JPWO2002048349A1 - ヘパリン結合能を有するポリペプチド - Google Patents
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Abstract
ラミニンα4鎖Gドメイン中のヘパリン結合能を有するポリペプチドおよび該ポリペプチドを用いる、細胞と毛細血管との接触、癌の成長、ヘパリン結合性の情報伝達分子のシグナル伝達、および細胞の増殖、分化、生存維持を阻害する方法を提供する。
Description
技術分野
本発明は、ヘパリン結合能を有するラミニンα4鎖由来のポリペプチド並びにその使用方法に関する。
背景技術
ラミニンはコラーゲンやプロテオグリカンと共に基底膜の主要な構成成分をなす糖蛋白質であり、コラーゲンやプロテオグリカンと結合して、基底膜の構造を形成すると共に、種々の細胞上の蛋白質およびレセプターと結合し、細胞の接着のみならず増殖、分化、生存維持等に関与していると考えられている。
ラミニンは、α鎖、β鎖、γ鎖の3種類のサブユニットからなるヘテロ三量体であり、またそれぞれのサブユニットにはサブタイプが存在し、現在までに5種類のα鎖(α1〜α5)、3種類のβ鎖(β1〜β3)、3種類のγ鎖(γ1〜γ3)が単離されている。これらの各サブタイプの組み合わせにより20種類以上のラミニンファミリーが形成されると考えられている。これらのラミニンファミリーは、胚発生時に、それぞれ発現の組織特異性が報告されており〔Rohrbach DH & Timple R eds.(1993)Molecular and Cellular Aspects of Basement Membranes,Academic Press、Horton MA ed.(1996)Adhesion Receptors as Therapeutic Targets,CRC Press〕、それぞれが独自の機能を持っていると考えられているが、その機能の違いはまだ明らかにはなっていない。
α4鎖〔Eur.J.Biochem.,264,727(1997)〕は、他のα鎖サブタイプのN末端に存在するドメインが欠失した200〜240kDaの低分子のα鎖サブタイプであり、かなり組織特異的な発現を示し、血管内皮細胞等でβ1およびγ1と会合してα4β1γ1を形成することが報告されている〔J.Biol.Chem.,265,18123(1990)〕。血管内皮細胞ではα1鎖と競合して、α4β1γ1とα1β1γ1の2種類のラミニンが形成されるが、血管新生時にはα4β1γ1の形成の方が優勢となる。マウス繊維芽細胞株3T3−L1では、ラミニンのα鎖としてα4鎖のみが発現しており、α4β1γ1を形成することと、デキサメタゾンによる脂肪細胞への分化に伴いα4鎖の発現量が増大することが報告されている〔J.Biol.Chem.,263,16163(1988)、Matrix Biol.,16,223(1997)〕。
α4β1γ1脂肪前駆細胞は、新生毛細血管の外表面と約0.2mmの間隙をおいて広範囲に接触構造を形成しているが、この間隙にはα4β1γ1が蓄積しており、脂肪前駆細胞と新生毛細血管の接触構造の形成に関与している可能性が示唆されている。このような、新生毛細血管との接触構造は、癌の成長の際にも想定され、また、マウスの末梢および腸間膜のリンパ節由来の内皮細胞株では、細胞密度が低い状態やサイトカインで刺激した場合に、α4鎖の発現が誘導されることが知られている〔Eur.J.Biochem.,223,603(1994)〕。このように間充織由来の細胞株において、α4鎖が特定の機能をもつことが予測される。
5種類のα鎖サブタイプには共通してC末端にGドメインとよばれる大きな球状の高次構造をとる領域があり、前述のようにα4鎖は他のα鎖がもつN末端側のドメインを欠いているので、α4鎖を含むラミニンであるα4β1γ1が他のラミニンファミリーと異なる特定の機能を示すのに、C末端のGドメインが重要であると考えられる。
Gドメインは、α1鎖、α2鎖、α3鎖においてヘパリン結合性を有するドメインであることが報告されているドメインであり、さらにこれらのαサブタイプのGドメインの中のどの領域がヘパリン結合性を規定しているかが、プロテアーゼによる限定分解や遺伝子組換え法により調製したGドメインの部分断片ポリペプチドや化学合成したペプチドあるいは抗体を利用して解析されてきた。Gドメインは約190アミノ酸からなる5つのモジュール(以下LG1〜LG5と表す。)からなるが、たとえば、α1鎖ではLG4、α2鎖ではLG5がヘパリンとの結合に重要であると報告されている〔J.Mol.Biol.,287,253(1999)、EMBO J.,18,863(1999)〕。また、ヘパリン結合能をもつラミニンα1鎖由来のペプチドの報告もある〔Biochem.J.,340,119(1999)、J.Cell.Physiol.,179,18(1999)〕。
しかし、α4鎖についてはGドメインのヘパリン結合性についての報告はない。α鎖の各サブタイプ間のアミノ酸相同性はそれほど高くなく、α4鎖でヘパリン結合性を規定する領域はα1鎖やα2鎖と同じであるかどうかは不明である。
ヘパリンと結合する分子として、ラミニンα鎖の他に、細胞の増殖、分化、生存維持に関与する情報伝達分子であるWnt1やFGFが知られている。ヘパリン結合性を示すWntファミリーの遺伝子は発現パターンやノックアウトマウスの解析からさまざまな器官の形成、例えば、Wnt1はマウスで脳の発生と分化に関与していることが報告されている〔Cell,62,1073(1990)〕。またヘパリン結合性の増殖因子であるFGFファミリーも、多様な細胞の増殖促進作用をもつことが知られている。例えば、FGF−2(b−FGF)は繊維芽細胞や血管内皮細胞、神経系細胞等の増殖を促進し、血管新生や創傷治癒に働いていると考えられている。
これらのヘパリン結合性情報伝達分子は、ヘパリンを介して細胞表面の膜結合型プロテオグリカンおよび細胞外マトリクス中のプロテオグリカンと結合して捕捉されることにより、細胞および組織での分布や濃度勾配が調節されていると考えられる。
Wnt、FGFの他にも、ヘパリン結合能を有する情報伝達分子は多く知られており、HB−EGF(Heparin−binding epidermal growth factor)、PDGF(Platelet−derived growth factor)BMP(Bone morphogenic protein)、GM−CSF(Granulocyte−macrophage colony stimulating factor)、HGF(Hepatocyte growth factor)、ケモカイン、TNF(Tumor necrosis factor)等がそのヘパリン結合能を利用して、細胞の分化や増殖に関与している。
本願発明のラミニンα4鎖のGドメイン由来のポリペプチドは、強力なヘパリン結合能を有していることから、上記ヘパリン結合性情報伝達分子をはじめとするヘパリン結合性分子のヘパリンへの結合を競合阻害することにより、ヘパリン結合性情報伝達分子を介した情報伝達、細胞と細胞外マトリックスとの結合、細胞と毛細血管との結合、若しくは細胞の増殖、分化などを阻害することが可能であり、血管新生が関与する疾患や癌などの予防薬または治療薬として有用である。
発明の開示
本発明の課題は、ヘパリン結合能を有するポリペプチド、該ポリペプチドをコードするDNA、該DNAを用いた該蛋白の製造法、該ポリペプチドを用いた、細胞と毛細血管の接触、血管の新生、癌の成長、細胞の増殖、分化、生存維持またはヘパリン結合性情報伝達分子のシグナル伝達を阻害する方法、該ポリペプチドを含有してなる医薬、該DNAを含有してなる医薬を提供することである。
本発明者は、遺伝子組換え法により大量に調製したマウスのα1鎖およびα4鎖のGドメインを用いて、α4鎖のGドメインが単独でヘパリン結合能を有すること、およびそのα4鎖のGドメインのヘパリン結合能は、従来知られていたα1鎖のGドメインのヘパリン結合能の約10倍の高さであることを見出すことに成功した。さらにα4鎖のGドメインを酵素分解した部分ポリペプチドを用いて、α4鎖のGドメインの中でモジュールLG4の領域がα4鎖のGドメイン全体と同等なヘパリン結合能を有すること、並びにモジュールLG4の部分ペプチドを用いて、ヘパリン結合能を有するLG4の部分ペプチドを同定することに成功し、本発明を完成するに至った。
即ち、本発明は、以下の(1)〜(22)に関する。
(1) ラミニン構成成分α4鎖のモジュールLG4領域に存在するヘパリン結合領域のアミノ酸配列を含む、分子量108kDa以下のポリペプチドまたは該ポリペプチドを含有する融合ポリペプチド。
(2) ヘパリン結合領域のアミノ酸配列が、配列番号3、4、6、17および33のいずれかに記載のアミノ酸配列である、(1)記載のポリペプチド。
(3)ポリペプチドが、ラミニン構成成分α4鎖のモジュールLG4領域、またはLG4およびLG5領域を含むポリペプチドである、(1)記載のポリペプチド。
(4) 融合ポリペプチドが、タグペプチド、マーカーペプチド、またはシグナルペプチドより選ばれるペプチドとの融合ポリペプチドである、(1)記載のポリペプチド。
(5) タグペプチド、マーカーペプチド、またはシグナルペプチドより選ばれるペプチドが、mycポリペプチド、β−ガラクトシダーゼ、プロテインA、プロテインAのIgG結合領域、クロラムフェニコール・アセチルトランスフェラーゼ、ポリ(Arg)、ポリ(Glu)、プロテインG、マルトース結合ポリペプチド、グルタチオンS−トランスフェラーゼ、ポリヒスチジン鎖、Sペプチド、DNA結合ポリペプチドドメイン、Tac抗原、チオレドキシン、グリーン・フルオレッセント・プロテイン、FLAGペプチド、任意の抗体のエピトープおよび任意の分泌蛋白質のシグナルペプチドからなる群より選ばれるペプチドである(4)記載のポリペプチド。
(6) 配列番号3、4、6、17および33のいずれかに記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド。
(7) (1)〜(6)のいずれか1項に記載のポリペプチドのアミノ酸配列において、1以上のアミノ酸が欠失、置換および/または付加されたアミノ酸配列からなり、マウスラミニンα4鎖の1518番目のヒスチジン残基と1520番目のアルギニン残基に相当する2アミノ酸が保存され、かつヘパリン結合能を有するポリペプチド。
(8) (1)〜(7)のいずれか1項に記載のポリペプチドのアミノ酸配列と60%以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、マウスラミニンα4鎖の1518番目のヒスチジン残基と1520番目のアルギニン残基に相当する2アミノ酸が保存され、かつヘパリン結合能を有するポリペプチド。
(9) (1)〜(8)のいずれか1項に記載のポリペプチドをコードするDNA。
(10) (9)に記載のDNAをベクターに組み込んで得られる組換え体DNA6
(11) (9)に記載のDNAまたは(10)に記載の組換え体DNAを保有する形質転換体。
(12) 形質転換体が、微生物、動物細胞、植物細胞、および昆虫細胞からなる群より選ばれる形質転換体である、(11)に記載の形質転換体。
(13) 形質転換体が、非ヒトトランスジェニック動物またはトランスジェニック植物である、(11)に記載の形質転換体。
(14) (11)または(12)に記載の形質転換体を培地に培養し、培養物中に(1)〜(8)のいずれか1項に記載のポリペプチドを生成、蓄積させ,該培養物から該ポリペプチドを採取することを特徴とする、該ポリペプチドの製造方法。
(15) (13)に記載の非ヒトトランスジェニック動物またはトランスジェニック植物を生育させ、(1)〜(8)のいずれか1項に記載のポリペプチドを該動植物中に生成、蓄積させ、該動植物中より該ポリペプチドを採取することを特徴とする、該ポリペプチドの製造方法。
(16) (1)〜(8)のいずれか1項に記載のポリペプチドを有効成分として含有してなる医薬。
(17) (9)に記載のDNAまたは(10)に記載の組換え体DNAを有効成分として含有してなる医薬。
(18) 細胞と細胞外マトリックスとの結合の阻害作用、細胞と毛細血管との接触の阻害作用、細胞の増殖の阻害作用または細胞の分化の阻害作用を有する(16)または(17)に記載の医薬。
(19) 医薬が癌、または血管新生が関与する疾患の治療および/または予防のための医薬である、(16)、(17)または(18)に記載の医薬。
(20) (1)〜(8)のいずれか1項に記載のポリペプチドを用いて、細胞からヘパリン結合性の情報伝達分子を遊離させる方法。
(21) (1)〜(8)のいずれか1項に記載のポリペプチドを用いて、ヘパリン結合性の情報伝達分子の濃度勾配形成またはシグナル伝達を阻害する方法。
(22) ヘパリン結合性の情報伝達分子がWnt1、FGF(Fibroblast growth factor)、HB−EGF(Heparin−binding epidermal growth factor)、PDGF(Platelet−derived growth factor)、BMP(Bone morphogenic protein)、GM−CSF(Granulocyte−macrophage colony stimulating factor)、HGF(Hepatocyte growth factor)、ケモカインおよびTNF(Tumor necrosis factor)からなる群から選ばれる情報伝達分子である(20)または(21)に記載の方法。
(23) ラミニン構成成分α4鎖のGドメインを含むポリペプチドを有効成分として含有してなる医薬。
(24) 細胞と細胞外マトリックスとの結合の阻害作用、細胞と毛細血管との接触の阻害作用、細胞の増殖の阻害作用または細胞の分化の阻害作用を有する(23)に記載の医薬。
(25) 医薬が癌、または血管新生が関与する疾患の治療および/または予防のための医薬である、(23)または(24)に記載の医薬。
(26) ラミニン構成成分α4鎖のGドメインを含むポリペプチドを用いて、細胞からヘパリン結合性の情報伝達分子を遊離させる方法。
(27) ラミニン構成成分α4鎖のGドメインを含むポリペプチドを用いて、ヘパリン結合性の情報伝達分子の濃度勾配形成またはシグナル伝達を阻害する方法。
(28) ヘパリン結合性の情報伝達分子がWnt1、FGF(Fibroblast growth factor)、HB−EGF(Heparin−binding epidermal growth factor)、PDGF(Platelet−derived growth factor)、BMP(Bone morphogenic protein)、GM−CSF(Granulocyte−macrophage colony stimulating factor)、HGF(Hepatocyte growth factor)、ケモカインおよびTNF(Tumor necrosis factor)からなる群から選ばれる情報伝達分子である(26)または(27)に記載の方法。
以下、本発明を詳細に説明する。
1.本発明のポリペプチドの製造
本発明のポリペプチドは、ラミニン構成成分α4鎖のモジュールLG4領域に存在するヘパリン結合領域のアミノ酸配列を有する、分子量108kDa以下のポリペプチドまたは該ポリペプチドを含有する融合ポリペプチドである。
該ポリペプチドとして、例えば、配列番号3、4、6、17および33のいずれかに記載のアミノ酸配列を有する、ラミニン構成成分α4鎖のヘパリン結合領域のアミノ酸配列を有するポリペプチド、ラミニン構成成分α4鎖のモジュールLG4領域を含むポリペプチド、LG4およびLG5領域を含むポリペプチド、配列番号3、4、6、17および33のいずれかに記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド等を挙げることができる。
上記ポリペプチドを含有する本発明の融合ポリペプチドとしては、上記ポリペプチドのヘパリン結合能を維持できる異種ポリペプチドとの融合ポリペプチドであればよく、異種ペプチドとしては、例えば、タグペプチド、マーカーペプチド、またはシグナルペプチドより選ばれるペプチドが挙げられ、具体的には、mycポリペプチド、β−ガラクトシダーゼ、プロテインA、プロテインAのIgG結合領域、クロラムフェニコール・アセチルトランスフェラーゼ、ポリ(Arg)、ポリ(Glu)、プロテインG、マルトース結合ポリペプチド、グルタチオンS−トランスフェラーゼ、ポリヒスチジン鎖(His−tag)、Sペプチド、DNA結合ポリペプチドドメイン、Tac抗原、チオレドキシン、グリーン・フルオレッセント・プロテイン(GFP)、FLAGペプチド、任意の抗体のエピトープおよび任意の分泌蛋白質のシグナルペプチド等との融合ポリペプチドなどを挙げることができる〔山川彰夫,実験医学,13,469−474(1995)〕。
更に、本発明のポリペプチドとしては、上記のポリペプチドのアミノ酸配列において、1以上のアミノ酸が欠失、置換および/または付加されたアミノ酸配列からなり、マウスラミニンα4鎖の1518番目のヒスチジン残基と1520番目のアルギニン残基に相当する2アミノ酸が保存され、かつヘパリン結合能を有するポリペプチド、上記のポリペプチドのアミノ酸配列と60%以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、マウスラミニンα4鎖の1518番目のヒスチジン残基と1520番目のアルギニン残基に相当する2アミノ酸が保存され、かつヘパリン結合能を有するポリペプチド等を挙げることができる。
上記の本発明のポリペプチドのアミノ酸配列において、1以上のアミノ酸が欠失、置換および/または付加されたアミノ酸配列を有するポリペプチドは、Molecular Cloning,A Laboratory Manual,Second Edition,Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989(以下、モレキュラー・クローニング第2版と略す)、Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley & Sons,1987−1997(以下、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジーと略す)、Nucleic Acids Research,10,6487,(1982)、Proc.Natl.Acad.Sci.,USA,79,6409(1982)、Gene,34,315(1985)、Nucleic Acids Research,13,4431(1985)、Proc.Natl.Acad.Sci USA,82,488(1985)等に記載の部位特異的変異導入法を用いて、本発明のポリペプチドをコードするDNAに部位特異的変異を導入することにより行うことができる。欠失、置換および/または付加されるアミノ酸の数は1から数個であり、その数は特に限定されないが、上記の部位特異的変異導入法などの周知の技術により、欠失、置換もしくは付加できる程度の数であり、例えば、1〜数十個、好ましくは1〜20個、より好ましくは1〜10個、さらに好ましくは1〜5個である。
また、上記本発明のポリペプチドのアミノ酸配列と60%以上の相同性を有するポリペプチドは、BLAST〔J.Mol.Biol.,215,403(1990)〕やFASTA(Methods in Enzymology,183,63−69)等の解析ソフトで、デフォルト(初期設定)のパラメータを用いて計算したときに、少なくとも60%以上の相同性を有するポリペプチドであり、好ましくは70%以上、より好ましくは80%以上、さらに好ましくは90%以上、特に好ましくは95%以上、最も好ましくは97%以上の相同性を有するポリペプチドである。相同性を有するポリペプチドとしては、マウス、ラット、ウシ、サル等の哺乳動物由来のラミニン構成成分α4鎖のホモログポリペプチドを挙げることができる。
本発明のポリペプチドは、モレキュラー・クローニング第2版やカレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー等に記載された方法等を用い、例えば以下の方法により、本発明のDNAを宿主細胞中で発現させて、製造することができる。
本発明のDNAとしては、上記本発明のポリペプチドをコードするDNAを挙げることができる。
本発明のDNAは、本発明のポリペプチドのアミノ酸配列情報に基づいて、該ポリペプチドをコードするDNAを化学合成することによって調製することができる。
DNAの化学合成は、チオホスファイト法を利用した島津製作所製のDNA合成機、フォスフォアミダイト法を利用したパーキン・エルマー社製のDNA合成機model392等を用いて行うことができる。
また、本発明のポリペプチドのアミノ酸配列情報に基づいて作製したオリゴヌクレオチドをセンスプライマーおよびアンチセンスプライマーとして用い、これらDNAに相補的なmRNAを発現している細胞のmRNAから調製したcDNAを鋳型として、PCRを行うことによっても、目的とするDNAを調製することができる。
アンチセンス・オリゴヌクレオチドあるいはセンス・オリゴヌクレオチドはモレキュラー・クローニング第2版等に記載の常法により、あるいは該DNAの塩基配列情報よりDNA合成機により調製することができる。
上記オリゴヌクレオチドとしては、本発明のポリペプチドのアミノ酸配列情報より想定される塩基配列中の連続した5〜120塩基、より好ましくは連続した5〜60塩基と同じ配列を有するDNA、または該DNAと相補的な配列を有するDNAを挙げることができ、具体的には、配列番号34で表される塩基配列中の連続した5〜120塩基と同じ配列を有するDNAまたは該DNAと相補的な配列を有するDNAを挙げることができる。センスプライマーおよびアンチセンスプライマーとして用いる場合には、両者の融解温度(Tm)および塩基数が極端に変わることのない上記記載のオリゴヌクレオチドが好ましい。具体的には配列番号37〜40等に示された塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを挙げることができる。
上記の方法で調製した、本発明のポリペプチドをコードする部分を含む適当な長さのDNA断片を適当な発現ベクターのプロモーターの下流に挿入することにより、組換え体DNAを作製することができる。
該組換え体DNAを、該発現ベクターに適合した宿主細胞に導入することにより、本発明のポリペプチドを生産する形質転換体を得ることができる。導入した組換え体DNAは、形質転換体の染色体ゲノム中に組み込まれて保持される場合と形質転換細胞内で組換え体DNAとして保持される場合とがある。
本発明の形質転換体としては、本発明の上記DNA若しくは組換え体DNAを適当な宿主細胞または動植物個体に導入して得られる形質転換体を挙げることができる。
宿主細胞としては、細菌などの原核細胞、糸状菌、酵母等の微生物細胞、動物細胞、昆虫細胞、植物細胞等、目的とする遺伝子を発現できるものであればいずれも用いることができる。また、動物個体や植物個体を用いることができる。
酵母、動物細胞、昆虫細胞または植物細胞により発現させた場合には、糖あるいは糖鎖が付加されたポリペプチドを得ることができる。
発現ベクターとしては、上記宿主細胞において自立複製が可能、または染色体中への組込みが可能で、本発明のポリペプチドをコードするDNAの転写に適した位置にプロモーターを含有しているものを用いることができる。
細菌等の原核生物を宿主細胞として用いる場合、本発明のポリペプチドをコードするDNAの発現ベクターは、原核生物中で自立複製可能であると同時に、プロモーター、リボソーム結合配列、本発明のポリペプチドをコードするDNA、転写終結配列、より構成されていることが好ましい。プロモーターを制御する遺伝子が含まれていてもよい。
発現ベクターとしては、例えば、pBTrp2、pBTac1、pBTac2(いずれもBoehringer Mannheim社より市販)、pSE280(Invitrogen社製)、pGEMEX−1(Promega社製)、pQE−8(QIAGEN社製)、pKYP10(特開昭58−110600)、pKYP200〔Agric.Biol.Chem.,48,669(1984)〕、pLSA1〔Agric.Biol.Chem.,53,277(1989)〕、pGEL1〔Proc.Natl.Acad.Sci.USA,82,4306(1985)〕、pBlue II SK(−)(Stratagene社製)、pTrs30(FERM BP−5407)、pTrs32(FERM BP−5408)、pGHA2(FERM BP−400)、pGKA2(FERM B−6798)、pTerm2(特開平3−22979、US4686191、US4939094、US5160735)、pKK233−2(Pharmacia社製)、pGEX(Pharmacia社製)、pETシステム(Novagen社製)、pSupex、pUB110、pTP5、pC194、pTrxFus(Invitrogen社製)、pMAL−c2(New England Biolabs社製)等を例示することができる。
