CN112567022A - 用于评定跨内皮屏障完整性的方法 - Google Patents

用于评定跨内皮屏障完整性的方法 Download PDF

Info

Publication number
CN112567022A
CN112567022A CN201980054641.6A CN201980054641A CN112567022A CN 112567022 A CN112567022 A CN 112567022A CN 201980054641 A CN201980054641 A CN 201980054641A CN 112567022 A CN112567022 A CN 112567022A
Authority
CN
China
Prior art keywords
cells
tbi
gene
vitro
reporter gene
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201980054641.6A
Other languages
English (en)
Inventor
C·A·考恩
C·A·迈尔
F·鲁德尼基
张继涛
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
F Hoffmann La Roche AG
Original Assignee
F Hoffmann La Roche AG
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by F Hoffmann La Roche AG filed Critical F Hoffmann La Roche AG
Publication of CN112567022A publication Critical patent/CN112567022A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G01N33/5044—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics involving specific cell types
    • G01N33/5064—Endothelial cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/435—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom
    • A61K31/44—Non condensed pyridines; Hydrogenated derivatives thereof
    • A61K31/4427—Non condensed pyridines; Hydrogenated derivatives thereof containing further heterocyclic ring systems
    • A61K31/4439—Non condensed pyridines; Hydrogenated derivatives thereof containing further heterocyclic ring systems containing a five-membered ring with nitrogen as a ring hetero atom, e.g. omeprazole
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/435—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom
    • A61K31/47—Quinolines; Isoquinolines
    • A61K31/4738—Quinolines; Isoquinolines ortho- or peri-condensed with heterocyclic ring systems
    • A61K31/4745—Quinolines; Isoquinolines ortho- or peri-condensed with heterocyclic ring systems condensed with ring systems having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. phenantrolines
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/069—Vascular Endothelial cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6897—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids involving reporter genes operably linked to promoters
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G01N33/502—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics for testing non-proliferative effects
    • G01N33/5023—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics for testing non-proliferative effects on expression patterns
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G01N33/502—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics for testing non-proliferative effects
    • G01N33/5032—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics for testing non-proliferative effects on intercellular interactions
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G01N33/5044—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics involving specific cell types
    • G01N33/5073—Stem cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/15—Transforming growth factor beta (TGF-β)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/70—Enzymes
    • C12N2501/72—Transferases [EC 2.]
    • C12N2501/727—Kinases (EC 2.7.)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2503/00—Use of cells in diagnostics
    • C12N2503/02—Drug screening
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2506/00—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells
    • C12N2506/03—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from non-embryonic pluripotent stem cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2510/00—Genetically modified cells

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Vascular Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)

Abstract

本申请涉及一种用于鉴定药物候选物的方法，所述药物候选物能够增加或降低内皮细胞的屏障组织完整性。此外，本申请涉及紧密连接基因转录报道基因作为跨内皮屏障完整性的替代标记物的用途。

