JP6531335B2 - 血管内皮細胞の誘導方法 - Google Patents
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Description
[1]次の(i)から(iii)の工程を含む多能性幹細胞から血管内皮細胞を製造する方法であって、
(i)多能性幹細胞を、第一のマトリックスでコーティングされた培養器材上にて、BMP(Bone Morphogenetic Protein)を含む培養液中で培養し、中胚葉前駆細胞を製造する工程、
(ii)(i)で得られた中胚葉前駆細胞を単細胞に解離させる工程、および
(iii)(ii)で得られた細胞を、ラミニン−411(LM411)またはその断片、ラミニン−511(LM511)またはその断片、Matrigel(登録商標)、IV型コラーゲン、およびフィブロネクチンから成る群より選択される第二のマトリックスでコーティングされた培養器上にて、VEGF(Vascular Endothelial Growth Factor)を含む培養液中で培養する工程
を含む方法。
[2]前記(iii)の第二のマトリックスが、ラミニン−411の断片である、[1]に記載の方法。
[3]前記ラミニン−411の断片が、ラミニン−411 E8である、[1]または[2]に記載の方法。
[4]前記(i)の第一のマトリックスが、Matrigelまたはラミニン−511もしくはその断片である、[1]〜[3]のいずれか一項に記載の方法。
[5]前記ラミニン−511の断片が、ラミニン−511 E8である、[4]に記載の方法。
[6]前記BMPが、BMP4である、[1]〜[5]のいずれか一項に記載の方法。
[7]前記(i)の培養液が、さらにGSK(Glycogen Synthase Kinase)3β阻害剤およびVEGFを含む、[1]〜[6]のいずれか一項に記載の方法。
[8]前記GSK3β阻害剤が、CHIR99021である、[7]に記載の方法。
[9]前記工程(i)が2日間または3日間行われる、[1]〜[8]のいずれか一項に記載の方法。
[10]前記工程(iii)が4日間行われる、[1]〜[9]のいずれか一項に記載の方法。
[11]次の工程を含む、中胚葉前駆細胞から血管内皮細胞を製造する方法であって、
中胚葉前駆細胞を、ラミニン−411またはその断片、ラミニン−511またはその断片、Matrigel、IV型コラーゲン、およびフィブロネクチンから成る群より選択されるマトリックスでコーティングされた培養器材上にて、VEGFを含む培養液中で培養する工程、
を含む方法。
[12]前記マトリックスが、ラミニン−411の断片である、[11]に記載の方法。[13]前記ラミニン−411の断片が、ラミニン−411 E8である、[12]に記載の方法。
[14]前記工程が、4日間行われる、[11]〜[13]のいずれか一項に記載の方法。
[15][1]〜[14]のいずれか一項に記載の方法で得られる、血管内皮細胞。
[16][15]に記載の血管内皮細胞を含む、血管再生剤。
[17]ラミニン−411の断片を含む血管内皮細胞を作製するためのキット。
[18]前記ラミニン−411の断片が、ラミニン−411 E8である、[17]に記載のキット。
(ii)(i)で得られた中胚葉前駆細胞を単細胞に解離させる工程、および
(iii)(ii)で得られた細胞を、ラミニン−411またはその断片、ラミニン−511またはその断片、Matrigel、IV型コラーゲン、およびフィブロネクチンから成る群より選択される第二のマトリックスでコーティングされた培養器上にて、VEGFを含む培養液中で培養する工程。
本発明で使用可能な多能性幹細胞は、生体に存在するすべての細胞に分化可能である多能性を有し、かつ、増殖能をも併せもつ幹細胞であり、それには、特に限定されないが、例えば胚性幹(ES)細胞、核移植により得られるクローン胚由来の胚性幹(ntES)細胞、精子幹細胞(「GS細胞」)、胚性生殖細胞(「EG細胞」)、人工多能性幹(iPS)細胞、培養線維芽細胞や骨髄幹細胞由来の多能性細胞(Muse細胞)などが含まれる。好ましい多能性幹細胞は、ES細胞、ntES細胞、およびiPS細胞である。
ES細胞は、ヒトやマウスなどの哺乳動物の初期胚(例えば胚盤胞)の内部細胞塊から樹立された、多能性と自己複製による増殖能を有する幹細胞である。
