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ゲノム編集及びＰｉｇｇｙｂａｃ切除を用いる、ＣＬＤＮ５座位におけるＧＦＰレポーターの、跡を残さない組み込み。終止コドン付近にＣａｓ９標的化部位を選択し

、相補性ｓｇＲＮＡをインビトロ転写により産生した（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）。６９４及び５１８ｂｐの長さで、ヒトＣＬＤＮ５の終止コドンの左側及び右側に隣接するホモロジーアームにより、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ ＤＮＡ二本鎖切断後の相同組み換え修復による、ＧＦＰ組み込みのためのベクター構築物（図１ｂ）を設計した。ＣＬＤＮ５の終止コドンから６１ヌクレオチド下流のＡＴＡＡ部位を、右側の相同組み換えアームでＴＴＡＡに変更し、耐性カセットの更なるｐｉｇｇｙＢａｃ切除を可能にした。ベクターは、ＥＦ１Ａプロモーターの下で、ピューロマイシン及び切頭チミジンキナーゼに対する耐性カセットを担持した。ｐｉｇｇｙＢａｃ切除を可能にする、反転末端反復（ＩＴＲ）配列、及びＣｒｅリコンビナーゼ切除を可能にするＬｏｘＰ部位が、耐性カセットの除去のために存在した。ｈＰＳＣを、ヌクレオフェクションの４時間前に１０μＭのＹ−２７６３２（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）で前処理した。１０．８μｇの特異的ｓｇＲＮＡ、８μｇのＣａｓ９、及び２．４μｇのプラスミドベクタードナーを含むＣＭ１３０プログラムを用いた一次細胞Ｐ３ヌクレオフェクター溶液（Ｌｏｎｚａ）と共に、Ａｍａｘａ ４ｄヌクレオフェクター（Ｌｏｎｚａ）を用いて、２０００００個の細胞をヌクレオフェクションした。ヌクレオフェクション後、細胞を１０μＭのＹ−２７６３２で２４時間処理した。細胞を５日間放置してヌクレオフェクションから回復させた後、ピューロマイシン（２００μｇ／ｍＬ）による選択下で増殖させた。選択後、切除のみのｐｉｇｇｙＢａｃ ｍＲＮＡトランスポーゼース（１．７５μｇ、Ｔｒａｎｓｐｏｓａｇｅｎ）と共にＡｍａｘａ ４ｄヌクレオファクター（プログラム：ＣＭ１３０）を用いて、細胞をヌクレオフェクションした。複数の培養皿にて、１〜３００ｃｅｌｌ／ｃｍ^２の範囲の連続希釈で、ヌクレオフェクションした細胞を播種した。十分に分離した単一細胞のコロニーを、直径２００μｍに達した後で取り出した。細胞をＰＢＳで洗浄し、コロニーを取り出す間、０．１ｍＬ／ｃｍ^２ ＰＢＳ中に放置した。滅菌したピペットの先端でコロニーを掻き取り、コロニーをピペット処理し、そのコロニーを、ｍＴｅＳＲ１培地を有する、ｍａｔｒｉｇｅｌでコーティングした４８ウェルプレート上でリプレーティングすることにより、コロニーを分離した。４時間後、培地を新しいｍＴｅＳＲ１培地で置き換え、１０μＭのＹ−２７６３２で２４時間更に処理した。

細胞を、コンフルエンシーまでｍＴｅＳＲ１中で増殖させた。ＢｉｏＳｐｒｉｎｔ ９６ ＤＮＡ Ｂｌｏｏｄ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて、ＤＮＡを単離した。ＴＫコード配列中で設計したプライマー

を用いるｑＰＣＲにより、耐性カセットの切除を評価し、参照遺伝子ＲＰＰ３０

を用いるマルチプレックス反応で実施した。メーカーの取扱説明書に従い、ライトライクラーキット（Ｒｏｃｈｅ）を備えたＬｉｇｈｔ Ｃｙｌｅｒ ４８０（Ｒｏｃｈｅ）にてＱＰＣＲを実施した。ｑＰＣＲにより最も低いＴＫの発現を示すクローンを、ＧＦＰ若しくはＴＫ、又はインサート

の外側に結合するプライマーを用いるＦａｓｔＳｔａｒｔキット（Ｒｏｃｈｅ）を用いるＰＣＲにより、確認した。ＴＢＥ緩衝液（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中の１％アガロース（Ｓｉｇｍａ）からなるゲル上で、生成したＰＣＲ産物を実施した。メーカーの取扱説明書に従い、ＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ）によりＰＣＲ産物を精製し、Ｓａｎｇｅｒ配列決定（Ｍｉｃｒｏｓｙｎｔｈ）のために送った。