Description

用于评定跨内皮屏障完整性的方法
技术领域
本申请涉及一种用于鉴定药物候选物的方法，所述药物候选物能够增加或降低内皮细胞的屏障完整性。此外，本申请涉及紧密连接基因转录报道基因作为跨内皮屏障完整性的替代标记物的用途。
背景技术
形成血-视网膜屏障(BRB)和血脑屏障(BBB)的内皮细胞屏障对于稳态和防止对眼睛和大脑的毒性和感染至关重要(Engelhardt B、Liebner S.Cell and tissueresearch.2014；355(3):687-99,Diaz-Coranguez M,Ramos C,Antonetti DA.Visionresearch.2017；139:123-37)。内皮细胞屏障的破坏与多种视网膜疾病有关，例如家族性渗出性玻璃体视网膜病变(Gilmour DF.Eye(London,England).2015；29(1):1-14)、年龄相关性黄斑变性和糖尿病性视网膜病变(Klaassen I,Van Noorden CJ,SchlingemannRO.Progress in retinal and eye research.2013；34:19-48)和大脑神经系统疾病(ZhaoZ,Nelson AR,Betsholtz C,Zlokovic BV.Cell.2015；163(5):1064-78)。内皮细胞(EC)表达紧密连接物和转运体的特化集合(Luissint AC,Artus C,Glacial F,GaneshamoorthyK,Couraud PO.Fluids and barriers of the CNS.2012；9(1):23)，该特化集合形成了具有高抗性的选择性障碍。
在体外自BRB和BBB分离的原代EC很快失去其体内发现的屏障特性，因此有几项研究使用复杂的二维和三维共培养系统，该复杂的二维和三维共培养系统使用来自神经血管接点(neurovascular junction)的原代细胞并且模拟体内条件(Helms HC,Abbott NJ,Burek M,Cecchelli R,Couraud PO,Deli MA等人.Journal of cerebral blood flow andmetabolism.2016；36(5):862-90,Nzou G,Wicks RT,Wicks EE,Seale SA,Sane CH,Chen A等人，Scientific reports.2018；8(1):7413)。用于药物探索的原代细胞的主要缺点是其寿命和可用性有限(Eglen R,Reisine T.2011；9(2):108-24)。多能干细胞具有分化为任何类型的成体细胞类型的潜能(Zhu Z,Huangfu D.Development(Cambridge,England).2013；140(4):705-17)，并且其已用于对血脑屏障进行建模(Lippmann ES,Azarin SM,Kay JE,Nessler RA,Wilson HK,Al-Ahmad A等人，Nature biotechnology.2012；30(8):783-91,Canfield SG,Stebbins MJ,Morales BS,Asai SW,Vatine GD,Svendsen CN等人，Journalof neurochemistry.2017；140(6):874-88)。这些公开模型的主要缺点是其非常复杂并且难以准确重现，从而使其难以适用于药物探索。
因此，仍然需要稳健并且有意义的跨内皮屏障完整性(TBI)模型和相应的细胞培养方法，所述模型和方法适合于生成大量能够建立高抗性体外TBI作为在健康和疾病状态下研究BRB和BBB的模型的EC。
本发明人先前已经建立了简单并且可扩大规模的6天方案来将人多能干细胞分化为功能性内皮细胞(Patsch C,Challet-Meylan L,Thoma EC,Urich E,Heckel T,O'Sullivan JF,等人，Nature cell biology.2015；17(8):994-1003)。
在此，发明人生成了具有高TBI的内皮细胞体外模型，该模型可用来寻找用于治疗具有内皮细胞破坏的疾病的新途径和靶标，特别是在药物筛选和/或开发环境中。
发明内容
本文提供了一种用于鉴定药物候选物的体外方法，所述药物候选物能够i)增加体内跨内皮屏障完整性(TBI)或ii)降低内皮细胞(EC)的体内TBI，所述方法包括以下步骤：
a)提供包含处于紧密连接基因启动子控制下的报道基因的EC，其中所述EC富含表达所述报道基因的细胞；
b)使所述EC与所述药物候选物接触；
c)在使所述EC与所述药物候选物接触之前和之后测量体外TBI，或者测量与所述药物候选物接触的所述EC的体外TBI并且并行地测量未与所述药物候选物接触的EC的体外TBI；
其中(i)与未与所述药物候选物接触的所述EC的体外TBI相比，与所述药物候选物接触的所述EC的体外TBI较高指示能够增加EC的体内TBI的药物，并且(ii)与未与所述药物候选物接触的所述EC的体外TBI相比，与所述药物候选物接触的所述EC的体外TBI较低指示能够降低EC的体内TBI的药物。
在一个实施例中，步骤c)包括测量跨内皮电阻(TEER)，其中所述测量的TEER指示体外TBI。
在一个实施例中，步骤c)包括测量报道基因的表达，其中所述报道基因的表达指示体外TBI。
在一个实施例中，紧密连接基因选自由以下项组成的组：CLDN5、闭合蛋白(OCLN)和MARVELD3，特别地其中所述紧密连接基因是CLDN5。
在一个实施例中，EC是从多能干细胞分化的，特别地其中所述多能干细胞是人细胞。
在一实施例中，多能干细胞源自患有与血管并发症相关联的疾病的受试者。
在一个实施例中，将编码报道基因的多核苷酸插入紧密连接基因的3’末端处，特别地其中(i)使紧密连接基因报道基因融合蛋白表达，或者(ii)使报道基因从内部核糖体进入位点(IRES)表达，或者(iii)使紧密连接基因报道基因融合蛋白表达并随后加工成单独的紧密连接蛋白和报道蛋白。
在一个实施例中，在紧密连接基因与报道基因之间引入编码自切割肽的多核苷酸，特别地其中所述自切割肽是P2A自切割肽。
在一个实施例中，紧密连接基因的启动子的激活导致报道基因的表达。
在一个实施例中，在步骤a)中通过荧光激活细胞分选(FACS)或磁性激活细胞分选(MACS)从细胞中富集表达报道基因的细胞。
在一个实施例中，本文所提供的方法以高通量形式执行。
在一个实施例中，本文所提供的方法用于在药物开发环境中筛选分子，特别是用于高通量筛选药物候选物化合物文库。
在一个实施例中，提供了一种根据本文所述方法的步骤1)a)产生的细胞培养物，其中表达所述紧密连接基因的细胞的分数高于30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或95％。
在一个实施例中，提供了一种能够表达报道基因的细胞，其中所述报道基因的表达处于紧密连接基因的启动子的控制下，所述紧密连接基因选自由以下项组成的组：CLDN5、闭合蛋白(OCLN)和MARVELD3。
在一个实施例中，提供了2-[3-(6-甲基-2-吡啶基)-1H-吡唑-4-基]-1,5-萘啶或4-[4-[3-(2-吡啶基)-1H-吡唑-4-基]-2-吡啶基]-N-(四氢-2H-吡喃-4-基)-苯甲酰胺，其用于治疗与血管并发症相关联的疾病。
附图说明
图1：CLDN5转录报道基因的基因组编辑。用于生成CLDN5-P2A-GFP报道基因的靶向策略的示意图。在CLDN5的终止密码子附近设计SgRNA，同时生成供体载体以携带无启动子的P2A-GFP序列，该序列侧接有两个同源臂(HA)，该HA在每个末端处具有piggyBac反向末端重复序列(ITR)。(LHA-左同源臂，RHA-右同源臂，PURO-嘌呤霉素，tTK-截短的胸苷激酶)。靶向分两个步骤执行，首先通过CLDN5与供体模板之间的同源重组修复由Cas9和sgRNA引起的双链断裂，然后通过仅切除piggybac转座酶去除抗性盒(图1a)。供体载体的示意图(图1b)。在基因组编辑和嘌呤霉素选择(细胞池-基因组编辑-嘌呤霉素选择(CPGP))之后，通过PCR和凝胶电泳检测报道基因的成功整合(图1c)。通过PCR和凝胶电泳检测抗性盒的成功切除(细胞池切除(CPE))(图1d)。通过PCR和凝胶电泳验证克隆(图1e)。阳性克隆的CLDN5基因座的Sanger序列(图1f)。
图2：包含CLDN5报道基因的干细胞源性内皮细胞的生成和表征。将WT和CLDN5-GFP报道系的人多能干细胞分化为内皮细胞，对来自CLDN5-GFP EC的EC进行荧光激活细胞分选(图2a)。实时观察到的GFP+和GFP-分选细胞的电子细胞基质阻抗感测(图2b)。一个克隆的代表值，通过质谱和RNA-seq测量的明显上调或下调的蛋白及其相应mRNA的Spearman相关性(图2c)。CLDN5(图2d)、OCLN、MARVELD3和PECAM1(图2e)和VEGFA受体2(KDR)(图2f)的相对RNA和蛋白表达。列示出了平均值±标准偏差。**＝p<0.01，***＝p<0.001
图3：CLDN5-GFP+EC显示出高内皮细胞屏障的功能反应。用50ng/mL VEGFA刺激GFP+细胞，并实时测量电子细胞基质阻抗(图3a)。在VEGFA处理2天后，用FACS测量细胞的相对GFP+％(图3b)。用5μM SU11248处理细胞2天，并确定GFP+细胞的百分比(图3c)，实时测量阻抗(图3d)，并测量FITC-右旋糖酐渗透性(图3e)。列示出了平均值±标准偏差。***＝p<0.001
图4：诱导EC屏障电阻的化合物的鉴定。在一式两份的平板中测试化合物文库。化合物以5μM使用，并且在处理后2天确定GFP+细胞的百分比(图4)。使用与DMSO相比2倍的平均GFP+细胞诱导百分比，鉴定出了62种化合物被映射到几种靶标类别(例如，TGFBR抑制剂)。
图5：对跨内皮屏障完整性(TBI)的拯救。候选化合物与VEGFA共处理时的阻抗实时测量。将GFP+细胞与50ng/mL VEGFA一起孵育，并实时测量电子细胞基质阻抗(图5)。Repsox(10μM)拯救VEGFA治疗诱导的TBI损失。列示出了平均值±标准偏差。
具体实施方式
如本文所用，术语“限定的培养基”或“化学上限定的培养基”是指其中所有单独的成分以及其相应的浓度为已知的细胞培养基。限定的培养基可含有重组的并且化学上限定的成分。
如本文所用，术语“分化(differentiating/differentiation/differentiate)”是指将较低分化的细胞转化为体细胞，例如将多能干细胞转化为EC的一个或多个步骤。通过本文描述的方法实现了多能干细胞至EC的分化。
如本文所用，“内皮细胞”，缩写为“EC”，是这样的细胞，所述细胞表达特异性表面标记物CD144(分化簇144，也称为钙粘素5、2型或血管内皮(VE)钙粘素，官方符号CDH5)并且具有内皮细胞的特征，即毛细血管样管形成，以及选自由以下项组成的组的一种或多种另外的表面标记物的表达：CD31(分化簇31，官方符号PECAM1)、vWF(冯维尔布兰德因子(VonWillebrand factor)，官方符号VWF)、CD34(分化簇34，官方符号CD34)、CD105(分化簇105，官方符号ENG)、CD146(分化簇34，官方符号MCAM)，以及VEGFR-2(激酶插入结构域受体(III型受体酪氨酸激酶)，官方符号KDR)。
如本文所用的“扩增培养基”是指可用于使内皮细胞在单层上扩增和传代的任何化学上限定的培养基。
“融合”是指组分(例如，紧密连接基因和报道基因)直接地或经由一个或多个肽接头而通过肽键连接。
如本文所用，术语“GW788388”是指4-[4-[3-(2-吡啶基)-1H-吡唑-4-基]-2-吡啶基]-N-(四氢-2H-吡喃-4-基)-苯甲酰胺。
如本文所用，术语“生长因子”是指引起细胞增殖的生物活性多肽或小分子化合物，并且包括生长因子及其类似物两者。
如本文所使用的“高通量筛选”应理解为表示可以使用本文所述的新颖测定并行和/或顺序地分析和比较大量不同的疾病模型条件和/或化学化合物。典型地，此类高通量筛选在多孔微量滴定板中执行，例如在96孔板或384孔板或具有1536或3456个孔的板中执行。
如本文所用的“诱导培养基”是指可用于将已接触抗原的细胞(primed cell)诱导成单层上的CD144阳性(CD144+)内皮细胞的任何化学上限定的培养基。
如本文所用的“多能细胞单层”是指多能干细胞被提供为多个单独细胞，该多个单独细胞以一个单层膜的形式附着至粘附基质，这与培养细胞团或拟胚体不同，在所述细胞团或拟胚体中，多层固体细胞团形成附着至粘附基质的各种三维形成物。
如本文所用的“多能性培养基”是指可用于将多能干细胞作为单细胞附着在单层上，同时保持所述多能干细胞的多能性的任何化学上限定的培养基。可用的多能性培养基是在本领域中众所周知的并且也在本文中进行了描述。在如本文所述的特定实施例中，多能性培养基含有以下生长因子中的至少一者：碱性成纤维细胞生长因子(bFGF，也描述为成纤维细胞生长因子2，FGF2)和转化生长因子β(TGFβ)。
如本文所用，术语“重编程”是指将体细胞转化为低分化细胞，例如将成纤维细胞、脂肪细胞、角化细胞或白细胞转化为多能干细胞所需的一个或多个步骤。“经重编程的”细胞是指通过对如本文所述的体细胞进行重编程而得到的细胞。
如本文所用，术语“Repsox”是指2-[3-(6-甲基-2-吡啶基)-1H-吡唑-4-基]-1,5-萘啶。
如本文所用的术语“小分子”或“小化合物”或“小分子化合物”是指合成或天然存在的有机或无机分子，所述分子的分子量通常小于10,000克/摩尔，任选地小于5,000克/摩尔，并且任选地小于2,000克/摩尔。
如本文所用的术语“体细胞”是指形成生物本体的任何细胞，所述细胞不是种系细胞(例如，精子和卵子、由精子和卵子形成的细胞(配子母细胞))和未分化的干细胞。
如本文所用的术语“干细胞”是指具有自我更新能力的细胞。如本文所用的“未分化的干细胞”是指具有分化成多种细胞类型的能力的干细胞。如本文所用，“多能干细胞”是指可以产生多种细胞类型的细胞的干细胞。多能干细胞(PSC)包括人胚胎干细胞(hESC)和人诱导多能干细胞(hiPSC)。人诱导多能干细胞可来源于经重编程的体细胞，例如通过本领域已知并且在本文中进一步描述的方法转导四种限定的因子(Sox2、Oct4、Klf4、c-Myc)。所述人类体细胞可获自健康个体或患者。这些供体细胞可以从任何合适的来源获得。本文中优选的是允许在不对人体进行侵入性操作的情况下分离供体细胞的来源，例如人皮肤细胞、血细胞或可从尿液样品获得的细胞。尽管人多能干细胞为优选的，但是该方法也适用于非人多能干细胞，例如灵长类、啮齿动物(例如大鼠、小鼠、兔子)和狗多能干细胞。
如本文所用，术语“跨内皮屏障完整性”，缩写为“TBI”，是指内皮细胞的体外和体内功能标志。内皮细胞(EC)充当血管腔与周围组织之间的半选择性屏障，控制物质的通过以及白血细胞进出血流的转运。在健康和疾病条件下观察屏障功能的丧失，例如TBI的暂时或永久丧失相吻合的创伤愈合、血管化以及慢性炎症。可以通过在如本文所述并且在本领域中已知的适当条件(例如，短期原代细胞培养)下产生的EC单层(例如，EC培养物)来对TBI进行体外建模。可以用本领域已知并且如本文所述的方法(例如，测量TEER和FITC-右旋糖酐渗透性)来测量TBI，例如，体外TBI。如本文所用，术语“体外TBI”是指体外内皮细胞培养物的TBI，其中所述TBI是在培养中跨细胞单层测量的，例如在单层下方的培养容器表面与细胞单层上方的细胞培养基之间测量的(在经典2D细胞培养设置中)。因此，如本文所用，术语“体内TBI”是指内皮细胞的体内TBI，其中所述TBI是在血管腔与周围组织之间建立和/或确定的(例如，测量的)。
本发明人惊奇地发现紧密连接基因的转录报道基因可以充当TBI的替代标记物，即，报道基因的表达与TBI相关。此外，该报道基因的表达可用来选择和富集能够建立高体外TBI的细胞。用如本文所述的方法产生的细胞培养物可用于预测对如本文所述的药物候选物的体内反应。作为概念的证明，将报道基因阳性细胞用血管内皮生长因子(VEGFA)、体内有效的血管通透性因子处理，随后观察到了TBI的显著丧失(图3a)并且有趣地，观察到了报道基因阳性细胞减少。用广泛的酪氨酸激酶受体(SU11248)抑制剂进行处理导致报道基因阳性细胞增加，并且用酪氨酸激酶抑制剂与VEGFA一起对细胞进行共处理防止TBI分解(图3c)。如本文所提供的该数据和另外的数据表明如本文所述的紧密连接基因转录报道基因可用作EC TBI的替代标记物。如本文所述的报道基因构建体以及包含此类报道基因构建体的细胞，尤其可用于分析化学文库以寻找诱导高内皮屏障完整性或防止屏障破坏丧失的化合物的方法中。
因此，本文提供了一种用于鉴定药物候选物的体外方法，所述药物候选物能够i)增加体内跨内皮屏障完整性(TBI)或ii)降低内皮细胞(EC)的体内TBI，所述方法包括以下步骤：
a)提供包含处于紧密连接基因启动子控制下的报道基因的EC，特别地其中所述EC富含表达所述报道基因的细胞；
b)使所述EC与所述药物候选物接触；
c)在使所述EC与所述药物候选物接触之前和之后测量体外TBI，或者测量与所述药物候选物接触的所述EC的体外TBI并且并行地测量未与所述药物候选物接触的EC的体外TBI；