プロモーターとしては、大腸菌等の宿主細胞中で発現できるものであればいかなるものでもよい。例えば、trpプロモーター(Ptrp)、lacプロモーター(Plac)、PLプロモーター、PRプロモーター等の、大腸菌やファージ等に由来するプロモーター、SPO1プロモーター、SPO2プロモーター、penPプロモーター等を挙げることができる。またPtrpを2つ直列させたプロモーター(Ptrp x2)、tacプロモーター、lacT7プロモーター、lte Iプロモーターのように人為的に設計改変されたプロモーター等も用いることができる。
リボソーム結合配列としては、シャイン−ダルガノ(Shine−Dalgarno)配列と開始コドンとの間を適当な距離(例えば6〜18塩基)に調節したプラスミドを用いることが好ましい。
本発明のDNAの発現には転写終結配列は必ずしも必要ではないが、好適には構造遺伝子直下に転写終結配列を配置することが望ましい。
宿主細胞としては、エシェリヒア属、セラチア属、バチルス属、ブレビバクテリウム属、コリネバクテリウム属、ミクロバクテリウム属、シュードモナス属等に属する微生物、例えば、Escherichia coli XL1−Blue、Escherichia coli XL2−Blue、Escherichia coli DH1、Escherichia coli MC1000、Escherichia coli KY3276、Escherichia coli W1485、Escherichia coli JM109、Escherichia coli HB101、Escherichia coli No.49、Escherichia coli W3110、Escherichia coli NY49、Escherichia coli BL21(DE3)、Escherichia coli BL21(DE3)pLysS、Escherichia coli HMS174(DE3)、Escherichia coli HMS174(DE3)pLysS、Serratia ficaria、Serratia fonticola、Serratia liquefaciens、Serratia marcescens、Bacillus subtilis、Bacillus amyloliquefaciens、Brevibacterium ammoniagenes、Brevibacterium immariophilum ATCC14068、Brevibacterium saccharolyticum ATCC14066、Corynebacterium glutamicu m ATCC13032、Corynebacterium glutamicum ATCC14067、Corynebacterium glutamicum ATCC13869、Corynebacterium acetoacidophilum ATCC13870、Microbacterium ammoniaphilum ATCC15354、Pseudomonas sp.D−0110等を挙げることができる。
組換えベクターの導入方法としては、上記宿主細胞へDNAを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、エレクトロポレーション法〔Nucleic Acids Res.,16,6127(1988)〕、カルシウムイオンを用いる方法〔Proc.Natl.Acad.Sci.USA,69,2110(1972)〕、プロトプラスト法(特開昭63−248394)、Gene,17,107(1982)やMol.Gen.Genet.,168,111(1979)に記載の方法等を挙げることができる。
酵母菌株を宿主細胞として用いる場合には、発現ベクターとして、例えば、YEp13(ATCC37115)、YEp24(ATCC37051)、YCp50(ATCC37419)、pHS19、pHS15等を例示することができる。
プロモーターとしては、酵母菌株中で発現できるものであればいかなるものでもよく、例えば、PHO5プロモーター、PGKプロモーター、GAPプロモーター、ADHプロモーター、gal 1プロモーター、gal 10プロモーター、ヒートショック蛋白質プロモーター、MFα1プロモーター、CUP 1プロモーター等のプロモーターを挙げることができる。
宿主細胞としては、サッカロマイセス属、シゾサッカロマイセス属、クルイベロミセス属、トリコスポロン属、シワニオミセス属等に属する酵母菌株を挙げることができ、具体的には、Saccharomyces cerevisiae、Schizosaccharomyces pombe、Kluyveromyces lactis、Trichosporon pullulans、Schwanniomyces alluvius等を挙げることができる。
組換えベクターの導入方法としては、酵母にDNAを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、エレクトロポレーション法〔Methods.Enzymol.,194,182(1990)〕、スフェロプラスト法〔Proc.Natl.Acad.Sci.USA,84,1929(1978)〕、酢酸リチウム法〔J.Bacteriol.,153,163(1983)〕、Proc.Natl.Acad.Sci.USA,75,1929(1978)記載の方法等を挙げることができる。
動物細胞を宿主細胞として用いる場合には、発現ベクターとして、例えば、pcDNAI/Amp(Invitrogen社製)、pcDNAI(フナコシ社製)、pCDM8〔Nature,329,840(1987)、フナコシ社製〕、pAGE107〔特開平3−22979;Cytotechnology,3,133(1990)〕、pREP4(Invitrogen社製)、pAGE103〔J.Biochemistry,101,1307(1987)〕、pAMo、pAMoA、pAS3−3(特開平2−227075)等を例示することができる。
プロモーターとしては、動物細胞中で発現できるものであればいずれも用いることができ、例えば、サイトメガロウイルス(ヒトCMV)のIE(immediate early)遺伝子のプロモーター、SV40の初期プロモーター、モロニー・ミュリン・ロイケミア・ウイルス(Moloney Murine Leukemia Virus)のロング・ターミナル・リピート・プロモーター(Long Terminal Repeat Promoter)、レトロウイルスのプロモーター、ヒートショックプロモーター、SRαプロモーター、あるいはメタロチオネインのプロモーター等を挙げることができる。また、ヒトCMVのIE遺伝子のエンハンサーをプロモーターと共に用いてもよい。
宿主細胞としては、DNAを細胞内に導入できる動物細胞であるならいかなる細胞も用いることができる。例えば、哺乳動物の細胞としてはヒト、サル、マウス、ラット、モルモットまたはミンクの細胞などを用いることができる。具体的には、マウス・ミエローマ細胞、ラット・ミエローマ細胞、マウス・ハイブリドーマ細胞、チャイニーズ・ハムスターの細胞であるCHO細胞(ATCC CRL−9096、ATCC CCL−61)、BHK細胞、アフリカミドリザル腎臓細胞、ヒトの細胞であるNamalwa細胞(ATCCCRL−1432)またはNamalwa KJM−1細胞、ヒト胎児腎臓細胞、ヒト白血病細胞、HBT5637(特開昭63−299)、ヒト大腸癌細胞株等を挙げることができる。
マウス・ミエローマ細胞としては、SP2/0、NSO等、ラット・ミエローマ細胞としてはYB2/0等、ヒト胎児腎臓細胞としてはHEK293、293〔J.Gen.Viol.36,59−72(1977)〕等、ヒト白血病細胞としてはBALL−1等、アフリカミドリザル腎臓細胞としてはCOS−1(ATCC CRL−1650)、COS−7(ATCC CRL−1651)、ヒト大腸癌細胞株としてはHCT−15等を挙げることができる。
治療用ポリペプチド性医薬品の製造などが目的の場合は、哺乳動物の細胞、特にCHO細胞を宿主とすることが好ましい。
組換えベクターの導入方法としては、動物細胞にDNAを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、エレクトロポレーション法〔Cytotechnology,3,133(1990)〕、リン酸カルシウム法(特開平2−227075)、DEAEデキストラン法(羊土社 バイオマニュアルシリーズ4,16)、リポフェクション法〔Proc.Natl.Acad.Sci.USA,84,7413(1987)〕、マイクロインジェクション法(羊土社 バイオマニュアルシリーズ4,36)、アデノウイルス法(羊土社 バイオマニュアルシリーズ4,43)、ワクシニアウイルス(羊土社 バイオマニュアルシリーズ4,59)レトロウイルスベクター(羊土社 バイオマニュアルシリーズ4,74)等を用いることができる。
昆虫細胞を宿主として用いる場合には、例えば、バキュロウイルス・イクスプレッション・ベクターズ ア・ラボラトリー・マニュアル〔Baculovirus Expression Vectors,A Laboratory Manual,W.H.Freeman and Company,NewYork(1992)〕、モレキュラー・バイオロジーア・ラボラトリー・マニュアル(Molecular Biology,A Laboratory Manual)、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー・サプルメント1〜38(Current Protocols in Molecular Biology)、Bio/Technology,6,47(1988)等に記載された方法によって、ポリペプチドを発現することができる。
即ち、組換え遺伝子導入ベクターおよびバキュロウイルスを昆虫細胞に共導入して昆虫細胞培養上清中に組換えウイルスを得た後、さらに組換えウイルスを昆虫細胞に感染させ、ポリペプチドを発現させることができる。
該方法において用いられる遺伝子導入ベクターとしては、例えば、pVL1392、pVL1393、pBlueBacIII(すべてInvitrogen社製)等を挙げることができる。
バキュロウイルスとしては、例えば、夜盗蛾科昆虫に感染するウイルスであるアウトグラファ・カリフォルニカ・ヌクレアー・ポリヘドロシス・ウイルス(Autographa californica nuclear polyhedrosis virus)等を用いることができる。
昆虫細胞としては、Spodoptera frugiperdaの卵巣細胞、Trichoplusia niの卵巣細胞、カイコ卵巣由来の培養細胞等を用いることができる。Spodoptera frugiperdaの卵巣細胞としてはSf9、Sf21(バキュロウイルス・イクスプレッション・ベクターズ ア・ラボラトリー・マニュアル)等、Trichoplusia niの卵巣細胞としてはHigh5(Invitrogen社製)、BTI−TN−5B1−4(Invitrogen社製)等、カイコ卵巣由来の培養細胞としてはBombyx mori N4等を挙げることができる。
組換えウイルスを調製するための、昆虫細胞への上記組換え遺伝子導入ベクターと上記バキュロウイルスの共導入方法としては、例えば、リン酸カルシウム法(特開平2−227075)、リポフェクション法〔Proc.Natl.Acad.Sci.USA,84,7413(1987)〕等を挙げることができる。
また、動物細胞にDNAを導入する方法と同様の方法を用いて、昆虫細胞にDNAを導入することもでき、例えば、エレクトロポレーション法〔Cytotechnology,3,133(1990)〕、リン酸カルシウム法(特開平2−227075)、リポフェクション法〔Proc.Natl.Acad.Sci.USA,84,7413(1987)〕等を挙げることができる。
植物細胞または植物個体を宿主として用いる場合には、公知の方法〔組織培養,20(1994)、組織培養,21(1995)、Trends in Biotechnology,15,45(1997)〕に準じてポリペプチドを生産することができる。
遺伝子発現に用いるプロモーターとしては、植物細胞中で発現できるものであればいずれも用いることができ、例えば、カリフラワーモザイクウイルス(CaMV)の35Sプロモーター、イネアクチン1プロモーター等を挙げることができる。また、プロモーターと発現させる遺伝子の間に、トウモロコシのアルコール脱水素酵素遺伝子のイントロン1等を挿入することにより、遺伝子の発現効率を上げることもできる。
宿主細胞としては、ジャガイモ、タバコ、トウモロコシ、イネ、アブラナ、ニンジン、大豆、トマト、小麦、大麦、ライ麦、アルファルファ、亜麻等の植物細胞等を挙げることができる。組換えベクターの導入方法としては、植物細胞にDNAを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、アグロバクテリウム(Agrobacterium)(特開昭59−140885、特開昭60−70080、WO94/00977)、エレクトロポレーション法〔Cytotechnology,3,133(1990)、特開昭60−251887〕、パーティクルガン(遺伝子銃)を用いる方法(特許第2606856、特許第2517813)等を挙げることができる。
遺伝子を導入した植物の細胞や器官は、ジャーファーメンターを用いて大量培養することができる。また、遺伝子導入した植物細胞を再分化させることにより、遺伝子が導入された植物個体(トランスジェニック植物)を造成することもできる。
動物個体を用いて本発明のポリペプチドを生産することもできる。例えば、公知の方法〔American Journal of Clinical Nutrition,63,639S(1996)、American Journal of Clinical Nutrition,63,627S(1996)、Bio/Technology,9,830(1991)〕に準じて、遺伝子を導入した動物中に本発明のポリペプチドを生産することができる。
プロモーターとしては、動物で発現できるものであればいずれも用いることができるが、例えば、乳腺細胞特異的なプロモーターであるαカゼインプロモーター、βカゼインプロモーター、βラクトグロブリンプロモーター、ホエー酸性プロテインプロモーター等が好適に用いられる。
本発明のポリペプチドをコードするDNAを組み込んだ組換え体ベクターを保有する微生物、動物細胞、あるいは植物細胞由来の形質転換体を、通常の培養方法に従って培養し、該ポリペプチドを生成蓄積させ、該培養物より該ポリペプチドを採取することにより、該ポリペプチドを製造することができる。
形質転換体が動物個体または植物個体の場合は、通常の方法に従って、飼育または栽培し、該ポリペプチドを生成蓄積させ、該動物個体または植物個体より該ポリペプチドを採取することにより、該ポリペプチドを製造することができる。
即ち、動物個体の場合、例えば、本発明のDNAを保有する非ヒトトランスジェニック動物を飼育し、該組換え体DNAのコードする本発明のポリペプチドを該動物中に生成、蓄積させ、該動物中より該ポリペプチドを採取することにより、本発明のポリペプチドを製造することができる。該動物中の生成、蓄積場所としては、例えば、該動物のミルク(特開昭63−309192)、卵等を挙げることができる。
植物個体の場合、例えば、本発明のDNAを保有するトランスジェニック植物を栽培し、該組換え体DNAのコードする本発明のポリペプチドを該植物中に生成、蓄積させ、該植物中より該ポリペプチドを採取することにより、本発明のポリペプチドを製造することができる。
本発明のポリペプチド製造用形質転換体が大腸菌等の原核生物、酵母菌等の真核生物である場合、これら生物を培養する培地は、該生物が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、形質転換体の培養を効率的に行える培地であれば天然培地、合成培地のいずれでもよい。
炭素源としては、該形質転換体が資化し得るものであればよく、グルコース、フラクトース、スクロース、これらを含有する糖蜜、デンプンあるいはデンプン加水分解物等の炭水化物、酢酸、プロピオン酸等の有機酸、エタノール、プロパノール等のアルコール類が用いられる。
窒素源としては、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等の各種無機酸や有機酸のアンモニウム塩、その他含窒素化合物、並びに、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーンスチープリカー、カゼイン加水分解物、大豆粕および大豆粕加水分解物、各種発酵菌体およびその消化物等を用いることができる。
無機物としては、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅、炭酸カルシウム等を用いることができる。
培養は、振盪培養または深部通気攪拌培養等の好気的条件下で行う。培養温度は15〜40℃がよく、培養時間は、通常16〜96時間である。培養中pHは、3.0〜9.0に保持する。pHの調整は、無機あるいは有機の酸、アルカリ溶液、尿素、炭酸カルシウム、アンモニア等を用いて行う。
また培養中必要に応じて、アンピシリンやテトラサイクリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
プロモーターとして誘導性のプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときには、必要に応じてインデューサーを培地に添加してもよい。例えば、lacプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときにはイソプロピル−β−D−チオガラクトピラノシド(IPTG)等を、trpプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときにはインドールアクリル酸(IAA)等を培地に添加してもよい。
本発明のポリペプチド製造用形質転換体が動物細胞である場合、該細胞を培養する培地は、一般に使用されているRPMI1640培地〔The Journal of the American Medical Association,199,519(1967)〕、EagleのMEM培地〔Science,122,501(1952)〕、DMEM培地〔Virology,8,396(1959)〕、199培地〔Proceeding of the Society for the Biological Medicine,73,1(1950)〕またはこれら培地に牛胎児血清等を添加した培地等を用いることができる。
培養は、通常pH6〜8、30〜40℃、5%CO2存在下等の条件下で1〜7日間行う。
また培養中必要に応じて、カナマイシン、ペニシリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
昆虫細胞を宿主細胞として得られた形質転換体を培養する培地としては、一般に使用されているTNM−FH培地(Pharmingen社)、Sf−900 II SFM培地(GIBCO BRL社製)、ExCell400、ExCell405〔いずれもJRH Biosciences社製〕、Grace’s Insect Medium〔Nature,195,788(1962)〕等を用いることができる。培養は、pH6〜7、培養温度25〜30℃がよく、培養時間は、通常1〜5日間である。また、培養中必要に応じて、ゲンタマイシン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
植物細胞を宿主として得られた形質転換体は、細胞として、または植物の細胞や器官に分化させて培養することができる。該形質転換体を培養する培地としては、一般に使用されているムラシゲ・アンド・スクーグ(MS)培地、ホワイト(White)培地、またはこれら培地にオーキシン、サイトカイニン等、植物ホルモンを添加した培地等を用いることができる。培養は、通常pH5〜9、20〜40℃の条件下で3〜60日間行う。また、培養中必要に応じて、カナマイシン、ハイグロマイシン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
本発明のポリペプチドの生産方法としては、宿主細胞内に生産させる方法、宿主細胞外に分泌させる方法、あるいは宿主細胞外膜上に生産させる方法があり、使用する宿主細胞や、生産させるポリペプチドの構造に応じて適宜、選択することができる。
本発明のポリペプチドが宿主細胞内あるいは宿主細胞外膜上に生産される場合、ポールソンらの方法〔J.Biol.Chem.,264,17619(1989)〕、ロウらの方法〔Proc.Natl.Acad.Sci.USA,86,8227(1989)、Genes Develop.,4,1288(1990)〕、または特開平05−336963、WO94123021等に記載の方法を準用することにより、該ポリペプチドを宿主細胞外に積極的に分泌させることができる。
即ち、遺伝子組換えの手法を用いて、本発明のポリペプチドの活性部位を含むポリペプチドの手前にシグナルペプチドを付加した形で発現させることにより、本発明のポリペプチドを宿主細胞外に積極的に分泌させることができる。
具体的には、活性部位を含むと考えられるアミノ酸配列を有するポリペプチドの手前に、シグナルペプチドを付加して発現させることにより、本発明のポリペプチドを宿主細胞外に積極的に分泌させることができると考えられる。さらに、シグナルペプチドと活性部位を含むポリペプチドの間、または活性部位を含むポリペプチドのC末端に、精製・検出用のタグを付加することもできる。
精製・検出用のタグとしては、β−ガラクトシダーゼ、プロテインA、プロテインAのIgG結合領域、クロラムフェニコール・アセチルトランスフェラーゼ、ポリ(Arg)、ポリ(Glu)、プロテインG、マルトース結合ポリペプチド、グルタチオンS−トランスフェラーゼ、ポリヒスチジン鎖(His−tag)、Sペプチド、DNA結合ポリペプチドドメイン、Tac抗原、チオレドキシン、グリーン・フルオレッセント・プロテイン(GFP)、FLAGペプチド、および任意の抗体のエピトープなどが挙げることができる山川彰夫,実験医学,13,469−474(1995)〕。
また、特開平2−227075に記載されている方法に準じて、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子等を用いた遺伝子増幅系を利用して生産量を上昇させることもできる。
本発明のポリペプチドの製造法として他に、本発明のDNAを用いたin vitroでの転写・翻訳系による製造法がある。in vitro転写・翻訳系とは、無細胞システムを用いてDNAからmRNAへの転写、およびmRNAから蛋白質への翻訳を行うことによりポリペプチドを生産する系のことであり、目的のDNAまたは目的のmRNAから目的のポリペプチドを生産できる無細胞システムであればどのようなものでも用いることができる。代表的な無細胞翻訳系として、例えば、ウサギの網状赤血球ライゼート(Rabbit Reticulocyte Lysate)や小麦杯ライゼート(Wheat Germ Lysate)を用いた系などが挙げられる。in vitro転写・翻訳系は各社からキットが販売されており、市販のキットを用いてポリペプチドを比較的容易に製造できるようになっている。市販キットとして例えば、In Vitro ExpressTM Translation Kit(Stratagene社製)が挙げられる。また、本発明のポリペプチドは、公知の方法〔J.Biomolecular NMR,6,129−134、Science,242,1162−1164、J.Biochem.,110,166−168(1991)〕に準じたin vitro転写・翻訳系を用いて生産することもできる。
本発明ポリペプチド製造用形質転換体の培養物から、本発明のポリペプチドを単離・精製するには、通常の酵素の単離・精製法を用いることができる。例えば、本発明のポリペプチドが本発明のポリペプチド製造用形質転換体の細胞内に溶解状態で蓄積する場合には、培養物を遠心分離することにより、培養物中の細胞を集め、該細胞を洗浄した後に、超音波破砕機、フレンチプレス、マントンガウリンホモゲナイザー、ダイノミル等により細胞を破砕し、無細胞抽出液を得る。
該無細胞抽出液を遠心分離することにより得られた上清から、溶媒抽出法、硫安等による塩析法脱塩法、有機溶媒による沈殿法、ジエチルアミノエチル(DEAE)−セファロース、DIAION HPA−75(三菱化成社製)等レジンを用いた陰イオン交換クロマトグラフィー法、S−Sepharose FF(Pharmacia社製)等のレジンを用いた陽イオン交換クロマトグラフィー法、ブチルセファロース、フェニルセファロース等のレジンを用いた疎水性クロマトグラフィー法、分子篩を用いたゲルろ過法、アフィニティークロマトグラフィー法、クロマトフォーカシング法、等電点電気泳動等の電気泳動法等の手法を用い、精製標品を得ることができる。