蛍光活性化細胞選別及び分析。アキュターゼ（ＳｔｅｍＣｅｌｌ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）により、ヒトＰＳＣ−ＥＣをプレートから解離し、選別前に３０μｍフィルター（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）でフィルタにかけた。選別中に、解離した細胞を完全培地に保持し、２０％ ＦＢＳ、及び２５ｍＭ ＨＥＰＥＳを補充した完全ＥＣ培地を含む、冷却した収集管で選別した。４通りの純度正確モードを用いて、ＢＤ ＦＡＣＳ ＡＲＩＡ ＩＩＩ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）により選別を実施した。ＦＡＣＳプロットをＦｌｏｗｊｏ＿Ｖ１０ソフトウェアにより生成した。ＲＮＡ−ｓｅｑの場合、最低で１０００００個の細胞を選別した。選別後、細胞を遠心沈殿させ（６１０ｇ、１０分）、６５０μＬのＲＬＴ細胞溶解緩衝液（Ｑｉａｇｅｎ）＋β−メルカプトエタノール（１％）中に溶解させた後、室温で１分間ボルテックスして急速凍結した。質量分析の場合、最低１０^６個の細胞を選別し、細胞をＰＢＳ⁻⁻（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で洗浄して遠心沈殿させ（１１０ｇ、３分）、ＰＢＳを取り除き、細胞ペレットを急速凍結した。

ＲＮＡ単離。ＲＮｅａｓｙマイクロキット若しくはＲＮｅａｓｙミニキット（共にＱｉａｇｅｎ）、又は自動化Ｍａｘｗｅｌｌ Ｔｏｔａｌ ＲＮＡ精製キット（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して、ＦＡＣＳ選別又は培養細胞からのＲＮＡ単離を実施した。全ての手順にＤＮａｓｅＩ分解を含んだ。手順は、キットのプロトコルに記載のとおりに従った。

ＲＮＡ配列決定及び分析。ＦＡＣＳ処理又は細胞培養処理サンプルからの全ＲＮＡを、オリゴ（ｄＴ）捕捉及び濃縮に通し、得られたｍＲＮＡ画分を使用して、相補性ＤＮＡライブラリーを構築した。サンプル当たり、５０塩基対の約３０００万個の読み取りを生成した標準的なプロトコル（ＴｒｕＳｅｑ Ｓｔｒａｎｄｅｄ Ｔｏｔａｌ ＲＮＡ Ｌｉｂｒａｒｙ，Ｉｌｌｕｍｉｎａ）を使用して、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＨｉＳｅｑプラットフォームにてトランスクリプトーム配列決定（ＲＮＡ−ｓｅｑ）を実施した。２つの異なるクローンからそれぞれ６個の複製を用いて、ＧＦＰ＋及びＧＦＰ−細胞に対するＦＡＣＳ選別実験を行った。次に、ＧＳＮＡＰ（Ｗｕ ＴＤ，Ｎａｃｕ Ｓ．Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ（Ｏｘｆｏｒｄ，Ｅｎｇｌａｎｄ）．２０１０；２６（７）：８７３−８１．）を用いて、ヒトゲノム（ＮＣＢＩ ｂｕｉｌｄ ３７）にＲＮＡ−ｓｅｑの読み取りをマッピングした。２つのクローンからの、１２個の、ＧＦＰ＋とＧＦＰ−サンプルにて比較を行った。ＳＴＡＲ（Ｄｏｂｉｎ Ａ，Ｄａｖｉｓ ＣＡ，Ｓｃｈｌｅｓｉｎｇｅｒ Ｆ，Ｄｒｅｎｋｏｗ Ｊ，Ｚａｌｅｓｋｉ Ｃ，Ｊｈａ Ｓ，ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ（Ｏｘｆｏｒｄ，Ｅｎｇｌａｎｄ）．２０１３；２９（１）：１５−２１．）を使用してヒトゲノム（ｈｇ１９／Ｒｅｆｓｅｑ）に、ＴＧＦＢＲ２阻害剤で処理したｈＰＳＣ−ＥＣサンプルをマッピングし、ＨｔＳｅｑ（Ａｎｄｅｒｓ Ｓ，Ｐｙｌ ＰＴ，Ｈｕｂｅｒ Ｗ．Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ（Ｏｘｆｏｒｄ，Ｅｎｇｌａｎｄ）．２０１５；３１（２）：１６６−９．）のユニオンモードを用いて、計数を行った。Ｄｅｓｅｑ２（Ｄｏｂｉｎ Ａ，Ｄａｖｉｓ ＣＡ，Ｓｃｈｌｅｓｉｎｇｅｒ Ｆ，Ｄｒｅｎｋｏｗ Ｊ，Ｚａｌｅｓｋｉ Ｃ，Ｊｈａ Ｓ，ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ（Ｏｘｆｏｒｄ，Ｅｎｇｌａｎｄ）．２０１３；２９（１）：１５−２１．）を使用して、分化発現を実施した。１５個の遺伝子より小さい、及び５０００個より多い遺伝子の遺伝子セットを無視するデフォルト条件に従って、重み付けしたｐ２分析を用いるＨａｌｌｍａｒｋｓ ＭｓｉｇＤｂデータベース（Ｌｉｂｅｒｚｏｎ Ａ，Ｂｉｒｇｅｒ Ｃ，Ｔｈｏｒｖａｌｄｓｄｏｔｔｉｒ Ｈ，Ｇｈａｎｄｉ Ｍ，Ｍｅｓｉｒｏｖ ＪＰ，Ｔａｍａｙｏ Ｐ．Ｃｅｌｌ ｓｙｓｔｅｍｓ．２０１５；１（６）：４１７−２５．）を用いるＧＳＥＡ（Ｓｕｂｒａｍａｎｉａｎ Ａ，Ｔａｍａｙｏ Ｐ，Ｍｏｏｔｈａ ＶＫ，Ｍｕｋｈｅｒｊｅｅ Ｓ，Ｅｂｅｒｔ ＢＬ，Ｇｉｌｌｅｔｔｅ ＭＡ，ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ．２００５；１０２（４３）：１５５４５−５０．）を用いて、遺伝子セットの濃縮分析を実施した。