其中(i)与未与所述药物候选物接触的所述EC的体外TBI相比，与所述药物候选物接触的所述EC的体外TBI较高指示能够增加EC的体内TBI的药物，并且(ii)与未与所述药物候选物接触的所述EC的体外TBI相比，与所述药物候选物接触的所述EC的体外TBI较低指示能够降低EC的体内TBI的药物。
不受理论束缚，本发明尤其提供了TBI细胞培养模型，其中评定EC的体外TBI以建立和/或预测药物候选物对内皮细胞的体内TBI的效应。因此，可以根据如本文所提供的方法选择合适的药物候选物。
本文提供了具有令人惊讶的高TBI的TBI模型，其中EC包含在紧密连接基因启动子控制下的报道基因，其中该报道基因与紧密连接基因启动子的活性可操作地偶联。
如本文所用，“紧密连接基因启动子”是指可操作地连接至紧密连接基因的基因启动子。紧密连接基因启动子的激活导致了相关联的紧密连接基因的表达(转录和翻译)。因此，报道基因与紧密连接基因启动子的操作偶联(例如通过将编码报道基因的DNA插入紧密连接基因的基因座或将编码报道基因的DNA与编码紧密连接基因的DNA序列融合)导致了在激活紧密连接基因启动子时报道基因的表达。用于将报道基因插入基因的基因座和/或将报道基因与启动子可操作地偶联的方法是本领域中已知的并且也在本文中进行了描述。
如本文所用，“报道基因”是指其表达可以被测定的基因。在一个优选的实施例中，报道基因是编码蛋白的基因，该蛋白的产生和检测被用作替代以(间接地)检测待报道的紧密连接启动子的活性。合适的报道基因是本领域中广泛已知的，并且包括例如具有固有荧光的蛋白(例如，荧光蛋白)。通过测量来自能够表达报道基因的细胞(例如，EC培养物)的荧光信号，可以方便地(例如，实时)检测或监测此类蛋白的表达。为此目的，如本文所述的方法包括测量报道基因的表达水平，其中报道基因的表达水平指示紧密连接基因的表达，并且因此被用作TBI的替代标记物。在一个优选的实施例中，通过测量荧光来确定报道基因的表达，其中荧光水平(例如，GFP荧光)指示TBI。
术语“具有固有荧光的蛋白”包括野生型荧光蛋白和表现出改变的光谱或物理特性的突变体。该术语不包括仅由于蛋白内未修饰的酪氨酸、色氨酸、组氨酸和苯丙氨酸基团的荧光作用而显示弱荧光的蛋白。具有固有荧光的蛋白是本领域已知的，例如绿色荧光蛋白(GFP)、红色荧光蛋白(RFP)、蓝色荧光蛋白(BFP，Heim等人，1994，1996)、青色荧光变体，称为CFP(Heim等人1996；Tsien 1998)；黄色荧光变体，称为YFP(Ormo等人1996；Wachter等人1998)；紫色可激发的绿色荧光变体，称为Sapphire(Tsien 1998；Zapata-Hommer等人2003)；青色可激发的绿色荧光变体，称为增强绿色荧光蛋白或EGFP(Yang等人1996)。然而，还设想了可以检测其催化活性的酶。此类酶的非限制性实例是荧光素酶、β半乳糖苷酶、碱性磷酸酶。荧光素酶是一种单体酶，分子量(MW)为61kDa。它充当催化剂，并能够在三磷酸腺苷(ATP)和Mg2+存在下将D-荧光素转化为荧光素腺苷酸。此外，焦磷酸(PPi)和单磷酸腺苷(AMP)也作为副产物生成。然后将中间体荧光素腺苷酸氧化为氧化荧光素、二氧化碳(CO2)和光。氧化荧光素是一种生物发光产物，可以通过反应中释放的光在发光计中进行定量测量。荧光素酶报道基因测定是可商购的并且是本领域已知的，例如，荧光素酶1000测定系统和ONE-GloTM荧光素酶测定系统。
在本发明的说明性实施例中，作为概念的证明，提供了CLDN5转录报道基因，其中报道基因GFP插入在所述CLDN5基因的3’末端处。所述报道基因用作具有高屏障功能的内皮细胞(即TBI)的替代标记物(参见图1a)。报道基因hPSC系可分化成EC，其中生成了例如20％的GFP+EC群体。可以如本文所述将细胞进一步FACS分选为GFP+群体和GFP-群体，其中观察到与GFP-EC相比，GFP+EC的屏障阻抗显著增加(参见图2a和图2b)。
如本文所述，报道基因的表达与紧密连接蛋白的表达可操作地偶联。在本发明的说明性实施例中，作为概念证明，提供了CLDN5转录报道基因，其中所述CLDN5转录报道基因表达为融合蛋白并且随后被加工成单独的紧密连接蛋白和报道蛋白。加工成单独的蛋白的优点是紧密连接基因(例如，CLDN5)发挥其细胞功能，而没有由于附接的报道多肽导致的潜在干扰或相互作用破坏。因此，在本发明的一个优选实施例中，紧密连接基因报道基因融合蛋白被表达并随后加工成单独的不同蛋白。例如，可以通过在紧密连接基因与报道基因之间引入自切割肽来进行后续加工。
然而，本领域中已知的其他系统也可用于表达报道基因和紧密连接基因，优选地来自同一基因座的报道基因和紧密连接基因，例如，内部核糖体进入位点(IRES)在本领域中用于表达来自一个启动子的两种蛋白。
因此，如本文所述的方法将生成具有一个或多个紧密连接基因的高表达的EC群体以建立具有高TBI的细胞培养模型与用于评定一个或多个紧密连接基因的表达水平的报道基因功能进行了组合。这对于建立用于高通量筛选(例如，药物测试)、评定响应于药物的组织屏障功能的标准化细胞培养物特别有用。报道基因(例如，GFP)测量可用于建立用于筛选的细胞培养系统，并且随后作为筛选过程本身期间的读数(可评定的信号)。不受理论的束缚，紧密连接基因(导入的报道基因为其替代标记物)的表达指示屏障功能(例如，TBI)的完整性或破坏。
在本发明的另一个变型中，通过本领域中已知的方法直接测量TBI。在本发明的此类实施例中，报道基因大体上或主要用于富集EC群体中具有一种或多种紧密连接基因的高表达的细胞。此后，所得富集的细胞群可用于建立TBI的细胞培养模型。通过直接评定屏障功能(例如跨内皮电阻或FITC右旋糖酐迁移率)的方法或如在本领域中众所周知的屏障完整性或破坏的其他度量来完成在药物候选物施加之前和/或之后的测量。因此，在一个特定的实施例中，提供了本文所述的方法，其中步骤c)包括测量跨内皮电阻(TEER)，其中所测量的TEER指示TBI。能够以高通量模式测量TEER的系统为例如购自Applied Biophysics的ECIS Z-θ系统，其中96孔阵列板可用于在药物筛选设置中建立TEER。
如本文所述，报道基因与紧密连接基因启动子可操作地偶联，优选地通过将报道基因整合到紧密连接基因的基因座中而可操作地偶联。具体地，可以通过基因编辑，例如使用CRISPR/CAS9基因编辑系统，将报道基因整合到EC的基因组中。紧密连接基因是本领域已知的，并且可以根据其在建立高抗性屏障功能或未能建立高抗性屏障功能的EC群体中的表达模式进一步选择。屏障功能可以如本文所述进行测量。在本发明的特定实施例中，紧密连接基因选自由以下项组成的组：CLDN5、闭合蛋白(OCLN)和MARVELD3，特别地其中紧密连接基因是CLDN5。
根据本领域已知的方案，可以在体外制备本发明方法的步骤a)中提供的EC。对于本发明的目的特别有用的是源自多能干细胞的EC。多能干细胞具有自我更新的特征，并且可以分化为成年哺乳动物体内的所有主要细胞类型。多能干细胞对于本发明的方法特别有用，因为其可以在标准化细胞培养条件下大量生产。因此，优选地，EC是从多能干细胞中分化的。在一个实施例中，EC是从胚胎干细胞分化的。在另一个实施例中，EC是从诱导多能干细胞(IPSC)分化的。在一个实施例中，IPSC是从经重编程的体细胞产生的。可以通过引入参与维持IPSC特性的具体基因来实现将体细胞重编程为IPSC。适用于将体细胞重编程为IPSC的基因包括但不限于Oct4、Sox2、Klf4和C-Myc及其组合。在一个实施例中，用于重编程的基因是Oct4、Sox2、Klf4和C-Myc。WO2012/022725中描述了用于将体细胞转分化为NPC的基因的组合，该专利通过引用并入本文。
内脏、皮肤、骨骼、血液和结缔组织均由体细胞组成。用于产生IPSC的体细胞包括但不限于成纤维细胞、脂肪细胞和角化细胞，并且可以从皮肤活检中获得。其他合适的体细胞是获自血液样品的白细胞、成红细胞或获自血液或尿液样品并通过本领域已知的方法并如本文所述重编程为IPSC的上皮细胞或其他细胞。体细胞可以获自健康个体或患病个体。在一个实施例中，体细胞来源于患有疾病的受试者(例如，人类受试者)。在一个实施例中，该疾病与血管并发症相关联(例如，与糖尿病性视网膜病变和/或湿性AMD相关血管并发症相似或相同)。通过本领域已知的方法，将本文所述的用于重编程的基因引入体细胞中，或者通过重编程载体将该基因递送至细胞中，或者通过小分子激活所述基因。重编程的方法尤其包括逆转录病毒、慢病毒、腺病毒、质粒和转座子、微小RNA、小分子、修饰的RNA信使RNA和重组蛋白。在一个实施例中，使用慢病毒递送如本文所述的基因。在另一个实施例中，使用仙台病毒颗粒将Oct4、Sox2、Klf4和C-Myc递送至体细胞。另外，可以在至少一种小分子的存在下培养体细胞。在一个实施例中，所述小分子包含Rho相关卷曲螺旋形成蛋白丝氨酸/苏氨酸激酶(ROCK)家族的蛋白激酶的抑制剂。ROCK抑制剂的非-限制性实例包括法舒地尔(1-(5-异喹啉磺酰基)高哌嗪)、噻唑韦(Thiazovivin)(N-苄基-2-(嘧啶-4-基氨基)噻唑-4-甲酰胺)和Y-27632((+)-(R)-反式-4-(1-氨基乙基)-N-(4-吡啶基)环己烷甲酰胺二盐酸盐)。
提供界定的多能干细胞单层，对于所得培养物的可再现性和效率是优选的。在一个实施例中，多能干细胞的单层可以通过将细胞酶促解离为单细胞并将其置于粘附基质上来制备，该基质诸如预包被的基质胶板(例如，从BD Bioscience获得的BD Matrigel hESC、从Invitrogen获得的Geltrex hESC、来自Corning的Synthemax)。适用于解离为单细胞的酶的实例包括Accutase(Invitrogen)、胰蛋白酶(Invitrogen)、TrypLe表达(Invitrogen)。在一实施例中，将每平方厘米20000至60000个细胞铺板在粘附基质上。本文所用的培养基是多能性培养基，其促进多能干细胞作为单层中的单细胞附着并生长。在一个实施例中，多能性培养基是无血清培养基，其补充有Rho相关卷曲螺旋形成蛋白丝氨酸/苏氨酸激酶(ROCK)家族的蛋白激酶的小分子抑制剂(在本文中称为ROCK激酶抑制剂)。
因此，在一个实施例中，上述方法的步骤a)包括在多能性培养基中提供单层多能干细胞，其中所述多能性培养基是补充有ROCK激酶抑制剂的无血清培养基。
适用于将多能干细胞附着于基质的无血清培养基的实例是来自Stem CellTechnologies的mTeSR1或TeSR2、来自ReproCELL的Primate ES/iPS细胞培养基、来自Invitrogen的StemPro hESC SFM、来自Lonza的X-VIVO。可用于本文的ROCK激酶抑制剂的实例是法舒地尔(1-(5-异喹啉磺酰基)高哌嗪)、噻唑韦(Thiazovivin)(N-苄基-2-(嘧啶-4-基氨基)噻唑-4-甲酰胺)和Y27632(R)-反式-4-(1-氨基乙基)-N-(4-吡啶基)环己烷甲酰胺二盐酸盐，例如目录号：1254，来自Tocris bioscience)。在一个实施例中，多能性培养基是补充有2-20μM Y27632，优选5-10μM Y27632的无血清培养基。在另一个实施例中，多能性培养基是补充有2-20μM法舒地尔的无血清培养基。在另一个实施例中，多能性培养基是补充有0.2-10μM的噻唑韦(Thiazovivin)的无血清培养基。
在一个实施例中，上述方法的步骤a)包括在多能性培养基中提供多能干细胞的单层，并使所述单层在多能性培养基中生长一天(24小时)。在另一个实施例中，上述方法的步骤a)包括在多能性培养基中提供多能干细胞的单层，并使所述单层在多能性培养基中生长18小时至30小时，优选23至25小时。
在另一个实施例中，上述方法的步骤a)包括在多能性培养基中提供多能干细胞的单层，其中所述多能性培养基是补充有ROCK激酶抑制剂的无血清培养基，并使所述单层在多能性培养基中生长一天(24小时)。在另一个实施例中，上述方法的步骤a)包括在多能性培养基中提供多能干细胞的单层，其中所述多能性培养基是补充有ROCK激酶抑制剂的无血清培养基，并使所述单层在多能性培养基中生长18小时至30小时，优选23至25小时。
在一个实施例中，使细胞与引发培养基接触以诱导分化。在一个实施例中，使细胞与补充有小分子的引发培养基接触，该小分子激活β-连环蛋白和/或Wnt信号传导和/或刺猬(HH)信号传导并通过在诱导培养基中孵育引发的细胞来诱导分化。在一个实施例中，激活β-连环蛋白和/或Wnt信号传导和/或刺猬(HH)信号传导的小分子选自以下项的组：糖原合成酶激酶3(Gsk3a-b)的小分子抑制剂、CDC样激酶1(Clk1-2-4)的小分子抑制剂、丝裂原激活蛋白激酶15(Mapk15)的小分子抑制剂、双特异性酪氨酸-(Y)-磷酸化调节激酶(Dyrk1a-b 4)的小分子抑制剂、周期蛋白依赖性激酶16(Pctk1-3 4)的小分子抑制剂、β-连环蛋白(或γ-连环蛋白)与共激活因子蛋白CBP(CREB结合蛋白)和p300(E1A结合蛋白p300)间相互作用的平滑化(SMO)激活剂和调节剂。
优选地，所述糖原合酶激酶3(Gsk3a-b)抑制剂是基于吡咯烷二酮的GSK3抑制剂。如本文所用，“基于吡咯烷二酮的GSK3抑制剂”涉及GSK3α和GSK3β的具有低IC50值的选择性细胞渗透性ATP竞争性抑制剂。在一个实施例中，基于吡咯烷二酮的GSK3抑制剂选自由以下项组成的组：SB216763(3-(2,4-二氯苯基)-4-(1-甲基-1H-吲哚-3-基)-1H-吡咯-2,5-二酮)、SB415286(3-[(3-氯-4-羟基苯基)氨基]-4-(2-硝基苯基)-1H-吡咯-2,5-二酮)、N6-{2-[4-(2,4-二氯-苯基)-5-咪唑-1-基-嘧啶-2-基氨基]-乙基}-3-硝基-吡啶-2,6-二胺2HCl、3-咪唑并[1,2-a]吡啶-3-基-4-[2-(吗啉-4-羰基)-1,2,3,4-四氢-[1,4]二氮杂环庚并[6,7,1-hi]吲哚-7-基]-吡咯-2,5-二酮、肯帕罗酮(Kenpaullone)(9-溴-7,12-二氢-吲哚并[3,2-d][1]苯并打杂环庚-6(5H)-酮)、CHIR99021(9-溴-7,12-二氢-吡啶并[3',2':2,3]氮杂环庚并[4,5-b]吲哚-6(5H)-酮)和3-(3-氨基-苯基)-4-(1-甲基-1H-吲哚-3-基)-吡唑-2,5-二酮(CP21R7，本文中也称为“化合物21”，参阅，例如，L.Gong等人；Bioorganic&Medicinal Chemistry Letters 20(2010),1693-1696)。在一个优选的实施例中，所述基于吡咯烷二酮的GSK3抑制剂是CP21R7。
在一个实施例中，所述CDC样激酶1(Clk1-2-4)抑制剂选自包括苯并噻唑和3-氟-N-[1-异丙基-6-(1-甲基-哌啶-4-基氧)-1,3-二氢-苯并咪唑-(2E)-亚基]-5-(4-甲基-1H-吡唑-3-磺酰基)-苯甲酰胺的组。
在一个实施例中，所述丝裂原激活蛋白激酶15(Mapk15)抑制剂选自包括4-(4-氟苯基)-2-(4-甲基亚磺酰基苯基)-5-(4-吡啶基)-1H-咪唑(SB203580)和5-异喹啉磺酰胺(H-89)的组。
在一个实施例中，所述双特异性酪氨酸-(Y)-磷酸化调节激酶(Dyrk1a-b 4)抑制剂选自包括6-[2-氨基-4-氧代-4H-噻唑-(5Z)-亚基甲基]-4-(四氢-吡喃-4-基氧)-喹啉-3-腈的组。
在一个实施例中，所述平滑化激活剂是嘌吗啡胺(Purmorphamine)(2-(1-萘氧基)-6-(4-吗啉代苯胺基)-9-环己基嘌呤。
β-连环蛋白(或γ-连环蛋白)与共激活因子蛋白CBP(CREB结合蛋白)和p300(E1A结合蛋白p300)间相互作用的调节剂的实例是IQ-1(2-(4-乙酰基-苯基偶氮)-2-[3,3-二甲基-3,4-二氢-2H-异喹啉-(1E)-亚基]-乙酰胺和ICG-001((6S,9aS)-6-(4-羟基-苄基)-8-萘-1-基甲基-4,7-二氧代-六氢-吡嗪并[1,2-a]嘧啶-1-甲酸苄基酰胺(WO 2007056593)。
在一个实施例中，引发培养基补充有转化生长因子β(TGFβ)的小分子抑制剂。在一个实施例中，TGFβ的小分子抑制剂是SB431542。
在一个实施例中，上述方法的步骤a)包括将所述细胞在引发培养基中孵育约2至约4天(约48小时至约96小时)。在一个实施例中，上述方法的步骤a)包括将所述细胞在引发培养基中孵育约3天(约72小时)。
在一个实施例中，所述引发培养基是补充有胰岛素、转铁蛋白和孕酮的无血清培养基。在一个实施例中，所述无血清培养基补充有10-50μg/ml胰岛素、10-100μg/ml转铁蛋白和10-50nM黄体酮，优选30-50μg/ml胰岛素、20-50μg/ml转铁蛋白和10-30nM黄体酮。适用于引发的无血清培养基的实例是N2B27培养基(N2B27是DMEM/F12的1:1混合物(Gibco,Paisley,UK)，补充有N2和B27(均来自Gibco))、N3培养基(由DMEM/F12(Gibco,Paisley,UK)、25μg/ml胰岛素、50μg/ml转铁蛋白、30nM亚硒酸钠、20nM孕酮、100nM腐胺(Sigma)构成)或
Figure BDA0002945373720000161