精子幹細胞は、精巣由来の多能性幹細胞であり、精子形成のための起源となる細胞である。この細胞は、ES細胞と同様に、種々の系列の細胞に分化誘導可能であり、例えばマウス胚盤胞に移植するとキメラマウスを作出できるなどの性質をもつ(M. Kanatsu-Shinohara et al. (2003) Biol. Reprod., 69:612-616; K. Shinohara et al. (2004), Cell, 119:1001-1012)。神経膠細胞系由来神経栄養因子(glial cell line-derived neurotrophic factor (GDNF))を含む培養液で自己複製可能であるし、またES細胞と同様の培養条件下で継代を繰り返すことによって、精子幹細胞を得ることができる(竹林正則ら(2008),実験医学,26巻,5号(増刊),41〜46頁,羊土社(東京、日本))。
胚性生殖細胞は、胎生期の始原生殖細胞から樹立される、ES細胞と同様な多能性をもつ細胞であり、LIF、bFGF、幹細胞因子(stem cell factor)などの物質の存在下で始原生殖細胞を培養することによって樹立しうる(Y. Matsui et al. (1992), Cell, 70:841-847; J.L. Resnick et al. (1992), Nature, 359:550-551)。
人工多能性幹(iPS)細胞は、ある特定の再プログラミング因子を、DNA又はタンパク質の形態で体細胞に導入することによって作製することができる、ES細胞とほぼ同等の特性、例えば分化多能性と自己複製による増殖能、を有する体細胞由来の人工の幹細胞である(K. Takahashi and S. Yamanaka (2006) Cell, 126:663-676; K. Takahashi et al. (2007), Cell, 131:861-872; J. Yu et al. (2007), Science, 318:1917-1920; Nakagawa, M.ら,Nat. Biotechnol. 26:101-106 (2008);国際公開WO 2007/069666)。再プログラム化因子は、ES細胞に特異的に発現している遺伝子またはES細胞の未分化維持に重要な役割を果たす遺伝子もしくはその遺伝子産物であれば良く、特に限定されないが、例えばOCT3/4、SOX2及びKLF4; OCT3/4、KLF4及びC-MYC; OCT3/4、SOX2、KLF4及びC-MYC; OCT3/4及びSOX2; OCT3/4、SOX2及びNANOG; OCT3/4、SOX2及びLIN28; OCT3/4及びKLF4などの組み合わせである。
nt ES細胞は、核移植技術によって作製されたクローン胚由来のES細胞であり、受精卵由来のES細胞とほぼ同じ特性を有している(T. Wakayama et al. (2001), Science, 292:740-743; S. Wakayama et al. (2005), Biol. Reprod., 72:932-936; J. Byrne et al. (2007), Nature, 450:497-502)。すなわち、未受精卵の核を体細胞の核と置換することによって得られたクローン胚由来の胚盤胞の内部細胞塊から樹立されたES細胞がnt ES(nuclear transfer ES)細胞である。nt ES細胞の作製のためには、核移植技術(J.B. Cibelli et al. (1998), Nature Biotechnol., 16:642-646)とES細胞作製技術(上記)との組み合わせが利用される(若山清香ら(2008),実験医学,26巻,5号(増刊), 47〜52頁)。核移植においては、哺乳動物の除核した未受精卵に、体細胞の核を注入し、数時間培養することで初期化することができる。
本発明において、中胚葉とは、発生の過程で体腔及びそれを裏打ちする中皮、筋肉、骨格、皮膚真皮、結合組織、心臓・血管(血管内皮も含む)、血液(血液細胞も含む)、リンパ管や脾臓、腎臓及び尿管、性腺(精巣、子宮、性腺上皮)をつくる能力を有した細胞から構成される胚葉を包含する。本発明において、中胚葉前駆細胞は、中胚葉細胞と区別されず、例えば、T(Brachyuryと同義)、KDR、FOXF1、FLK1、BMP4、MOX1及びSDF1から成るマーカー遺伝子から選択される少なくとも一つのマーカー遺伝子が発現する細胞である。好ましくは、T及びKDRを発現する細胞である。本発明において製造される、中胚葉前駆細胞は他の細胞種が含まれる細胞集団として製造されてもよく、例えば、50%以上、60%以上、70%以上、80%以上または90%以上の中胚葉前駆細胞が含まれる細胞集団である。中胚葉前駆細胞は、例えば前記工程(i)の方法、特許文献4の方法、非特許文献3の方法及び非特許文献4の方法で作製することができるが、製造方法は特に限定されない。