蛍光活性化細胞読み出しによる、化合物ライブラリースクリーニング。化合物を複製プレートにてプレーティングした。各プレートはＤＭＳＯ処理した対照を有した。ＥＣ（ウェルあたり１００００細胞）を、完全培地中のフィブロネクチンコーティングプレートに播種した。播種の２日後に細胞を処理し、ＭＡＣＳクアント分析器１０（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ ｂｉｏｔｅｃ）を用いるＦＡＣＳ測定を行った。スクリーンデータをＦｌｏｗｊｏ＿Ｖ１０ソフトウェアで分析した。

電気的細胞−基質インピーダンス感知。２５０Ｈｚの周波数にて、９６ウェルアレイプレート（９６ｗｉｄｆ，Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ）を使用して、ＥＣＩＳ（登録商標）Ｚ−ゼータシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ，ＭｃＡｌｉｓｔｅｒ ＧＣ，Ｎｕｓｉｎｏｗ ＤＰ，Ｊｅｄｒｙｃｈｏｗｓｋｉ ＭＰ，Ｗｕｈｒ Ｍ，Ｈｕｔｔｌｉｎ ＥＬ，Ｅｒｉｃｋｓｏｎ ＢＫ，ｅｔ ａｌ．Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．２０１４；８６（１４）：７１５０−８．）を用いてリアルタイムでＴＢＩを検出した。１００μＬのフィブロネクチン（２５μｇ／ｍＬ；室温で３０分間）でプレートをコーティングし、フィブロネクチンを完全培地で置き換え、電極をシステム上で１時間安定させた。その後、培地を取り除き、ｈＰＳＣ−ＥＣを播種した（ウェルあたり１００００細胞）。細胞を２日間放置してフルコンフルエンシーに到達させた後、化合物をＶＥＧＦＡ（５０ｎｇ／ｍＬ）により、又はこれなしで処理した。全ての処理を３通りで実施した。

ＦＩＴＣ−デキストランの透過性アッセイ。ＥＣを、完全培地中のフィブロネクチンをコーティングしたトランスウェル９６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）に播種した。下部チャンバーに３２５μＬ、上部に７５μＬのＥＣ培地を添加した。細胞を２日間放置して結合させ、コンフルエントな単一層を生成した。細胞を上部チャンバーで、化合物により、及び、ＶＥＧＦＡ（５０ｎｇ／ｍＬ）により、又はこれなしで処理した。

競合プロテインキナーゼ結合アッセイ。キノームスキャン（４６８個のキナーゼ）を、ｓｃａｎＭＡＸ（ＤｉｓｃｏｖｅＲｘ）により１μＭにて実施した。（Ｂｅｒｎａｓ ＭＪ，Ｃａｒｄｏｓｏ ＦＬ，Ｄａｌｅｙ ＳＫ，Ｗｅｉｎａｎｄ ＭＥ，Ｃａｍｐｏｓ ＡＲ，Ｆｅｒｒｅｉｒａ ＡＪ，ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ．２０１０；５（７）：１２６５−７２．）に記載のとおりに、キノームスキャン手順は従った。ＡＣＶＲ１Ｂ、ＴＧＦＲＢ１、ＴＧＦＢＲ２、及びＫＤＲのＫｄ測定を、３０μＭの１１点の３倍連続希釈（ＤｉｓｃｏｖｅＲｘ）により２通りに実施した。全ての化合物をＤＭＳＯに溶解した。ヒルの式を用いる標準的な用量反応曲線により、結合定数（Ｋｄ）を計算し、ヒルの勾配を−１に設定した。Ｌｅｖｅｎｂｅｒｇ−Ｍａｒｑｕａｒｄｔのアルゴリズムによる、非線形最小２乗法を用いて、曲線を適合させた。

統計分析。Ｐｒｉｓｍ ７（Ｇｒａｐｈｐａｄ）を使用してチャートを作製し、統計分析を実施した。別途記載のない限り、対のない両側スチューデントｔ検定により統計分析を実施した。全ての棒グラフに関して、データは平均±ＳＤとして表される。０．０５未満のＰ値を有意とみなした。

実施例１
ｈＰＳＣにおけるＣＬＤＮ５転写レポーターのゲノム編集。
サロゲートマーカーにより、内皮細胞のバリア性を評価するために、ＣＬＤＮ５を３’末端にて、Ｐ２Ａ自己切断ペプチド及びＧＦＰでタグ付けした（図１ａ）。ＣＬＤＮ５の終止コドン近傍にｓｇＲＮＡを設計しながら、ドナープラスミド（図１ｂ）を生成し、耐性カセットの跡を残さない切除を可能にする、ｐｉｇｇｙＢａｃ反転末端反復（ＩＴＲ）を有する各末端において、２つのホモロジーアーム（ＨＡ）が隣接する、プロモーター非含有のＰ２Ａ−ＧＦＰ配列を運搬した。Ｃａｓ９及びｓｇＲＮＡにより作製された二本鎖切断が、ＣＬＤＮ５とドナーテンプレートとの間で相同組み換えにより修復され（図１ｃ）、その後、耐性カセットが切除のみのｐｉｇｇｙｂａｃトランスポーゼースにより取り除かれる（図１ｄ）。単一細胞クローンを取り出して増殖させた。ｑＰＣＲ（図示せず）により、ｔＴＫの欠如を確認し、ｔＴＫを欠くいくつかのクローンを同定した。これらのクローンの、ＧＦＰの正しい挿入及び向き（図１ｅ、Ｆ３／Ｒ１）、並びにｔＴＫの欠如（図１ｅ、Ｆ１／Ｒ１）を、ゲルＰＣＲで確認した。Ｓａｎｇｅｒ配列決定により、正しいインフレーム組み込みを確認した（図１ｆ）。