NS-A增殖培养基(Stemcell Technologies)。在一个实施例中，所述引发培养基是无血清培养基，其补充有胰岛素、转铁蛋白、孕酮和小分子，该小分子激活β-连环蛋白(钙粘蛋白相关蛋白，β1；人类基因名称CTNNB1)途径和/或Wnt受体信号传导途径和/或刺猬(HH)信号传导途径。优选地，所述小分子选自包含以下项的组：3-(2,4-二氯苯基)-4-(1-甲基-1H-吲哚-3-基)-1H-吡咯-2,5-二酮(SB216763)、3-[(3-氯-4-羟基苯基)氨基]-4-(2-硝基苯基)-1H-吡咯-2,5-二酮(SB415286)、N6-{2-[4-(2,4-二氯-苯基)-5-咪唑-1-基-嘧啶-2-基氨基]-乙基}-3-硝基-吡啶-2,6-二胺2HCl、3-咪唑并[1,2-a]吡啶-3-基-4-[2-(吗啉-4-羰基)-1,2,3,4-四氢-[1,4]二氮杂环庚并[6,7,1-hi]吲哚-7-基]-吡咯-2,5-二酮、9-溴-7,12-二氢-吲哚并[3,2-d][1]苯并环庚-6(5H)-酮(肯帕罗酮)、9-溴-7,12-二氢-吡啶并[3',2':2,3]氮杂环庚并[4,5-b]吲哚-6(5H)-酮(CHIR99021)、3-(3-氨基-苯基)-4-(1-甲基-1H-吲哚-3-基)-吡咯-2,5-二酮(CP21R7，本文中也称为“化合物21”)、苯并噻唑、3-氟-N-[1-异丙基-6-(1-甲基-哌啶-4-基氧)-1,3-二氢-苯并咪唑-(2E)-亚基]-5-(4-甲基-1H-吡唑-3-磺酰基)-苯甲酰胺、4-(4-氟苯基)-2-(4-甲基亚磺酰基苯基)-5-(4-吡啶基)-1H-咪唑(SB203580)、5-一扩林磺酰胺(H-89)、6-[2-氨基-4-氧代-4H-噻唑-(5Z)-亚基甲基]-4-(四氢-吡喃-4-基氧)-喹啉-3-腈、2-(1-萘氧基)-6-(4-吗啉代苯胺基)-9-环己基嘌呤(嘌吗啡胺)、2-(4-乙酰基-苯基偶氮)-2-[3,3-二甲基-3,4-二氢-2H-异喹啉-(1E)-亚基]-乙酰胺(IQ-1)和ICG-001((6S,9aS)-6-(4-羟基-苄基)-8-萘-1-基甲基-4,7-二氧代-六氢-哌嗪并[1,2-a]嘧啶-1-甲酸苄基酰胺。
在另一个实施例中，上述方法的步骤a)包括在引发培养基中孵育所述细胞，其中所述引发培养基是补充有CP21R7(3-(3-氨基-苯基)-4-(1-甲基-1H-吲哚-3-基)-吡咯-2,5-二酮)的无血清培养基。优选地，所述引发培养基补充有0.5–4μM CP21R7(3-(3-氨基-苯基)-4-(1-甲基-1H-吲哚-3-基)-吡咯-2,5-二酮)，最优选1-2μM CP21R7(3-(3-氨基-苯基)-4-(1-甲基-1H-吲哚-3-基)-吡咯-2,5-二酮)。在另一个实施例中，上述方法的步骤a)包括在引发培养基中孵育所述细胞，其中所述引发培养基是补充有CP21R7(3-(3-氨基-苯基)-4-(1-甲基-1H-吲哚-3-基)-吡咯-2,5-二酮)的无血清培养基，并使所述细胞生长2至4天(48小时至96小时)。在另一个实施例中，上述方法的步骤a)包括在引发培养基中孵育所述细胞，其中所述引发培养基是补充有CP21R7(3-(3-氨基-苯基)-4-(1-甲基-1H-吲哚-3-基)-吡咯-2,5-二酮)的无血清培养基，并将所述细胞孵育三天(72小时)。
在一个实施例中，引发培养基是无血清培养基，其包含10-50μg/ml胰岛素、10-100μg/ml转铁蛋白和10-50nM孕酮，补充有0.5-4μM CP21R7(3-(3-氨基-苯基)-4-(1-甲基-1H-吲哚-3-基)-吡咯-2,5-二酮)。
在一个实施例中，引发培养基还包含重组骨形态发生蛋白-4(BMP4)。在一个优选的实施例中，引发培养基是无血清培养基，其包含10-50μg/ml胰岛素、10-100μg/ml转铁蛋白和10-50nM孕酮，补充有0.5-4μM CP21R7(3-(3-氨基-苯基)-4-(1-甲基-1H-吲哚-3-基)-吡咯-2,5-二酮)和10-50ng/ml重组骨形态发生蛋白-4(BMP4)。
在一个实施例中，使细胞与诱导培养基接触以进行分化。为了主要诱导内皮细胞，所述诱导培养基补充有VEGF(＝血管内皮生长因子)或胎盘样生长因子1(PLGF-1)和小分子腺苷酸环化酶激活剂。在一个实施例中，所述小分子腺苷酸环化酶激活剂导致PKA/PKI信号传导途径的激活。在一个实施例中，所述小分子腺苷酸激活剂选自包括以下项的组：毛喉素(醋酸(3R)-(6aαH)十二氢-6β,10α,10bα-三羟基-3β,4aβ,7,7,10aβ-五甲基-1-氧代-3-乙烯基-1H-萘并[2,1-b]吡喃-5β-酯)、8-溴-cAMP(8-溴腺苷-3',5'-环状单磷酸酯)和肾上腺髓质素。在一个实施例中，所述诱导培养基是补充有人血清白蛋白、乙醇胺、转铁蛋白、胰岛素和氢化可的松的无血清培养基。适用于诱导的无血清培养基的实例是StemPro-34(Invitrogen，主要成分：人血清白蛋白、脂质剂(诸如Human Ex-
Figure BDA0002945373720000171
和乙醇胺或其混合物)、人锌胰岛素、氢化可的松、铁饱和转移2-巯基乙醇和D,L-生育酚乙酸酯或其衍生物或混合物)以及X-VIVO 10和15(Lonza)。
在一个实施例中，所述诱导培养基是无血清培养基，其补充有人血清白蛋白、乙醇胺、转铁蛋白、胰岛素和氢化可的松以及1-10μM毛喉素和5-100ng/ml VEGF-A。在另一个实施例中，诱导培养基包含补充有30-70ng/ml VEGF-A或30-70ng/ml胎盘样生长因子1(PLGF-1)的StemPro-34(来自Invitrogen)。
在一个实施例中，上述方法的步骤a)包括通过在补充有VEGF-A或胎盘样生长因子1(PLGF-1)和小分子腺苷酸环化酶激活剂的诱导培养基中孵育所述引发的细胞来诱导分化为内皮细胞，其中所述小分子腺苷酸环化酶激活剂选自毛喉素、8-溴-cAMP和肾上腺髓质素。在一个实施例中，诱导培养基是补充有1-10μM毛喉素和5-100ng/ml VEGF-A(优选2μM毛喉素和50ng/ml VEGF-A)的无血清培养基。
在另一个实施例中，上述方法的步骤a)包括通过在补充有VEGF-A或胎盘样生长因子1(PLGF-1)和小分子腺苷酸环化酶激活剂的诱导培养基中将所述引发的细胞孵育一天来诱导分化为内皮细胞。
在另一个实施例中，上述方法的步骤a)包括通过在补充有VEGF-A或胎盘样生长因子1(PLGF-1)和小分子腺苷酸环化酶激活剂的诱导培养基中将所述引发的细胞孵育18小时至48小时，优选22小时至36小时，来诱导分化为内皮细胞。
在一个实施例中，上述方法的步骤a)包括在诱导培养基中将所述细胞孵育约18小时至约48小时。在一个实施例中，上述方法的步骤a)包括在诱导培养基中将所述细胞孵育约24小时。
引发和诱导后，EC可以进一步扩增以产生大量细胞。因此，在另一个实施例中，本发明的所述方法还包括在适用于内皮细胞增殖的条件下孵育步骤a)的产物。优选地，所述适用于内皮细胞增殖的条件包括收获对于报道基因(例如，GFP)呈阳性的细胞，并将其在化学上界定的扩增培养基中扩增。如本文所用，“收获”涉及细胞从粘附基质的酶促解离和随后重悬浮在新培养基中。在一个优选的实施例中，如本文所述在收获后分选细胞。在一个实施例中，所述扩增培养基是补充有VEGF-A的无血清培养基。适用于内皮细胞扩增的无血清培养基的实例是StemPro-34(Invitrogen)、EGM2(Lonza)和DMEM/F12(Invitrogen)，所述DMEM/F12(Invitrogen)补充有8ng/ml FGF-2、50ng/ml VEGF和10μM SB431542(4-(4-苯并[1,3]二氧杂环戊-5-基-5-吡啶-2-基-1H-咪唑-2-基)-苯甲酰胺)。优选地，在贴壁培养条件下培养内皮细胞。在一个实施例中，扩增培养基补充有5-100ng/ml VEGF-A。在另一个实施例中，扩增培养基是补充有5-100ng/ml，优选50ng/ml VEGF-A的StemPro-34。
可以从根据本发明的包含处于紧密连接基因启动子控制下的报道基因的EC中富集表达该报道基因的细胞，这将指示紧密连接基因的表达。不同的细胞分选和富集方案是本领域已知的。细胞分选方法的实例包括流式细胞术，包括荧光激活细胞分选(FACS)和磁激活细胞分选(MACS)。在一个优选的实施例中，EC在细胞例如GFP内表达报道基因。然而，还设想了部分或全部位于EC细胞表面上的报道蛋白，例如，报道基因编码跨膜蛋白，该跨膜蛋白包含可用于细胞表面标记以及相应的分选和富集技术(例如，MACS)的胞外部分。本文呈现的流式细胞术分析表明，可以从培养物中富集的GFP阳性细胞占细胞总数的不到40％至最多60％或更多，优选占细胞总数的不到30％至最多80％或更多，最优选最多占细胞总数的90％以上。如本文所述，GFP阳性部分中的大多数细胞显示出典型的EC形态。特别地，所富集的部分显示出增加的跨内皮电阻(TEER)。
通过本文描述的方法获得的内皮细胞可以扩增数代，并且培养可以很好地表征。可以将通过本文所述方法获得的内皮细胞的等分试样可重复地冷冻和解冻。可以如本文所述进一步扩增解冻的细胞以达到所需的细胞数量，这特别适合于建立化合物筛选所需的通量。
根据本发明的方法产生的细胞可用于建立病理或非病理状况的体外模型，其中跨内皮屏障功能的建立或丧失是相关的。在一个特定的实施例中，提供了一种用于鉴定药物候选物的体外方法，所述药物候选物能够i)增加体内跨内皮屏障完整性(TBI)或ii)降低内皮细胞(EC)的体内TBI，该方法由以下顺序步骤组成：
a)提供包含处于紧密连接基因启动子控制下的报道基因的EC，其中所述EC富含表达所述报道基因的细胞；
b)使EC与药物候选物接触以及在使EC与药物候选物接触之前和之后测量体外TBI，或者使EC与药物候选物接触以及测量与药物候选物接触的EC的体外TBI并且并行地测量未与药物候选物接触的EC的体外TBI；
其中(i)与未与所述药物候选物接触的所述EC的体外TBI相比，与所述药物候选物接触的所述EC的体外TBI较高指示能够增加EC的体内TBI的药物，并且(ii)与未与所述药物候选物接触的所述EC的体外TBI相比，与所述药物候选物接触的所述EC的体外TBI较低指示能够降低EC的体内TBI的药物。
在另一个实施例中，提供了一种用于选择药物候选物的体外方法，所述药物候选物用于体内应用于患有与跨内皮屏障完整性破坏或丧失相关的疾病的个体，该方法由以下顺序步骤组成：
a)提供包含处于紧密连接基因启动子控制下的报道基因的EC，其中所述EC富含表达所述报道基因的细胞；
b)使EC与药物候选物接触以及在使EC与药物候选物接触之前和之后测量体外TBI，或者使EC与药物候选物接触以及测量与药物候选物接触的EC的体外TBI并且并行地测量未与药物候选物接触的EC的体外TBI；
其中选择具有比未与药物候选物接触的EC的体外TBI更高的与药物候选物接触的EC的TBI的药物候选物用于药物候选物的体内应用。
如本文所述，本发明的方法提供细胞收率增加的EC培养物，该培养物具有增加的紧密连接形成并因此具有增加的屏障完整性。在一个实施例中，提供了根据本文所述的体外方法的步骤a)产生的细胞培养物。优选地，本文使用和描述的细胞培养物中富集了如本文所述的表达报道基因的EC。因此，本文使用和描述的细胞培养物包含超过30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或超过99％的表达报道基因的EC。在一个优选的实施例中，本文提供的细胞培养物包含超过90％的表达报道基因的EC，最优选超过95％的表达报道基因的EC。不受理论的束缚，报道基因的表达将与控制报道基因表达的紧密连接基因的表达相关。因此，本发明提供了EC细胞培养物，其中超过30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或超过99％的EC表达紧密连接基因，例如，CLDN5、OCLN和MARVELD3。在一个优选的实施例中，本文提供的细胞培养物包含超过90％的表达CNDN5的EC，最优选超过95％的表达CNDN5的EC。
在本发明的上下文中，较高的体外TBI是指，与参考条件下的细胞培养物(例如，未与药物候选物接触的EC培养物)相比，对感兴趣的细胞培养物(例如，与药物候选物接触的EC培养物)测得的更高值的与TBI有关的参数(例如，TEER)。在一个实施例中，与所测得的未与药物候选物接触的EC培养物的体外TBI相比，所测得的与药物候选物接触的EC培养物的体外TBI更高，尤其是与所测得的未与药物候选物接触的EC培养物的体外TBI相比，至少高约1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍或10倍。在一个实施例中，与所测得的未与药物候选物接触的EC培养物的体外TBI相比，所测得的与药物候选物接触的EC培养物的体外TBI更低，尤其是与所测得的未与药物候选物接触的EC培养物的体外TBI相比，至少低约1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍或10倍。在一个实施例中，本文所述方法的步骤c)包括测量跨内皮电阻(TEER)，其中所测量的TEER指示体外TBI。在一个实施例中，与所测得的未与药物候选物接触的EC培养物的体外TEER相比，所测得的与药物候选物接触的EC培养物的TEER更高，尤其是与所测得的未与药物候选物接触的EC培养物的TEER相比，至少高约1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍或10倍。在一个实施例中，与所测得的未与药物候选物接触的EC培养物的体外TEER相比，所测得的与药物候选物接触的EC培养物的TEER更低，尤其是与所测得的未与药物候选物接触的EC培养物的TEER相比，至少低约1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍或10倍。在一个实施例中，报道基因是荧光蛋白(例如，GFP)，并且与所测得的未与药物候选物接触的EC(例如，EC培养物)的荧光相比，所测得的与药物候选物接触的EC(例如，EC培养物)的荧光更高，特别是与所测得的未与药物候选物接触的EC(例如，EC培养物)的荧光相比，至少高约1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍或10倍。在一个实施例中，报道基因是荧光蛋白(例如，GFP)，并且与所测得的未与药物候选物接触的EC(例如，EC培养物)的荧光相比，所测得的与药物候选物接触的EC(例如，EC培养物)的荧光更低，特别是与所测得的未与药物候选物接触的EC(例如，EC培养物)的荧光相比，至少低约1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍或10倍。用于测量TEER和荧光的手段是本领域众所周知的，并且也在本文中进行了描述。
在本发明的一个实施例中，提供了一种用于产生具有高TBI的患者特异性或健康个体特异性EC的方法。这对于与遗传突变相关联的疾病状况尤其理想，但是，在没有遗传突变与疾病状况相关联的情况下，或者在与遗传突变的联系未知或不应该存在的情况下，患者特异性疾病模型也可能是相关的。为此，在本文所述方法中使用了从患者或健康个体获得的人诱导多能干细胞(iPSC)。所述患者特异性人iPSC可以通过本领域已知的方法获得，并且如本文进一步描述的那样，通过将从患者或健康个体获得的体细胞重编程为多能干细胞来获得。例如，成纤维细胞、角化细胞或脂肪细胞可通过皮肤活检从需要治疗的个体或健康个体获得，并通过本领域已知的方法并且如本文进一步描述的那样经重编程为诱导多能干细胞。其他适合作为诱导多能干细胞来源的体细胞是从血液样品获得的白细胞或从尿液样品获得的上皮细胞或其他细胞。然后通过本文所述的方法将患者特异性诱导多能干细胞分化为患者特异性的患病或健康的EC。在本发明的另一方面，提供了通过任何前述方法产生的EC群。优选地，EC群是患者特异性的，即源自从患病个体获得的iPSC。在另一个实施例中，所述EC群是从健康个体获得的。源自患者的EC代表一种与疾病相关的体外模型，用于研究2型和1型糖尿病、湿性AMD、代谢综合征和严重肥胖等疾病的血管并发症的病理生理。在一个实施例中，通过该方法获得的EC用于筛选逆转、抑制或预防由内皮细胞功能障碍引起的血管并发症的化合物，该血管并发症例如由2型和1型糖尿病、湿性AMD、代谢综合征、严重肥胖、高胆固醇血症、高血压、冠状动脉疾病、肾病变、视网膜病变、肾衰竭、组织缺血、慢性缺氧、动脉硬化和药源性毒性所致的组织水肿所致的血管并发症。优选地，通过本文所述的本发明的方法获得的所述EC来自患病的受试者。分化来自患病受试者的EC代表了独特的机会，可以在人类背景研究范式下进行药物安全性的早期评估。
在另一个实施例中，通过该方法获得的EC用作血-视网膜屏障(BRB)和/或血脑屏障(BBB)的体外模型。
一个实施例是通过根据本发明的方法获得的EC培养物用于确定药物候选物的功效的用途。培养物可以源自健康个体和/或患病个体，并且可以将使用本文所述的EC培养物进行的功效和/或毒性研究的结果整合，以预测药物候选物的疾病和/或治疗相关的生理效应。在一个实施例中，评定药物候选物的体外功效概况，并选择具有有利功效性的药物候选物用于进一步开发。进一步的开发可能包括在非人灵长动物体内的药物候选物体内测试和/或在人类体内的药物候选物体内测试。
示例性实施例：
1.一种用于鉴定药物候选物的体外方法，所述药物候选物能够i)增加体内跨内皮屏障完整性(TBI)或ii)降低内皮细胞(EC)的体内TBI，所述方法包括以下步骤：