また、該ポリペプチドが細胞内に不溶体を形成して発現した場合は、同様に細胞を回収後破砕し、遠心分離を行うことにより得られた沈殿画分より、通常の方法により該ポリペプチドを回収後、該ポリペプチドの不溶体をポリペプチド変性剤で可溶化する。該可溶化液を、ポリペプチド変性剤を含まないあるいはポリペプチド変性剤の濃度がポリペプチドが変性しない程度に希薄な溶液に希釈、あるいは透析し、該ポリペプチドを正常な立体構造に構成させた後、上記と同様の単離精製法により精製標品を得ることができる。
本発明のポリペプチドあるいはその糖修飾体等の誘導体が細胞外に分泌される場合には、培養上清に該ポリペプチドあるいはその糖鎖付加体等の誘導体を回収することができる。即ち、該培養物を上記と同様の遠心分離等の手法により処理することにより可溶性画分を取得し、該可溶性画分から、上記と同様の単離精製法を用いることにより、精製標品を得ることができる。
また、本発明のポリペプチドを他のポリペプチドとの融合ポリペプチドとして生産し、融合したポリペプチドに親和性をもつ物質を用いたアフィニティークロマトグラフィーを利用して精製することもできる〔山川彰夫,実験医学,13,469−474(1995)〕。例えば、ロウらの方法〔Proc.Natl.Acad.Sci.USA,86,8227(1989)、Genes Develop.,4,1288(1990)〕、特開平05−336963、特開平06−823021に記載の方法に準じて、本発明のポリペプチドをプロテインAとの融合ポリペプチドとして生産し、イムノグロプリンGを用いるアフィニティークロマトグラフィーにより精製することができる。また、本発明のポリペプチドをFLAGペプチドとの融合ポリペプチドとして生産し、抗FLAG抗体を用いるアフィニティークロマトグラフィーにより精製することができる〔Proc.Natl.Acad.Sci.USA,86,8227(1989)、Genes Develop.,4,1288(1990)〕。
更に、該ポリペプチド自身に対する抗体を用いたアフィニティークロマトグラフィーで精製することもできる。
また、本発明のポリペプチドは、Fmoc法(フルオレニルメチルオキシカルボニル法)、tBoc法(t−ブチルオキシカルボニル法)等の化学合成法によっても製造することができる。また、Advanced ChemTech社、Perkin−Elmer社、Amersham Pharmacia Biotech社、Protein Technology Instrument社、Synthecell−Vega社、PerSeptive社、島津製作所等のペプチド合成機を利用して化学合成することもできる。
形質転換体を培養して培養液を回収し、本発明のポリペプチドのヘパリン結合能を利用し、ヘパリン・アフィニティーカラムを用いて本発明のポリペプチドを精製することが可能である。ヘパリン・アフィニティーカラムとしては例えばハイトラップ(HiTrap)ヘパリンカラム(Amersham Pharmacia Biotech AB社製)、ヘパリンセファロースCL−6B(アマシャム・ファルマシア・バイオテク社製)等を用いることができる。カラムに本発明のポリペプチドを結合させ緩衝液で洗浄後、緩衝液を用いて溶出させ、一定量ずつ分画しながら回収し、本発明のポリペプチドを含有する分画だけを集めることにより、本発明のポリペプチドを精製することができる。
精製した本発明のポリペプチドの構造解析は、蛋白質化学で通常用いられる方法、例えば遺伝子クローニングのためのタンパク質構造解析(平野久著、東京化学同人発行、1993年)に記載の方法により実施可能である。
本発明のヘパリン結合能をもつポリペプチドは、上記のように該ポリペプチドをコードする本発明のDNAを用いた組換えDNA法により、製造することができるが、別法として、ラミニンα4鎖のGドメインをまず調製した後に、各種プロテアーゼによる分解処理により調製することも可能である。また、該ペプチドについては、ペプチドシンセサイザー等を用いた合成法により簡便に調製することができる。
以下に、本発明のヘパリン結合能をもつラミニンα4鎖由来の部分ポリペプチドのプロテアーゼ処理および合成法による調製、該ポリペプチドのヘパリン結合能の解析法について具体的に記す。
(1)ラミニンα4鎖のGドメインの大量調製
ラミニンα4鎖のGドメイン(以下、「α4G」と表わす。)のin vitroでの解析のためには、他のラミニンα鎖サブタイプを含まない高純度のラミニンα4Gを大量に調製し、解析する必要がある。そのためには、α4GをコードするDNAを用いた遺伝子組換え法によりα4G(マウスα4G:配列番号1、ヒトα4G:配列番号2)のみを動物細胞で大量に発現させ、そこから精製する方法が好ましい。
α4GをコードするDNAは、RT−PCRにより取得できる。すなわちα4鎖を大量に発現している臓器たとえば心臓、肺、骨格筋、胎盤等のRNAからオリゴdTプライマーと逆転写酵素を用いてcDNAを合成し、このcDNAを鋳型にして、マウスおよびヒトのα4鎖のcDNAの塩基配列から設計したα4Gをコードする部分の塩基配列に対応するプライマーを用いてPCRを行うことにより得られる。α4鎖のcDNAの塩基配列は、ヒト、マウスとも公知である〔マウスα4:GenBankアクセス番号U59865、Matrix Biol.,15,433(1996)、J.Biol.Chem.,272,27862(1997)、ヒトα4:GenBankアクセス番号X76939、Eur.J.Biochem.,238,813(1996)〕。
α4Gは、上述した方法に従って、マウスおよびヒトのα4GをコードするDNAを発現用ベクターに挿入して構築した発現プラスドを宿主細胞に導入して、α4Gのみを大量に分泌発現する形質転換体を取得し、その形質転換体を培養することにより生産させることができる。
(2)α4Gの部分ポリペプチドおよび部分ペプチドの調製
α4Gをαキモトリプシンやトリプシン等のエンドプロテアーゼで処理することによりα4Gを断片化することができる。また、α4Gのアミノ酸配列のデータに基づいてペプチド合成機を用いて固相化学合成をすることにより、任意の位置および長さのα4Gの部分ペプチドを得ることが可能である。このようにして得られたα4G部分ポリペプチドおよび部分ペプチドについて、(3)に述べるヘパリン結合能の測定を行い、ヘパリン結合能を有する部分ポリペプチドを選択する。
ヘパリン結合能を有するα4G部分ポリペプチドとしては、例えば、マウスα4Gのキモトリプシン分解により得られるN末端のアミノ酸配列がLys Phe Leu Glu Gln Lys Alaである39kDaおよび44kDaのポリペプチド、N末端のアミノ酸配列がThr Gln Ser Arg Ala Ala Serである41kDaのポリペプチド、マウスα4Gのトリプシン分解により得られる45kDaおよび40kDaのポリペプチド、N末端のアミノ酸配列がAla Ile Glu His Ala Tyr Glnである23kDaおよび35kDaのポリペプチド、配列番号3、4または6に示すアミノ酸配列を有するポリペプチド、またはα4GのモジュールLG4を含むポリペプチドなどを挙げることができる。
ヘパリン結合能を有するα4Gの部分ペプチドとして配列番号17または33に示すアミノ酸配列を含むペプチドを挙げることができる。
(3)α4Gの部分ポリペプチド、部分ペプチドの改変体の調製
ヘパリン結合能を有するポリペプチドとして、上記に挙げたラミニンα4鎖由来のヘパリン結合性ポリペプチドが有するアミノ酸配列において1以上のアミノ酸が欠失、置換および/または付加されたアミノ酸配列からなり、かつヘパリン結合能を保持したポリペプチドを挙げることができる。
上記ポリペプチドの有するアミノ酸配列において1以上のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなり、かつヘパリン結合能を有するポリペプチドは、モレキュラー・クローニング第2版、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー、Nucleic Acids Research,10,6487(1982)、Proc.Natl.Acad.Sci.USA,79,6409(1982)、Gene,34,315(1985)、Nucleic Acids Research,13,4431(1985)、Proc.Natl.Acad.Sci.USA,82,488(1985)等に記載の部位特異的変異導入法を用いて、例えば、上記の配列番号で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするDNAに部位特異的変異を導入することにより、取得することができる。
欠失、置換もしくは付加されるアミノ酸の数は特に限定されないが、上記の部位特異的変異法等の周知の方法により欠失、置換もしくは付加できる程度の数であり、1個から数10個、好ましくは1〜20個、より好ましくは1〜10個、さらに好ましくは1〜5個である。
上記部位特異的変異法により改変されたポリペプチドにおいて、改変前のヘパリン結合能を有するポリペプチドとしては、改変前のポリペプチドが有するアミノ酸配列と、BLAST〔J.Mol.Biol.,215,403(1990)〕やFASTA〔Methods in Enzymology,183,63(1990)〕などの解析ソフトで計算したときに、少なくとも60%以上の相同性を有するポリペプチド、好ましくは70%以上、より好ましくは80%以上、さらに好ましくは90%以上、特に好ましくは95%以上、最も好ましくは97%以上の相同性を有しているポリペプチドを挙げることができる。
尚、本明細書に記載される相同性の数値は、特に明示した場合を除き、当業者に公知の相同性検索プログラムを用いて算出される数値であってよいが、好ましくはBLASTやFASTAにおいてデフォルト(初期設定)のパラメータを用いて算出される数値である。
(4)糖鎖を付加または欠損させたα4Gの部分ポリペプチド、部分ペプチドの調製
ラミニンα4鎖のGドメイン中にはN結合型糖鎖が付加される部位が複数存在することから、ヘパリン結合能を有するポリペプチドとして、N結合型糖鎖を付加または欠損させた上記ポリペプチドを挙げることができる。
上記ポリペプチドにN結合型糖鎖を付加させるには、例えば、糖鎖付加能力を有する真核細胞を宿主として、上記ポリペプチドをコードするDNAを含む発現プラスミドを導入した組換え細胞体を作製し、その組換え細胞を培養して、上記ポリペプチドを製造する方法が挙げられる。一方、上記ポリペプチドのN結合型糖鎖を欠損させるには、糖鎖付加能力を有さない宿主細胞、またはN結合型糖鎖の合成に関与する糖転移酵素を欠損させることにより糖鎖付加能力が無くなった真核細胞を宿主として製造することができる。また、N結合型糖鎖の分解酵素により糖鎖を分解することにより製造することもできる。N結合型糖鎖の分解酵素として、例えば、ツニカマイシンやN−グルコシダーゼが挙げられる。
(5)ヘパリン結合能の測定
α4Gあるいはα4G部分ポリペプチドおよびα4G部分ペプチド等について、以下のような方法でヘパリン結合能を測定することができる。以下の記載では、測定するα4Gあるいはα4G部分ポリペプチドおよびα4G部分ペプチド等を「測定サンプル」とする。
(5−1)ヘパリン・アフィニティーカラムを使用する方法
ハイトラップ・ヘパリンカラム(Amersham Pharmacia Biotech AB社製)等のヘパリン・アフィニティーカラムに、測定サンプルを繰り返し通して結合させた後、NaClの直線濃度勾配の緩衝液を一定の流速でカラムに通すことにより溶出させ、一定量ずつ分画しながら回収する。各画分についてSDSポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS−PAGE)を行い、クマージー・ブリリアント・ブルー(CBB)染色あるいは測定サンプルと特異的に結合できる抗体を用いたイムノブロット法により、各分画に含まれる測定サンプルを検出し、ヘパリンと解離する塩濃度を算出する。解離塩濃度が高いほどヘパリンとの結合性が強いと判断できる。
(5−2)固相化ヘパリンを使用する方法
抗原の検出に用いられるサンドイッチELISA法と同様な手法で、プレートに抗体のかわりにヘパリンを固定化することにより、ヘパリンと結合した測定サンプルを検出することができる。ヘパリンは、マイクロウェルプレートにウシ血清アルブミン(BSA)と結合させたヘパリンの溶液を入れ数時間〜一晩静置することにより固相化できる。BSAやスキムミルク等により非特異的結合をブロック後、測定サンプルの溶液を接触させて結合させ、洗浄後、結合した測定サンプルの量を測定する。
測定サンプルの量は、以下のようにして測定できる。まず溶液中で測定サンプルと特異的に結合できる抗体(1次抗体)を適当な濃度に希釈して添加し、プレート上のヘパリンと結合した測定サンプルと接触させて結合させる。洗浄後、1次抗体を検出できる標識2次抗体、たとえば1次抗体を作製した動物のIgGに対する抗体をホースラディッシュ・パーオキシダーゼやアルカリ・フォスファターゼ等の酵素で標識したもの等を適当な濃度に希釈して添加して、1次抗体と結合させる。洗浄後、2次抗体の標識物に応じた検出法、たとえばホースラディッシュ・パーオキシダーゼの場合はH2O2存在下でo−フェニレンジアミン等の発色基質を反応させて分光光度計で発色量を測定する方法等により、ヘパリンと結合した測定サンプルの検出ができる。
この方法では、測定サンプルの濃度がある濃度以上ではプレート上のヘパリンに結合する量が飽和するので、最終的な発色量等の検出値にも飽和値が存在する。段階的に測定サンプルの濃度を変えて測定し、検出値の飽和値を求めて、その半分の検出値(半飽和値)を与える測定サンプルの濃度を算出する。半飽和値の値が低いほどヘパリンとの結合能が強いと判断できる。
(5−3)ヘパリン固定化ビーズを使用する方法
測定サンプルのヘパリン結合能の強さの比較はできないが、ヘパリン結合能の有無を簡便に測定する方法である。ヘパリンを固定化したビーズと測定サンプルを適当な緩衝液中で接触させて結合させた後、ビーズを洗浄してSDS−PAGE用サンプル緩衝液中に測定サンプルを溶出させる。このSDS−PAGE用サンプル緩衝液でSDS−PAGEを行い、CBB染色あるいは測定サンプルと特異的に結合できる抗体を用いたイムノブロット法により、ヘパリン固定化ビーズに結合した測定サンプルを検出する。
(5−4)α4Gのヘパリン結合の阻害
(1)〜(3)において、α4Gのヘパリン結合能を、α4G以外の測定サンプルを共存させた場合と、α4G以外の測定サンプルを添加しないα4G単独の場合で測定する。両者を比較し、測定サンプルが存在した場合のα4Gのヘパリン結合能が阻害された場合は、測定サンプルはヘパリンと結合能があるといえる。段階的に測定サンプルの濃度を変えて測定し、50%阻害する測定サンプルの濃度を算出する。50%阻害濃度の値が低いほどヘパリンとの結合能が強いと判断できる。
2.本発明のポリペプチドの利用
α4鎖の組織や生体における機能は、細胞外マトリックスにおけるヘパリンとの結合が非常に重要であると考えられる。癌の成長時や脂肪細胞の新生毛細血管との接触構造の形成においては、α4鎖が特異的に関与すると考えられるので、本発明のヘパリン結合能を有するα4Gを含むポリペプチド、α4G部分ポリペプチドまたはα4G部分ペプチドが細胞外マトリックスにおけるヘパリンとの結合を阻害する場合、これらは細胞と毛細血管との接触を阻害し、血管の新生を阻害し、癌の成長を阻害すると考えられる。また、α4鎖のヘパリンとの結合部位の解析、例えばそのアミノ酸配列や高次構造の解析等は、細胞と毛細血管との接触の阻害剤、血管新生阻害剤あるいは抗癌剤のドラッグデザインに役立つと考えられる。
細胞と毛細血管の接触、血管新生が関与する疾患としては、固形癌、癌の転移、糖尿病性網膜症、未熟児網膜症、加齢黄班変性症、血管新生緑内症、慢性関節リウマチ、または乾せん等が挙げられ、本発明のポリペプチドは、該疾患に対する医薬として利用できる。
ヘパリン結合能を有するα4G、α4G部分ポリペプチド、α4G部分ペプチドは、細胞外マトリックスにおいてα4鎖とヘパリンの結合を阻害し、ヘパリン結合性の因子の遊離をもたらす。したがって細胞に外からヘパリン結合能を有するα4G、α4G部分ポリペプチド、α4G部分ペプチドを投与することによりヘパリン結合性の情報伝達分子の濃度勾配形成あるいはシグナル伝達を阻害することができる。ヘパリン結合性の情報伝達分子としてはWntやFGFの他、HB−EGF(Heparin−binding epidermal growth factor)、PDGF(Platelet−derived growth factor)BMP(Bone morphogenic protein)、GM−CSF(Granulocyte−macrophage colony stimulating factor)、HGF(Hepatocyte growth factor)、ケモカイン、TNF(Tumor necrosis factor)等を挙げることができる。これら情報伝達分子の濃度勾配形成やシグナル伝達を阻害することにより細胞の分化や増殖を阻害することができる。
ヘパリン結合能を有する、α4Gを含むポリペプチド、α4G部分ポリペプチドを含むポリペプチドまたはα4G部分ペプチドを含むポリペプチドを含有する医薬製剤は、活性成分として該ポリペプチドを単独で、あるいは任意の他の治療のための有効成分との混合物として含有することができる。また、それらの医薬製剤は、活性成分を薬理学的に許容される一種あるいはそれ以上の担体と一緒に混合し、製剤学の技術分野においてよく知られる任意の方法により製造される。
投与経路は、治療に際し最も効果的なものを使用するのが望ましく、経口または、例えば静脈内などの非経口をあげることができる。
投与形態としては、錠剤、散剤、顆粒剤、シロップ剤、注射剤などがある。
経口投与に適当な、例えばシロップ剤のような液体調製物は、水、ショ糖、ソルビトール、果糖などの糖類、ポリエチレングリコール、プロピレングリコールなどのグリコール類、ごま油、オリーブ油、大豆油などの油類、p−ヒドロキシ安息香酸エステル類などの防腐剤、ストロベリーフレーバー、ペパーミントなどのフレーバー類などを添加剤として用いて製造できる。また、錠剤、散剤および顆粒などは、乳糖、ブドウ糖、ショ糖、マンニトールなどの賦形剤、デンプン、アルギン酸ナトリウムなどの崩壊剤、ステアリン酸マグネシウム、タルクなどの滑沢剤、ポリビニルアルコール、ヒドロキシプロピルセルロース、ゼラチンなどの結合剤、脂肪酸エステルなどの界面活性剤、グリセリンなどの可塑剤などを添加剤として用いて製造できる。
非経口投与に適当な製剤は、好ましくは受容者の血液と等張である活性成分を含む滅菌水性剤からなる。例えば、注射剤の場合は、塩溶液、ブドウ糖溶液、または塩溶液とブドウ糖溶液の混合物からなる担体などを用いて注射用の溶液を調製する。
また、これらの非経口剤においても経口剤で例示した、糖類、グリコール類、油類、防腐剤、フレーバー類、賦形剤、崩壊剤、添加剤、滑沢剤、結合剤、界面活性剤、可塑剤などから選択される1種もしくはそれ以上の補助成分を添加することもできる。
ヘパリン結合能を有する、α4Gを含むポリペプチド、α4G部分ポリペプチドを含むポリペプチドまたはα4G部分ペプチドを含むポリペプチドの投与量または投与回数は、投与形態、患者の年齢、体重、治療すべき症状の性質もしくは重篤度により異なるが、通常経口の場合、成人1人当たり1μg〜1gを1日1回ないし数回投与する。静脈内投与などの非経口投与の場合、成人1人当たり0.1μg〜100mgを1日1回ないし数回投与する。しかしながら、これら投与量および投与回数に関しては、前述の種々の条件により変動する。
3.本発明のDNAまたは組換え体DNAの医薬としての利用
本発明のDNAを含有するウイルスベクターを用いた遺伝子治療剤は、組換えウイルスベクターおよび遺伝子治療剤に用いる基剤を調合することにより製造することができる〔Nature Genet.,8,42(1994)〕。
本発明のDNA断片をウイルスベクター内のプロモーターの下流に挿入することにより、組換えウイルスベクターを造成する。
該組換えウイルスベクターを、該ベクターに適合したパッケージング細胞に導入する。
パッケージング細胞としては、対応する組換えウイルスベクターにおいて欠損しているウイルスのパッケジーングに必要な遺伝子がコードするポリペプチドを補給できる細胞は全て用いることができ、例えば下記ポリペプチドを発現したヒト腎臓由来のHEK293細胞やマウス繊維芽細胞NIH3T3などを用いることができる。
パッケージング細胞で補給するポリペプチドとしては、レトロウイルスベクターの場合はマウスレトロウイルス由来のgag,pol,envなどのポリペプチドが、レンチウイルスベクターの場合はHIVウイルス由来のgag,pol,env,vpr,vpu,vif,tat,rev,nefなどのポリペプチド、アデノウイルスベクターの場合はアデノウイルス由来のE1A・E1Bなどのポリペプチドが、アデノ随伴ウイルスの場合はRep(p5,p19,p40),Vp(Cap)などのポリペプチドが、センダイウイルスの場合はNP、P/C、L、M、F、HNなどのポリペプチドが挙げられる。
ウイルスベクターとしては上記パッケージング細胞において組換えウイルスが生産でき、標的細胞で本発明のDNAを転写できる位置にプロモーターを含有しているものが用いられる。プラスミドベクターとしてはMFG〔Proc.Natl.Acad.Sci.USA,92,6733−6737(1995)〕、pBabePuro〔Nucleic Acids Res.,18,3587−3596(1990)〕、LL−CG、CL−CG、CS−CG、CLG〔Journal of Virology,72,8150−8157(1998)〕、pAdex1〔Nucleic Acids Res.,23,3816−3821(1995)〕等が用いられる。
プロモーターとしては、ヒト組織中で発現できるものであればいずれも用いることができ、例えば、サイトメガロウイルス(ヒトCMV)のIE(immediate early)遺伝子のプロモーター、SV40の初期プロモーター、レトロウイルスのプロモーター、メタロチオネインプロモーター、ヒートショックタンパク質プロモーター、SRαプロモーター等を挙げることができる。また、ヒトCMVのIE遺伝子のエンハンサーをプロモーターと共に用いてもよい。
パッケージング細胞への組換えウイルスベクターの導入法としては、例えば、リン酸カルシウム法(特開平2−227075号公報)、リポフェクション法〔Proc.Natl.Acad.Sci.USA,84,7413(1987)〕等を挙げることができる。
本発明のDNAを含有するウイルスベクターを用いた遺伝子治療剤は、細胞と毛細血管の接触を伴う疾患、血管新生が関与する疾患などの治療または予防のための医薬として利用することができる。
細胞と毛細血管の接触、血管新生が関与する疾患としては、癌、癌の転移、糖尿病性網膜症、未熟児網膜症、加齢黄班変性症、血管新生緑内症、慢性関節リウマチ、または乾せん等が挙げられ、本発明のDNAまたは組換え体DNAは、該疾患に対する医薬として利用できる。
遺伝子治療剤に用いる基剤としては、通常注射剤に用いる基剤であればどのようなものでもよく、蒸留水、塩化ナトリウムまたは塩化ナトリウムと無機塩との混合物等の塩溶液、マンニトール、ラクトース、デキストラン、グルコース等の糖溶液、グリシン、アルギニン等のアミノ酸溶液、有機酸溶液又は塩溶液とグルコース溶液との混合溶液等があげられる。また常法に従い、これらの基剤に浸透圧調整剤、pH調整剤、ゴマ油、ダイズ油等の植物油又はレシチンもしくは非イオン界面活性剤等の界面活性剤等の助剤を用いて、溶液、懸濁液、分散液として注射剤を調製してもよい。これらの注射剤を、粉末化、凍結乾燥等の操作により用時溶解用製剤として調製することもできる。本発明の遺伝子治療剤は、液体の場合はそのままで、個体の場合は必要により滅菌処理をした上記の基剤に遺伝子治療の直前に溶解して治療に使用することができる。本発明の遺伝子治療剤の投与方法としては、患者の治療部位に吸収されるように、局所的に投与する方法を挙げることができる。
適当なサイズの本発明のDNAを、アデノウイルス・ヘキソン・タンパク質に特異的なポリリジン−コンジュゲート抗体と組み合わせてコンプレックスを作製し、得られたコンプレックスをアデノウイルスベクターに結合させることにより、ウイルスベクターを調製することができる。該ウイルスベクターは安定に標的細胞に到達し、エンドソームにより細胞内に取り込まれ、細胞内で分解され効率的に遺伝子を発現させることができる。
該DNAは、非ウイルス遺伝子移入法によっても病巣に輸送することができる。