実施例２
幹細胞由来の内皮細胞ＣＬＤＮ５レポーターの生成及び性質決定。以前に公開されたプロトコル（Ｐａｔｓｃｈ Ｃ，Ｃｈａｌｌｅｔ−Ｍｅｙｌａｎ Ｌ，Ｔｈｏｍａ ＥＣ，Ｕｒｉｃｈ Ｅ，Ｈｅｃｋｅｌ Ｔ，Ｏ’Ｓｕｌｌｉｖａｎ ＪＦ，ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ ｃｅｌｌ ｂｉｏｌｏｇｙ．２０１５；１７（８）：９９４−１００３．）を用いて、ヒト多能性幹細胞株レポーター株及びＷＴ株を内皮細胞に分化させると、１５〜２５％（図２ｂ、クローンにより異なる、あるクローンに対してのデータを示す）のＧＦＰ＋細胞、及びＷＴ株におけるゼロのＧＦＰ＋細胞が観察された。ＧＦＰ＋及びＧＦＰ−細胞をＦＡＣＳ選別し、電気的細胞−基質インピーダンス感知測定を実施した。バリア耐性が１．７５倍強化したことが、ＧＦＰ＋細胞で観察された（３２００Ωの抵抗、図２ｃ）。次に、ＧＦＰ＋及びＧＦＰ−ＦＡＣＳ選別細胞の両方において、ＲＮＡ配列決定及びＴＭＴ質量プロテオミクスを実施する（図示せず）と、著しく変化したタンパク質と、対応するｍＲＮＡとの間に、非常に良好な相関が見られた（ｒ＝０．７９、ｐ＜０．０００１、図２ｄ）。ｍＲＮＡ及びタンパク質の量において、ＣＬＤＮ５の有意な上方制御が確認された（図２ｅ）が、他のタイトジャンクションオクルディン（ＯＣＬＮ）及びＭＡＲＶＥＬＤ３の有意な上方制御もまた観察された（図２ｆ）。更に、接着接合ＣＤ３１の有意な上方制御が見られた。ＶＥＧＦＲ２（ＫＤＲ）又はＣＤ３４発現における発現の差は観察されなかった。このことは、バリア性において、ＧＦＰ＋とＧＦＰ−細胞との差が存在することを示唆している（図２ｇ）。

実施例３
ＣＬＤＮ５−ＧＦＰ＋ＥＣは、高い経内皮バリア一体性の機能的応答を示す。次に、ＧＦＰ＋及びＧＦＰ−選別細胞の、ｌｏｇ２ＦＣ及び−ｌｏｇ１０ＦＤＲの生成物の格付けリストを用い、Ｈａｌｌｍａｒｋｓ ＭｓｉｇＤＢ（Ｌｉｂｅｒｚｏｎ Ａ，Ｂｉｒｇｅｒ Ｃ，Ｔｈｏｒｖａｌｄｓｄｏｔｔｉｒ Ｈ，Ｇｈａｎｄｉ Ｍ，Ｍｅｓｉｒｏｖ ＪＰ，Ｔａｍａｙｏ Ｐ．Ｃｅｌｌ ｓｙｓｔｅｍｓ．２０１５；１（６）：４１７−２５．）データベースにより、遺伝子セット濃縮分析を実施した（ＧＳＥＡ，Ｓｕｂｒａｍａｎｉａｎ Ａ，Ｔａｍａｙｏ Ｐ，Ｍｏｏｔｈａ ＶＫ，Ｍｕｋｈｅｒｊｅｅ Ｓ，Ｅｂｅｒｔ ＢＬ，Ｇｉｌｌｅｔｔｅ ＭＡ，ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ．２００５；１０２（４３）：１５５４５−５０．）（データは図示せず）。興味深いことに、血管新生、ＴＧＦβ及びＥ２Ｆ増殖経路の濃縮は、下方制御した遺伝子間で見られ、上方制御した遺伝子ではＷＮＴシグナル伝達の濃縮が見られた（データは図示せず）。経路濃縮分析（Ｚｈｏｕ Ｙ，Ｗａｎｇ Ｙ，Ｔｉｓｃｈｆｉｅｌｄ Ｍ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ Ｊ，Ｓｍａｌｌｗｏｏｄ ＰＭ，Ｒａｔｔｎｅｒ Ａ，ｅｔ ａｌ．Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ．２０１４；１２４（９）：３８２５−４６．，Ｓｕｚｕｋｉ Ｅ，Ｎａｇａｔａ Ｄ，Ｙｏｓｈｉｚｕｍｉ Ｍ，Ｋａｋｏｋｉ Ｍ，Ｇｏｔｏ Ａ，Ｏｍａｔａ Ｍ，ｅｔ ａｌ．Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．２０００；２７５（５）：３６３７−４４）により、ＧＦＰ＋が、より高い内皮細胞バリア性を示すことが確認された。次に、ＧＦＰ＋細胞集団を血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦＡ）で処理すると、最も強力なインビボ血管透過性因子、及びバリア性の急激な喪失が観察され（図３ａ）、更に興味深いことに、ＶＥＧＦＡ処理条件において、ＧＦＰ＋細胞の減少が観察された。後続実験において、広範なチロシンキナーゼ受容体阻害剤ＳＵ１１２４８を使用し（Ｍｅｎｄｅｌ ＤＢ，Ｌａｉｒｄ ＡＤ，Ｘｉｎ Ｘ，Ｌｏｕｉｅ ＳＧ，Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ ＪＧ，Ｌｉ Ｇ，ｅｔ ａｌ．Ｃｌｉｎｉｃａｌ ｃａｎｃｅｒ ｒｅｓｅａｒｃｈ．２００３；９（１）：３２７−３７．，ＰＤＧＦＲ，ＶＥＧＦＲ，ｃ−Ｋｉｔ）、ＧＦＰ＋細胞の割合の急激な強化が観察された（９９％、図３ｂ）。興味深いことに、ＥＣＩＳ（図３ｃ、カラー及びグレースケールで示す）、及びトランスウェル４０ｋＤａ ＦＩＴＣ−デキストラン透過性（図３ｄ）により示されるように、ＶＥＧＦＡにより、処理細胞はバリア破壊に耐性を有した。我々のデータは、ＣＬＤＮ５は内皮細胞バリアの機能的レポーターであり、驚くべきことに、これを使用して、化学的ライブラリーをプロファイリングして、高内皮バリア一体性を誘発する、又は、バリア破壊の喪失を予防することができることを示している。機能的レポーターは、インビボ透過性因子のＶＥＧＦＡに反応し、インビボでのバリア破壊を誘発するＶＥＧＦＡによる処理で、レポーターＧＦＰの低い発現がもたらされ、そのために、組織バリア一体性のためのサロゲートマーカーとして使用することができる。