a)提供包含处于紧密连接基因启动子控制下的报道基因的EC，特别地其中所述EC富含表达所述报道基因的细胞；
b)使所述EC与所述药物候选物接触；
c)在使所述EC与所述药物候选物接触之前和之后测量体外TBI，或者测量与所述药物候选物接触的所述EC的体外TBI并且并行地测量未与所述药物候选物接触的EC的体外TBI；
其中(i)与未与所述药物候选物接触的所述EC的体外TBI相比，与所述药物候选物接触的所述EC的体外TBI较高指示能够增加EC的体内TBI的药物，并且(ii)与未与所述药物候选物接触的所述EC的体外TBI相比，与所述药物候选物接触的所述EC的体外TBI较低指示能够降低EC的体内TBI的药物。
2.根据实施例1所述的方法，其中步骤a)中的EC作为细胞单层，特别是作为汇合的细胞单层提供。
3.根据实施例1或2中任一项所述的方法，其中步骤a)中的EC被提供在细胞培养载体上，特别是在多孔板上，更特别是在选自由以下项组成的组的多孔板上：24孔板、96孔板、384孔板或1536孔板。
4.根据实施例1至3中任一项所述的方法，其中步骤c)包括测量跨内皮电阻(TEER)，其中测得的TEER指示体外TBI。
5.根据实施例1至3中任一项所述的方法，其中步骤c)包括测量报道基因的表达，其中报道基因的表达指示体外TBI。
6.根据实施例1至5中任一项所述的方法，其中紧密连接基因选自由以下项组成的组：CLDN5、闭合蛋白(OCLN)和MARVELD3，特别地其中紧密连接基因是CLDN5。
7.根据实施例1至6中任一项所述的方法，其中EC是从多能干细胞分化的。
8.根据实施例1至7中任一项所述的方法，其中多能干细胞是胚胎干细胞或诱导多能干细胞。
9.根据实施例1至8中任一项所述的方法，其中多能干细胞是人类细胞。
10.根据实施例1至9中任一项所述的方法，其中多能干细胞源自患有与血管并发症相关联的疾病的受试者。
11.根据实施例7至10中任一项所述的方法，其中步骤a)包括在补充有激活β-连环蛋白和/或Wnt信号传导和/或刺猬(HH)信号传导的小分子的诱导培养基中孵育多能干细胞，以及通过在诱导培养基中孵育引发的细胞来诱导分化。
12.根据实施例11所述的方法，其中激活β-连环蛋白和/或Wnt信号传导和/或刺猬(HH)信号传导的小分子选自由以下项组成的组：糖原合成酶激酶3(Gsk3a-b)的小分子抑制剂、CDC样激酶1(Clk1-2-4)的小分子抑制剂、丝裂原激活蛋白激酶15(Mapk15)的小分子抑制剂、双特异性酪氨酸-(Y)-磷酸化调节激酶(Dyrk1a-b 4)的小分子抑制剂、周期蛋白依赖性激酶16(Pctk1-3 4)的小分子抑制剂、β-连环蛋白(或γ-连环蛋白)与共激活因子蛋白CBP(CREB结合蛋白)和p300(E1A结合蛋白p300)间相互作用的平滑化(SMO)激活剂和调节剂。
13.根据实施例11或12中任一项所述的方法，其中引发培养基补充有转化生长因子β(TGFβ)的小分子抑制剂。
14.根据实施例13所述的方法，其中TGFβ的小分子抑制剂是SB431542。
15.根据实施例11至14中任一项所述的方法，其中步骤a)包括在引发培养基中将细胞孵育2至4天，特别是3天。
16.根据实施例11至15中任一项所述的方法，其中步骤a)的引发培养基是补充有胰岛素、转铁蛋白和孕酮的无血清培养基。
17.根据实施例11至16中任一项所述的方法，其中步骤a)的激活β-连环蛋白和/或Wnt信号传导和/或刺猬(HH)信号传导的小分子是3-(3-氨基-苯基)-4-(1-甲基-1H-吲哚-3-基)-吡咯-2,5-二酮(CP21R7)。
18.根据实施例11至17中任一项所述的方法，其中步骤a)的引发培养基还包含重组骨形态发生蛋白-4(BMP4)。
19.根据实施例11至18中任一项所述的方法，其中引发培养基是无血清培养基，其包含10-50μg/ml胰岛素、10-100μg/ml转铁蛋白和10-50nM孕酮，补充有0.5-4μM CP21R7(3-(3-氨基-苯基)-4-(1-甲基-1H-吲哚-3-基)-吡咯-2,5-二酮)和10-50ng/ml重组骨形态发生蛋白-4(BMP4)，特别地，其中引发培养基包含1μM CP21R7和25ng/ml BMP4。
20.根据实施例11至19中任一项所述的方法，其中诱导培养基是补充有VEGF-A(血管内皮生长因子)或胎盘样生长因子1(PLGF-1)和小分子腺苷酸环化酶激活剂的无血清培养基。
21.根据实施例20所述的方法，其中小分子腺苷酸激活剂选自包括以下项的组：毛喉素((3R)-(6aαH)十二氢-6β,10α,10bα-三羟基-3β,4aβ,7,7,10aβ-五甲基-1-氧代-3-乙烯基-1H-萘并[2,1-b]吡喃-5β-基酯)、8-溴-cAMP(8-溴腺苷-3',5'-环状单磷酸酯)和肾上腺髓质素。
22.根据实施例11至21中任一项所述的方法，其中诱导培养基是补充有1-10μM毛喉素和5-100ng/ml VEGF-A，特别是200ng/ml VEGF和2μM毛喉素的无血清培养基。
23.根据实施例11至22中任一项所述的方法，其中步骤a)包括将细胞在诱导培养基中孵育18小时至48小时。
24.根据实施例1至23中任一项所述的方法，还包括将步骤a)的产物在适用于EC增殖的扩增培养基中孵育。
25.根据实施例24所述的方法，其中扩增培养基补充有VEGF-A，特别是50ng/mlVEGF-A。
26.根据实施例1至25中任一项所述的方法，其中将编码报道基因的多核苷酸插入紧密连接基因的3'末端处，特别地其中(i)使紧密连接基因报道基因融合蛋白表达，或者(ii)使报道基因从内部核糖体进入位点(IRES)表达，或者(iii)使紧密连接基因报道基因融合蛋白表达并随后加工成单独的紧密连接蛋白和报道蛋白。
27.根据实施例26(iii)所述的方法，其中在紧密连接基因与报道基因之间引入编码自切割肽的多核苷酸，特别地其中自切割肽是P2A自切割肽。
28.根据实施例1至27中任一项所述的方法，其中紧密连接基因的启动子的激活导致报道基因的表达。
29.根据实施例1至28中任一项所述的方法，其中报道基因编码发光蛋白，特别是荧光蛋白。
30.根据实施例1至29中任一项所述的方法，其中报道基因编码绿色荧光蛋白(GFP)。
31.根据实施例1至30中任一项所述的方法，其中在步骤a)中通过荧光激活细胞分选(FACS)或磁性激活细胞分选(MACS)从细胞中富集表达报道基因的细胞。
32.根据实施例24至31所述的方法，其中在使细胞与扩增培养基接触之前，从细胞中富集表达报道基因的细胞。
33.根据实施例1至32中任一项所述的方法，该方法以高通量形式执行。
34.根据实施例1至33中任一项所述的方法，该方法用于在药物开发环境中筛选分子，特别是用于高通量筛选药物候选物化合物文库。
35.一种根据实施例1至34中任一项所述的步骤1)a)产生的细胞培养物，特别地其中表达紧密连接基因的细胞的百分比高于30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或95％。
36.一种能够表达报道基因的细胞，其中所述报道基因的表达处于紧密连接基因的启动子的控制下。
37.根据实施例36所述的细胞，其中该细胞包含编码报道基因的多核苷酸，其中编码报道基因的多核苷酸插入在紧密连接基因的3'末端。
38.根据实施例36或37中任一项所述的细胞，其中该细胞包含编码以下项的多核苷酸：(i)紧密连接基因报道基因融合蛋白或(ii)紧密连接基因和报道基因之间的自切割肽，特别地其中自切割肽是P2A自切割肽。
39.根据实施例36至38中任一项所述的细胞，其中紧密连接基因的启动子的激活导致报道基因的表达。
40.根据实施例36至39中任一项所述的细胞，其中紧密连接基因选自由以下项组成的组：CLDN5、闭合蛋白(OCLN)和MARVELD3，特别地其中紧密连接基因是CLDN5。
41.根据实施例36至40中任一项所述的细胞，其中报道基因编码发光蛋白，特别地其中报道基因编码荧光蛋白，更特别地其中报道基因编码绿色荧光蛋白(GFP)。
42.2-[3-(6-甲基-2-吡啶基)-1H-吡唑-4-基]-1,5-萘啶用于治疗与血管并发症相关联的疾病的用途。
43.4-[4-[3-(2-吡啶基)-1H-吡唑-4-基]-2-吡啶基]-N-(四氢-2H-吡喃-4-基)-苯甲酰胺用于治疗与血管并发症相关联的疾病的用途。
44.2-[3-(6-甲基-2-吡啶基)-1H-吡唑-4-基]-1,5-萘啶，其用于根据实施例42所述之使用，其中疾病选自由以下项组成的组：2型糖尿病和1型糖尿病、糖尿病性视网膜病变、湿性AMD、代谢综合征、重症肥胖、高胆固醇血症、高血压、冠状动脉疾病、肾病、视网膜病变、肾衰竭、组织缺血、慢性缺氧、动脉粥样硬化和由药物引起的毒性导致的组织水肿。
45.4-[4-[3-(2-吡啶基)-1H-吡唑-4-基]-2-吡啶基]-N-(四氢-2H-吡喃-4-基)-苯甲酰胺，其用于根据实施例43所述之使用，其中疾病选自由以下项组成的组：2型糖尿病和1型糖尿病、糖尿病性视网膜病变、湿性AMD、代谢综合征、重症肥胖、高胆固醇血症、高血压、冠状动脉疾病、肾病、视网膜病变、肾衰竭、组织缺血、慢性缺氧、动脉粥样硬化和由药物引起的毒性导致的组织水肿。
46.2-[3-(6-甲基-2-吡啶基)-1H-吡唑-4-基]-1,5-萘啶，其用于根据实施例44所述之使用，其中疾病是糖尿病性视网膜病变或湿性AMD。
47.4-[4-[3-(2-吡啶基)-1H-吡唑-4-基]-2-吡啶基]-N-(四氢-2H-吡喃-4-基)-苯甲酰胺，其用于根据实施例45所述之使用，其中疾病是糖尿病性视网膜病变或湿性AMD。
48.2-[3-(6-甲基-2-吡啶基)-1H-吡唑-4-基]-1,5-萘啶用于制备用于治疗与血管并发症相关联的疾病的药物的用途。
49.4-[4-[3-(2-吡啶基)-1H-吡唑-4-基]-2-吡啶基]-N-(四氢-2H-吡喃-4-基)-苯甲酰胺用于制备用于治疗与血管并发症相关联的疾病的药物的用途。
50.根据实施例48或49中任一项所述的用途，其中疾病选自由以下项组成的组：2型糖尿病和1型糖尿病、糖尿病性视网膜病变、湿性AMD、代谢综合征、重症肥胖、高胆固醇血症、高血压、冠状动脉疾病、肾病、视网膜病变、肾衰竭、组织缺血、慢性缺氧、动脉粥样硬化和由药物引起的毒性导致的组织水肿。
51.根据实施例50所述的用途，其中疾病是糖尿病性视网膜病变或湿性AMD。
52.一种治疗个体疾病的方法，所述方法包括向所述个体施用治疗有效量的组合物，所述组合物包含药用形式的2-[3-(6-甲基-2-吡啶基)-1H-吡唑-4-基]-1,5-萘啶。
53.一种治疗个体疾病的方法，所述方法包括向所述个体施用治疗有效量的组合物，所述组合物包含药用形式的4-[4-[3-(2-吡啶基)-1H-吡唑-4-基]-2-吡啶基]-N-(四氢-2H-吡喃-4-基)-苯甲酰胺。
54.根据实施例52或53中任一项所述的方法，其中疾病选自由以下项组成的组：2型糖尿病和1型糖尿病、糖尿病性视网膜病变、湿性AMD、代谢综合征、重症肥胖、高胆固醇血症、高血压、冠状动脉疾病、肾病、视网膜病变、肾衰竭、组织缺血、慢性缺氧、动脉粥样硬化和由药物引起的毒性导致的组织水肿。
55.根据权利要求54所述的方法，其中疾病是糖尿病性视网膜病变或湿性AMD。
56.如前所述的发明。
材料和方法
人PSC培养和分化。人ESC系SA001(Zetterqvist AV,Blanco F,Ohman J,KotovaO,Berglund LM,de Frutos Garcia S,等人,Journal of diabetes research.2015；2015:428473.)获自Cellartis AB(Englund MC,Caisander G,Noaksson K,Emanuelsson K,Lundin K,Bergh C,等人,In vitro cellular&developmental biology Animal.2010；46(3-4):217-30.)。对细胞系进行常规支原体污染测试，在整个研究过程中均为阴性。SA001系已经使用STR分析、g谱带和Illumina SNP阵列(Omni Express)进行测试。插入CLDN5-P2A-GFP后，重复STR分析、g谱带和Illumina SNP阵列(Omni Express)。使用Accutase(StemCell Technologies)将细胞常规传代，并以1:10至1:15的稀释率重新铺板成小细胞团。为了分化，使用Accutase将hPSC解离。遵循描述的分化方案(Patsch C,Challet-MeylanL,Thoma EC,Urich E,Heckel T,O'Sullivan JF,等人,Nature cell biology.2015；17(8):994-1003.)并作如下修改：由StemPro和50ng/mL VEGFA组成的扩增培养基仅在第一次分裂时才被保留在细胞上。从第二次分裂开始，使用VascuLife VEGF内皮细胞培养基完全试剂盒(LifeLine Cell Technology)培养细胞。添加到培养基中的补充剂的最终组成为10％FBS、4mM L-谷氨酰胺、0.75U/mL硫酸肝素、5ng/mL FGF-2、5ng/mL EGF、5ng/mL VEGFA、15ng/mL IGF1、1μg/mL氢化可的松半琥珀酸酯、50μg/mL抗坏血酸。将SB431542(10μM)补充至培养基中。每隔一天更换一次培养基。使用传代5代到传代9代的细胞执行实验。
使用CRISPR/Cas9基因组编辑和Piggybac切除技术将GFP报道基因无痕整合到CLDN5基因座中。将Cas9靶向位点选择为靠近终止密码子(GCGAGGCGTTGGATAAGCCT)，通过体外转录(Thermo Fisher)产生互补的sgRNA。设计用于在CRISPR/Cas9 DNA双链断裂后通过同源重组修复进行GFP整合的载体构建体(图1b)，其具有位于人CLDN5终止密码子左侧和右侧的长度分别为694bp和518bp的同源臂。将CLDN5终止密码子下游61个核苷酸处的ATAA位点更改为右侧同源重组臂中的TTAA，以允许进行抗性基因盒的进一步piggyBac切除。该载体携带在EF1A启动子下的对嘌呤霉素和截短的胸苷激酶的抗性基因盒。存在允许进行piggyBac切除的反向末端重复(ITR)序列和允许进行Cre重组酶切除的LoxP位点，以用于去除抗性基因盒。在核转染前4h，用10μM的Y-27632(Calbiochem)预处理hPSC。使用Amaxa 4d核转染子(Lonza)和原代细胞P3核转染子溶液(Lonza)，使用CM130程序，用10.8μg特异性sgRNA、8μg Cas9和2.4μg质粒载体供体，对200'000个细胞进行核转染。核转染后，将细胞用10μM Y-27632处理24小时。将细胞静置5天以令其从核转染中恢复，然后在用嘌呤霉素(200μg/mL)选择下扩增。选择后，使用Amaxa 4d核转染子(程序：CM130)和仅用于切除的piggyBac mRNA转座酶(1.75ug，Transposagen)对细胞进行核转染。在几块培养板上以1-300个细胞/cm2的系列稀释度接种核转染后的细胞。直径达到200μm后，挑选出分离良好的单细胞集落。用PBS洗涤细胞，并留在0.1mL/cm2 PBS中，同时挑选菌落。用无菌移液器端部刮掉菌落，吸取菌落，然后将其重新铺板在装有mTeSR1培养基的基质胶包被的48孔板上，从而分离菌落。4小时后，将培养基替换为新的mTeSR1培养基，并进一步用10μM Y-27632处理24小时。
细胞在mTeSR1中扩增直至汇合。使用96孔板血液DNA提取试剂盒(Qiagen)分离DNA。使用在TK编码序列中设计的引物(正向-GTACCCGAGCCGATGACTTAC、反向-CCCGGCCGATATCTCA、探针-CTTCCGAGACAATCGCGAACATCTACACC)和与参考基因RPP30进行多重反应的引物(正向-GATTTGGACCTGCGA、反向-GCGGCTGTCTCCACA、探针-CTGACCTGAAGGCTCT)，通过qPCR评估抗性基因盒的切除。根据制造商的说明，在Light Cyler 480(Roche)上使用光循环仪试剂盒(Roche)进行QPCR。使用FastStart试剂盒(Roche)和结合至GFP或TK或插入物外部的引物(R1-GGCTGGACAGAGAACAGGAC、F2-GCCCCCGAACCTTCAAAGA、R2-CTGCACGCCGTAGGTCAG、F3-GGAGATGGGGGAGGC TAACT)，通过PCR验证了通过qPCR显示TK最低表达的克隆。生成的PCR产物在由TBE缓冲液(Life Technologies)中的1％琼脂糖(Sigma)组成的凝胶上电泳。按照生产商的说明，使用QIAquick PCR纯化试剂盒(Qiagen)纯化PCR产物，并用于Sanger测序(Microsynth)。
荧光激活细胞分选和分析。用Accutase(StemCell Technologies)将人PSC-EC从板上解离并过滤，然后用30μm过滤器(Miltenyi Biotec)分选。在分选过程中，将解离的细胞保持在完全培养基中，并在冷却的收集管中分选，该收集管中具有补充有20％FBS和25mMHEPES的完全EC培养基。使用BD FACS ARIA III(BD Biosciences)，以4通道纯度精密模式进行分选。FACS图由Flowjo_V10软件生成。对于RNA-seq，至少要分选100,000个细胞。分选后，将细胞离心分离(610g，10分钟)，并在650μL RLT裂解缓冲液(Qiagen)+β-巯基乙醇(1％)中裂解，然后在室温下涡旋1分钟并速冻。对于质谱分析，最少要分选106个细胞，用PBS--(Life Technologies)洗涤细胞，离心分离(110g，3分钟)，去除PBS，将细胞沉淀物速冻。