当該分野で公知の非ウイルス遺伝子移入法には、リン酸カルシウム共沈法〔Virology,52,456−467(1973);Science,209,1414−1422(1980)〕、マイクロインジェクション法〔Proc.Natl.Acad.Sci.USA,77,5399−5403(1980);Proc.Natl.Acad.Sci.USA,77,7380−7384(1980);Cell,27,223−231(1981);Nature,294,92−94(1981)〕、リポソームを介した膜融合−介在移入法〔Proc.Natl.Acad.Sci.USA,84,7413−7417(1987);Biochemistry,28,9508−9514(1989);J.Biol.Chem.,264,12126−12129(1989);Hum.Gene Ther.,3,267−275(1992);Science,249,1285−1288(1990);Circulation,83,2007−2011(1992)〕あるいは直接DNA取り込みおよび受容体−媒介DNA移入法〔Science,247,1465−1468(1990);J.Biol.Chem.,266,14338−14342(1991);Proc.Natl.Acad.Sci.USA,87,3655−3659(1991);J.Biol.Chem.,264,16985−16987(1989);BioTechniques,11,474−485(1991);Proc.Natl.Acad.Sci.USA,87,3410−3414(1990);Proc.Natl.Acad.Sci.USA,88,4255−4259(1991);Proc.Natl.Acad.Sci.USA,87,4033−4037(1990);Proc.Natl.Acad.Sci.USA,88,8850−8854(1991);Hum.Gene Ther.,3,147−154(1991)〕等を挙げることができる。
リポソームを介した膜融合−介在移入法ではリポソーム調製物を標的とする組織に直接投与することにより、当該組織の局所的な遺伝子の取り込みおよび発現が可能であることが癌に関する研究において報告されている〔Hum.Gene Ther.,3,399−410(1992)〕。従って同様の効果が本発明のDNAおよびポリペプチドが関与する疾患病巣でも期待される。DNAを病巣に直接ターゲッティングするには、直接DNA取り込み技術が好ましい。受容体−媒介DNA移入は、例えば、ポリリジンを介して、タンパク質リガンドにDNA(通常、共有的に閉環したスーパーコイル化プラスミドの形態をとる)をコンジュゲートすることによって行う。リガンドは、標的細胞または組織の細胞表面上の対応するリガンド受容体の存在に基づいて選択する。当該リガンド−DNAコンジュゲートは、所望により、血管に直接注射することができ、受容体結合およびDNA−タンパク質コンプレックスの内在化が起こる標的組織に指向し得る。DNAの細胞内破壊を防止するために、アデノウイルスを同時感染させて、エンドソーム機能を崩壊させることもできる。
本発明のDNAまたは該DNAを含む組換え体DNA等を含有する上記の遺伝子治療剤を、細胞へ導入し、該DNAにコードされるポリペプチドを発現させることにより、細胞と細胞外マトリックスとの結合、細胞と毛細血管の接触、血管新生、細胞の増殖、分化、癌の成長、あるいは癌の転移などを制御することができる。
さらに、Wnt1、FGF(Fibroblast growth factor)、HB−EGF(Heparin−binding epidermal growth factor)、PDGF(Platelet−derived growth factor)、BMP(Bone morphogenic protein)、GM−CSF(Granulocyte−macrophage colony stimulating factor)、HGF(Hepatocyte growth factor)、ケモカイン、TNF(Tumor necrosis factor)などのヘパリン結合性の情報伝達分子を細胞から遊離させたり、上記ヘパリン結合性情報伝達分子の濃度勾配形成あるいはシグナル伝達を阻害することができる。これら情報伝達分子の濃度勾配形成やシグナル伝達を阻害することにより細胞の分化や増殖を阻害することができる。
発明を実施するための最良の形態
以下に実施例を挙げて、本発明を具体的に説明する。但し、これらの実施例は説明のためのものであり、本発明の技術的範囲を限定するものではない。
〔実施例1〕 マウスα4Gのヘパリン結合能
(1)マウスα4Gの動物細胞での発現
宿主となるジヒドロ葉酸デヒドロゲナーゼ(dhfr)遺伝子欠損チャイニーズ・ハムスター卵巣細胞株CHO DG44〔Cell,33,405(1983)〕を、核酸含有α−MEMに10%ウシ胎児血清および抗生物質を添加した培地で培養し維持した。
λZAP II(Stratagene社製)をベクターにしたマウス心臓cDNAライブラリーを作製し、マウスラミニンα4鎖cDNA断片〔Matrix Biol.,16,223(1997)〕をプローブにして、プラークハイブリダイゼーションにより選択したポジティブクローンをイン・ビボ・エクシジョン(in vivo excision)によりプラスミドに変換し、マウスラミニンα4鎖のcDNAクローンpA4−3(配列番号34の4261番目以降およびpoly Aに相当する1.4kbのcDNAを有する。配列番号34は、Matrix Biol.,15,433(1996)の記載に基づくマウスラミニンα4鎖cDNAの塩基配列)、pA4−8(配列番号34の3658〜5021番めに相当する1.4kbのcDNAを有する)、pA4−14(配列番号34の2714〜4611番めに相当する1.9kbのcDNAを有する)、pA4−15(配列番号34の840〜3315番目に相当する2.5kbのcDNAを有する)を単離した。
このcDNAクローンから、プラスミドpEFΔβ1S〔FEBS.Lett.,400,71(1997)〕を利用し、以下のようにして、ラミニンα4G(マウスラミニンα4鎖の833Gly〜1815Alaの領域)発現用プラスミドpEFα4Gmycを作製した。pEFΔβ1Sは、EF−1(elongation factor−1)プロモーター、開始コドン、分泌発現のためのエリスロポエチンのシグナルペプチドをコードする配列、クローニングサイト、抗c−myc抗体で発現蛋白を検出するためのmycタグペプチドをコードする配列、終止コドン、ネオマイシン耐性遺伝子発現ユニット、SV40複製オリジン、大腸菌内での複製オリジンとアンピシリン耐性遺伝子発現ユニットを有する動物細胞での外来遺伝子発現型のプラスミドである。
pA4−8の0.7kbのEcoRI−XbaI断片と、pA4−14の1.4kbのSacI−EcoRI断片を、EcoRIでつなげるようにしてプラスミドpBluescript SKII(+)(Stratagene社製)のSacI/XbaIサイト間に挿入し、プラスミドpBSA4Sac/Xbaを作製した。また、pA4−3を鋳型にして5’端にEcoRVサイトを有するリバースプライマーを用いてPCRを行うことにより、3’端にEcoRVサイトを有し、マウスラミニンα4cDNAの4954〜5445番目に相当する配列を増幅し、単離した。この断片をXbaIとEcoRVで切断し、pBSA4Sac/XbaのXbaI/EcoRVサイト間に挿入することにより、pBSA4Sac/EcoRVを作製した。また、pA4−15を鋳型にして5’端にSmaIサイトを有するフォワードプライマーを用いてPCRを行うことにより、5’端にSmaIサイトを有する配列番号34の2497〜2758番目に相当する配列を増幅し、単離した。この断片をSmaIとSacIで切断したものと、pBSA4Sac/EcoRVのSacI−EcoRV断片を、SacIでつなげるようにしてベクターpEFΔβ1SのSmaI/EcoRVサイト間に挿入することにより、pEFα4Gmycを作製した。作製後、挿入断片の塩基配列(配列番号34の2497〜5445番目に相当する)を確認した。
pEFα4Gmycは、α4GのC末端にmycタグペプチドの配列が付加したポリペプチドを、エリスロポエチンのシグナルペプチドを利用して、EF−1プロモーターの制御下で分泌発現できるプラスミドである。
また、対照用としてマウスラミニンα1鎖のGドメイン(ラミニンα1鎖の2100Ile〜3060Proの領域、以下α1Gとする)をコードするDNA断片をマウス胚性癌細胞株F9(ATCC CRL−1720)から抽出したRNAを鋳型にして、5’端にBamHIサイトを有するフォワードプライマーおよび5’端にEcoRVサイトを有するリバースプライマーを用いたRT−PCRにより増幅し、BamHIとEcoRVで処理後、pEFΔβ1SのBamHI/EcoRVサイト間に挿入することにより、pEFα1Gmyc作製した。pEFα1Gmycは、pEFα4Gmycと同様に、α1GのC末端にmycタグペプチドの配列が付加したポリペプチドを、エリスロポエチンのシグナルペプチドを利用して、EF−1プロモーターの制御下で分泌発現できるプラスミドである。図1にpEFα4GmycおよびpEFα1Gmycの構造を示した。
以上のように作製したプラスミドを、それぞれdhfrミニ遺伝子発現用プラスミドpGENSVdhfrと共に、リン酸カルシウム法によりCHO DG44株に導入し、Kaufman RJらの方法〔Mol.Cell.Biol.,9,1233(1989)〕に従って、ネオマイシン耐性を有する安定な形質転換体を確立し、さらにメトトレキセートを添加して培養することにより、dhfr遺伝子と共に導入したα4Gまたはα1Gの遺伝子を増幅させた。遺伝子増幅を行った細胞をクローン化し、各クローンの培養上清中に分泌されたα4Gまたはα1Gを、抗c−myc抗血清(Santa Cruz Biotechnology社製;#sc−789)を用いたドット・イムノアッセイによって検出することにより、α4Gまたはα1Gをそれぞれ大量発現するものを選択し、大量発現クローンとして樹立した。なお、安定な形質転換体を確立した後の細胞培養は、核酸不含α−MEM培地を用いて行った。
(2)発現したα4Gまたはα1Gの解析
樹立されたそれぞれのα4Gまたはα1G発現クローンをディッシュで接着培養したものについて、培養上清を除き、ダルベッコ改変PBSで洗浄した後、10μg/mlツニカマイシン(tunicamycin;N結合型糖鎖合成阻害剤)を含む培地と対照としてツニカマイシンを含まない培地それぞれを添加して、12時間培養した。培養後の細胞と培養上清それぞれについて、SDS−PAGE(12%アクリルアミド)を行った後、抗c−myc抗血清を用いたイムノブロットにより発現したα4Gまたはα1Gを検出した。イムノブロットは以下のようにして行った。まず、ゲルからHybond ECLニトロセルロース膜(Amersham Pharmacia Biotech AB社製)にポリペプチドを転写した。膜に5%(w/v)スキムミルクを含むPBS(イムノブロット・ブロッキング液)を乗せて室温で2時間静置し、非特異的結合のブロッキングを行った。0.1%Tween−20を含むPBS(イムノブロット洗浄液)で5回洗浄した後、イムノブロット・ブロッキング液で1/400に希釈した抗c−myc抗血清と室温で2時間反応させた。イムノブロット洗浄液で洗浄後、イムノブロット・ブロッキング液で1/1000に希釈したホースラディッシュ・パーオキシダーゼ標識抗ウサギIgG(Amersham Pharmacia Biotech AB社製)と室温で1時間反応させ、ECLウェスタン・ブロッティング検出試薬(Amersham Pharmacia Biotech AB社製)を用いて、バンドを検出した。
その結果を図2Aに示した。図2Aの右の4レーンがα4G、左の4レーンがα1Gの発現細胞について、Tun+はツニカマイシン添加、Tun−はツニカマイシン非添加での培養を表している。Mは培養上清、Cは細胞を泳動試料とした場合を示し、左の矢印は分子量マーカーの位置を示している。
ツニカマイシンを含む培地では、ツニカマイシンを含まない通常の培地に比較して、α4Gまたはα1G共に分子量がN結合型糖鎖が付加しないため低下した。また、ツニカマイシンを含まない培地で増加する分子量は、α1Gの方がα4Gよりも顕著であった。これは、N結合型糖鎖が付加しうるアミノ酸残基がα4Gが5ヶ所なのに対し、α1Gでは7ヶ所あるためと考えられる。また、ツニカマイシンによりN結合型糖鎖の合成を阻害した場合、α4Gはほとんど培地中に分泌されなかった。
また、ツニカマイシンを含まない通常の培地で培養したα4Gまたはα1G発現細胞の培養上清について、SDS−PAGEを還元条件〔2%(v/v)2−メルカプトエタノール添加〕と非還元条件(2−メルカプトエタノール非添加)で行った後、同様にイムノブロットによりα4Gまたはα1Gを検出した。
その結果を図2Bに示した。図2Bの左の2レーンは非還元条件、右の2レーンは還元条件でSDS−PAGEを行った場合で、α4Gはα4G発現細胞、α1Gはα1G発現細胞の各培養上清を泳動試料とした。右の矢印は分子量マーカーの位置を示している。
α1Gでは、あまり泳動度に変化がないのに対し、α4Gでは還元条件に比べて非還元条件での泳動度が明らかに増加しており、充分にジスルフィド結合の形成が進行していると考えられた。
(3)α4Gおよびα1Gの精製
(1)で作製したα4Gおよびα1G発現細胞を培養し、それぞれから培養液約500mlを回収した。1000×gで10分間遠心分離することにより細胞の断片等の固形物を除いた後の上清に0.5mmol/lの濃度になるようにN−エチルマレイミド(N−ethylmaleimide)を添加した。この培養上清を3ml/分の流速で、緩衝液A〔10mmol/l Tris−HCl(pH7.4)、150mmol/l NaCl、2mmol/lエチレンジアミン4酢酸(ethylene diamine tetraacetate;EDTA)、0.5mmol/l N−エチルマレイミド〕で平衡化したヘパリン・アフィニティー・カラムであるハイトラップ・ヘパリンカラム(Amersham Pharmacia Biotech AB社製、容量5ml)に通した。出てきた流出液を同じ流速で再度カラムに通すことを5回繰り返し、α4Gまたはα1Gをカラムに確実に結合させた。α4Gあるいはα1Gが結合したカラムをfast performance liquid chromatography(以下、FPLC)システム(Amersham Pharmacia Biotech AB社製)に接続し、30mlの緩衝液Aで洗浄後、NaCl直線濃度勾配150−600mmol/lの緩衝液A150mlを流速0.5ml/分で通すことによりα4Gまたはα1Gを溶出させ、溶出液を2.5mlずつ分画して回収した。
各分画20μlを用いてSDS−PAGE(8%アクリルアミド、還元条件)を行うと共に、各分画の蛋白質濃度を、BSAを標準としたBCA蛋白質アッセイ試薬(Pierce社製)を用いて測定した。その結果を図3に示した。
図3のA、Bはα1Gの発現細胞、C、Dはα4Gの発現細胞の各培養上清についての図である。AとCは各カラム溶出液画分(横軸)の蛋白濃度を示し、点線は溶出液のNaCl濃度(縦右軸)、●は各カラム溶出液画分の蛋白濃度(縦左軸)である。B、Dはその各カラム溶出液画分1つおきのSDS−PAGEの結果を示している。B、Dの横軸の数字はA、Cの横軸の溶出画分の数字と同一であり、Mは分子量マーカーである。縦軸の数字と矢印は分子量マーカーの分子量とバンドの位置を示している。
α1GはNaCl濃度300mmol/lで溶出されたのに対しα4GはNaCl濃度470mmol/lで溶出され、α4Gの方がα1Gよりもヘパリンに対する結合能が強いことが示された。
α4Gまたはα1Gを含む分画を集めて、セントリプレップ(Centriprep)−30(Amicon社製)にかけることにより、濃縮(蛋白質濃度0.4mg/ml以上)と脱塩を行い、精製したα4Gおよびα1Gをそれぞれ約3mgずつ得た。
(4)固相化ヘパリンに対するα4Gおよびα1Gの結合活性
Aumailley Mらの方法〔Eur.J.Biochem.,184,241(1989)〕を一部変更して、固相化ヘパリンに対するα4Gおよびα1Gの結合を測定した。96穴マルチウェルプレート(Nalge Nunc International社製)に10μg/mlのヘパリン−BSA(Sigma−Aldrich社製)を含む緩衝液〔15mmol/l Na2CO3、35mmol/l NaHCO3(pH9.2)、3mmol/l NaN3〕を入れて、4℃で18時間静置することにより、ヘパリンをウェルに固相化した。液を除き、ブロッキング液〔1%(w/v)BSA、50mmol/l Tris−HCl(pH7.4)、150mmol/l NaCl、5mmol/l CaCl2〕を入れて室温で2時間静置して非特異的結合をブロックした後、0.04% Tween−20を含むPBS(10mmol/l Na2HPO4、2mol/l KH2PO4、140mmol/l NaCl、3mmol/l KCl、以降、この0.04%Tween−20含有PBSを「洗浄用緩衝液」と呼ぶ)で5回洗浄した。(1)で得られた精製α4Gおよびα1Gを、ブロッキング液で0.01nmol/l〜1μmol/lに段階的に希釈して、ウェルに入れ、4℃で2時間静置してヘパリンと結合させた。洗浄用緩衝液で5回洗浄した後、抗α4G抗血清(1/1000希釈)または抗α1G抗血清(1/1000希釈)あるいは抗c−myc抗血清(1/400希釈)を反応させた。抗α4G抗血清および抗α1G抗血清は、(1)で得た精製α4Gあるいはα1Gでウサギを免疫して作製した。洗浄用緩衝液で5回洗浄した後、ホースラディッシュ・パーオキシダーゼ標識した抗ウサギIgG抗体(Amersham Pharmacia Biotech AB社製)を反応させた。洗浄後、0.4mg/ml o−フェニレンジアミン二塩酸(Sigma−Aldrich社製)を溶解させた0.01%H2O2を含む50mmol/lリン酸−クエン酸緩衝液を加えてパーオキシダーゼによる発色反応を行い、3mol/l HClを加えて反応を停止させた。波長492nmの吸光度をマイクロプレートリーダー(Bio−Rad Laboratories社製)、モデル3550−UVによって測定することにより、ヘパリンと結合したα4Gおよびα1Gの量を測定した。
その結果を図4に示した。横軸は添加したα4Gまたはα1Gの濃度(nmol/l)、縦軸は492nmの吸光度を示している。●および○はα4Gの結合、▲および△はα1Gの結合を示している。●は抗α4G抗体を、○と△は抗c−myc抗体、▲は抗α1G抗体を検出の1次抗体に用いた場合を示している。
抗α4G抗血清および抗α1G抗血清で検出した場合、α1Gの半飽和(結合量が飽和に達したときの吸光度の半分の値)を与える濃度が14nmol/lなのに対して、α4Gは1.4nmol/lであり、α4Gのヘパリン結合活性はα1Gの約10倍であると考えられた。この値は両者を抗c−myc抗血清を用いて検出した場合にも同様であり、抗血清の反応性による差ではない。このα1Gの半飽和濃度は、Talts JFらによって報告された値とほぼ一致する〔EMBO J.,18,863(1999)〕。
なおα4Gについて、5mmol/l Ca2+存在下で同様の結合測定を行った場合も、半飽和濃度の値はほぼ同じであり、Caイオンはα4Gのヘパリン結合能には影響しなかった。
(5)グリコシダーゼ処理したα4Gのヘパリン結合能
(3)で得た精製α4G溶液(75μg/250μl)にN−グリコシダーゼF(New England BioLabs社製)溶液15μl、10×G7緩衝液〔500mmol/lリン酸ナトリウム緩衝液(pH7.5)〕30μlを添加して37℃で一晩反応させることにより、α4GのN結合型糖鎖を除去した。対照としてN−グリコシダーゼFの代わりに水15μlを添加して同様の条件で反応させたもの(非処理α4G)も調製した。
このグリコシダーゼ処理α4Gについて(2)と同様にしてまず、イムノブロット解析を行った。
その結果を図5Aに示した。図5Aは左からグリコシダーゼ非処理のα4G、グリコシダーゼ処理したα4G、ツニカマイシン非添加のα4G発現細胞、ツニカマイシン添加のα4G発現細胞のSDS−PAGEの結果を示し、左の矢印は分子量マーカーの位置を示している。
グリコシダーゼ処理したα4Gは、対照の非処理のα4Gと比較して分子量が低下しており、この分子量の変化は(2)で行ったツニカマイシン添加によるN結合型糖鎖合成の阻害による分子量の低下と同様であり、N−グリコシダーゼFによりN結合型糖鎖が分解されたと考えられた。
また、該グリコシダーゼ処理α4Gについて(4)と同様にして、固相化ヘパリンに対する結合活性を調べた。
その結果を図5Bに示した。図5Bは固定化ヘパリンに対するグリコシダーゼ処理したα4Gまたはコントロールのグリコシダーゼ非処理のα4Gの結合量を1次抗体として抗c−myc抗体を用いて検出した結果であるが、△はグリコシダーゼ処理したα4G、○はグリコシダーゼ非処理のα4Gの結合量を示し、横軸は添加したα4Gの濃度(nmol/l)、縦軸は492nmの吸光度を示している。
グリコシダーゼ処理したα4Gは、対照の非グリコシダーゼ処理のα4Gと全く同じヘパリン結合能を示し、α4Gのヘパリン結合性にはN結合型糖鎖は関与していないと考えられた。
(6)尿素による変性の影響
ハイトラップ・ヘパリンカラム(Amersham Pharmacia Biotech AB社製、容量1ml)3本を緩衝液B〔10mmol/l Tris−HCl(pH7.4)、2mmol/l EDTA〕で平衡化した後、それぞれに実施例2で得た精製α4Gを0.3mgずつ通してカラムに結合させ、緩衝液B3mlで洗浄した。
1本(カラムA)は緩衝液B3mlを通し、残りの2本(カラムB、C)は8mol/l尿素を含む緩衝液B3mlを通して蛋白質の立体構造を変性させた。それぞれのカラムをFPLCシステムに接続し、カラムAとCはNaCl直線濃度勾配0−800mmol/lの緩衝液B30ml(流速0.1ml/分)でα4Gを溶出させ、カラムBは変性状態のまま溶出させるため8mol/l尿素を含むNaCl直線濃度勾配0−800mmol/lの緩衝液B30mlで溶出させた。それぞれの溶出液は1mlずつ分画して回収し、それぞれに終濃度10%(w/v)になるようにトリクロロ酢酸を添加して、蛋白質を沈殿させた。沈殿した蛋白質をアセトンで洗浄後、SDSサンプル緩衝液に溶解させ、SDS−PAGE(8%アクリルアミド、還元条件)を行った。
その結果を図6に示した。図6のAは、カラム上での尿素による変性を行わず尿素を含まない溶出液で溶出したコントロール、Bはカラム上で8mol/l尿素により変成させ8mol/l尿素を含む溶出液で溶出させた場合、Cはカラム上で8mol/l尿素により変成させ尿素を含まない溶出液で溶出させた場合の各溶出画分のSDS−PAGEの結果を示している。横軸は溶出画分の番号で、点線は各溶出液のNaCl濃度(右縦軸)を示し、最も左のレーンは分子量マーカーで左の矢印と数字は分子量マーカーのバンドの位置と分子量を示している。
カラムBの尿素で変性後に変性状態のまま溶出させたα4Gは、NaCl濃度180mmol/lで溶出がおこり、カラムAの変性させないα4Gの溶出NaCl濃度約400mmol/lと比較して、溶出NaCl濃度が低下していた。
このように尿素による変性はα4Gのヘパリン結合能を低下させることから、α4Gの高いヘパリン結合能には、アミノ酸配列だけでなくその立体構造も重要であると考えられた。また尿素で変性後、溶出時に尿素を除いたCのケースにおける溶出NaCl濃度は、Aのケースと同じになることから、尿素による変性は可逆性であり、尿素を除くことにより立体構造が元に戻り、ヘパリン結合能も回復したと考えられた。
〔実施例2〕 ヘパリン結合能を有するα4G部分ポリペプチド
α4Gをプロテアーゼで断片に切断後、ヘパリン・アフィニティーカラムに結合するα4Gの断片からなる部分ポリペプチドを単離し、構造を解析することにより、α4Gの中でヘパリン結合能を有する領域を特定し、ヘパリン結合能を有する部分ポリペプチドを得ることにした。
(1)α−キモトリプシン分解
実施例1で得た精製α4G1.2mgに、TLCK(n−α−p−tosyl−L−lysine chloromethyl ketone)処理α−キモトリプシン(Sigma C−3142、Sigma−Aldrich社製〕を基質の1/50量添加して、37℃で2時間切断反応させた後、終濃度1mmol/lになるようにプロテアーゼ阻害剤PMSF(phenylmethylsulfonyl fluoride)を添加して反応を停止させた。反応後の溶液を、NaCl濃度150mmol/lの緩衝液Aで平衡化したハイトラップ・ヘパリンカラム(Amersham Pharmacia Biotech AB社製、容量1ml)に乗せた後、5mlの緩衝液Aで洗浄した。FPLCシステムに接続し、NaCl直線濃度勾配150−600mmol/lの緩衝液A30mlで断片を溶出させ、溶出液を1mlずつ分画して回収した。各分画の蛋白質濃度を実施例1(3)と同様にして測定した。
その結果を図7Aに示した。図7Aの●は、各溶出画分(横軸)の蛋白質濃度(左縦軸mg/ml)、点線は、溶出液のNaCl濃度(右縦軸mmol/l)を示している。