実施例４
経内皮バリア一体性を誘発する化合物の同定。ＣＬＤＮ５レポーターを担持するｈＰＳＣ−ＥＣを、薬剤候補化合物ライブラリーでスクリーニングし、処理の２日後にＦＡＣＳ測定を実施して、ＧＦＰ＋細胞の割合を誘発する化合物を同定した（図４ａ）。ＤＭＳＯと比べて、少なくとも２倍ＧＦＰ＋細胞の割合が強化した化合物の部類に、焦点を当てた（＞３１．７％ ＧＦＰ＋）。次に、選択した強力な化合物による用量応答性処理を実施することで、ＧＦＰ＋細胞の割合の誘発を確認し、バリア促進活性を、ＥＣＩＳ及びＦＩＴＣ−デキストラン透過性アッセイで観察した（データは図示せず）。ＬＹ２１５７２９（ＴＧＦＢＲ阻害剤）が、休息しているＥＣのバリア活動を促進するという傾向が観察され、これは部分的に、ＶＥＧＦＡによる内皮細胞層の破壊を防止した。ＴＧＦβ経路は、ＧＦＰ＋細胞で下方制御されることが観察された。

実施例５
ＴＧＦＢＲ阻害は経内皮バリア一体性を誘発する。機能的バリアアッセイにおいて、ＶＥＧＦＡとの同時適用における、ＥＣバリアでのＴＧＦＲβ阻害化合物の効果を評価した（図５）。両方の条件下において、Ｒｅｐｓｏｘの強力なＥＣバリア促進効果が観察され、その後、ＧＷ７８３８８が、ＶＥＧＦＡによるバリア破壊を防止し、ＳＢ５０５１２４は部分的効果を有し、ＳＢ４３１５４２は効果を有しなかった。次に、ＴＧＦＢＲを標的にするいくつかのキナーゼ阻害剤の特異性を、大型キナーゼパネルを用いて比較した。化合物は全て、ＡＣＶＲ１Ｂ及びＴＧＦＢＲ１に対する阻害活性を有したものの、２つの最も強力な化合物（Ｒｅｐｓｏｘ及びＧＷ７８８３８８）のみは、ＴＧＦＢＲ２に強力な阻害活性を有し、ＢＭＰＲ１Ｂに弱い阻害活性を有した（データは図示せず）。次に、同じ化合物に対するＫｄを測定し、ＡＣＶＲ１Ｂ及びＴＧＦＢＲ１における、全ての化合物の、ナノモル範囲でのＫｄを同定したが、Ｒｅｐｓｏｘ及びＧＷ７８８３８８は、ＴＧＦＢＲ２に対するナノモル阻害活性を有した（データは図示せず）。バリア性の、Ｒｅｐｓｏｘの強力な誘発の背後にある分子メカニズムを明らかにするために、ＲＮＡ−ｓｅｑを、ＴＧＦＢＲ阻害剤での治療の８時間後、及び４８時間後に実施した。Ｈａｌｌｍａｒｋｓ ＭｓｉｇＤＢデータベースを用いて、最も活性、及び不活性な化合物の分析に対するＧＳＥＡ経路を評価した。両方の化合物に対して、ＴＧＦβ経路の下方制御が同定されたが、異なる経路の制御もまた同定された。特に、Ｒｅｐｓｏｘによる、強力なＣＬＤＮ５の上方制御、及びＰＬＶＡＰの下方制御が観察された一方で、ＫＤＲ（ＶＥＧＦＲ２）及びＰＥＣＡＭ１（ＣＤ３１）の発現は変化しなかった。ＰＬＶＡＰは、成長している血液脳バリアＥＣで抑制されることが示されており（Ｈａｌｌｍａｎｎ Ｒ，Ｍａｙｅｒ ＤＮ，Ｂｅｒｇ ＥＬ，Ｂｒｏｅｒｍａｎｎ Ｒ，Ｂｕｔｃｈｅｒ ＥＣ．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ ｄｙｎａｍｉｃｓ．１９９５；２０２（４）：３２５−３２）、ＢＲＢのＥＣ上にＰＬＶＡＰが存在することは、血管透過性の強化と相関している（Ｗｉｓｎｉｅｗｓｋａ−Ｋｒｕｋ Ｊ，ｖａｎ ｄｅｒ Ｗｉｊｋ ＡＥ，ｖａｎ Ｖｅｅｎ ＨＡ，Ｇｏｒｇｅｌｓ ＴＧ，Ｖｏｇｅｌｓ ＩＭ，Ｖｅｒｓｔｅｅｇ Ｄ，ｅｔ ａｌ．Ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｐａｔｈｏｌｏｇｙ．２０１６；１８６（４）：１０４４−５４．）。いくつかの他のタイトジャンクション、又はタイトジャンクションの制御因子（ＭＡＲＶＥＬＤ３、ＧＪＡ４、ＧＪＡ５、ＩＦＩＴＭ３）の、Ｒｅｐｓｏｘによる上方制御が観察された。バリア性を促進することが示されているＲＨＯＢの下方制御が観察された。更に、Ｒｅｐｓｏｘによる、Ｗｎｔ標的遺伝子（ＡＸＩＮ２、ＡＰＣＤＤ１、ＴＮＦＲＳＦ１９）、並びにＷｎｔ ＦＺＤ４及びＬＲＰ１の上方制御、並びに、ＧＳＫ３βの下方制御が観察された。