RNA分离。使用Rneasy微型试剂盒或Rneasy迷你试剂盒(均来自Qiagen)或自动Maxwell Total RNA纯化试剂盒(Promega)从FACS分选或培养的细胞中分离RNA，所有步骤均包括DNAse I消化。过程遵循试剂盒方案中所述。
RNA测序和分析。将来自FACS分选或培养的处理样品的细胞的总RNA进行寡核苷酸(dT)捕获和富集，然后将所得的mRNA部分用于构建互补的DNA文库。使用标准方案(TruSeqStranded Total RNA文库，Illumina)在Illumina HiSeq平台上进行转录组测序(RNA-seq)，每个样品产生约3千万次每次50个碱基对的读数。使用来自2个不同克隆的6个重复样本，进行GFP+和GFP-细胞的FACS分选实验。然后使用GSNAP将RNA-seq读数映射到人类基因组(NCBI构建37)(Wu TD,Nacu S.Bioinformatics(Oxford,England).2010；26(7):873-81.)。在来自两个克隆的12个GFP+和GFP-样品之间进行比较。使用STAR将TGFBR2抑制剂处理的hPSC-EC样品映射到人类基因组(hg19/Refseq)(Dobin A,Davis CA,Schlesinger F,Drenkow J,Zaleski C,Jha S,等人,Bioinformatics(Oxford,England).2013；29(1):15-21.)并使用联合模式的HtSeq进行计数(Anders S,Pyl PT,Huber W.Bioinformatics(Oxford,England).2015；31(2):166-9.)。使用Deseq2进行差异表达(Dobin A,Davis CA,Schlesinger F,Drenkow J,Zaleski C,Jha S,等人,Bioinformatics(Oxford,England).2013；29(1):15-21.)。使用GSEA(Subramanian A,Tamayo P,Mootha VK,Mukherjee S,Ebert BL,Gillette MA,等人,Proceedings of the National Academy of Sciences ofthe United States of America.2005；102(43):15545-50.)，使用Hallmarks MsigDb数据库(Liberzon A,Birger C,Thorvaldsdottir H,Ghandi M,Mesirov JP,Tamayo P.Cellsystems.2015；1(6):417-25.)，使用加权p2分析，遵循默认条件，并且忽略小于15个基因和大于5000个基因的基因集，进行基因集富集分析。
通过荧光激活的细胞读出进行化合物文库筛选。将化合物铺板于同样的板中，并且每个板具有经DMSO处理的对照。将EC(每孔10'000个细胞)在完全培养基中接种在纤连蛋白包被的板上。接种后2天，处理细胞，并使用MACS定量分析仪10(Miltenyi biotec)进行FACS测量。在Flowjo_V10软件中分析筛选数据。
电子细胞-基质阻抗判断。使用
Figure BDA0002945373720000321
Z-θ系统(Applied Biophysics,McAlisterGC,Nusinow DP,Jedrychowski MP,Wuhr M,Huttlin EL,Erickson BK,等人,Analyticalchemistry.2014；86(14):7150-8.)，使用96孔阵列板(96widf，Applied Biophysics)在250Hz频率下实时检测TBI。用100μL纤连蛋白(25μg/mL；在室温下30分钟)包被板，用完全培养基代替纤连蛋白，并将电极在系统上稳定1小时。之后，去除培养基，并接种hPSC-EC(每孔10'000个细胞)。将细胞放置2天以达到完全汇合，然后用具有或不具有VEGFA的化合物(50ng/mL)处理。所有处理均重复三次进行。
FITC右旋糖酐渗透率测定。将EC在完全培养基中接种在纤连蛋白包被的transwell 96孔板(Corning)上。加入EC培养基，腔室底部为325μL，顶部为75μL。将细胞放置2天以附着并产生汇合的单层。在上腔室中用具有或不具有VEGFA的化合物(50ng/mL)处理细胞。
竞争性蛋白激酶结合测定。Kinome扫描(468个激酶)通过scanMAX(DiscoveRx)以1μM进行。Kinome扫描过程遵循(Bernas MJ,Cardoso FL,Daley SK,Weinand ME,Campos AR,Ferreira AJ,等人,Nature protocols.2010；5(7):1265-72.)。ACVR1B、TGFRB1、TGFBR2和KDR的Kd测定已经在从30μM(DiscoveRx)开始的11点3倍连续稀释中平行进行两次。将所有化合物溶解在DMSO中。使用希尔方程并将希尔斜率设为-1，通过标准剂量-响应曲线计算结合常数(Kd)。使用非线性最小二乘拟合和Levenberg-Marquardt算法拟合曲线。
统计分析。使用Prism 7(Graphpad)来创建图表并进行统计分析。如果没有另外说明，则采用不成对的两尾学生t检验进行统计分析。对于所有条形图，数据均表示为平均值±SD。<0.05的P值被认为是显著的。
实例1
hPSC中CLDN5转录报道基因的基因组编辑。
为了评估具有替代标记物的内皮细胞的屏障特性，在3'末端用P2A自切割肽和GFP标记了CLDN5(图1a)。我们设计了CLDN5终止密码子附近的sgRNA，同时生成了一个供体质粒(图1b)以携带无启动子的P2A-GFP序列，该序列侧接有两个同源臂(HA)，该同源臂每个末端处有允许对抗性基因盒进行无痕切除的piggyBac反向末端重复序列(ITR)。Cas9和sgRNA造成的双链断裂通过CLDN5与供体模板之间的同源重组修复(图1c)，随后通过仅用于切除的piggybac转座酶去除了抗性基因盒(图1d)。挑选单细胞克隆并扩增。我们通过qPCR评估了tTK的缺乏(未显示)，并鉴定了几个缺乏tTK的克隆。在凝胶PCR中评估了这些克隆的GFP正确插入和方向(图1e，F3/R1)和tTK缺失(图1e，F1/R1)。Sanger测序证实了正确的框内整合(图1f)。
实例2
干细胞来源的内皮细胞CLDN5报道基因的产生和表征。使用先前发布的方案(Patsch C,Challet-Meylan L,Thoma EC,Urich E,Heckel T,O'Sullivan JF,等人,Nature cell biology.2015；17(8):994-1003.)，将人多能干细胞系报道基因系和WT系分化为内皮细胞和15％至25％的GFP+细胞(图2b，取决于克隆，显示的是一个克隆的数据)，在WT系中没有观察到GFP+细胞。经过FACS分选出GFP+和GFP-细胞，并进行电子细胞-基质阻抗判断。在GFP+细胞中观察到屏障阻抗增加1.75倍(电阻为3200Ω，图2c)。接下来，在FACS分选出的GFP+和GFP-细胞上都进行了RNA测序和TMT大规模蛋白组学研究(未显示)，并且观察到了显著改变的蛋白与相应的mRNA之间的非常良好的相关性(r＝0.79，p<0.0001，图2d)。证实了CLDN5在mRNA和蛋白水平上的显著上调(图2e)，但也证实了其他紧密连接蛋白(OCLN)和MARVELD3的显著上调(图2f)。此外，发现了黏着连接CD31的显著上调。没有观察到VEGFR2(KDR)或CD34表达的差异，这表明GFP+和GFP-细胞的差异在于屏障特性(图2g)。
实例3
CLDN5-GFP+EC显示高跨内皮屏障完整性的功能性响应。接下来，进行了基因集富集分析(GSEA,Subramanian A,Tamayo P,Mootha VK,Mukherjee S,Ebert BL,GilletteMA,等人,Proceedings of the National Academy of Sciences of the United Statesof America.2005；102(43):15545-50.)，使用Hallmarks MsigDB(Liberzon A,Birger C,Thorvaldsdottir H,Ghandi M,Mesirov JP,Tamayo P.Cell systems.2015；1(6):417-25.)数据库并使用分选出的GFP+细胞与GFP-细胞比较的log2FC和-log10FDR乘积的排序列表(数据未显示)进行该分析。有趣的是，在下调的基因中发现了血管生成、TGFβ和E2F增殖途径的富集，而在上调的基因中发现了WNT信号传导的富集(数据未显示)。途径富集分析(Zhou Y,Wang Y,Tischfield M,Williams J,Smallwood PM,Rattner A,等人,TheJournal of clinical investigation.2014；124(9):3825-46.；Suzuki E,Nagata D,Yoshizumi M,Kakoki M,Goto A,Omata M,等人,The Journal of biologicalchemistry.2000；275(5):3637-44)证实，GFP+显示出较高的内皮细胞屏障特性。接下来，用血管内皮生长因子(VEGFA)(体内最有效的血管通透性因子)处理GFP+细胞群，并观察到屏障特性显著丧失(图3a)，而且有趣的是在经VEGFA处理的条件下观察到GFP+细胞的减少。在后面的实验中，使用了广泛的酪氨酸激酶受体抑制剂SU11248(Mendel DB,Laird AD,XinX,Louie SG,Christensen JG,Li G,等人,Clinical cancer research.2003；9(1):327-37.，PDGFR、VEGFR、c-Kit)，并且观察到GFP+细胞的百分比显著增加(99％，图3b)。有趣的是，如ECIS(图3c，用彩色和灰度表示)和transwell 40-kDa FITC-右旋糖酐渗透率(图3d)所示，用VEGFA处理的细胞对屏障破坏具有抗性。我们的数据表明，CLDN5是内皮细胞屏障的功能性报道基因，令人惊讶的是，它可用于分析化学文库，以发现诱导高内皮屏障完整性或防止屏障破坏的化合物。功能性报道基因对体内渗透因子VEGFA起反应，在使用诱导体内屏障破坏的VEGFA进行处理中导致报道蛋白GFP的表达降低，因此可以用作组织屏障完整性的替代标记物。
实例4
鉴定诱导跨内皮屏障完整性的化合物。用药物候选物化合物文库筛选携带CLDN5报道基因的hPSC-EC，并在处理后2天进行FACS测量以鉴定诱导GFP+细胞百分比的化合物(图4a)。关注焦点是，与DMSO相比，将GFP+细胞的百分比增加至少两倍(>31.7％GFP+)的化合物。接下来，通过用选定的有效化合物进行剂量响应处理来证实GFP+细胞百分比的诱导，并且在ECIS和FITC-右旋糖酐渗透率测定中观察到了屏障促进活性(数据未显示)。观察到LY215729(TGFBR抑制剂)促进静息EC的屏障活性的趋势，这一趋势部分地阻止了VEGFA对内皮细胞层的破坏。观察到TGFβ途径在GFP+细胞中被下调。
实例5
TGFBR抑制诱导跨内皮屏障完整性。在功能性屏障测定中，评定与VEGFA共同应用对于TGFRβ抑制化合物对EC屏障的影响(图5)。在两种情况下，都观察到Repsox具有很强的EC屏障促进作用，然后GW78388阻止了VEGFA对屏障的破坏，SB505124起到部分作用而SB431542没有作用。接下来，使用大激酶组比较了几种靶向TGFBR的激酶抑制剂的特异性。所有化合物均具有针对ACVR1B和TGFBR1的抑制活性，但只有两种最有效的化合物(Repsox和GW788388)对TGFBR2具有强抑制活性，而对BMPR1B具有较弱的抑制活性(数据未显示)。接下来，测量相同化合物的Kd并在ACVR1B和TGFBR1上对所有化合物鉴定出纳摩尔范围内的Kd，但只有Repsox和GW788388对TGFBR2具有纳摩尔抑制活性(数据未显示)。为了阐明Repsox强势诱导屏障特性背后的分子机制，在用TGFBR抑制剂处理后8小时和48小时后进行RNA-seq。使用Hallmarks MsigDB数据库对GSEA途径进行了最活跃和最不活跃的化合物评定。确认了两种化合物的TGF-β途径均下调，但也存在途径的差异性调节。值得注意的是，观察到了Repsox对CLDN5的强烈上调和对PLVAP的下调，而KDR(VEGFR2)和PECAM1(CD31)的表达没有改变。PLVAP在发展中的血脑屏障EC中被遏制(Hallmann R,Mayer DN,Berg EL,Broermann R,Butcher EC.Developmental dynamics.1995；202(4):325-32)，并且PLVAP在BRB的EC上的存在与血管通透性增加相关(Wisniewska-Kruk J,van der Wijk AE,vanVeen HA,Gorgels TG,Vogels IM,Versteeg D,等人,The American journal ofpathology.2016；186(4):1044-54.)。观察到Repsox上调了几种其他紧密连接或紧密连接的调节因子(MARVELD3、GJA4、GJA5、IFITM3)。观察到RHOB的下调，而这一下调已经显示出促进屏障性能。此外，观察到Wnt靶基因(AXIN2、APCDD1、TNFRSF19)以及Wnt FZD4和LRP1受体的上调，并且Repsox下调了GSK3β。Repsox也是在下调血管生成相关基因(ESM1、ANGPTL4和PPARGC1A和上调的VEGFR1(FLT1)(其下调VEGFA途径))中最有效的化合物(数据未显示)。Repsox可能下调几种炎症基因(NFATC2、JAK1、JAK3和ICAM1)。所有测试的化合物都能够下调TGFβ途径，Repsox是最有效的化合物，还可以诱导SMAD6(TGFβ拮抗剂)。Repsox也可以有效抑制BMP信号传导(ENG、LRG1和BMPR2的下调)。RepSox处理后上调最明显的是BMP信号传导拮抗剂(BMPER、GREM2和GDF6)。BMP信号传导的所有拮抗剂都参与了内皮细胞屏障的稳定性。已经证明，BMPER单倍剂量不足导致视网膜血管形成增加(Moreno-Miralles I,Ren R,Moser M,Hartnett ME,Patterson C.Arteriosclerosis,thrombosis,and vascularbiology.2011；31(10):2216-22.)并导致促炎表型(Helbing T,Rothweiler R,KettererE,Goetz L,Heinke J,Grundmann S,等人,Blood.2011；118(18):5040-9)。以前的报道显示BMP信号传导参与到诱导内皮细胞的通透性中(Benn A,Bredow C,Casanova I,VukicevicS,Knaus P.Journal of cell science.2016；129(1):206-18.)。我们已经使用了阻断ALK1、ALK2、ALK 3的化合物，但是我们没能观察到对内皮细胞屏障的任何影响。另外，未观察到GFP+的诱导(数据未显示)。总之，这项工作已经鉴定出可以诱导内皮屏障抗性的化合物。特别是，RepSox被鉴定为能够诱导强烈的屏障抗性。在寻找替代转基因因子Sox2的化合物的筛选中发现了Repsox(Ichida JK,Blanchard J,Lam K,Son EY,Chung JE,Egli D,等人,Cell stem cell.2009；5(5):491-503)。经Repsox处理后，鉴定了SOX17和KLF4的诱导。先前已证明，SOX17(Zhou Y,Williams J,Smallwood PM,Nathans J.PloS one.2015；10(12):e0143650)和KLF4(Cowan CE,Kohler EE,Dugan TA,Mirza MK,Malik AB,WaryKK.Circulation research.2010；107(8):959-66)促进屏障形成。总之，生成了CLDN5的转录报道基因，并将其用于筛选涵盖大量药物候选物的化合物文库，以寻找可防止VEGFA破坏内皮细胞屏障的TGFβ抑制剂，尤其是可有效诱导跨内皮细胞屏障完整性的Repsox，并因此被选择用于的组织屏障完整性的进一步体内分析。
Figure IDA0002945373770000011
Figure IDA0002945373770000021
Figure IDA0002945373770000031
Figure IDA0002945373770000041
Figure IDA0002945373770000051