本発明において、血管内皮細胞とは、血管の内表面を構成する扁平で薄い細胞であるが、本発明では血管内皮前駆細胞と区別されない。本発明における血管内皮細胞は、培養を継続することで管構造を形成することができる細胞であってもよく、さらに好ましくは、アセチル化低密度リポタンパク質(Ac−LDL)を取り込む能力がある細胞をいう。血管内皮細胞は、例えば、特に限定されないが、KDR,CD34、およびVEカドヘリンのようなマーカーが発現していることによって特徴づけられる。本発明において製造される、血管内皮細胞は他の細胞種が含まれる細胞集団として製造されてもよく、例えば、20%以上、30%以上、40%以上、50%以上、60%以上、70%以上、80%以上または90%以上の血管内皮細胞が含まれる細胞集団である。分化が誘導された血管内皮細胞は、有用な培養モデルを提供することができる。すなわち、本発明の方法により生成される血管内皮細胞は、遺伝子変異に起因する血管疾患のモデルとして有用である。さらに、本方法により生成された血管内皮細胞を移植のために用いることができる。
本工程(i)は、多能性幹細胞を接着培養する工程であり、本発明において、接着培養とは、細胞接着に適した表面加工をした培養容器または細胞外基質をコーティング処理された培養容器を用いて培養することによって行ってもよい。コーティング処理は、マトリックスを含有する溶液を培養容器に入れた後、当該溶液を適宜除くことによって行い得る。
本工程(ii)は、工程(i)で得られた細胞集団を実質的に単細胞に解離させる工程であり、細胞を解離させる方法としては、例えば、力学的に解離する方法、プロテアーゼ活性とコラゲナーゼ活性を有する解離溶液(例えば、Accutase(商標)およびAccumax(商標)など)またはプロテアーゼ活性もしくはコラゲナーゼ活性のみを有する解離溶液を用いた解離方法が挙げられる。好ましくは、トリプシン代替物であるTrypLE Express(Life Technologies)を使用して解離する方法が用いられる。
本工程(iii) 等は、中胚葉前駆細胞を接着培養する工程である。本工程(iii) 等で用いる中胚葉前駆細胞の製造方法は特に限定されず、前記工程(i)の方法で製造された中胚葉前駆細胞であってもよく、当該中胚葉前駆細胞は、前記工程(ii)を経て、単細胞へ解離された細胞であってもよい。接着培養は、前記工程(i)に記載のマトリックスを用いて行うことができるが、本工程(iii) 等で用いる好ましいマトリックスは、Matrigel、タイプIVコラーゲン、フィブロネクチン、ラミニン−411またはその断片、ラミニン−511またはその断片であり、好ましくは、ラミニン−411の断片である。ラミニン−411の断片とは、インテグリンα6β1への結合活性を有する断片であり、より好ましくはラミニン−411のE8フラグメント(ラミニン−411 E8:LM411E8)である。なお、ラミニンにはその変異体が含まれ得るが、ラミニン−411 E8のγ鎖のC末端から3番目のグルタミン酸をグルタミンに置換することによりインテグリンα6β1への結合活性を消失した変異体(ラミニン−411 E8(EQ))は、含まない。
本発明で得られた血管内皮細胞は、冠動脈疾患や下肢虚血疾患(バージャー病や閉塞性動脈硬化症など)を含む重症虚血性疾患患者の治療のために投与することができる。すなわち、得られた血管内皮細胞を、虚血部位に移植することにより、血管再生療法として使用することができる(Takayuki Asahara, YAKUGAKU ZASSHI 127(5)841-845, 2007)。したがって、本発明では、上記の方法で多能性幹細胞より得られた血管内皮細胞を含む血管再生剤を提供する。
本発明では、次の工程を含む冠動脈疾患や下肢虚血疾患(バージャー病や閉塞性動脈硬化症など)を含む重症虚血性疾患の治療薬をスクリーニングする方法を提供する;
(i)上述した方法で得られた血管内皮細胞へ候補薬剤を接触させる工程、
(ii)前記血管内皮細胞の機能障害を測定する工程、および、
(iii)候補薬剤を接触させなかった場合と比較して、前記血管内皮細胞の機能障害を減少させた候補薬剤を重症虚血性疾患の治療薬として選択する工程。