血管新生関連遺伝子（ＶＥＧＦＡ経路を下方制御する、ＥＳＭ１、ＡＮＧＰＴＬ４、及びＰＰＡＲＧＣ１Ａ、並びに上方制御されたＶＥＧＦＲ１（ＦＬＴ１））の下方制御においてもまた、Ｒｅｐｓｏｘは最も強力な化合物であった（データは図示せず）。Ｒｅｐｓｏｘは、いくつかの炎症遺伝子（ＮＦＡＴＣ２、ＪＡＫ１、ＪＡＫ３、及びＩＣＡＭ１）を下方制御することができる。試験した化合物は全て、ＴＧＦβ経路の下方制御が可能であり、Ｒｅｐｓｏｘが、ＳＭＡＤ６（ＴＧＦβアンタゴニスト）もまた誘発する、最も強力な化合物であった。Ｒｅｐｓｏｘはまた、強力にＢＭＰシグナル伝達（ＥＮＧ、ＬＲＧ１、及びＢＭＲＰ２）を強力に阻害した。ＲｅｐＳｏｘ処理後に最も急激な上方制御が起こったのは、ＢＭＰシグナル伝達のアンタゴニスト（ＢＭＰＥＲ、ＧＲＥＭ２、及びＧＤＦ６）であった。ＢＭＰシグナル伝達のアンタゴニストは全て、内皮細胞バリアの安定性に関与した。ＢＭＰＥＲハプロ不全が、網膜脈管化（Ｍｏｒｅｎｏ−Ｍｉｒａｌｌｅｓ Ｉ，Ｒｅｎ Ｒ，Ｍｏｓｅｒ Ｍ，Ｈａｒｔｎｅｔｔ ＭＥ，Ｐａｔｔｅｒｓｏｎ Ｃ．Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ，ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ，ａｎｄ ｖａｓｃｕｌａｒ ｂｉｏｌｏｇｙ．２０１１；３１（１０）：２２１６−２２．）、及びプロ炎症性表現型（Ｈｅｌｂｉｎｇ Ｔ，Ｒｏｔｈｗｅｉｌｅｒ Ｒ，Ｋｅｔｔｅｒｅｒ Ｅ，Ｇｏｅｔｚ Ｌ，Ｈｅｉｎｋｅ Ｊ，Ｇｒｕｎｄｍａｎｎ Ｓ，ｅｔ ａｌ．Ｂｌｏｏｄ．２０１１；１１８（１８）：５０４０−９）を強化させることが示されている。以前の報告では、内皮細胞の透過性の誘発における、ＢＭＰシグナル伝達の改善が示された（Ｂｅｎｎ Ａ，Ｂｒｅｄｏｗ Ｃ，Ｃａｓａｎｏｖａ Ｉ，Ｖｕｋｉｃｅｖｉｃ Ｓ，Ｋｎａｕｓ Ｐ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｃｅｌｌ ｓｃｉｅｎｃｅ．２０１６；１２９（１）：２０６−１８．）。ＡＬＫ１、２、３を遮断する化合物を用いたが、内皮細胞バリアにおける影響はなんら観察することができなかった。また、ＧＦＰ＋における誘発は観察されなかった（データは図示せず）。結論として、本研究は、内皮バリア耐性を誘発することができる化合物を同定した。特に、ＲｅｐＳｏｘが、バリア耐性を強力に誘発可能であると同定された。Ｒｅｐｓｏｘは、トランスジェニック因子Ｓｏｘ２を置き換えた化合物を検索したスクリーンで発見された（Ｉｃｈｉｄａ ＪＫ，Ｂｌａｎｃｈａｒｄ Ｊ，Ｌａｍ Ｋ，Ｓｏｎ ＥＹ，Ｃｈｕｎｇ ＪＥ，Ｅｇｌｉ Ｄ，ｅｔ ａｌ．Ｃｅｌｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ．２００９；５（５）：４９１−５０３）。ＳＯＸ１７及びＫＬＦ４の誘発は、Ｒｅｐｓｏｘ処理時に同定された。ＳＯＸ１７（Ｚｈｏｕ Ｙ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ Ｊ，Ｓｍａｌｌｗｏｏｄ ＰＭ，Ｎａｔｈａｎｓ Ｊ．ＰｌｏＳ ｏｎｅ．２０１５；１０（１２）：ｅ０１４３６５０）、及びＫＬＦ４（Ｃｏｗａｎ ＣＥ，Ｋｏｈｌｅｒ ＥＥ，Ｄｕｇａｎ ＴＡ，Ｍｉｒｚａ ＭＫ，Ｍａｌｉｋ ＡＢ，Ｗａｒｙ ＫＫ．Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ ｒｅｓｅａｒｃｈ．２０１０；１０７（８）：９５９−６６）は、バリア形成を促進することが以前に示されている。結論として、ＣＬＤＮ５に対する転写レポーターを生成して使用し、多数の薬剤候補をカバーする化合物のライブラリーをスクリーニングして、ＶＥＧＦＡ、及び特に、経内皮バリア一体性を強力に誘発可能なＲｅｐｓｏｘにより、内皮細胞バリアの破壊を防止するＴＧＦβの阻害剤を発見し、それ故、インビボでの組織バリア一体性の更なる分析のために選択した。