大部分の断片はカラムに吸着せず通過画分に出てきたが、NaCl濃度330mmol/l(ピーク1)および480mmol/l(ピーク2)の2つの溶出ピークがあった。これらのピークの分画(ピーク1;画分16,17、ピーク2;画分23,24,25)について実施例1(6)と同様にしてトリクロロ酢酸で蛋白質を沈殿させ、SDS−PAGE(12%アクリルアミド、還元条件)を行った。
その結果を図7Bに示した。図7Bの左はCBB染色による蛋白質の染色、中央は抗LG5ペプチド抗体によるイムノブロット、右は抗c−myc抗体によるイムノブロットの結果を示している。左の矢印は分子量マーカーの位置を示している。
ゲルをCBB R−250(Sigma−Aldrich社製)で染色した結果、低アフィニティーのピーク1には分子量41kDaの1本、高アフィニティーのピーク2には分子量44kDaと39kDaの2本のα4G部分ポリペプチドが存在することがわかった。
SDS−PAGEのゲルを用いて実施例1(2)と同様にして抗c−myc抗体および抗LG5ペプチド抗体を1次抗体としたイムノブロットを行ったところ、高アフィニティーの44kDaの断片は、抗c−myc抗体および抗LG5ペプチド抗体と反応したが、39kDaの断片は抗LG5ペプチド抗体とのみ反応した。また、低アフィニティーの41kDaの断片は、抗c−myc抗体および抗LG5ペプチド抗体のどちらにも反応しなかった。なお、抗LG5ペプチド抗体は化学合成したLG5部分ペプチド(Leu Asp Glu Ser Phe Asn Ile Gly Leu Lys Phe Glu Ile Ala、α4鎖のアミノ酸配列の1652〜1665番目に相当)を抗原としてウサギを免疫として作製した〔Matrix Biol.,16,223(1997)〕。
さらに、Matsudaira Pらの報告〔Matsudaira P.,J.Biol.Chem.,262,10035(1987)〕に基づいて上記のヘパリン結合能をもつα4G部分ポリペプチドのN末端のアミノ酸配列を以下のようにして解析した。SDS−PAGEを行ったゲルから各α4G部分ポリペプチドをPVDF膜に転写し、CBB G−250(Sigma−Aldrich社製)で染色した。分子量44kDa、41kDa、39kDaに相当するバンドを切り出し、ペプチドを膜から溶出させた後、ペプチドシークエンサーを用いて各ペプチドのN末端からのアミノ酸配列を決定した。その結果得られた、低アフィニティーの41kDaの断片のN末端のアミノ酸配列(配列番号7:Thr Gln Ser Arg Ala Ala Ser)はα4鎖の1037Thr以降のアミノ酸配列と一致した。また、高アフィニティーの44kDaと39kDaの断片のN末端のアミノ酸配列(配列番号5:Lys Phe Leu Glu Gln Lys Ala)は1437Lys以降のアミノ酸配列と一致した。この領域はLG3とLG4をつなぐヒンジ領域にあたる。
以上の分子量、抗LG5ペプチド抗体および抗c−myc抗体との反応性、N末端のアミノ酸配列の解析から、低アフィニティーの41kDaの断片は、1037Thr以降のLG2からLG3の前半までにあたる部分のα4G部分ポリペプチドと考えられた。高アフィニティーの44kDaの断片は、1437LysからLG4およびLG5全体とそれに続くmycタグペプチドを含むα4G部分ポリペプチド、高アフィニティーの39kDaの断片は、1437LysからLG4全体およびLG5のC末端部分を除いた大部分(LG5全体の80〜90%)を含むα4G部分ポリペプチドと考えられた。配列番号6に44kDaの断片のmycタグペプチド部分を除いたアミノ酸配列を示した。
(2)トリプシン分解
TPCK処理トリプシン(Sigma T−8642、Sigma−Aldrich社製)を(1)のα−キモトリプシンの代わりに用いて、全く同様に反応を行った。キモトリプシンとトリプシンの切断認識部位は異なるが、やはり2つの溶出ピークが見られ、低アフィニティーのピーク1には分子量45kDaの1本、高アフィニティーのピーク2には分子量40kDaと35kDaの2本のα4G部分ポリペプチドが存在していた。N末端アミノ酸配列分析、抗体とのイムノブロット解析の結果、やはり低アフィニティーのα4G部分ポリペプチドはLG2−LG3の領域、高アフィニティーの2本のα4G部分ポリペプチドはLG4−LG5の領域にあたると推定された。
(3)ヘパリンカラム上でのトリプシン分解
実施例1で得た精製α4G0.4mgをハイトラップ・ヘパリンカラム(Amersham Pharmacia Biotech AB社製、1ml)に結合させ、TPCK処理トリプシン15μgを溶解させた緩衝液〔50mmol/l Tris−HCl(pH7.4)、100mmol/l NaCl、2mmol/l CaCl2〕1mlをカラムにのせ、カラムを37℃で2時間保温して切断反応させた後、FPLCシステムに接続した。6mlの緩衝液Aで洗浄し、NaCl直線濃度勾配150−600mmol/lの緩衝液A25ml、流速0.1ml/分でα4G部分ポリペプチドを溶出させ、溶出液を1mlずつ分画して回収した。実施例1(6)と同様にしてトリクロロ酢酸で蛋白質を沈殿させ、トリシン(tricine)−アクリルアミドゲル電気泳動〔Anal.Biochem.,166,368(1987)〕を行い、CBB G−250で染色した。
その結果を図8Aに示した。図8のAはα4Gをヘパリンカラムに結合させてキモトリプシンで消化後、溶出させたヘパリン結合性を有するトリプシン断片を含む溶出画分(画分18,19,20)のトリシンゲル電気泳動の結果であり、左の矢印は分子量マーカーの位置を示し、下の数字は各溶出画分のNaCl濃度(mmol/l)を示している。
NaCl濃度370〜400mmol/lで溶出される画分には、35kDaおよび23kDaのα4G部分ポリペプチドが検出された。
またイムノブロットの結果を図8Bに示した。図8Bはトリプシン断片の溶出画分を、左から抗c−myc抗体、抗LG5ペプチド抗体、抗α4G抗体を用いたイムノブロットにより検出した結果であり、左の矢印は分子量マーカーの位置を示している。
両者とも抗α4G抗体では検出され、抗c−myc抗体には反応しなかった。また、抗LG5ペプチド抗体には35kDaの断片のみ反応し、23kDaの断片は反応しなかった。
N末端からのアミノ酸配列の解析の結果、両断片ともN末端のアミノ酸配列はAla Ile Glu His Ala Tyr Gln(配列番号8)であり、α4鎖のLG4の開始部分から7アミノ酸残基下流に存在する1457Ala以降の配列と一致していた。23kDaの断片はその分子量と抗LG5ペプチド抗体と反応しないことから、LG4の始めの7アミノ酸を除いたほぼ全体とLG5の開始部分を含むが1652Leu以降のLG5の配列は含まないα4G部分ポリペプチドと推測された。したがって、α4GはLG4が結合部位となって、強いアフィニティーでヘパリンと結合すると考えられた。
なお、この23kDaの断片の溶出NaCl濃度は(1)で得られた高アフィニティーのα4G部分ポリペプチド(LG4−LG5の領域)の溶出NaCl濃度480mmol/lよりも少し低いことから、LG5はLG4のヘパリンへの結合を助けると考えられた。配列番号3にマウスα4GのLG4のアミノ酸配列、配列番号4にヒトα4GのLG4のアミノ酸配列を示した。
〔実施例3〕 ヘパリン結合性ペプチド
LG4からLG5の開始部分の中でさらにヘパリンとの結合能を規定する領域を特定するため、LG4およびLG5の開始部分の中の連続した12アミノ酸残基からなるペプチド24種類(A4G−74、A4G−75、A4G−76、A4G−77、A4G−78、A4G−79、A4G−80、A4G−81、A4G−82、A4G−83、A4G−84、A4G−85、A4G−86、A4G−87、A4G−88、A4G−89、A4G−90、A4G−91、A4G−92、A4G−93、A4G−94、A4G−95、A4G−96、A4G−97)をFmoc法により合成し、Nomizu Mらの方法〔J.Biol.Chem.,273,32491(1998)〕に基づいてHPLCで精製した。これらのペプチドのアミノ酸配列をそれぞれ配列番号9から32に示した。これらのペプチドの純度はHPLCによる分析でアミノ酸配列はイオンスプレー質量分析法により確認した。これらのペプチドのうち、水溶性が悪いA4G−80、A4G−81、A4G−93、A4G−94、A4G−95、A4G−97を除いた18種類のペプチドについて、各ペプチド21μg(約200μmol/l)と実施例2で得た精製α4G 3.4μg(約0.4μmol/l)およびヘパリンセファロースCL−6B(Amersham Pharmacia Biotech AB社製)ビーズ1mgを緩衝液〔Tris−HCl(pH7.4)、100mmol/l NaCl〕70μl中で混合し4℃で1時間おき、ビーズ上のヘパリンにα4Gを結合させた。ビーズをカラムに移し、同緩衝液100μlで3回洗浄後、ビーズにSDSサンプル緩衝液を添加してSDSサンプル緩衝液中にビーズと結合した蛋白を溶出させた。このSDSサンプル緩衝液についてSDS−PAGEを行い、結合したα4Gの量を比較することにより、各ペプチドがα4Gのヘパリン結合性を阻害するかどうかを調べた。
その結果を図9に示した。A4G−82(配列番号17)だけは完全にα4Gのヘパリンへの結合を阻害した。このペプチド以外には、A4G−83が非常に弱い阻害を示しただけで、他のペプチドは阻害を示さなかった。
なお、阻害アッセイを行わなかった6ペプチドのうちA4G−93以外の5ペプチドには塩基性アミノ酸が含まれていないので、これらのペプチドの部位はα4Gのヘパリン結合部位ではないと考えられた。α4鎖の1513Thrから1524Metのアミノ酸配列に対応するA4G−82がα4Gのヘパリンとの結合を阻害したことおよび、ヘパリンが塩基性アミノ酸と結合することから、1518Hisおよび1520Argがα4Gのヘパリン結合部位と推定された。
なお、A4G−82と全く同じアミノ酸組成だが、配列をランダムに変えたペプチドA4G−82S(配列番号35)、A4G−82T(配列番号36)は全く阻害を示さないことから、塩基性アミノ酸残基だけでなく、アミノ酸配列全体が結合に関与していると考えられた。なお、A4G−82のペプチド濃度を20μmol/lまで低下させるとほとんど阻害がみられず、A4G−82がα4Gと同等にヘパリンに結合するためにはα4Gの50倍以上の濃度が必要であった。A4G−82はマウスα4Gの配列由来のペプチドであるが、ヒトα4Gにおいてもその配列相同性から1514Thrから1525Metの配列番号33に示すアミノ酸配列のペプチドはヘパリン結合能を有すると考えられる。
LG4全体においても1518Hisおよび1520Argが結合に重要であることを確認するために、LG4(配列番号3、1453Ser〜1636Pro)、1518HisをAlaに置換したLG4変異体(以下LG4 H1518Aとする)、1520ArgをAlaに置換した変異体(以下LG4 R1520Aとする)を大腸菌で発現させ、それぞれのヘパリン結合性を比較した。
まず、5’にBamHIサイトを付加したフォワードプライマーと5’にEcoRIサイトを付加したリバースプライマーを用いてpEFα4mycに対してPCRを行い、配列番号34の4357番目〜4908番目に相当するLG4断片を増幅し単離した。この断片をグルタチオンSトランスフェラーゼ(GST)との融合蛋白発現ベクターpGEX−3T(Amersham Pharmacia Biotech AB社製)のBamHI/EcoRIサイト間に挿入することにより、GSTとLG4の融合蛋白質の発現プラスミドを作製した。
このプラスミドに対して、配列番号37および38に配列を示したプライマーを用いて、部位特異的変異を行うことによりLG4 H1518AのGSTとの融合蛋白質の発現プラスミドを作製した。また、配列番号39および40に配列を示したプライマーを用いて、部位特異的変異を行うことによりLG4 R1520AのGSTとの融合蛋白質の発現プラスミドを作製した。部位特異的変異は、クイック・チェンジ部位特異的変異キット(Quick Change Site−Directed Mutagenesis Kit;Stratagene社製)により行った。
これらのプラスミドおよびコントロールのpGEX−3Tで大腸菌を形質転換し、培養することによりLG4、LG4H1518A、LG4R1520Aの各GSTとの融合蛋白質およびコントロールのGSTを大腸菌の細胞中に発現させた。培養後の大腸菌を緩衝液〔10mmol/l Tris−HCl(pH7.4)、2mmol/l EDTA〕中で超音波破砕し、得られた細胞破砕液5mlを、同緩衝液0.5mlで平衡化したヘパリンセファロースCL−6Bカラムに通し、LG4、LG4H1518A、LG4R1520Aの各GSTとの融合蛋白質を結合させた後、同緩衝液5mlで洗浄した。カラムにNaCl濃度を100、200、400、500、600、1000mmol/lと段階的に上げた同緩衝液を5mlずつ通すことにより、結合したLG4、LG4 H1518A、LG4 R1520Aの各GSTとの融合蛋白質をカラムから溶出させた。
細胞破砕液、細胞破砕液のカラム通過後の画分、洗浄液の画分、各NaCl濃度の溶出画分それぞれ10μlについて、LG4、LG4 H1518A、LG4 R1520Aは抗α4G抗体、GSTは抗GST抗体(大腸菌で発現させたGSTを抗原としてウサギを免疫して作製した抗血清)を用いてイムノブロットによりそれぞれの蛋白質を検出した。
その結果を図10に示した。上段から、GSTとLG4の融合蛋白、GSTとLG4 R1520Aの融合蛋白、GSTとLG4 H1518Aの融合蛋白、GSTについて、各段の左から各蛋白質を発現させた大腸菌の細胞破砕液、ヘパリンセファロースCL−6Bに通した後の細胞破砕液、洗浄液の画分、NaCl濃度が100、200、400、500、600、1000mmol/lの緩衝液での各溶出画分をSDS−PAGEし、それぞれの蛋白質をイムノブロットで検出した結果を示している。
LG4はNaCl濃度400および500mmol/lで溶出されたのに対し、LG4 H1518Aは細胞破砕液のカラム通過後の画分と洗浄液の画分にしか検出されず、ヘパリン結合性がなくなっていた。また、LG4 R1520AはNaCl濃度100および200mmol/lで溶出され、ヘパリンに対する結合がLG4と比較して弱くなっていた。
なお、コントロールのGSTはヘパリンとの結合能は示さなかった。この結果からLG4のみならずラミニンα4鎖においても1518Hisおよび1520Argがヘパリンとの強い結合能を規定していると考えられた。LG4のGSTとの融合蛋白質の結合性はアフィニティーカラムから溶出する塩濃度からα4Gの44kDaおよび33kDaの断片と同程度であり、35kDaおよび23kDaの断片よりも強いと考えられた。
〔実施例4〕 α4G部分ポリペプチドによるWnt1の遊離
ヘパリン結合能をもつα4G部分ポリペプチドのWnt1の細胞からの遊離に対する影響を検討した。
動物細胞発現用ベクターpMKIT〔J.Biochem.,120,236(1996)〕に、c−mycタグペプチドの配列を付加したマウスWnt1 cDNA〔Cell,39,233(1984)〕を挿入し、Wnt1発現用プラスミドを作製してヒト細胞株293T〔293tsA1607neo;Mol.Cell.Biol.,7,379(1987)〕に導入した。このWnt1発現細胞を10%ウシ胎児血清を含む培地DMEMで1日間培養した後、培地を除いてダルベッコ改変PBSで3回細胞を洗浄し、実施例2(3)で得られたヘパリンに高い結合能を有する23kDaおよび35kDaのα4Gトリプシン断片20nmol/lまたは40nmol/lを含むDMEM(血清を含まない)2mlあるいは2mlのDMEM(血清およびα4G部分ポリペプチドを含まない)を加えて4時間培養した。それぞれの培養後の培地を回収し、終濃度10%(w/v)になるようにトリクロロ酢酸を添加して、蛋白質を沈殿させた。
培養後の細胞はダルベッコ改変PBSで3回洗浄した。沈殿させた培地中の蛋白質および細胞にSDS−PAGE用サンプルバッファーを添加して溶解させ、SDS−PAGE(10%アクリルアミド)を行った後、実施例1(2)と同様に1次抗体としてc−myc抗血清を用いたイムノブロット法により培地中および細胞中のWnt1を検出した。
その結果を図11に示した。図11は、Wnt1発現細胞、ヘパリン結合能を有するα4Gトリプシン断片を20nmol/l(左から3、7番目のレーン)および40nmol/l(左から4、8番目のレーン)添加して培養した場合(+)と添加しなかった場合(−)の、培地中のWnt1をイムノブロット法により検出した結果であり、左の4レーンは培地中、右の4レーンは細胞中のWnt1を示している。
α4G部分ポリペプチド非添加では培地中にWnt1はほとんど検出されなかったのに対し、α4G部分ポリペプチドを添加した場合は20nmol/lおよび40nmol/l共に明らかにWnt1が培地中に検出され、ヘパリン結合能をもつα4G部分ポリペプチドにより細胞からWnt1が遊離することが確認された。なお、細胞中のWnt1については、α4G部分ポリペプチド添加・非添加でほとんど量に変化はみられなかった。
〔実施例5〕 ラミニンα4Gの抗腫瘍活性
実施例1に記載の方法に従い、ラミニンα4Gを精製し、以下の実験に用いた。
(1)皮下腫瘍モデルでの抗腫瘍活性
マウスメラノーマ細胞B16/F10(ATCC番号:CRL1581)5×105細胞をPBS(GIBCO−BRL)またはラミニンα4G(23、115、231μg)と混ぜてC57BL/6ブラックマウス(SPF、オス6〜8週齢、日本クレア社より購入)の右胸部に皮下移植した(各群n=4又は5)。移植後2、3、4、5日目にPBSを混合して移植したマウスにはPBSを、ラミニンα4Gを混合して移植したマウスには移植時と同量のラミニンα4G(23、115、231μg)を尾静注した。移植後4〜6日目より黒色の腫瘍径を経時的に測定した。その結果を図12aに示す。PBS投与群に比べラミニンα4Gの231μg投与群では腫瘍増殖阻害効果が認められた。
(2)肺転移腫瘍モデルでの抗腫瘍活性
マウスメラノーマ細胞B16/F10 2.5×105細胞をPBSまたはラミニンα4G(23、115、231μg)と混ぜてC57BL/6ブラックマウス(SPF、オス6〜8週齢、日本クレア社より購入)に尾静注した(各群n=5)。尾静注後2、3、4、5日目にPBSを尾静注したマウスにはPBSを、ラミニンα4Gを尾静注したマウスには尾静注時と同量のラミニンα4G(23、115、231μg)をさらに尾静注した。最初の尾静注から14日目に肺を摘出し転移腫瘍数を測定した。その結果を図12bに示す。PBS投与群に比べラミニンα4Gの231μg投与群では肺腫瘍転移数の減少が認められた。
〔実施例6〕 ラミニンα4Gによる血管新生および脂肪細胞の誘導の阻害
実施例1に記載の方法に従い、ラミニンα4Gを精製し、以下に記載するマトリゲル・プラーグアッセイに用いた。
マトリゲル(Becton Dickinson社製)0.5mlに150ng/ml b−FGF(Pepro Tech社製)、20U/mlヘパリン(Sigma−Aldrich社製)を混ぜたもの、あるいは、マトリゲル0.5mlに150ng/ml b−FGF、20U/mlヘパリンおよび100μg/ml α4Gを混ぜたものを、それぞれC57BL/6ブラックマウス(SPF、オス6〜8週齢、日本クレア社より購入)の右腹部に皮下投与した。コントロールとして、マトリゲルのみも同様にマウスに投与した。
14日後にマトリゲルを取り出し10%中性ホルマリン緩衝液(ナカライテスク社製)で約12時間固定化操作を行い2〜3mmの切片にした。続いてバキュームロータリーを用いて24時間脱水・パラフィン置換を行い、ヒストエンブダーによりパラフィンブロックを作成した。パラフィンブロックは約2〜3□mに薄切しスライドグラスに伸展させ、ヘマトキシリン・エオジン染色を以下のように行った。まず、切片を伸展させたスライドグラスをキシレンに10分間×2回、100%エタノールに30秒間×2回、95%エタノールに30秒間、70%エタノールに30秒間それぞれ漬けて脱パラフィン処理をした。ついで、流水で5分間洗浄し、ヘマトキシリン(Sigma−Aldrich社製)で1分間染色した後、流水で5分間洗浄し、エオジン(ムトウ社製)で5分間染色した。さらに、70%エタノールに30秒間、95%エタノールに30秒間、100%エタノールに5分間×3回、キシレンに10分間×2回それぞれ漬けて脱水を行った。作成したスライドグラスを検鏡した。
その結果を図13に示す。コントロールのマトリゲルのみを投与したマウスに比べマトリゲルにb−FGFおよびヘパリンを添加して投与したマウスは、マトリゲル中に血管新生及び脂肪細胞が誘導された。マトリゲル、b−FGF、ヘパリンに100μg/ml α4Gを添加して投与したマウスではb−FGFにより誘導されたマトリゲル中の血管新生、及び脂肪細胞の誘導が阻害された。
産業上の利用の可能性
本発明により、ラミニンα4鎖のヘパリン結合能を有するポリペプチドが提供される。本発明のポリペプチドは、α1鎖の約10倍ものヘパリン結合能を有し、ヘパリン結合性の情報伝達分子の濃度勾配形成やシグナル伝達を阻害し、細胞と毛細血管との接触、癌の成長、および細胞の増殖、分化、生存維持を阻害する作用を有する。
配列表フリーテキスト
配列番号35−人工配列の説明:配列番号16と同じアミノ酸組成のランダムな配列
配列番号36−人工配列の説明:配列番号16と同じアミノ酸組成のランダムな配列
配列番号37−人工配列の説明:ラミニンα4鎖のモジュールLG4の1518−HisをAlaに置換する部位特異変異のためのプライマー
配列番号38−人工配列の説明:ラミニンα4鎖のモジュールLG4の1518−HisをAlaに置換する部位特異変異のためのプライマー
配列番号39−人工配列の説明:ラミニンα4鎖のモジュールLG4の1520−ArgをAlaに置換する部位特異変異のためのプライマー
配列番号40−人工配列の説明:ラミニンα4鎖のモジュールLG4の1520−ArgをAlaに置換する部位特異変異のためのプライマー
【配列表】
【図面の簡単な説明】
図1は、pEFα4GmycおよびpEFα1Gmycの構造を示す図である。
図2は、α4Gまたはα1Gを発現させた動物細胞についての、ウェスタン・ブロットによるα4Gおよびα1Gの検出を示す写真である。Aはツニカマイシン添加・非添加で培養した場合の結果であり、Bは非還元条件と還元条件でSDS−PAGEを行った場合の結果を示す写真である。
図3は、α4Gまたはα1Gを発現させた動物細胞の培養上清からヘパリン・アフィニティーカラムによる精製を示す図および写真である。A、Bはα1Gの発現細胞、C、Dはα4Gの発現細胞の各培養上清についての図および写真である。
図4は、固相化ヘパリンに対するα4Gまたはα1Gの結合を示す図である。
図5は、グリコシダーゼ処理がα4Gのヘパリン結合性に及ぼす影響を示す図および写真である。Aはグリコシダーゼ処理、非処理α4G、ツニカマイシン添加、非添加α4G発現細胞のSDS−PAGEの結果を示す写真であり、Bは固定化ヘパリンに対するグリコシダーゼ処理、未処理のα4Gの結合量を1次抗体として抗c−myc抗体を用いて検出した結果を示す図である。
図6は、尿素による変性がα4Gのヘパリン結合性に及ぼす影響を示す写真である。α4Gをヘパリンカラムに結合後、Aはカラム上での尿素による変性を行わず尿素を含まない溶出液で溶出したコントロール、Bはカラム上で8mol/l尿素により変成させ8mol/l尿素を含む溶出液で溶出させた場合、Cはカラム上で8mol/l尿素により変成させ尿素を含まない溶出液で溶出させた場合の各溶出画分のSDS−PAGEの結果を示す写真である。
図7は、ヘパリン結合性を有するα4Gのキモトリプシン断片の単離を示す図および写真である。Aはα4Gをヘパリンカラムに結合させてキモトリプシンで消化後、溶出させた場合で、Bはpeak1(画分16,17)、peak2(画分23,24,25)の画分をSDS−PAGEし蛋白質を検出した写真である。
図8は、ヘパリン結合性を有するα4Gのトリプシン断片の単離を示す写真である。Aはα4Gをヘパリンカラムに結合させてキモトリプシンで消化後、溶出させたヘパリン結合性を有するトリプシン断片を含む溶出画分(画分18,19,20)のトリシンゲル電気泳動の結果であり、Bはトリプシン断片の溶出画分を、左から抗c−myc抗体、抗LG5ペプチド抗体、抗α4G抗体を用いたイムノブロットにより検出した結果を示す写真である。
図9は、α4G部分ペプチドのヘパリン結合性を示す写真である。
図10は、LG4、LG4 R1520A、LG4 H1518Aの各GSTとの融合蛋白質のヘパリン結合性を示す写真である。
図11は、α4G部分ポリペプチドによるWnt1の細胞からの遊離を示す写真である。
