JP6954586B2 - モデル血管システム、シアストレス負荷用のモデル血管部及び循環器系疾患の治療薬のスクリーニング方法 - Google Patents
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項1. ポンプ、モデル血管部、第1液体槽を備えたモデル血管システムであって、前記モデル血管部は液体流入部と液体流出部を結ぶ流路に血管様構造部が配置され、第1液体槽とポンプ、ポンプと液体流入部を各々接続するチューブを備え、液体流出部と第1液体槽をチューブで接続してモデル血管部を通過した液体は第1液体槽に戻される構成とするか、液体流出部と第2液体槽をチューブで接続し、モデル血管部を通過した液体は廃液として第2液体槽に貯める構成とし、前記血管様構造部は、下層の血管平滑筋細胞層と上層の血管内皮細胞層を含み、ポンプにより液体を供給したときに前記血管様構造部にシアストレスを負荷することができる、モデル血管システム。
項2. 血管内皮細胞が液体の流れの方向に配向している、項1に記載のモデル血管システム。
項3. 液体がモデル血管システム内を循環するように構成される、項1又は2に記載のモデル血管システム。
項4. シアストレスが20〜60dyn/cm2である、項1〜3のいずれか1項に記載のモデル血管システム。
項5. 液体流入部と液体流出部を結ぶ流路に血管様構造部を配置し、前記血管様構造部は、下層の血管平滑筋細胞層と上層の血管内皮細胞層を含む、シアストレス負荷用のモデル血管部。
項6. 血管平滑筋細胞層と血管内皮細胞層の間にコーティング層をさらに含む、項5に記載のシアストレス負荷用のモデル血管部。
項7. 項1に記載のモデル血管システムの液体に候補物質を添加し、前記候補物質の添加によるモデル血管部の状態変化を評価する工程を含む、シアストレスに起因する循環器系疾患の治療薬のスクリーニング方法。
項8. 項1のモデル血管システムにおいて、シアストレスの負荷の前後の液体の成分量を比較する工程を含む、シアストレスにより増加するバイオマーカーのスクリーニング方法。
工程1 :常法により培養容器から剥離させた血管平滑筋細胞を、培地を送液できる構造を有するスライドに播種して血管平滑筋細胞層 (下層) を形成する工程
原料となる血管平滑筋細胞は、市販品を用いることができる。血管平滑筋細胞をディッシュ等の適当な培養容器で平面培養における常法に従い培養する。培養された血管平滑筋細胞は、常法に従いトリプシン等のプロテアーゼ処理により培養容器から剥離させ、遠心分離により上清を除去する。血管平滑筋細胞のペレットを目的の細胞密度(最も好ましくは1.0〜3.0 x 106 個/mL) になるよう培地に懸濁する。細胞懸濁液をスライドに播種する。
原料となる血管内皮細胞は、市販品を用いることができる。血管内皮細胞をディッシュなどの適当な培養容器で、平面培養における常法に従い培養する。培養された血管内皮細胞は、常法に従いトリプシン等のプロテアーゼ処理により培養容器から剥離させ、遠心分離により上清を除去する。血管内皮細胞のペレットを目的の細胞密度(最も好ましくは1.0〜3.0 x 106 個/mL)になるよう培地に懸濁する。細胞懸濁液を工程1 で血管内皮細胞層を接着させたスライドに播種する。
ポンプを用いて、モデル血管システムにシアストレスを負荷する。ポンプにセットする適当なチューブを用意する。還流させるための培地を適当な容器に必要量加える。工程1、2 によって作製されたモデル血管システム及び培地の入った容器にチューブを接続し、ポンプにセットする。目的のシアストレス (1〜60 dyn/cm2、好ましくは10〜60 dyn/cm2、より好ましくは20〜60 dyn/cm2、さらに好ましくは10〜60 dyn/cm2、特に好ましくは40〜60 dyn/cm2)をモデル血管システムに負荷する。
本発明のモデル血管システムを以下のようにして製造した。
I. 肺高血圧症患者由来血管平滑筋細胞 (PH-SMC) 層の形成
(1) 培養したPH-SMC を、TrypLE を用いて培養容器から剥離させ、培地でPH-SMC を回収して遠心する。