本発明での他の実施態様において、多能性幹細胞から血管内皮細胞を作製するキットが含まれる。当該キットには、上述した血管内皮細胞を作製する各工程に使用する培養液、添加剤または培養容器等が含まれる。例えば、マトリックス(好ましくは、ラミニン−411 E8)、BMP4、VEGF及びGSK3β阻害剤から成る群より選択される1種類以上の試薬を含むキットが挙げられる。本キットには、さらに製造工程の手順を記載した書面や説明書を含んでもよい。
細胞および培養
ヒトES細胞(KhES1)は、京都大学再生医科学研究所より受領し、従来の方法で培養した(Suemori H, et al. Biochem Biophys Res Commun. 345:926-32, 2006)。ヒトiPS細胞(253G4、409B2及び223Q5)は、京都大学の山中教授より受領した。
ヒトES細胞およびヒトiPS細胞の維持培養はSNLフィーダー細胞上で、5mg/mLのbFGF(Wako)を添加したES培地(ReproCELL)を用いて行った。SNLフィーダー細胞は、DSファーマバイオメディカル社等から入手可能である。また、継代はCTK溶液(0.25%トリプシン(Life Technologies)、0.1%コラゲナーゼIV(Life Technologies)、20%KSR、及び1mMCaCl2)によって約30秒間室温で処理して細胞を解離させ、既存の方法(Suemori, H. et al. Biochemical and Biophysical Research Communications 345, 926932 (2006))により、SNL細胞を除去した。
LM411E8は、Idoら(Ido H, et al., J. Biol. Chem., 282, 11144-11154, 2007)に記載の方法に従い、α4鎖E8フラグメント、β1E8フラグメント、γ1鎖E8フラグメントの発現ベクターをヒト腎臓由来293F細胞(Invitrogen)に導入して発現させた。
5’側から、マウスIg−κ鎖V−J2−Cシグナルペプチドと6×Hisタグとα4鎖E8フラグメントを順にコードするcDNA断片を獲得するために、マウスIg−κ鎖V−J2−Cシグナルペプチドと6×HisタグをコードするcDNA断片、そしてα4鎖E8をコードするcDNA断片をそれぞれ取得し、エクステンションPCRによってそれら2種類の断片を連結・増幅した。
5’-GAGGTCTATATAAGCAGAGCTCTCTGGCTAACTA-3’(forward、配列番号2)
5’-CATTGGCTTCATCATGATGATGATGATGATGAAGC-3’(reverse、配列番号3)
5’-CATCATGATGAAGCCAATGAAACAGCAGAATTTGC-3’(forward、配列番号4)
5’-GCAGAATTCTCAATGAGAGTTTCTTGGAGTATTCC-3’(reverse、配列番号5)
ヒトβ1鎖E8フラグメント(N末端側にHAタグを含む)、ヒトγ1鎖E8フラグメント(N末端側にFLAGタグを含む)の発現ベクターはIdoら(Ido H, et al., J. Biol. Chem., 282, 11144-11154, 2007)の方法により作製した。
Laminin-411(LM411)(Biolamina)およびLaminin-511(LM511) (Biolamina)は、PBS(-)で希釈し、20μg/mLの濃度で調製した後、2μg/cm2の濃度になるように培養皿に分注した。GFR-Matirgel(BD Biosciences)は、PBS(-)で希釈し、200μg/mLの濃度で氷上で調製した後、20μg/cm2の濃度になるように培養皿に分注した。Type IV collagen (BD Biosciences)は、0.05 M 塩酸で希釈し、100μg/mLの濃度で調製した後、10μg/cm2の濃度になるように培養皿に分注した。Fibronectin(Millipore) は、PBS(-)で希釈し、20μL/mLの濃度で調製した後、2μg/cm2の濃度になるように培養皿に分注した。LM511E8 fragment(Nippi)および LM411E8は、PBS(-)で希釈し、4μL/mLの濃度で調製し後、0.4μg/cm2の濃度になるように培養皿に分注した。
いずれのコーティング剤も分注後37℃で2時間インキュベートすることでコーティングを行った。