図12は、α4Gの抗腫瘍活性を示す図である。aは皮下腫瘍モデルで、●はPBS、▲はα4G 23μg、◆はα4G 115μg、■はα4G 231μgをそれぞれメラノーマ細胞と混合して移植した場合の結果を表す。横軸はメラノーマ細胞移植後の日数、縦軸は形成された腫瘍の容積を示す。グラフ上の棒は標準偏差を示す。bは肺転移腫瘍モデルで、左からPBS、α4G 23μg、α4G 115μg、α4G 231μgをそれぞれ混合して尾静注した場合の結果を表す。縦軸は肺に転移した腫瘍の数を示す。グラフ上の棒は標準偏差を示す。
図13は、α4Gによる血管新生および脂肪細胞の誘導の阻害を示す写真である。上から、マトリゲルのみ、マトリゲルに150ng/ml b−FGFおよび20U/mlヘパリンを添加したもの、マトリゲル、b−FGF、ヘパリンに100μg/ml α4Gを添加したものをそれぞれ移植した場合のマトリゲル・プラーグアッセイの結果を表す。Aは脂肪細胞、Vは血管を示す。
本発明は、ヘパリン結合能を有するラミニンα4鎖由来のポリペプチド並びにその使用方法に関する。
背景技術
ラミニンはコラーゲンやプロテオグリカンと共に基底膜の主要な構成成分をなす糖蛋白質であり、コラーゲンやプロテオグリカンと結合して、基底膜の構造を形成すると共に、種々の細胞上の蛋白質およびレセプターと結合し、細胞の接着のみならず増殖、分化、生存維持等に関与していると考えられている。
ラミニンは、α鎖、β鎖、γ鎖の3種類のサブユニットからなるヘテロ三量体であり、またそれぞれのサブユニットにはサブタイプが存在し、現在までに5種類のα鎖(α1〜α5)、3種類のβ鎖(β1〜β3)、3種類のγ鎖(γ1〜γ3)が単離されている。これらの各サブタイプの組み合わせにより20種類以上のラミニンファミリーが形成されると考えられている。これらのラミニンファミリーは、胚発生時に、それぞれ発現の組織特異性が報告されており〔Rohrbach DH & Timple R eds.(1993)Molecular and Cellular Aspects of Basement Membranes,Academic Press、Horton MA ed.(1996)Adhesion Receptors as Therapeutic Targets,CRC Press〕、それぞれが独自の機能を持っていると考えられているが、その機能の違いはまだ明らかにはなっていない。
α4鎖〔Eur.J.Biochem.,264,727(1997)〕は、他のα鎖サブタイプのN末端に存在するドメインが欠失した200〜240kDaの低分子のα鎖サブタイプであり、かなり組織特異的な発現を示し、血管内皮細胞等でβ1およびγ1と会合してα4β1γ1を形成することが報告されている〔J.Biol.Chem.,265,18123(1990)〕。血管内皮細胞ではα1鎖と競合して、α4β1γ1とα1β1γ1の2種類のラミニンが形成されるが、血管新生時にはα4β1γ1の形成の方が優勢となる。マウス繊維芽細胞株3T3−L1では、ラミニンのα鎖としてα4鎖のみが発現しており、α4β1γ1を形成することと、デキサメタゾンによる脂肪細胞への分化に伴いα4鎖の発現量が増大することが報告されている〔J.Biol.Chem.,263,16163(1988)、Matrix Biol.,16,223(1997)〕。
α4β1γ1脂肪前駆細胞は、新生毛細血管の外表面と約0.2mmの間隙をおいて広範囲に接触構造を形成しているが、この間隙にはα4β1γ1が蓄積しており、脂肪前駆細胞と新生毛細血管の接触構造の形成に関与している可能性が示唆されている。このような、新生毛細血管との接触構造は、癌の成長の際にも想定され、また、マウスの末梢および腸間膜のリンパ節由来の内皮細胞株では、細胞密度が低い状態やサイトカインで刺激した場合に、α4鎖の発現が誘導されることが知られている〔Eur.J.Biochem.,223,603(1994)〕。このように間充織由来の細胞株において、α4鎖が特定の機能をもつことが予測される。
5種類のα鎖サブタイプには共通してC末端にGドメインとよばれる大きな球状の高次構造をとる領域があり、前述のようにα4鎖は他のα鎖がもつN末端側のドメインを欠いているので、α4鎖を含むラミニンであるα4β1γ1が他のラミニンファミリーと異なる特定の機能を示すのに、C末端のGドメインが重要であると考えられる。
Gドメインは、α1鎖、α2鎖、α3鎖においてヘパリン結合性を有するドメインであることが報告されているドメインであり、さらにこれらのαサブタイプのGドメインの中のどの領域がヘパリン結合性を規定しているかが、プロテアーゼによる限定分解や遺伝子組換え法により調製したGドメインの部分断片ポリペプチドや化学合成したペプチドあるいは抗体を利用して解析されてきた。Gドメインは約190アミノ酸からなる5つのモジュール(以下LG1〜LG5と表す。)からなるが、たとえば、α1鎖ではLG4、α2鎖ではLG5がヘパリンとの結合に重要であると報告されている〔J.Mol.Biol.,287,253(1999)、EMBO J.,18,863(1999)〕。また、ヘパリン結合能をもつラミニンα1鎖由来のペプチドの報告もある〔Biochem.J.,340,119(1999)、J.Cell.Physiol.,179,18(1999)〕。
しかし、α4鎖についてはGドメインのヘパリン結合性についての報告はない。α鎖の各サブタイプ間のアミノ酸相同性はそれほど高くなく、α4鎖でヘパリン結合性を規定する領域はα1鎖やα2鎖と同じであるかどうかは不明である。
ヘパリンと結合する分子として、ラミニンα鎖の他に、細胞の増殖、分化、生存維持に関与する情報伝達分子であるWnt1やFGFが知られている。ヘパリン結合性を示すWntファミリーの遺伝子は発現パターンやノックアウトマウスの解析からさまざまな器官の形成、例えば、Wnt1はマウスで脳の発生と分化に関与していることが報告されている〔Cell,62,1073(1990)〕。またヘパリン結合性の増殖因子であるFGFファミリーも、多様な細胞の増殖促進作用をもつことが知られている。例えば、FGF−2(b−FGF)は繊維芽細胞や血管内皮細胞、神経系細胞等の増殖を促進し、血管新生や創傷治癒に働いていると考えられている。
これらのヘパリン結合性情報伝達分子は、ヘパリンを介して細胞表面の膜結合型プロテオグリカンおよび細胞外マトリクス中のプロテオグリカンと結合して捕捉されることにより、細胞および組織での分布や濃度勾配が調節されていると考えられる。
Wnt、FGFの他にも、ヘパリン結合能を有する情報伝達分子は多く知られており、HB−EGF(Heparin−binding epidermal growth factor)、PDGF(Platelet−derived growth factor)BMP(Bone morphogenic protein)、GM−CSF(Granulocyte−macrophage colony stimulating factor)、HGF(Hepatocyte growth factor)、ケモカイン、TNF(Tumor necrosis factor)等がそのヘパリン結合能を利用して、細胞の分化や増殖に関与している。
本願発明のラミニンα4鎖のGドメイン由来のポリペプチドは、強力なヘパリン結合能を有していることから、上記ヘパリン結合性情報伝達分子をはじめとするヘパリン結合性分子のヘパリンへの結合を競合阻害することにより、ヘパリン結合性情報伝達分子を介した情報伝達、細胞と細胞外マトリックスとの結合、細胞と毛細血管との結合、若しくは細胞の増殖、分化などを阻害することが可能であり、血管新生が関与する疾患や癌などの予防薬または治療薬として有用である。
発明の開示
本発明の課題は、ヘパリン結合能を有するポリペプチド、該ポリペプチドをコードするDNA、該DNAを用いた該蛋白の製造法、該ポリペプチドを用いた、細胞と毛細血管の接触、血管の新生、癌の成長、細胞の増殖、分化、生存維持またはヘパリン結合性情報伝達分子のシグナル伝達を阻害する方法、該ポリペプチドを含有してなる医薬、該DNAを含有してなる医薬を提供することである。
本発明者は、遺伝子組換え法により大量に調製したマウスのα1鎖およびα4鎖のGドメインを用いて、α4鎖のGドメインが単独でヘパリン結合能を有すること、およびそのα4鎖のGドメインのヘパリン結合能は、従来知られていたα1鎖のGドメインのヘパリン結合能の約10倍の高さであることを見出すことに成功した。さらにα4鎖のGドメインを酵素分解した部分ポリペプチドを用いて、α4鎖のGドメインの中でモジュールLG4の領域がα4鎖のGドメイン全体と同等なヘパリン結合能を有すること、並びにモジュールLG4の部分ペプチドを用いて、ヘパリン結合能を有するLG4の部分ペプチドを同定することに成功し、本発明を完成するに至った。
即ち、本発明は、以下の(1)〜(22)に関する。
(1) ラミニン構成成分α4鎖のモジュールLG4領域に存在するヘパリン結合領域のアミノ酸配列を含む、分子量108kDa以下のポリペプチドまたは該ポリペプチドを含有する融合ポリペプチド。
(2) ヘパリン結合領域のアミノ酸配列が、配列番号3、4、6、17および33のいずれかに記載のアミノ酸配列である、(1)記載のポリペプチド。
(3)ポリペプチドが、ラミニン構成成分α4鎖のモジュールLG4領域、またはLG4およびLG5領域を含むポリペプチドである、(1)記載のポリペプチド。
(4) 融合ポリペプチドが、タグペプチド、マーカーペプチド、またはシグナルペプチドより選ばれるペプチドとの融合ポリペプチドである、(1)記載のポリペプチド。
(5) タグペプチド、マーカーペプチド、またはシグナルペプチドより選ばれるペプチドが、mycポリペプチド、β−ガラクトシダーゼ、プロテインA、プロテインAのIgG結合領域、クロラムフェニコール・アセチルトランスフェラーゼ、ポリ(Arg)、ポリ(Glu)、プロテインG、マルトース結合ポリペプチド、グルタチオンS−トランスフェラーゼ、ポリヒスチジン鎖、Sペプチド、DNA結合ポリペプチドドメイン、Tac抗原、チオレドキシン、グリーン・フルオレッセント・プロテイン、FLAGペプチド、任意の抗体のエピトープおよび任意の分泌蛋白質のシグナルペプチドからなる群より選ばれるペプチドである(4)記載のポリペプチド。
(6) 配列番号3、4、6、17および33のいずれかに記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド。
(7) (1)〜(6)のいずれか1項に記載のポリペプチドのアミノ酸配列において、1以上のアミノ酸が欠失、置換および/または付加されたアミノ酸配列からなり、マウスラミニンα4鎖の1518番目のヒスチジン残基と1520番目のアルギニン残基に相当する2アミノ酸が保存され、かつヘパリン結合能を有するポリペプチド。
(8) (1)〜(7)のいずれか1項に記載のポリペプチドのアミノ酸配列と60%以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、マウスラミニンα4鎖の1518番目のヒスチジン残基と1520番目のアルギニン残基に相当する2アミノ酸が保存され、かつヘパリン結合能を有するポリペプチド。
(9) (1)〜(8)のいずれか1項に記載のポリペプチドをコードするDNA。
(10) (9)に記載のDNAをベクターに組み込んで得られる組換え体DNA6
(11) (9)に記載のDNAまたは(10)に記載の組換え体DNAを保有する形質転換体。
(12) 形質転換体が、微生物、動物細胞、植物細胞、および昆虫細胞からなる群より選ばれる形質転換体である、(11)に記載の形質転換体。
(13) 形質転換体が、非ヒトトランスジェニック動物またはトランスジェニック植物である、(11)に記載の形質転換体。
(14) (11)または(12)に記載の形質転換体を培地に培養し、培養物中に(1)〜(8)のいずれか1項に記載のポリペプチドを生成、蓄積させ,該培養物から該ポリペプチドを採取することを特徴とする、該ポリペプチドの製造方法。
(15) (13)に記載の非ヒトトランスジェニック動物またはトランスジェニック植物を生育させ、(1)〜(8)のいずれか1項に記載のポリペプチドを該動植物中に生成、蓄積させ、該動植物中より該ポリペプチドを採取することを特徴とする、該ポリペプチドの製造方法。
(16) (1)〜(8)のいずれか1項に記載のポリペプチドを有効成分として含有してなる医薬。
(17) (9)に記載のDNAまたは(10)に記載の組換え体DNAを有効成分として含有してなる医薬。
(18) 細胞と細胞外マトリックスとの結合の阻害作用、細胞と毛細血管との接触の阻害作用、細胞の増殖の阻害作用または細胞の分化の阻害作用を有する(16)または(17)に記載の医薬。
(19) 医薬が癌、または血管新生が関与する疾患の治療および/または予防のための医薬である、(16)、(17)または(18)に記載の医薬。
(20) (1)〜(8)のいずれか1項に記載のポリペプチドを用いて、細胞からヘパリン結合性の情報伝達分子を遊離させる方法。
(21) (1)〜(8)のいずれか1項に記載のポリペプチドを用いて、ヘパリン結合性の情報伝達分子の濃度勾配形成またはシグナル伝達を阻害する方法。
(22) ヘパリン結合性の情報伝達分子がWnt1、FGF(Fibroblast growth factor)、HB−EGF(Heparin−binding epidermal growth factor)、PDGF(Platelet−derived growth factor)、BMP(Bone morphogenic protein)、GM−CSF(Granulocyte−macrophage colony stimulating factor)、HGF(Hepatocyte growth factor)、ケモカインおよびTNF(Tumor necrosis factor)からなる群から選ばれる情報伝達分子である(20)または(21)に記載の方法。
(23) ラミニン構成成分α4鎖のGドメインを含むポリペプチドを有効成分として含有してなる医薬。
(24) 細胞と細胞外マトリックスとの結合の阻害作用、細胞と毛細血管との接触の阻害作用、細胞の増殖の阻害作用または細胞の分化の阻害作用を有する(23)に記載の医薬。
(25) 医薬が癌、または血管新生が関与する疾患の治療および/または予防のための医薬である、(23)または(24)に記載の医薬。
(26) ラミニン構成成分α4鎖のGドメインを含むポリペプチドを用いて、細胞からヘパリン結合性の情報伝達分子を遊離させる方法。
(27) ラミニン構成成分α4鎖のGドメインを含むポリペプチドを用いて、ヘパリン結合性の情報伝達分子の濃度勾配形成またはシグナル伝達を阻害する方法。
(28) ヘパリン結合性の情報伝達分子がWnt1、FGF(Fibroblast growth factor)、HB−EGF(Heparin−binding epidermal growth factor)、PDGF(Platelet−derived growth factor)、BMP(Bone morphogenic protein)、GM−CSF(Granulocyte−macrophage colony stimulating factor)、HGF(Hepatocyte growth factor)、ケモカインおよびTNF(Tumor necrosis factor)からなる群から選ばれる情報伝達分子である(26)または(27)に記載の方法。
以下、本発明を詳細に説明する。
1.本発明のポリペプチドの製造
本発明のポリペプチドは、ラミニン構成成分α4鎖のモジュールLG4領域に存在するヘパリン結合領域のアミノ酸配列を有する、分子量108kDa以下のポリペプチドまたは該ポリペプチドを含有する融合ポリペプチドである。
該ポリペプチドとして、例えば、配列番号3、4、6、17および33のいずれかに記載のアミノ酸配列を有する、ラミニン構成成分α4鎖のヘパリン結合領域のアミノ酸配列を有するポリペプチド、ラミニン構成成分α4鎖のモジュールLG4領域を含むポリペプチド、LG4およびLG5領域を含むポリペプチド、配列番号3、4、6、17および33のいずれかに記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド等を挙げることができる。
上記ポリペプチドを含有する本発明の融合ポリペプチドとしては、上記ポリペプチドのヘパリン結合能を維持できる異種ポリペプチドとの融合ポリペプチドであればよく、異種ペプチドとしては、例えば、タグペプチド、マーカーペプチド、またはシグナルペプチドより選ばれるペプチドが挙げられ、具体的には、mycポリペプチド、β−ガラクトシダーゼ、プロテインA、プロテインAのIgG結合領域、クロラムフェニコール・アセチルトランスフェラーゼ、ポリ(Arg)、ポリ(Glu)、プロテインG、マルトース結合ポリペプチド、グルタチオンS−トランスフェラーゼ、ポリヒスチジン鎖(His−tag)、Sペプチド、DNA結合ポリペプチドドメイン、Tac抗原、チオレドキシン、グリーン・フルオレッセント・プロテイン(GFP)、FLAGペプチド、任意の抗体のエピトープおよび任意の分泌蛋白質のシグナルペプチド等との融合ポリペプチドなどを挙げることができる〔山川彰夫,実験医学,13,469−474(1995)〕。
更に、本発明のポリペプチドとしては、上記のポリペプチドのアミノ酸配列において、1以上のアミノ酸が欠失、置換および/または付加されたアミノ酸配列からなり、マウスラミニンα4鎖の1518番目のヒスチジン残基と1520番目のアルギニン残基に相当する2アミノ酸が保存され、かつヘパリン結合能を有するポリペプチド、上記のポリペプチドのアミノ酸配列と60%以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、マウスラミニンα4鎖の1518番目のヒスチジン残基と1520番目のアルギニン残基に相当する2アミノ酸が保存され、かつヘパリン結合能を有するポリペプチド等を挙げることができる。
上記の本発明のポリペプチドのアミノ酸配列において、1以上のアミノ酸が欠失、置換および/または付加されたアミノ酸配列を有するポリペプチドは、Molecular Cloning,A Laboratory Manual,Second Edition,Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989(以下、モレキュラー・クローニング第2版と略す)、Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley & Sons,1987−1997(以下、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジーと略す)、Nucleic Acids Research,10,6487,(1982)、Proc.Natl.Acad.Sci.,USA,79,6409(1982)、Gene,34,315(1985)、Nucleic Acids Research,13,4431(1985)、Proc.Natl.Acad.Sci USA,82,488(1985)等に記載の部位特異的変異導入法を用いて、本発明のポリペプチドをコードするDNAに部位特異的変異を導入することにより行うことができる。欠失、置換および/または付加されるアミノ酸の数は1から数個であり、その数は特に限定されないが、上記の部位特異的変異導入法などの周知の技術により、欠失、置換もしくは付加できる程度の数であり、例えば、1〜数十個、好ましくは1〜20個、より好ましくは1〜10個、さらに好ましくは1〜5個である。
また、上記本発明のポリペプチドのアミノ酸配列と60%以上の相同性を有するポリペプチドは、BLAST〔J.Mol.Biol.,215,403(1990)〕やFASTA(Methods in Enzymology,183,63−69)等の解析ソフトで、デフォルト(初期設定)のパラメータを用いて計算したときに、少なくとも60%以上の相同性を有するポリペプチドであり、好ましくは70%以上、より好ましくは80%以上、さらに好ましくは90%以上、特に好ましくは95%以上、最も好ましくは97%以上の相同性を有するポリペプチドである。相同性を有するポリペプチドとしては、マウス、ラット、ウシ、サル等の哺乳動物由来のラミニン構成成分α4鎖のホモログポリペプチドを挙げることができる。
本発明のポリペプチドは、モレキュラー・クローニング第2版やカレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー等に記載された方法等を用い、例えば以下の方法により、本発明のDNAを宿主細胞中で発現させて、製造することができる。
本発明のDNAとしては、上記本発明のポリペプチドをコードするDNAを挙げることができる。
本発明のDNAは、本発明のポリペプチドのアミノ酸配列情報に基づいて、該ポリペプチドをコードするDNAを化学合成することによって調製することができる。
DNAの化学合成は、チオホスファイト法を利用した島津製作所製のDNA合成機、フォスフォアミダイト法を利用したパーキン・エルマー社製のDNA合成機model392等を用いて行うことができる。
また、本発明のポリペプチドのアミノ酸配列情報に基づいて作製したオリゴヌクレオチドをセンスプライマーおよびアンチセンスプライマーとして用い、これらDNAに相補的なmRNAを発現している細胞のmRNAから調製したcDNAを鋳型として、PCRを行うことによっても、目的とするDNAを調製することができる。
アンチセンス・オリゴヌクレオチドあるいはセンス・オリゴヌクレオチドはモレキュラー・クローニング第2版等に記載の常法により、あるいは該DNAの塩基配列情報よりDNA合成機により調製することができる。
上記オリゴヌクレオチドとしては、本発明のポリペプチドのアミノ酸配列情報より想定される塩基配列中の連続した5〜120塩基、より好ましくは連続した5〜60塩基と同じ配列を有するDNA、または該DNAと相補的な配列を有するDNAを挙げることができ、具体的には、配列番号34で表される塩基配列中の連続した5〜120塩基と同じ配列を有するDNAまたは該DNAと相補的な配列を有するDNAを挙げることができる。センスプライマーおよびアンチセンスプライマーとして用いる場合には、両者の融解温度(Tm)および塩基数が極端に変わることのない上記記載のオリゴヌクレオチドが好ましい。具体的には配列番号37〜40等に示された塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを挙げることができる。
上記の方法で調製した、本発明のポリペプチドをコードする部分を含む適当な長さのDNA断片を適当な発現ベクターのプロモーターの下流に挿入することにより、組換え体DNAを作製することができる。
該組換え体DNAを、該発現ベクターに適合した宿主細胞に導入することにより、本発明のポリペプチドを生産する形質転換体を得ることができる。導入した組換え体DNAは、形質転換体の染色体ゲノム中に組み込まれて保持される場合と形質転換細胞内で組換え体DNAとして保持される場合とがある。
本発明の形質転換体としては、本発明の上記DNA若しくは組換え体DNAを適当な宿主細胞または動植物個体に導入して得られる形質転換体を挙げることができる。
宿主細胞としては、細菌などの原核細胞、糸状菌、酵母等の微生物細胞、動物細胞、昆虫細胞、植物細胞等、目的とする遺伝子を発現できるものであればいずれも用いることができる。また、動物個体や植物個体を用いることができる。
酵母、動物細胞、昆虫細胞または植物細胞により発現させた場合には、糖あるいは糖鎖が付加されたポリペプチドを得ることができる。
発現ベクターとしては、上記宿主細胞において自立複製が可能、または染色体中への組込みが可能で、本発明のポリペプチドをコードするDNAの転写に適した位置にプロモーターを含有しているものを用いることができる。
細菌等の原核生物を宿主細胞として用いる場合、本発明のポリペプチドをコードするDNAの発現ベクターは、原核生物中で自立複製可能であると同時に、プロモーター、リボソーム結合配列、本発明のポリペプチドをコードするDNA、転写終結配列、より構成されていることが好ましい。プロモーターを制御する遺伝子が含まれていてもよい。
発現ベクターとしては、例えば、pBTrp2、pBTac1、pBTac2(いずれもBoehringer Mannheim社より市販)、pSE280(Invitrogen社製)、pGEMEX−1(Promega社製)、pQE−8(QIAGEN社製)、pKYP10(特開昭58−110600)、pKYP200〔Agric.Biol.Chem.,48,669(1984)〕、pLSA1〔Agric.Biol.Chem.,53,277(1989)〕、pGEL1〔Proc.Natl.Acad.Sci.USA,82,4306(1985)〕、pBlue II SK(−)(Stratagene社製)、pTrs30(FERM BP−5407)、pTrs32(FERM BP−5408)、pGHA2(FERM BP−400)、pGKA2(FERM B−6798)、pTerm2(特開平3−22979、US4686191、US4939094、US5160735)、pKK233−2(Pharmacia社製)、pGEX(Pharmacia社製)、pETシステム(Novagen社製)、pSupex、pUB110、pTP5、pC194、pTrxFus(Invitrogen社製)、pMAL−c2(New England Biolabs社製)等を例示することができる。