(2) 上清を除去し、2 x 106 個/mL の細胞密度となるようペレットを培地で懸濁する。
(3) 1 mL シリンジに細胞懸濁液を充填し、スライド (ibidi、μ-slide I: 0.2 Luer ibiTreat) に注入する。ibiTreatのコーティング部分に細胞が付着する。細胞の付着は、コラーゲンなどでコーティングした製品でも行うことができる。
(4) 24 時間培養する。
(1) PH-SMC 層上に培地で希釈したフィブロネクチン溶液 (0.04 mg/mL) を添加し、PH-SMC 層をコートする。
(2) 培養したMS1-GFP 細胞をTrypLE を用いて培養容器から剥離させ、培地でMS1-GFP 細胞を回収して遠心する。
(3) 上清を除去し、2 x 106 個/mL の細胞密度となるようペレットを培地で懸濁する。
(4) 1 mL シリンジに細胞懸濁液を充填し、スライドに注入する。
(5) 24 時間培養する。
(1) ローラーポンプ (古江サイエンス株式会社、RP-MH) にセットする適当なチューブを用意する。
(2) 還流させるための培地をT25 フラスコに20 mL 程度加える。
(3) 工程1、2 によって作製されたモデル血管システム、及びT25 フラスコにチューブを接続し、ローラーポンプにセットする。
(4) モデル血管システムに対して50 dyn/cm2 のシアストレスを24 時間負荷する。
血管平滑筋細胞あるいは血管内皮細胞1 層のみの場合、流体に対する強度が弱いため、高いシアストレス (20〜60 dyn/cm2 程度) を負荷すると細胞がスライドから剥離した(図7)。本来の血管と同じ積層構造を形成させることで、流体に対する強度が強まり、シアストレスに対しても長期に構造を維持できることが確認された。
Claims (6)
- ポンプと、モデル血管部と、第1液体槽又は第1液体槽と第2液体槽とを備えたモデル血管システムであって、前記モデル血管部は液体流入部と液体流出部を結ぶ流路に血管様構造部が配置され、第1液体槽とポンプ、ポンプと液体流入部を各々接続するチューブを備え、液体流出部と第1液体槽をチューブで接続してモデル血管部を通過した液体は第1液体槽に戻される構成とするか、液体流出部と第2液体槽をチューブで接続し、モデル血管部を通過した液体は廃液として第2液体槽に貯める構成とし、前記血管様構造部は、フィブロネクチン、コラーゲン、ゼラチン、ラミニン、エラスチン、ビトロネクチン、テネイシン、エンタクチン、ポリ−L−リジン、及びポリ−D−リジンから選ばれるコーティング剤を介して接着された、下層の血管平滑筋細胞層と上層の血管内皮細胞層とを含み、ポンプにより液体を供給したときに前記血管様構造部にシアストレスを負荷することができる、モデル血管システム。
- 血管内皮細胞が液体の流れの方向に配向している、請求項1に記載のモデル血管システム。
- 液体がモデル血管システム内を循環するように構成される、請求項1又は2に記載のモデル血管システム。
- シアストレスが20〜60dyn/cm2である、請求項1〜3のいずれか1項に記載のモデル血管システム。
- 請求項1に記載のモデル血管システムの液体に候補物質を添加し、前記候補物質の添加によるモデル血管部の状態変化を評価する工程を含む、シアストレスに起因する循環器系疾患の治療薬のスクリーニング方法。
- 請求項1のモデル血管システムにおいて、シアストレスの負荷の前後の液体の成分量を比較する工程を含む、シアストレスにより増加するバイオマーカーのスクリーニング方法。
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JP2017017692A JP6954586B2 (ja) | 2017-02-02 | 2017-02-02 | モデル血管システム、シアストレス負荷用のモデル血管部及び循環器系疾患の治療薬のスクリーニング方法 |
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