Claims (25)

1. ｉ）インビボ経内皮バリア一体性（ＴＢＩ）を強化させること、又は、ｉｉ）内皮細胞（ＥＣ）のインビボＴＢＩを低下させることが可能な薬剤候補を同定するための、インビトロ法であって、
   ａ）タイトジャンクション遺伝子プロモーターの制御下においてレポーター遺伝子を含むＥＣを提供するステップであって、前記ＥＣが前記レポーター遺伝子を発現する細胞に関して濃縮されているステップと、
   ｂ）前記ＥＣを前記薬剤候補と接触させるステップと、
   ｃ）前記ＥＣを前記薬剤候補と接触させる前後にインビトロＴＢＩを測定するステップ、又は、前記薬剤候補と接触した前記ＥＣのインビトロＴＢＩを測定し、並行して、前記薬剤候補と接触していないＥＣのインビトロＴＢＩを測定するステップと
   を含み、
   （ｉ）前記薬剤候補と接触していない前記ＥＣのインビトロＴＢＩと比較してより高い、前記薬剤候補と接触した前記ＥＣのインビトロＴＢＩが、ＥＣのインビボＴＢＩを強化可能な薬剤であることを示し、（ｉｉ）前記薬剤候補と接触していない前記ＥＣのインビトロＴＢＩと比較してより低い、前記薬剤候補と接触した前記ＥＣのインビトロＴＢＩが、ＥＣのインビボＴＢＩを低下可能な薬剤であることを示す、方法。
2. ステップｃ）が、経内皮電気抵抗（ＴＥＥＲ）を測定することを含み、前記測定したＴＥＥＲは、インビトロＴＢＩを示す、請求項１に記載の方法。
3. ステップｃ）が、前記レポーター遺伝子の前記発現を測定することを含み、前記レポーター遺伝子の前記発現は、インビトロＴＢＩを示す、請求項１に記載の方法。
4. 前記タイトジャンクション遺伝子が、ＣＬＤＮ５、オクルディン（ＯＣＬＮ）、及びＭＡＲＶＥＬＤ３からなる群から選択され、特に、前記タイトジャンクション遺伝子はＣＬＤＮ５である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
5. 前記ＥＣが多能性幹細胞から分化しており、特に前記多能性幹細胞はヒト細胞である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
6. 前記レポーター遺伝子をコードするポリヌクレオチドが、前記タイトジャンクション遺伝子の３’末端に挿入され、特に、（ｉ）前記タイトジャンクション遺伝子レポーター遺伝子融合タンパク質が発現するか、又は（ｉｉ）前記レポーター遺伝子が内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）から発現するか、又は（ｉｉｉ）前記タイトジャンクション遺伝子レポーター遺伝子融合タンパク質が発現し、その後、個別のタイトジャンクションタンパク質及びレポータータンパク質へとプロセシングされる、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
7. 自己切断ペプチドをコードするポリヌクレオチドが、前記タイトジャンクション遺伝子と前記レポーター遺伝子との間に導入され、特に、前記自己切断ペプチドは、Ｐ２Ａ自己切断ペプチドである、請求項６（ｉｉｉ）に記載の方法。
8. 前記タイトジャンクション遺伝子の前記プロモーターの活性化により、前記レポーター遺伝子の発現がもたらされる、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
9. 前記細胞が、ステップａ）において蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）又は磁気活性化細胞選別（ＭＡＣＳ）により、前記レポーター遺伝子を発現する細胞に関して濃縮される、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
10. ハイスループットフォーマットで実施される、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
11. 薬剤開発状況において分子をスクリーニングするために、特に、薬剤候補化合物ライブラリーをハイスループットスクリーニングするために使用される、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
12. 前記タイトジャンクション遺伝子を発現する細胞の割合が３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、又は９５％を超える、請求項１〜１１のいずれか一項のステップ１）ａ）に従い作製した細胞培養液。