プロモーターとしては、大腸菌等の宿主細胞中で発現できるものであればいかなるものでもよい。例えば、trpプロモーター(Ptrp)、lacプロモーター(Plac)、PLプロモーター、PRプロモーター等の、大腸菌やファージ等に由来するプロモーター、SPO1プロモーター、SPO2プロモーター、penPプロモーター等を挙げることができる。またPtrpを2つ直列させたプロモーター(Ptrp x2)、tacプロモーター、lacT7プロモーター、lte Iプロモーターのように人為的に設計改変されたプロモーター等も用いることができる。
リボソーム結合配列としては、シャイン−ダルガノ(Shine−Dalgarno)配列と開始コドンとの間を適当な距離(例えば6〜18塩基)に調節したプラスミドを用いることが好ましい。
本発明のDNAの発現には転写終結配列は必ずしも必要ではないが、好適には構造遺伝子直下に転写終結配列を配置することが望ましい。
宿主細胞としては、エシェリヒア属、セラチア属、バチルス属、ブレビバクテリウム属、コリネバクテリウム属、ミクロバクテリウム属、シュードモナス属等に属する微生物、例えば、Escherichia coli XL1−Blue、Escherichia coli XL2−Blue、Escherichia coli DH1、Escherichia coli MC1000、Escherichia coli KY3276、Escherichia coli W1485、Escherichia coli JM109、Escherichia coli HB101、Escherichia coli No.49、Escherichia coli W3110、Escherichia coli NY49、Escherichia coli BL21(DE3)、Escherichia coli BL21(DE3)pLysS、Escherichia coli HMS174(DE3)、Escherichia coli HMS174(DE3)pLysS、Serratia ficaria、Serratia fonticola、Serratia liquefaciens、Serratia marcescens、Bacillus subtilis、Bacillus amyloliquefaciens、Brevibacterium ammoniagenes、Brevibacterium immariophilum ATCC14068、Brevibacterium saccharolyticum ATCC14066、Corynebacterium glutamicu m ATCC13032、Corynebacterium glutamicum ATCC14067、Corynebacterium glutamicum ATCC13869、Corynebacterium acetoacidophilum ATCC13870、Microbacterium ammoniaphilum ATCC15354、Pseudomonas sp.D−0110等を挙げることができる。
組換えベクターの導入方法としては、上記宿主細胞へDNAを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、エレクトロポレーション法〔Nucleic Acids Res.,16,6127(1988)〕、カルシウムイオンを用いる方法〔Proc.Natl.Acad.Sci.USA,69,2110(1972)〕、プロトプラスト法(特開昭63−248394)、Gene,17,107(1982)やMol.Gen.Genet.,168,111(1979)に記載の方法等を挙げることができる。
酵母菌株を宿主細胞として用いる場合には、発現ベクターとして、例えば、YEp13(ATCC37115)、YEp24(ATCC37051)、YCp50(ATCC37419)、pHS19、pHS15等を例示することができる。
プロモーターとしては、酵母菌株中で発現できるものであればいかなるものでもよく、例えば、PHO5プロモーター、PGKプロモーター、GAPプロモーター、ADHプロモーター、gal 1プロモーター、gal 10プロモーター、ヒートショック蛋白質プロモーター、MFα1プロモーター、CUP 1プロモーター等のプロモーターを挙げることができる。
宿主細胞としては、サッカロマイセス属、シゾサッカロマイセス属、クルイベロミセス属、トリコスポロン属、シワニオミセス属等に属する酵母菌株を挙げることができ、具体的には、Saccharomyces cerevisiae、Schizosaccharomyces pombe、Kluyveromyces lactis、Trichosporon pullulans、Schwanniomyces alluvius等を挙げることができる。
組換えベクターの導入方法としては、酵母にDNAを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、エレクトロポレーション法〔Methods.Enzymol.,194,182(1990)〕、スフェロプラスト法〔Proc.Natl.Acad.Sci.USA,84,1929(1978)〕、酢酸リチウム法〔J.Bacteriol.,153,163(1983)〕、Proc.Natl.Acad.Sci.USA,75,1929(1978)記載の方法等を挙げることができる。
動物細胞を宿主細胞として用いる場合には、発現ベクターとして、例えば、pcDNAI/Amp(Invitrogen社製)、pcDNAI(フナコシ社製)、pCDM8〔Nature,329,840(1987)、フナコシ社製〕、pAGE107〔特開平3−22979;Cytotechnology,3,133(1990)〕、pREP4(Invitrogen社製)、pAGE103〔J.Biochemistry,101,1307(1987)〕、pAMo、pAMoA、pAS3−3(特開平2−227075)等を例示することができる。
プロモーターとしては、動物細胞中で発現できるものであればいずれも用いることができ、例えば、サイトメガロウイルス(ヒトCMV)のIE(immediate early)遺伝子のプロモーター、SV40の初期プロモーター、モロニー・ミュリン・ロイケミア・ウイルス(Moloney Murine Leukemia Virus)のロング・ターミナル・リピート・プロモーター(Long Terminal Repeat Promoter)、レトロウイルスのプロモーター、ヒートショックプロモーター、SRαプロモーター、あるいはメタロチオネインのプロモーター等を挙げることができる。また、ヒトCMVのIE遺伝子のエンハンサーをプロモーターと共に用いてもよい。
宿主細胞としては、DNAを細胞内に導入できる動物細胞であるならいかなる細胞も用いることができる。例えば、哺乳動物の細胞としてはヒト、サル、マウス、ラット、モルモットまたはミンクの細胞などを用いることができる。具体的には、マウス・ミエローマ細胞、ラット・ミエローマ細胞、マウス・ハイブリドーマ細胞、チャイニーズ・ハムスターの細胞であるCHO細胞(ATCC CRL−9096、ATCC CCL−61)、BHK細胞、アフリカミドリザル腎臓細胞、ヒトの細胞であるNamalwa細胞(ATCCCRL−1432)またはNamalwa KJM−1細胞、ヒト胎児腎臓細胞、ヒト白血病細胞、HBT5637(特開昭63−299)、ヒト大腸癌細胞株等を挙げることができる。
マウス・ミエローマ細胞としては、SP2/0、NSO等、ラット・ミエローマ細胞としてはYB2/0等、ヒト胎児腎臓細胞としてはHEK293、293〔J.Gen.Viol.36,59−72(1977)〕等、ヒト白血病細胞としてはBALL−1等、アフリカミドリザル腎臓細胞としてはCOS−1(ATCC CRL−1650)、COS−7(ATCC CRL−1651)、ヒト大腸癌細胞株としてはHCT−15等を挙げることができる。
治療用ポリペプチド性医薬品の製造などが目的の場合は、哺乳動物の細胞、特にCHO細胞を宿主とすることが好ましい。
組換えベクターの導入方法としては、動物細胞にDNAを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、エレクトロポレーション法〔Cytotechnology,3,133(1990)〕、リン酸カルシウム法(特開平2−227075)、DEAEデキストラン法(羊土社 バイオマニュアルシリーズ4,16)、リポフェクション法〔Proc.Natl.Acad.Sci.USA,84,7413(1987)〕、マイクロインジェクション法(羊土社 バイオマニュアルシリーズ4,36)、アデノウイルス法(羊土社 バイオマニュアルシリーズ4,43)、ワクシニアウイルス(羊土社 バイオマニュアルシリーズ4,59)レトロウイルスベクター(羊土社 バイオマニュアルシリーズ4,74)等を用いることができる。
昆虫細胞を宿主として用いる場合には、例えば、バキュロウイルス・イクスプレッション・ベクターズ ア・ラボラトリー・マニュアル〔Baculovirus Expression Vectors,A Laboratory Manual,W.H.Freeman and Company,NewYork(1992)〕、モレキュラー・バイオロジーア・ラボラトリー・マニュアル(Molecular Biology,A Laboratory Manual)、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー・サプルメント1〜38(Current Protocols in Molecular Biology)、Bio/Technology,6,47(1988)等に記載された方法によって、ポリペプチドを発現することができる。
即ち、組換え遺伝子導入ベクターおよびバキュロウイルスを昆虫細胞に共導入して昆虫細胞培養上清中に組換えウイルスを得た後、さらに組換えウイルスを昆虫細胞に感染させ、ポリペプチドを発現させることができる。
該方法において用いられる遺伝子導入ベクターとしては、例えば、pVL1392、pVL1393、pBlueBacIII(すべてInvitrogen社製)等を挙げることができる。
バキュロウイルスとしては、例えば、夜盗蛾科昆虫に感染するウイルスであるアウトグラファ・カリフォルニカ・ヌクレアー・ポリヘドロシス・ウイルス(Autographa californica nuclear polyhedrosis virus)等を用いることができる。
昆虫細胞としては、Spodoptera frugiperdaの卵巣細胞、Trichoplusia niの卵巣細胞、カイコ卵巣由来の培養細胞等を用いることができる。Spodoptera frugiperdaの卵巣細胞としてはSf9、Sf21(バキュロウイルス・イクスプレッション・ベクターズ ア・ラボラトリー・マニュアル)等、Trichoplusia niの卵巣細胞としてはHigh5(Invitrogen社製)、BTI−TN−5B1−4(Invitrogen社製)等、カイコ卵巣由来の培養細胞としてはBombyx mori N4等を挙げることができる。
組換えウイルスを調製するための、昆虫細胞への上記組換え遺伝子導入ベクターと上記バキュロウイルスの共導入方法としては、例えば、リン酸カルシウム法(特開平2−227075)、リポフェクション法〔Proc.Natl.Acad.Sci.USA,84,7413(1987)〕等を挙げることができる。
また、動物細胞にDNAを導入する方法と同様の方法を用いて、昆虫細胞にDNAを導入することもでき、例えば、エレクトロポレーション法〔Cytotechnology,3,133(1990)〕、リン酸カルシウム法(特開平2−227075)、リポフェクション法〔Proc.Natl.Acad.Sci.USA,84,7413(1987)〕等を挙げることができる。
植物細胞または植物個体を宿主として用いる場合には、公知の方法〔組織培養,20(1994)、組織培養,21(1995)、Trends in Biotechnology,15,45(1997)〕に準じてポリペプチドを生産することができる。
遺伝子発現に用いるプロモーターとしては、植物細胞中で発現できるものであればいずれも用いることができ、例えば、カリフラワーモザイクウイルス(CaMV)の35Sプロモーター、イネアクチン1プロモーター等を挙げることができる。また、プロモーターと発現させる遺伝子の間に、トウモロコシのアルコール脱水素酵素遺伝子のイントロン1等を挿入することにより、遺伝子の発現効率を上げることもできる。
宿主細胞としては、ジャガイモ、タバコ、トウモロコシ、イネ、アブラナ、ニンジン、大豆、トマト、小麦、大麦、ライ麦、アルファルファ、亜麻等の植物細胞等を挙げることができる。組換えベクターの導入方法としては、植物細胞にDNAを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、アグロバクテリウム(Agrobacterium)(特開昭59−140885、特開昭60−70080、WO94/00977)、エレクトロポレーション法〔Cytotechnology,3,133(1990)、特開昭60−251887〕、パーティクルガン(遺伝子銃)を用いる方法(特許第2606856、特許第2517813)等を挙げることができる。
遺伝子を導入した植物の細胞や器官は、ジャーファーメンターを用いて大量培養することができる。また、遺伝子導入した植物細胞を再分化させることにより、遺伝子が導入された植物個体(トランスジェニック植物)を造成することもできる。
動物個体を用いて本発明のポリペプチドを生産することもできる。例えば、公知の方法〔American Journal of Clinical Nutrition,63,639S(1996)、American Journal of Clinical Nutrition,63,627S(1996)、Bio/Technology,9,830(1991)〕に準じて、遺伝子を導入した動物中に本発明のポリペプチドを生産することができる。
プロモーターとしては、動物で発現できるものであればいずれも用いることができるが、例えば、乳腺細胞特異的なプロモーターであるαカゼインプロモーター、βカゼインプロモーター、βラクトグロブリンプロモーター、ホエー酸性プロテインプロモーター等が好適に用いられる。
本発明のポリペプチドをコードするDNAを組み込んだ組換え体ベクターを保有する微生物、動物細胞、あるいは植物細胞由来の形質転換体を、通常の培養方法に従って培養し、該ポリペプチドを生成蓄積させ、該培養物より該ポリペプチドを採取することにより、該ポリペプチドを製造することができる。
形質転換体が動物個体または植物個体の場合は、通常の方法に従って、飼育または栽培し、該ポリペプチドを生成蓄積させ、該動物個体または植物個体より該ポリペプチドを採取することにより、該ポリペプチドを製造することができる。
即ち、動物個体の場合、例えば、本発明のDNAを保有する非ヒトトランスジェニック動物を飼育し、該組換え体DNAのコードする本発明のポリペプチドを該動物中に生成、蓄積させ、該動物中より該ポリペプチドを採取することにより、本発明のポリペプチドを製造することができる。該動物中の生成、蓄積場所としては、例えば、該動物のミルク(特開昭63−309192)、卵等を挙げることができる。
植物個体の場合、例えば、本発明のDNAを保有するトランスジェニック植物を栽培し、該組換え体DNAのコードする本発明のポリペプチドを該植物中に生成、蓄積させ、該植物中より該ポリペプチドを採取することにより、本発明のポリペプチドを製造することができる。
本発明のポリペプチド製造用形質転換体が大腸菌等の原核生物、酵母菌等の真核生物である場合、これら生物を培養する培地は、該生物が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、形質転換体の培養を効率的に行える培地であれば天然培地、合成培地のいずれでもよい。
炭素源としては、該形質転換体が資化し得るものであればよく、グルコース、フラクトース、スクロース、これらを含有する糖蜜、デンプンあるいはデンプン加水分解物等の炭水化物、酢酸、プロピオン酸等の有機酸、エタノール、プロパノール等のアルコール類が用いられる。
窒素源としては、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等の各種無機酸や有機酸のアンモニウム塩、その他含窒素化合物、並びに、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーンスチープリカー、カゼイン加水分解物、大豆粕および大豆粕加水分解物、各種発酵菌体およびその消化物等を用いることができる。
無機物としては、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅、炭酸カルシウム等を用いることができる。
培養は、振盪培養または深部通気攪拌培養等の好気的条件下で行う。培養温度は15〜40℃がよく、培養時間は、通常16〜96時間である。培養中pHは、3.0〜9.0に保持する。pHの調整は、無機あるいは有機の酸、アルカリ溶液、尿素、炭酸カルシウム、アンモニア等を用いて行う。
また培養中必要に応じて、アンピシリンやテトラサイクリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
プロモーターとして誘導性のプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときには、必要に応じてインデューサーを培地に添加してもよい。例えば、lacプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときにはイソプロピル−β−D−チオガラクトピラノシド(IPTG)等を、trpプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときにはインドールアクリル酸(IAA)等を培地に添加してもよい。
本発明のポリペプチド製造用形質転換体が動物細胞である場合、該細胞を培養する培地は、一般に使用されているRPMI1640培地〔The Journal of the American Medical Association,199,519(1967)〕、EagleのMEM培地〔Science,122,501(1952)〕、DMEM培地〔Virology,8,396(1959)〕、199培地〔Proceeding of the Society for the Biological Medicine,73,1(1950)〕またはこれら培地に牛胎児血清等を添加した培地等を用いることができる。
培養は、通常pH6〜8、30〜40℃、5%CO2存在下等の条件下で1〜7日間行う。
また培養中必要に応じて、カナマイシン、ペニシリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
昆虫細胞を宿主細胞として得られた形質転換体を培養する培地としては、一般に使用されているTNM−FH培地(Pharmingen社)、Sf−900 II SFM培地(GIBCO BRL社製)、ExCell400、ExCell405〔いずれもJRH Biosciences社製〕、Grace’s Insect Medium〔Nature,195,788(1962)〕等を用いることができる。培養は、pH6〜7、培養温度25〜30℃がよく、培養時間は、通常1〜5日間である。また、培養中必要に応じて、ゲンタマイシン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
植物細胞を宿主として得られた形質転換体は、細胞として、または植物の細胞や器官に分化させて培養することができる。該形質転換体を培養する培地としては、一般に使用されているムラシゲ・アンド・スクーグ(MS)培地、ホワイト(White)培地、またはこれら培地にオーキシン、サイトカイニン等、植物ホルモンを添加した培地等を用いることができる。培養は、通常pH5〜9、20〜40℃の条件下で3〜60日間行う。また、培養中必要に応じて、カナマイシン、ハイグロマイシン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
本発明のポリペプチドの生産方法としては、宿主細胞内に生産させる方法、宿主細胞外に分泌させる方法、あるいは宿主細胞外膜上に生産させる方法があり、使用する宿主細胞や、生産させるポリペプチドの構造に応じて適宜、選択することができる。
本発明のポリペプチドが宿主細胞内あるいは宿主細胞外膜上に生産される場合、ポールソンらの方法〔J.Biol.Chem.,264,17619(1989)〕、ロウらの方法〔Proc.Natl.Acad.Sci.USA,86,8227(1989)、Genes Develop.,4,1288(1990)〕、または特開平05−336963、WO94123021等に記載の方法を準用することにより、該ポリペプチドを宿主細胞外に積極的に分泌させることができる。
即ち、遺伝子組換えの手法を用いて、本発明のポリペプチドの活性部位を含むポリペプチドの手前にシグナルペプチドを付加した形で発現させることにより、本発明のポリペプチドを宿主細胞外に積極的に分泌させることができる。
具体的には、活性部位を含むと考えられるアミノ酸配列を有するポリペプチドの手前に、シグナルペプチドを付加して発現させることにより、本発明のポリペプチドを宿主細胞外に積極的に分泌させることができると考えられる。さらに、シグナルペプチドと活性部位を含むポリペプチドの間、または活性部位を含むポリペプチドのC末端に、精製・検出用のタグを付加することもできる。
精製・検出用のタグとしては、β−ガラクトシダーゼ、プロテインA、プロテインAのIgG結合領域、クロラムフェニコール・アセチルトランスフェラーゼ、ポリ(Arg)、ポリ(Glu)、プロテインG、マルトース結合ポリペプチド、グルタチオンS−トランスフェラーゼ、ポリヒスチジン鎖(His−tag)、Sペプチド、DNA結合ポリペプチドドメイン、Tac抗原、チオレドキシン、グリーン・フルオレッセント・プロテイン(GFP)、FLAGペプチド、および任意の抗体のエピトープなどが挙げることができる山川彰夫,実験医学,13,469−474(1995)〕。
また、特開平2−227075に記載されている方法に準じて、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子等を用いた遺伝子増幅系を利用して生産量を上昇させることもできる。
本発明のポリペプチドの製造法として他に、本発明のDNAを用いたin vitroでの転写・翻訳系による製造法がある。in vitro転写・翻訳系とは、無細胞システムを用いてDNAからmRNAへの転写、およびmRNAから蛋白質への翻訳を行うことによりポリペプチドを生産する系のことであり、目的のDNAまたは目的のmRNAから目的のポリペプチドを生産できる無細胞システムであればどのようなものでも用いることができる。代表的な無細胞翻訳系として、例えば、ウサギの網状赤血球ライゼート(Rabbit Reticulocyte Lysate)や小麦杯ライゼート(Wheat Germ Lysate)を用いた系などが挙げられる。in vitro転写・翻訳系は各社からキットが販売されており、市販のキットを用いてポリペプチドを比較的容易に製造できるようになっている。市販キットとして例えば、In Vitro ExpressTM Translation Kit(Stratagene社製)が挙げられる。また、本発明のポリペプチドは、公知の方法〔J.Biomolecular NMR,6,129−134、Science,242,1162−1164、J.Biochem.,110,166−168(1991)〕に準じたin vitro転写・翻訳系を用いて生産することもできる。
本発明ポリペプチド製造用形質転換体の培養物から、本発明のポリペプチドを単離・精製するには、通常の酵素の単離・精製法を用いることができる。例えば、本発明のポリペプチドが本発明のポリペプチド製造用形質転換体の細胞内に溶解状態で蓄積する場合には、培養物を遠心分離することにより、培養物中の細胞を集め、該細胞を洗浄した後に、超音波破砕機、フレンチプレス、マントンガウリンホモゲナイザー、ダイノミル等により細胞を破砕し、無細胞抽出液を得る。
該無細胞抽出液を遠心分離することにより得られた上清から、溶媒抽出法、硫安等による塩析法脱塩法、有機溶媒による沈殿法、ジエチルアミノエチル(DEAE)−セファロース、DIAION HPA−75(三菱化成社製)等レジンを用いた陰イオン交換クロマトグラフィー法、S−Sepharose FF(Pharmacia社製)等のレジンを用いた陽イオン交換クロマトグラフィー法、ブチルセファロース、フェニルセファロース等のレジンを用いた疎水性クロマトグラフィー法、分子篩を用いたゲルろ過法、アフィニティークロマトグラフィー法、クロマトフォーカシング法、等電点電気泳動等の電気泳動法等の手法を用い、精製標品を得ることができる。