Claims (25)

1.一种用于鉴定药物候选物的体外方法，所述药物候选物能够i)增加体内跨内皮屏障完整性(TBI)或ii)降低内皮细胞(EC)的体内TBI，所述方法包括以下步骤：
a)提供包含处于紧密连接基因启动子控制下的报道基因的EC，其中所述EC富含表达所述报道基因的细胞；
b)使所述EC与所述药物候选物接触；
c)在使所述EC与所述药物候选物接触之前和之后测量体外TBI，或者测量与所述药物候选物接触的所述EC的体外TBI并且并行地测量未与所述药物候选物接触的EC的体外TBI；
其中(i)与未与所述药物候选物接触的所述EC的体外TBI相比，与所述药物候选物接触的所述EC的体外TBI较高指示能够增加EC的体内TBI的药物，并且(ii)与未与所述药物候选物接触的所述EC的体外TBI相比，与所述药物候选物接触的所述EC的体外TBI较低指示能够降低EC的体内TBI的药物。
2.根据权利要求1所述的方法，其中步骤c)包括测量跨内皮电阻(TEER)，其中所述测量的TEER指示体外TBI。
3.根据权利要求1所述的方法，其中步骤c)包括测量所述报道基因的表达，其中所述报道基因的表达指示体外TBI。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中所述紧密连接基因选自由以下项组成的组：CLDN5、闭合蛋白(OCLN)和MARVELD3，特别地其中所述紧密连接基因是CLDN5。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述EC是从多能干细胞分化的，特别地其中所述多能干细胞是人细胞。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中将编码所述报道基因的多核苷酸插入所述紧密连接基因的3'末端处，特别地其中(i)使紧密连接基因报道基因融合蛋白表达，或者(ii)使所述报道基因从内部核糖体进入位点(IRES)表达，或者(iii)使紧密连接基因报道基因融合蛋白表达并随后加工成单独的紧密连接蛋白和报道蛋白。
7.根据权利要求6(iii)所述的方法，其中在所述紧密连接基因与所述报道基因之间引入编码自切割肽的多核苷酸，特别地其中所述自切割肽是P2A自切割肽。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其中所述紧密连接基因的所述启动子的激活导致所述报道基因的表达。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的方法，其中在步骤a)中通过荧光激活细胞分选(FACS)或磁性激活细胞分选(MACS)从所述细胞中富集表达所述报道基因的细胞。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的方法，所述方法以高通量形式执行。
11.根据权利要求1至10中任一项所述的方法，所述方法用于在药物开发环境中筛选分子，特别是用于高通量筛选药物候选物化合物文库。
12.一种根据权利要求1至11中任一项所述的步骤1)a)产生的细胞培养物，其中表达所述紧密连接基因的细胞的分数高于30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或95％。
13.一种能够表达报道基因的细胞，其中所述报道基因的表达处于紧密连接基因的启动子的控制下，特别地其中所述紧密连接基因是CLDN5。
14.2-[3-(6-甲基-2-吡啶基)-1H-吡唑-4-基]-1,5-萘啶或4-[4-[3-(2-吡啶基)-1H-吡唑-4-基]-2-吡啶基]-N-(四氢-2H-吡喃-4-基)-苯甲酰胺，其用于治疗与血管并发症相关联的疾病。
15.2-[3-(6-甲基-2-吡啶基)-1H-吡唑-4-基]-1,5-萘啶或4-[4-[3-(2-吡啶基)-1H-吡唑-4-基]-2-吡啶基]-N-(四氢-2H-吡喃-4-基)-苯甲酰胺，其用于根据权利要求14所述之使用，其中所述疾病是糖尿病性视网膜病变或湿性AMD。
16.2-[3-(6-甲基-2-吡啶基)-1H-吡唑-4-基]-1,5-萘啶，其用于根据权利要求14所述之使用，其中所述疾病选自由以下项组成的组：2型糖尿病和1型糖尿病、糖尿病性视网膜病变、湿性AMD、代谢综合征、重症肥胖、高胆固醇血症、高血压、冠状动脉疾病、肾病、视网膜病变、肾衰竭、组织缺血、慢性缺氧、动脉粥样硬化和由药物引起的毒性导致的组织水肿。
17.4-[4-[3-(2-吡啶基)-1H-吡唑-4-基]-2-吡啶基]-N-(四氢-2H-吡喃-4-基)-苯甲酰胺，其用于根据权利要求14所述之使用，其中所述疾病选自由以下项组成的组：2型糖尿病和1型糖尿病、糖尿病性视网膜病变、湿性AMD、代谢综合征、重症肥胖、高胆固醇血症、高血压、冠状动脉疾病、肾病、视网膜病变、肾衰竭、组织缺血、慢性缺氧、动脉粥样硬化和由药物引起的毒性导致的组织水肿。
18.2-[3-(6-甲基-2-吡啶基)-1H-吡唑-4-基]-1,5-萘啶用于制备用于治疗与血管并发症相关联的疾病的药物的用途。
19.4-[4-[3-(2-吡啶基)-1H-吡唑-4-基]-2-吡啶基]-N-(四氢-2H-吡喃-4-基)-苯甲酰胺用于制备用于治疗与血管并发症相关联的疾病的药物的用途。
20.根据权利要求18或19中任一项所述的用途，其中所述疾病选自由以下项组成的组：2型糖尿病和1型糖尿病、糖尿病性视网膜病变、湿性AMD、代谢综合征、重症肥胖、高胆固醇血症、高血压、冠状动脉疾病、肾病、视网膜病变、肾衰竭、组织缺血、慢性缺氧、动脉粥样硬化和由药物引起的毒性导致的组织水肿。
21.根据权利要求20所述的用途，其中所述疾病是糖尿病性视网膜病变或湿性AMD。
22.一种治疗个体疾病的方法，所述方法包括向所述个体施用治疗有效量的组合物，所述组合物包含药用形式的2-[3-(6-甲基-2-吡啶基)-1H-吡唑-4-基]-1,5-萘啶。
23.一种治疗个体疾病的方法，所述方法包括向所述个体施用治疗有效量的组合物，所述组合物包含药用形式的4-[4-[3-(2-吡啶基)-1H-吡唑-4-基]-2-吡啶基]-N-(四氢-2H-吡喃-4-基)-苯甲酰胺。
24.根据权利要求22或23中任一项所述的方法，其中所述疾病选自由以下项组成的组：2型糖尿病和1型糖尿病、糖尿病性视网膜病变、湿性AMD、代谢综合征、重症肥胖、高胆固醇血症、高血压、冠状动脉疾病、肾病、视网膜病变、肾衰竭、组织缺血、慢性缺氧、动脉粥样硬化和由药物引起的毒性导致的组织水肿。
25.如前所述的发明。
CN201980054641.6A 2018-08-21 2019-08-19 用于评定跨内皮屏障完整性的方法 Pending CN112567022A (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP18190039.0 2018-08-21
EP18190039 2018-08-21
PCT/EP2019/072070 WO2020038851A1 (en) 2018-08-21 2019-08-19 Methods for assessing transendothelial barrier integrity