多能性幹細胞から中胚葉前駆細胞への分化誘導は、Niwaらの記載に従って行った(Niwa A, et al, PLoS One.6:e22261 2011, Yanagimachi MD, et al, PLoS One. 8:e59243, 2013)。詳細には、多能性幹細胞のコロニーをGFR-Matrigelでコーティングしたプレートに2 colonies/cm2の密度で播種し、mTeSR1培地(STEMCELL TECHNOLOGIES)で培養した。コロニーの直径が約750μm になるまで増殖させた後、20ng/mLのBMP4(R&D systems)を含むmTeSR1培地に交換し、3日間培養した(図1中Day3)。
上記のとおり得られた中胚葉前駆細胞を含む培養物の培地を、40ng/mL VEGF(R&D systems)を含むStempro34SFM(Life Technologies)に交換し、さらに4日間培養した(図1中Day7)。
分化誘導7日目におけるマーカーの発現をフローサイトメトリーで解析した。詳細には、得られた細胞をTrypLE Expressで37℃で20分間処理し、Stempro34培地で抗体反応を行った。抗ヒトKDR抗体(Biolegend)、抗ヒトCD34抗体(Beckman coulter)、及び抗ヒトVE-cadherin抗体(eBioscience)は、いずれも1:100で希釈して用いた。その結果、約10%の細胞にKDR/CD34/VE-cadherinの発現が認められた(図2)。
分化誘導3日目においてKDR陽性中胚葉前駆細胞は80%以上出現するものの(図4)、その後VEGFで刺激しても血管内皮細胞となるのはわずかである。そこで、3日目までに形成されていた細胞間相互作用を消去する目的で、BMP/Matrigelで培養後、VEGFで刺激する直前に、TrypLE Express(Life Technologies)によって37℃で20分間処理することで細胞を解離させ、single cellを再度平面培養(VEGF/Matrigel)によって分化させた。その結果、single cellにまで解離した群(passage群)において、CD34+/VE-cadherin+細胞の純度の上昇が認められた(図5)。
前述のとおり3日目で細胞を解離することによって、CD34+/VE-cadherin+細胞の純度の上昇が認められたものの、その効果は細胞株によって異なっていた(図5)。そこで、種々の単一のマトリックスタンパク質でコーティングした、第二のマトリックスプレートを使用した分化誘導を行い(Day3からDay7)、高純度かつ株間で安定に血管内皮細胞を誘導できるマトリックスを探索した。分化誘導方法を図6に示す。その結果、non-coatingとLM411についてどの細胞株でも高純度に血管内皮細胞を誘導できることが示された(図7)。一方、多能性幹細胞の維持に有用と考えられているLM511では純度が低下した細胞株があった。また、血管内皮細胞の収量を比較したところ、LM411の方が高収量であった。
さらに、LM411を用いて得られた血管内皮細胞の機能を評価するため、Ac−LDL取り込みアッセイ及びチューブ形成アッセイを行った。チューブ形成アッセイは、次の方法で行った。Matrigel (BD Biosciences) を96 well plateに50μL/well で分注し、37℃で30分間放置することで固形化させた。次に細胞をEndothelial Serum Free Mediumに懸濁し、VEGFを80ng/mLとなるように加えた。この細胞懸濁液を先ほどの固形化したMatrigel上に細胞密度4×104/wellとなるように分注し、37℃, 5%CO2の条件で一晩培養した(Kurian L, et al., Nat. Methods. 10:77-83, 2013)。その結果、LM411を用いて誘導した血管内皮細胞はチューブ形成能及びAc−LDL取り込み能を有することが確認された(図8)。以上より、中胚葉前駆細胞を解離させ、LM411でコーティングされたプレート上で培養することによって、血管内皮細胞を効率よく誘導できることが確認された。
続いて、LM411のintegrinと結合する部分を有する断片であるLM411E8を用いた場合の中胚葉前駆細胞に対する接着活性及び分化に対する影響について検討を行った。詳細には、多能性幹細胞のコロニーをGFR-Matrigelでコーティングしたプレートに2 colonies/cm2の密度で播種し、mTeSR1培地(STEMCELL TECHNOLOGIES)で培養した。コロニーの直径が約750μm になるまで増殖させた後、80ng/mLのBMP4(R&D systems)を含むmTeSR1培地に交換した。3日間培養した後、TrypLE Express(Life Technologies)によって37℃で20分間処理することで細胞を解離させ、80ng/mL VEGF(R&D systems)を含むStempro34SFM(Life Technologies)培地に懸濁し、LM411E8でコーティングしたプレートに4×104/cm2の密度で播種し、さらに4日間培養した。