13. レポーター遺伝子を発現可能な細胞であって、前記レポーター遺伝子の発現がタイトジャンクション遺伝子のプロモーターの制御下にあり、特に、前記タイトジャンクション遺伝子はＣＬＤＮ５である、細胞。
14. 血管合併症と関連する疾患の治療で使用するための、２−［３−（６−メチル−２−ピリジニル）−１Ｈ−ピラゾール−４−イル］−１，５−ナフチリジン又は４−［４−［３−（２−ピリジニル）−１Ｈ−ピラゾール−４−イル］−２−ピリジニル］−Ｎ−（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−４−イル）−ベンズアミド。
15. 前記疾患が糖尿病性網膜症又はＷｅｔ ＡＭＤである、請求項１４に記載の使用のための２−［３−（６−メチル−２−ピリジニル）−１Ｈ−ピラゾール−４−イル］−１，５−ナフチリジン又は４−［４−［３−（２−ピリジニル）−１Ｈ−ピラゾール−４−イル］−２−ピリジニル］−Ｎ−（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−４−イル）−ベンズアミド。
16. 前記疾患が、２型及び１型糖尿病、糖尿病性網膜症、Ｗｅｔ ＡＭＤ、メタボリックシンドローム、重度肥満、高コレステロール血症、高血圧、冠動脈疾患、腎症、網膜症、腎臓不全、組織虚血、慢性低酸素症、アテローム性動脈硬化症、並びに、薬剤が誘発する毒性により引き起こされる組織浮腫からなる群から選択される、請求項１４に記載の使用のための２−［３−（６−メチル−２−ピリジニル）−１Ｈ−ピラゾール−４−イル］−１，５−ナフチリジン。
17. 前記疾患が、２型及び１型糖尿病、糖尿病性網膜症、Ｗｅｔ ＡＭＤ、メタボリックシンドローム、重度肥満、高コレステロール血症、高血圧、冠動脈疾患、腎症、網膜症、腎臓不全、組織虚血、慢性低酸素症、アテローム性動脈硬化症、並びに、薬剤が誘発する毒性により引き起こされる組織浮腫からなる群から選択される、請求項１４に記載の使用のための４−［４−［３−（２−ピリジニル）−１Ｈ−ピラゾール−４−イル］−２−ピリジニル］−Ｎ−（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−４−イル）−ベンズアミド。
18. 血管合併症と関連する疾患の治療のための医薬を製造するための、２−［３−（６−メチル−２−ピリジニル）−１Ｈ−ピラゾール−４−イル］−１，５−ナフチリジンの使用。
19. 血管合併症と関連する疾患の治療のための医薬を製造するための、４−［４−［３−（２−ピリジニル）−１Ｈ−ピラゾール−４−イル］−２−ピリジニル］−Ｎ−（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−４−イル）−ベンズアミドの使用。
20. 前記疾患が、２型及び１型糖尿病、糖尿病性網膜症、Ｗｅｔ ＡＭＤ、メタボリックシンドローム、重度肥満、高コレステロール血症、高血圧、冠動脈疾患、腎症、網膜症、腎臓不全、組織虚血、慢性低酸素症、アテローム性動脈硬化症、並びに、薬剤が誘発する毒性により引き起こされる組織浮腫からなる群から選択される、請求項１８又は１９のいずれか一項に記載の使用。
21. 前記疾患が糖尿病性網膜症又はＷｅｔ ＡＭＤである、請求項２０に記載の方法。
22. 個体における疾患の治療方法であって、前記個体に、２−［３−（６−メチル−２−ピリジニル）−１Ｈ−ピラゾール−４−イル］−１，５−ナフチリジンを薬学的に許容される形態で含む、治療に有効な量の組成物を投与することを含む、方法。
23. 個体における疾患の治療方法であって、前記個体に、４−［４−［３−（２−ピリジニル）−１Ｈ−ピラゾール−４−イル］−２−ピリジニル］−Ｎ−（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−４−イル）−ベンズアミドを薬学的に許容される形態で含む、治療に有効な量の組成物を投与することを含む、方法。
24. 前記疾患が、２型及び１型糖尿病、糖尿病性網膜症、Ｗｅｔ ＡＭＤ、メタボリックシンドローム、重度肥満、高コレステロール血症、高血圧、冠動脈疾患、腎症、網膜症、腎臓不全、組織虚血、慢性低酸素症、アテローム性動脈硬化症、並びに、薬剤が誘発する毒性により引き起こされる組織浮腫からなる群から選択される、請求項２２又は２３のいずれか一項に記載の方法。
25. 本明細書で上述した発明。

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