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN112567022A true CN112567022A (zh) 2021-03-26

Family

ID=63350451

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201980054641.6A Pending CN112567022A (zh) 2018-08-21 2019-08-19 用于评定跨内皮屏障完整性的方法

Country Status (5)

Country Link
US (1) US20210247385A1 (zh)
EP (1) EP3841197A1 (zh)
JP (1) JP2021534753A (zh)
CN (1) CN112567022A (zh)
WO (1) WO2020038851A1 (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113577083A (zh) * 2021-08-13 2021-11-02 中山大学中山眼科中心 一种小分子化合物组合在制备预防和治疗视网膜损伤性疾病药物中的应用

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20070129353A1 (en) 2005-11-08 2007-06-07 Michael Kahn Alpha-helix mimetics and method relating to the treatment of cancer stem cells
RU2562111C2 (ru) 2010-08-19 2015-09-10 Ф.Хоффманн-Ля Рош Аг Конверсия соматических клеток в индуцированные репрограмированные нейрональные стволовые клетки (ирнск)
KR101957923B1 (ko) * 2011-02-28 2019-03-14 프레지던트 앤드 펠로우즈 오브 하바드 칼리지 세포 배양 시스템
BR112013030166A2 (pt) * 2011-06-09 2017-03-21 Hoffmann La Roche método de diferenciação de células haste pluripotentes em células leito vasculares, células endoteliais ou células dos músculos moles vasculares, banco biológico e uso de células endoteliais ou células dos músculos moles vasculares, composição terapêutica, métodos e usos.
KR102410389B1 (ko) * 2015-10-19 2022-06-16 에뮬레이트, 인크. 혈액 뇌 장벽의 미세유체 모델
US10214724B2 (en) * 2016-04-05 2019-02-26 Wisconsin Alumni Research Foundation Methods for differentiation of human pluripotent stem cells to brain microvascular endothelial cells

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113577083A (zh) * 2021-08-13 2021-11-02 中山大学中山眼科中心 一种小分子化合物组合在制备预防和治疗视网膜损伤性疾病药物中的应用

Also Published As

Publication number Publication date
US20210247385A1 (en) 2021-08-12
WO2020038851A1 (en) 2020-02-27
EP3841197A1 (en) 2021-06-30
JP2021534753A (ja) 2021-12-16

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Darden et al. Excess vascular endothelial growth factor-A disrupts pericyte recruitment during blood vessel formation
Tanigawa et al. Wnt4 induces nephronic tubules in metanephric mesenchyme by a non-canonical mechanism
JP5718648B2 (ja) 間葉系幹細胞粒子
US20170020925A1 (en) Methods for monitoring cellular states and for immortalizing mesenchymal stem cell
Mademtzoglou et al. Cellular localization of the cell cycle inhibitor Cdkn1c controls growth arrest of adult skeletal muscle stem cells
JP2015527084A (ja) 誘導肝細胞を作製するための方法及び組成物
Igarashi et al. VEGF-C and TGF-β reciprocally regulate mesenchymal stem cell commitment to differentiation into lymphatic endothelial or osteoblastic phenotypes
Fujino et al. Sensing of apoptotic cells through Axl causes lung basal cell proliferation in inflammatory diseases
WO2021125340A1 (ja) ネフロン前駆細胞を拡大培養するための培地、ネフロン前駆細胞を拡大培養する方法、腎臓オルガノイドの製造方法
KR20180042391A (ko) 신장 전구 세포를 제조하는 방법
Huang et al. Small molecule antagonist of cell surface glycosaminoglycans restricts mouse embryonic stem cells in a pluripotent state
Yang et al. Detection and characterization of side population in Ewing’s sarcoma SK-ES-1 cells in vitro
US20210247385A1 (en) Methods for assessing transendothelial barrier integrity
Yeo et al. Chromatin accessibility dynamics of neurogenic niche cells reveal defects in neural stem cell adhesion and migration during aging
US20240076624A1 (en) Methods and Tools for Studying Enteroendocrine Cells
Tardos et al. SR proteins ASF/SF2 and SRp55 participate in tissue factor biosynthesis in human monocytic cells
EP3985103A1 (en) Cells capable of differentiating into placenta-constituting cells, and method for producing same
Byrnes et al. Opposing transcription factors MYCL and HEY1 mediate the Notch-dependent airway stem cell fate decision
US20210222122A1 (en) Synergistic transcription factors to induce high resistance transendothelial barrier
JP2016077159A (ja) 心筋細胞の製造方法、心室型心筋細胞及びその製造方法、並びにスクリーニング方法
EP4182442A1 (en) Methods enabling infection and differentiation of human distal lung organoids by sars-cov-2 and other pathogens
CN116802272A (zh) 荧光蛋白标记的细胞色素p450转化的人诱导多能干细胞系以及使用其的ahr调节剂的筛选方法
Rath TET3 impacts cardiac fibrosis partially via regulation of DNA damage response
Rica et al. HDAC1 controls the generation and maintenance of effector-like CD8+ T cells during chronic viral infection
EP4372075A1 (en) Structure and use thereof

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
REG Reference to a national code

Ref country code: HK

Ref legal event code: DE

Ref document number: 40048463

Country of ref document: HK