その結果、LM411E8を用いた場合に、LM411とほぼ同等の純度で血管内皮細胞が得られ、収量はLM411を用いた場合より多かった (図9左)。また、LM411E8の濃度依存的に血管内皮細胞の数は増加した(図9右)。
また、LM411E8を用いて分化した血管内皮細胞は、チューブ形成能及びAc−LDL取り込み能を有することが認められた(図10)。
LM411E8を用いることによって内皮細胞の収量が上がった理由として、細胞との接着活性が考えられる。そこで、分化誘導3日目の中胚葉前駆細胞のnon-coating、LM411またはLM411E8に対する接着活性を比較したところ、LM411E8は他の2つに比べて著しく高かった。
LM411が血管内皮細胞へ分化する細胞を選別しているのか、あるいは接着した細胞の血管内皮分化を促進しているのかを検討するために、BMP4/Matrigelでの分化誘導3日目に得られた中胚葉前駆細胞を解離させたのちにLM411に播種し、接着した細胞を再びMatrigel(MG)あるいはLM411に再継代するダブルスイッチングアッセイ(double-switching assay)を行った。その結果、LM411-MGはLM411-LM411に比べて純度が著しく低下した(図13)。以上より、LM411は受容体特異的に細胞を選別しているだけでなく、接着した細胞のその後の血管内皮分化にも影響を及ぼしていると考えられる。また、LM411E8に単独で血管内皮分化を誘導する機能があるか否かを調べるため、分化誘導3日目の中胚葉前駆細胞をLM411E8の上でVEGFの無い条件で培養したところ、血管内皮細胞は誘導されず、すなわち、LM411E8そのものに血管内皮分化を誘導する機能は無いことが示された。
中胚葉から血管内皮細胞への分化過程において、マトリックス選別が個々の細胞にどのような影響を及ぼすかを詳細に検討するためにsingle-cell RNA-sequencingを行った。ここで、多能性幹細胞をBMP4/Matrigelで分化させて得られた中胚葉前駆細胞(Day3)を解離した後、MatrigelまたはLM411E8上で分化させ、分化誘導5日目(Day5)及び7日目(Day7)における遺伝子発現をシングルセルレベルで比較した(図14)。主成分分析を行ったところ、分化誘導0日目及び3日目で比較的ばらついていた遺伝子発現が、LM411E8上にまき直した結果、均一な集団になった。一方、Matrigel上では、細胞の発現の不均一性(heterogeneity)が改善しなかった。以上より、遺伝子発現プロファイルの観点からも、LM411E8は細胞の運命の方向性決定において、遺伝子発現プロファイルを限定するガイドの働きをすることが示された。さらに、分化誘導5日目のLM411E8及びMatrigelを用いて得られた血管内皮細胞についてマイクロアレイを行い、Gene Set Enrichment Analysis(GSEA)を行ったところ、Rho family GTPase pathwayがLM411E8において活性化していることが示唆された。
Wnt/β-cateninシグナルを活性化することで中胚葉分化誘導効率が上昇することが知られており(Sumi, T., et al., Development. 135:2969-2979, 2008)、強力なGSK3β阻害剤であるCHIR99021が血球や内皮の分化誘導に用いられている(Sturgeon, C, et al., Nat Biotechnol. 32:554-561, 2014)。Single cell RNA-seq の結果より、分化誘導3日目における、Wnt シグナリングの既知のレポーター遺伝子であるAXIN2の増加が、シングルセルレベルで不均一であることが示されており、これによって、Wnt/β-catenin経路の内因性活性化(endogenous activation)が初期分化において十分ではないことが明らかとなっている。Single cell RNA seq解析により、従来法では初期分化における内在性wntシグナルの活性化が不均一であることが考えられたため、CHIR99021によってWnt/β-cateninシグナルを一様に活性化することで、LM411E8に接着して血管内皮細胞に分化する前駆細胞の数を増やすことができる可能性が考えられた。また、分化の初期からVEGFを添加することで、KDRを発現した中胚葉前駆細胞から血管内皮細胞への分化を逐次促すことができる可能性も考えられた。
そこで、多能性幹細胞をLM511E8 fragmentでコーティングしたプレートに5 colonies/cm2の密度で播種し、mTeSR1で培養した。コロニーの直径が750μmになるまで増殖させた後、4 μM CHIR99021 (Wako), 80 ng/mL BMP4, 80 ng/mL VEGFを含むEssential 8 (Life Technologies)培地に交換することで、分化誘導を開始した(図15)。分化開始後2日にTrypLE Expressで37℃で20分間処理することで細胞を解離させ、80 ng/mL VEGFを含むStempro34培地に懸濁し、LM411E8でコーティングしたプレートに4×104/cm2の密度で播種し、4日間培養した。
bFGF (Wako)を300ng/mLになるように加えたMatrigelに、上記で得られた誘導血管内皮細胞を1×107/mLの密度で懸濁した。この懸濁液100μLをNOGマウス(6週齢前後)の背中に皮下注射した(Nakahara M, et al, cloning and stem cells, 11:509-522, 2009)。Matrigelは移植後21日目に回収し、免疫蛍光染色により解析した。詳細には、Matrigelを4% paraformaldehyde (Wako) で4℃で一晩固定した。その後、20% スクロース溶液で4℃で一晩置換し、O.C.T. compoundを用いて凍結包埋した。これを厚さ6μmの切片にし、スライドガラスに吸着させた。切片を乾燥させた後、Cytofixを用いて室温で5分間処理することで固定した。続いてPerm/Washを用いて室温で30分間インキュベートすることで透過性を亢進し、抗体反応を行った。1次抗体にはヒツジ抗CD31抗体 (BD Biosciences, 1:10), マウス抗ヒト核抗体 (Millipore, 1:100), ラットAlexa fluor647標識抗マウスTER-119抗体 (BD Biosciences, 1:10)をPerm/Washに溶解して室温で2時間反応させた。2次抗体反応は、抗ヒツジIgG抗体(Jackson immunoresearch, 1:100), 抗マウスIgG抗体(Jackson immunoresearch, 1:100)をPerm/Washに溶解し、室温で1時間反応させた。撮影には蛍光顕微鏡(OLYMPUS, fluoview)を用いた。
Claims (10)
- 次の(i)から(iii)の工程を含む多能性幹細胞から血管内皮細胞を製造する方法であって、
(i)多能性幹細胞を、第一のマトリックスでコーティングされた培養器材上にて、BMPを含む培養液中で培養し、中胚葉前駆細胞を製造する工程、
(ii)(i)で得られた中胚葉前駆細胞を単細胞に解離させる工程、および
(iii)(ii)で得られた細胞を、ラミニン−411またはその断片、ラミニン−511またはその断片、Matrigel、IV型コラーゲン、およびフィブロネクチンから成る群より選択される第二のマトリックスでコーティングされた培養器上にて、VEGFを含む培養液中で培養する工程
を含む方法。 - 前記(iii)の第二のマトリックスが、ラミニン−411の断片である、請求項1に記載の方法。
- 前記ラミニン−411の断片が、ラミニン−411 E8である、請求項1または2に記載の方法。
- 前記(i)の第一のマトリックスが、Matrigelまたはラミニン−511もしくはその断片である、請求項1〜3のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ラミニン−511の断片が、ラミニン−511 E8である、請求項4に記載の方法。
- 前記BMPが、BMP4である、請求項1〜5のいずれか一項に記載の方法。
- 前記(i)の培養液が、さらにGSK3β阻害剤およびVEGFを含む、請求項1〜6のいずれか一項に記載の方法。
- 前記GSK3β阻害剤が、CHIR99021である、請求項7に記載の方法。
- 前記工程(i)が2日間または3日間行われる、請求項1〜8のいずれか一項に記載の方法。
- 前記工程(iii)が4日間行われる、請求項1〜9のいずれか一項に記載の方法。
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