また、該ポリペプチドが細胞内に不溶体を形成して発現した場合は、同様に細胞を回収後破砕し、遠心分離を行うことにより得られた沈殿画分より、通常の方法により該ポリペプチドを回収後、該ポリペプチドの不溶体をポリペプチド変性剤で可溶化する。該可溶化液を、ポリペプチド変性剤を含まないあるいはポリペプチド変性剤の濃度がポリペプチドが変性しない程度に希薄な溶液に希釈、あるいは透析し、該ポリペプチドを正常な立体構造に構成させた後、上記と同様の単離精製法により精製標品を得ることができる。
本発明のポリペプチドあるいはその糖修飾体等の誘導体が細胞外に分泌される場合には、培養上清に該ポリペプチドあるいはその糖鎖付加体等の誘導体を回収することができる。即ち、該培養物を上記と同様の遠心分離等の手法により処理することにより可溶性画分を取得し、該可溶性画分から、上記と同様の単離精製法を用いることにより、精製標品を得ることができる。
また、本発明のポリペプチドを他のポリペプチドとの融合ポリペプチドとして生産し、融合したポリペプチドに親和性をもつ物質を用いたアフィニティークロマトグラフィーを利用して精製することもできる〔山川彰夫,実験医学,13,469−474(1995)〕。例えば、ロウらの方法〔Proc.Natl.Acad.Sci.USA,86,8227(1989)、Genes Develop.,4,1288(1990)〕、特開平05−336963、特開平06−823021に記載の方法に準じて、本発明のポリペプチドをプロテインAとの融合ポリペプチドとして生産し、イムノグロプリンGを用いるアフィニティークロマトグラフィーにより精製することができる。また、本発明のポリペプチドをFLAGペプチドとの融合ポリペプチドとして生産し、抗FLAG抗体を用いるアフィニティークロマトグラフィーにより精製することができる〔Proc.Natl.Acad.Sci.USA,86,8227(1989)、Genes Develop.,4,1288(1990)〕。
更に、該ポリペプチド自身に対する抗体を用いたアフィニティークロマトグラフィーで精製することもできる。
また、本発明のポリペプチドは、Fmoc法(フルオレニルメチルオキシカルボニル法)、tBoc法(t−ブチルオキシカルボニル法)等の化学合成法によっても製造することができる。また、Advanced ChemTech社、Perkin−Elmer社、Amersham Pharmacia Biotech社、Protein Technology Instrument社、Synthecell−Vega社、PerSeptive社、島津製作所等のペプチド合成機を利用して化学合成することもできる。
形質転換体を培養して培養液を回収し、本発明のポリペプチドのヘパリン結合能を利用し、ヘパリン・アフィニティーカラムを用いて本発明のポリペプチドを精製することが可能である。ヘパリン・アフィニティーカラムとしては例えばハイトラップ(HiTrap)ヘパリンカラム(Amersham Pharmacia Biotech AB社製)、ヘパリンセファロースCL−6B(アマシャム・ファルマシア・バイオテク社製)等を用いることができる。カラムに本発明のポリペプチドを結合させ緩衝液で洗浄後、緩衝液を用いて溶出させ、一定量ずつ分画しながら回収し、本発明のポリペプチドを含有する分画だけを集めることにより、本発明のポリペプチドを精製することができる。
精製した本発明のポリペプチドの構造解析は、蛋白質化学で通常用いられる方法、例えば遺伝子クローニングのためのタンパク質構造解析(平野久著、東京化学同人発行、1993年)に記載の方法により実施可能である。
本発明のヘパリン結合能をもつポリペプチドは、上記のように該ポリペプチドをコードする本発明のDNAを用いた組換えDNA法により、製造することができるが、別法として、ラミニンα4鎖のGドメインをまず調製した後に、各種プロテアーゼによる分解処理により調製することも可能である。また、該ペプチドについては、ペプチドシンセサイザー等を用いた合成法により簡便に調製することができる。
以下に、本発明のヘパリン結合能をもつラミニンα4鎖由来の部分ポリペプチドのプロテアーゼ処理および合成法による調製、該ポリペプチドのヘパリン結合能の解析法について具体的に記す。
(1)ラミニンα4鎖のGドメインの大量調製
ラミニンα4鎖のGドメイン(以下、「α4G」と表わす。)のin vitroでの解析のためには、他のラミニンα鎖サブタイプを含まない高純度のラミニンα4Gを大量に調製し、解析する必要がある。そのためには、α4GをコードするDNAを用いた遺伝子組換え法によりα4G(マウスα4G:配列番号1、ヒトα4G:配列番号2)のみを動物細胞で大量に発現させ、そこから精製する方法が好ましい。
α4GをコードするDNAは、RT−PCRにより取得できる。すなわちα4鎖を大量に発現している臓器たとえば心臓、肺、骨格筋、胎盤等のRNAからオリゴdTプライマーと逆転写酵素を用いてcDNAを合成し、このcDNAを鋳型にして、マウスおよびヒトのα4鎖のcDNAの塩基配列から設計したα4Gをコードする部分の塩基配列に対応するプライマーを用いてPCRを行うことにより得られる。α4鎖のcDNAの塩基配列は、ヒト、マウスとも公知である〔マウスα4:GenBankアクセス番号U59865、Matrix Biol.,15,433(1996)、J.Biol.Chem.,272,27862(1997)、ヒトα4:GenBankアクセス番号X76939、Eur.J.Biochem.,238,813(1996)〕。
α4Gは、上述した方法に従って、マウスおよびヒトのα4GをコードするDNAを発現用ベクターに挿入して構築した発現プラスドを宿主細胞に導入して、α4Gのみを大量に分泌発現する形質転換体を取得し、その形質転換体を培養することにより生産させることができる。
(2)α4Gの部分ポリペプチドおよび部分ペプチドの調製
α4Gをαキモトリプシンやトリプシン等のエンドプロテアーゼで処理することによりα4Gを断片化することができる。また、α4Gのアミノ酸配列のデータに基づいてペプチド合成機を用いて固相化学合成をすることにより、任意の位置および長さのα4Gの部分ペプチドを得ることが可能である。このようにして得られたα4G部分ポリペプチドおよび部分ペプチドについて、(3)に述べるヘパリン結合能の測定を行い、ヘパリン結合能を有する部分ポリペプチドを選択する。
ヘパリン結合能を有するα4G部分ポリペプチドとしては、例えば、マウスα4Gのキモトリプシン分解により得られるN末端のアミノ酸配列がLys Phe Leu Glu Gln Lys Alaである39kDaおよび44kDaのポリペプチド、N末端のアミノ酸配列がThr Gln Ser Arg Ala Ala Serである41kDaのポリペプチド、マウスα4Gのトリプシン分解により得られる45kDaおよび40kDaのポリペプチド、N末端のアミノ酸配列がAla Ile Glu His Ala Tyr Glnである23kDaおよび35kDaのポリペプチド、配列番号3、4または6に示すアミノ酸配列を有するポリペプチド、またはα4GのモジュールLG4を含むポリペプチドなどを挙げることができる。
ヘパリン結合能を有するα4Gの部分ペプチドとして配列番号17または33に示すアミノ酸配列を含むペプチドを挙げることができる。
(3)α4Gの部分ポリペプチド、部分ペプチドの改変体の調製
ヘパリン結合能を有するポリペプチドとして、上記に挙げたラミニンα4鎖由来のヘパリン結合性ポリペプチドが有するアミノ酸配列において1以上のアミノ酸が欠失、置換および/または付加されたアミノ酸配列からなり、かつヘパリン結合能を保持したポリペプチドを挙げることができる。
上記ポリペプチドの有するアミノ酸配列において1以上のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなり、かつヘパリン結合能を有するポリペプチドは、モレキュラー・クローニング第2版、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー、Nucleic Acids Research,10,6487(1982)、Proc.Natl.Acad.Sci.USA,79,6409(1982)、Gene,34,315(1985)、Nucleic Acids Research,13,4431(1985)、Proc.Natl.Acad.Sci.USA,82,488(1985)等に記載の部位特異的変異導入法を用いて、例えば、上記の配列番号で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするDNAに部位特異的変異を導入することにより、取得することができる。
欠失、置換もしくは付加されるアミノ酸の数は特に限定されないが、上記の部位特異的変異法等の周知の方法により欠失、置換もしくは付加できる程度の数であり、1個から数10個、好ましくは1〜20個、より好ましくは1〜10個、さらに好ましくは1〜5個である。
上記部位特異的変異法により改変されたポリペプチドにおいて、改変前のヘパリン結合能を有するポリペプチドとしては、改変前のポリペプチドが有するアミノ酸配列と、BLAST〔J.Mol.Biol.,215,403(1990)〕やFASTA〔Methods in Enzymology,183,63(1990)〕などの解析ソフトで計算したときに、少なくとも60%以上の相同性を有するポリペプチド、好ましくは70%以上、より好ましくは80%以上、さらに好ましくは90%以上、特に好ましくは95%以上、最も好ましくは97%以上の相同性を有しているポリペプチドを挙げることができる。
尚、本明細書に記載される相同性の数値は、特に明示した場合を除き、当業者に公知の相同性検索プログラムを用いて算出される数値であってよいが、好ましくはBLASTやFASTAにおいてデフォルト(初期設定)のパラメータを用いて算出される数値である。
(4)糖鎖を付加または欠損させたα4Gの部分ポリペプチド、部分ペプチドの調製
ラミニンα4鎖のGドメイン中にはN結合型糖鎖が付加される部位が複数存在することから、ヘパリン結合能を有するポリペプチドとして、N結合型糖鎖を付加または欠損させた上記ポリペプチドを挙げることができる。
上記ポリペプチドにN結合型糖鎖を付加させるには、例えば、糖鎖付加能力を有する真核細胞を宿主として、上記ポリペプチドをコードするDNAを含む発現プラスミドを導入した組換え細胞体を作製し、その組換え細胞を培養して、上記ポリペプチドを製造する方法が挙げられる。一方、上記ポリペプチドのN結合型糖鎖を欠損させるには、糖鎖付加能力を有さない宿主細胞、またはN結合型糖鎖の合成に関与する糖転移酵素を欠損させることにより糖鎖付加能力が無くなった真核細胞を宿主として製造することができる。また、N結合型糖鎖の分解酵素により糖鎖を分解することにより製造することもできる。N結合型糖鎖の分解酵素として、例えば、ツニカマイシンやN−グルコシダーゼが挙げられる。
(5)ヘパリン結合能の測定
α4Gあるいはα4G部分ポリペプチドおよびα4G部分ペプチド等について、以下のような方法でヘパリン結合能を測定することができる。以下の記載では、測定するα4Gあるいはα4G部分ポリペプチドおよびα4G部分ペプチド等を「測定サンプル」とする。
(5−1)ヘパリン・アフィニティーカラムを使用する方法
ハイトラップ・ヘパリンカラム(Amersham Pharmacia Biotech AB社製)等のヘパリン・アフィニティーカラムに、測定サンプルを繰り返し通して結合させた後、NaClの直線濃度勾配の緩衝液を一定の流速でカラムに通すことにより溶出させ、一定量ずつ分画しながら回収する。各画分についてSDSポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS−PAGE)を行い、クマージー・ブリリアント・ブルー(CBB)染色あるいは測定サンプルと特異的に結合できる抗体を用いたイムノブロット法により、各分画に含まれる測定サンプルを検出し、ヘパリンと解離する塩濃度を算出する。解離塩濃度が高いほどヘパリンとの結合性が強いと判断できる。
(5−2)固相化ヘパリンを使用する方法
抗原の検出に用いられるサンドイッチELISA法と同様な手法で、プレートに抗体のかわりにヘパリンを固定化することにより、ヘパリンと結合した測定サンプルを検出することができる。ヘパリンは、マイクロウェルプレートにウシ血清アルブミン(BSA)と結合させたヘパリンの溶液を入れ数時間〜一晩静置することにより固相化できる。BSAやスキムミルク等により非特異的結合をブロック後、測定サンプルの溶液を接触させて結合させ、洗浄後、結合した測定サンプルの量を測定する。
測定サンプルの量は、以下のようにして測定できる。まず溶液中で測定サンプルと特異的に結合できる抗体(1次抗体)を適当な濃度に希釈して添加し、プレート上のヘパリンと結合した測定サンプルと接触させて結合させる。洗浄後、1次抗体を検出できる標識2次抗体、たとえば1次抗体を作製した動物のIgGに対する抗体をホースラディッシュ・パーオキシダーゼやアルカリ・フォスファターゼ等の酵素で標識したもの等を適当な濃度に希釈して添加して、1次抗体と結合させる。洗浄後、2次抗体の標識物に応じた検出法、たとえばホースラディッシュ・パーオキシダーゼの場合はH2O2存在下でo−フェニレンジアミン等の発色基質を反応させて分光光度計で発色量を測定する方法等により、ヘパリンと結合した測定サンプルの検出ができる。
この方法では、測定サンプルの濃度がある濃度以上ではプレート上のヘパリンに結合する量が飽和するので、最終的な発色量等の検出値にも飽和値が存在する。段階的に測定サンプルの濃度を変えて測定し、検出値の飽和値を求めて、その半分の検出値(半飽和値)を与える測定サンプルの濃度を算出する。半飽和値の値が低いほどヘパリンとの結合能が強いと判断できる。
(5−3)ヘパリン固定化ビーズを使用する方法
測定サンプルのヘパリン結合能の強さの比較はできないが、ヘパリン結合能の有無を簡便に測定する方法である。ヘパリンを固定化したビーズと測定サンプルを適当な緩衝液中で接触させて結合させた後、ビーズを洗浄してSDS−PAGE用サンプル緩衝液中に測定サンプルを溶出させる。このSDS−PAGE用サンプル緩衝液でSDS−PAGEを行い、CBB染色あるいは測定サンプルと特異的に結合できる抗体を用いたイムノブロット法により、ヘパリン固定化ビーズに結合した測定サンプルを検出する。
(5−4)α4Gのヘパリン結合の阻害
(1)〜(3)において、α4Gのヘパリン結合能を、α4G以外の測定サンプルを共存させた場合と、α4G以外の測定サンプルを添加しないα4G単独の場合で測定する。両者を比較し、測定サンプルが存在した場合のα4Gのヘパリン結合能が阻害された場合は、測定サンプルはヘパリンと結合能があるといえる。段階的に測定サンプルの濃度を変えて測定し、50%阻害する測定サンプルの濃度を算出する。50%阻害濃度の値が低いほどヘパリンとの結合能が強いと判断できる。
2.本発明のポリペプチドの利用
α4鎖の組織や生体における機能は、細胞外マトリックスにおけるヘパリンとの結合が非常に重要であると考えられる。癌の成長時や脂肪細胞の新生毛細血管との接触構造の形成においては、α4鎖が特異的に関与すると考えられるので、本発明のヘパリン結合能を有するα4Gを含むポリペプチド、α4G部分ポリペプチドまたはα4G部分ペプチドが細胞外マトリックスにおけるヘパリンとの結合を阻害する場合、これらは細胞と毛細血管との接触を阻害し、血管の新生を阻害し、癌の成長を阻害すると考えられる。また、α4鎖のヘパリンとの結合部位の解析、例えばそのアミノ酸配列や高次構造の解析等は、細胞と毛細血管との接触の阻害剤、血管新生阻害剤あるいは抗癌剤のドラッグデザインに役立つと考えられる。
細胞と毛細血管の接触、血管新生が関与する疾患としては、固形癌、癌の転移、糖尿病性網膜症、未熟児網膜症、加齢黄班変性症、血管新生緑内症、慢性関節リウマチ、または乾せん等が挙げられ、本発明のポリペプチドは、該疾患に対する医薬として利用できる。
ヘパリン結合能を有するα4G、α4G部分ポリペプチド、α4G部分ペプチドは、細胞外マトリックスにおいてα4鎖とヘパリンの結合を阻害し、ヘパリン結合性の因子の遊離をもたらす。したがって細胞に外からヘパリン結合能を有するα4G、α4G部分ポリペプチド、α4G部分ペプチドを投与することによりヘパリン結合性の情報伝達分子の濃度勾配形成あるいはシグナル伝達を阻害することができる。ヘパリン結合性の情報伝達分子としてはWntやFGFの他、HB−EGF(Heparin−binding epidermal growth factor)、PDGF(Platelet−derived growth factor)BMP(Bone morphogenic protein)、GM−CSF(Granulocyte−macrophage colony stimulating factor)、HGF(Hepatocyte growth factor)、ケモカイン、TNF(Tumor necrosis factor)等を挙げることができる。これら情報伝達分子の濃度勾配形成やシグナル伝達を阻害することにより細胞の分化や増殖を阻害することができる。
ヘパリン結合能を有する、α4Gを含むポリペプチド、α4G部分ポリペプチドを含むポリペプチドまたはα4G部分ペプチドを含むポリペプチドを含有する医薬製剤は、活性成分として該ポリペプチドを単独で、あるいは任意の他の治療のための有効成分との混合物として含有することができる。また、それらの医薬製剤は、活性成分を薬理学的に許容される一種あるいはそれ以上の担体と一緒に混合し、製剤学の技術分野においてよく知られる任意の方法により製造される。
投与経路は、治療に際し最も効果的なものを使用するのが望ましく、経口または、例えば静脈内などの非経口をあげることができる。
投与形態としては、錠剤、散剤、顆粒剤、シロップ剤、注射剤などがある。
経口投与に適当な、例えばシロップ剤のような液体調製物は、水、ショ糖、ソルビトール、果糖などの糖類、ポリエチレングリコール、プロピレングリコールなどのグリコール類、ごま油、オリーブ油、大豆油などの油類、p−ヒドロキシ安息香酸エステル類などの防腐剤、ストロベリーフレーバー、ペパーミントなどのフレーバー類などを添加剤として用いて製造できる。また、錠剤、散剤および顆粒などは、乳糖、ブドウ糖、ショ糖、マンニトールなどの賦形剤、デンプン、アルギン酸ナトリウムなどの崩壊剤、ステアリン酸マグネシウム、タルクなどの滑沢剤、ポリビニルアルコール、ヒドロキシプロピルセルロース、ゼラチンなどの結合剤、脂肪酸エステルなどの界面活性剤、グリセリンなどの可塑剤などを添加剤として用いて製造できる。
非経口投与に適当な製剤は、好ましくは受容者の血液と等張である活性成分を含む滅菌水性剤からなる。例えば、注射剤の場合は、塩溶液、ブドウ糖溶液、または塩溶液とブドウ糖溶液の混合物からなる担体などを用いて注射用の溶液を調製する。
また、これらの非経口剤においても経口剤で例示した、糖類、グリコール類、油類、防腐剤、フレーバー類、賦形剤、崩壊剤、添加剤、滑沢剤、結合剤、界面活性剤、可塑剤などから選択される1種もしくはそれ以上の補助成分を添加することもできる。
ヘパリン結合能を有する、α4Gを含むポリペプチド、α4G部分ポリペプチドを含むポリペプチドまたはα4G部分ペプチドを含むポリペプチドの投与量または投与回数は、投与形態、患者の年齢、体重、治療すべき症状の性質もしくは重篤度により異なるが、通常経口の場合、成人1人当たり1μg〜1gを1日1回ないし数回投与する。静脈内投与などの非経口投与の場合、成人1人当たり0.1μg〜100mgを1日1回ないし数回投与する。しかしながら、これら投与量および投与回数に関しては、前述の種々の条件により変動する。
3.本発明のDNAまたは組換え体DNAの医薬としての利用
本発明のDNAを含有するウイルスベクターを用いた遺伝子治療剤は、組換えウイルスベクターおよび遺伝子治療剤に用いる基剤を調合することにより製造することができる〔Nature Genet.,8,42(1994)〕。
本発明のDNA断片をウイルスベクター内のプロモーターの下流に挿入することにより、組換えウイルスベクターを造成する。
該組換えウイルスベクターを、該ベクターに適合したパッケージング細胞に導入する。
パッケージング細胞としては、対応する組換えウイルスベクターにおいて欠損しているウイルスのパッケジーングに必要な遺伝子がコードするポリペプチドを補給できる細胞は全て用いることができ、例えば下記ポリペプチドを発現したヒト腎臓由来のHEK293細胞やマウス繊維芽細胞NIH3T3などを用いることができる。
パッケージング細胞で補給するポリペプチドとしては、レトロウイルスベクターの場合はマウスレトロウイルス由来のgag,pol,envなどのポリペプチドが、レンチウイルスベクターの場合はHIVウイルス由来のgag,pol,env,vpr,vpu,vif,tat,rev,nefなどのポリペプチド、アデノウイルスベクターの場合はアデノウイルス由来のE1A・E1Bなどのポリペプチドが、アデノ随伴ウイルスの場合はRep(p5,p19,p40),Vp(Cap)などのポリペプチドが、センダイウイルスの場合はNP、P/C、L、M、F、HNなどのポリペプチドが挙げられる。
ウイルスベクターとしては上記パッケージング細胞において組換えウイルスが生産でき、標的細胞で本発明のDNAを転写できる位置にプロモーターを含有しているものが用いられる。プラスミドベクターとしてはMFG〔Proc.Natl.Acad.Sci.USA,92,6733−6737(1995)〕、pBabePuro〔Nucleic Acids Res.,18,3587−3596(1990)〕、LL−CG、CL−CG、CS−CG、CLG〔Journal of Virology,72,8150−8157(1998)〕、pAdex1〔Nucleic Acids Res.,23,3816−3821(1995)〕等が用いられる。
プロモーターとしては、ヒト組織中で発現できるものであればいずれも用いることができ、例えば、サイトメガロウイルス(ヒトCMV)のIE(immediate early)遺伝子のプロモーター、SV40の初期プロモーター、レトロウイルスのプロモーター、メタロチオネインプロモーター、ヒートショックタンパク質プロモーター、SRαプロモーター等を挙げることができる。また、ヒトCMVのIE遺伝子のエンハンサーをプロモーターと共に用いてもよい。
パッケージング細胞への組換えウイルスベクターの導入法としては、例えば、リン酸カルシウム法(特開平2−227075号公報)、リポフェクション法〔Proc.Natl.Acad.Sci.USA,84,7413(1987)〕等を挙げることができる。
本発明のDNAを含有するウイルスベクターを用いた遺伝子治療剤は、細胞と毛細血管の接触を伴う疾患、血管新生が関与する疾患などの治療または予防のための医薬として利用することができる。
細胞と毛細血管の接触、血管新生が関与する疾患としては、癌、癌の転移、糖尿病性網膜症、未熟児網膜症、加齢黄班変性症、血管新生緑内症、慢性関節リウマチ、または乾せん等が挙げられ、本発明のDNAまたは組換え体DNAは、該疾患に対する医薬として利用できる。
遺伝子治療剤に用いる基剤としては、通常注射剤に用いる基剤であればどのようなものでもよく、蒸留水、塩化ナトリウムまたは塩化ナトリウムと無機塩との混合物等の塩溶液、マンニトール、ラクトース、デキストラン、グルコース等の糖溶液、グリシン、アルギニン等のアミノ酸溶液、有機酸溶液又は塩溶液とグルコース溶液との混合溶液等があげられる。また常法に従い、これらの基剤に浸透圧調整剤、pH調整剤、ゴマ油、ダイズ油等の植物油又はレシチンもしくは非イオン界面活性剤等の界面活性剤等の助剤を用いて、溶液、懸濁液、分散液として注射剤を調製してもよい。これらの注射剤を、粉末化、凍結乾燥等の操作により用時溶解用製剤として調製することもできる。本発明の遺伝子治療剤は、液体の場合はそのままで、個体の場合は必要により滅菌処理をした上記の基剤に遺伝子治療の直前に溶解して治療に使用することができる。本発明の遺伝子治療剤の投与方法としては、患者の治療部位に吸収されるように、局所的に投与する方法を挙げることができる。
適当なサイズの本発明のDNAを、アデノウイルス・ヘキソン・タンパク質に特異的なポリリジン−コンジュゲート抗体と組み合わせてコンプレックスを作製し、得られたコンプレックスをアデノウイルスベクターに結合させることにより、ウイルスベクターを調製することができる。該ウイルスベクターは安定に標的細胞に到達し、エンドソームにより細胞内に取り込まれ、細胞内で分解され効率的に遺伝子を発現させることができる。
該DNAは、非ウイルス遺伝子移入法によっても病巣に輸送することができる。
当該分野で公知の非ウイルス遺伝子移入法には、リン酸カルシウム共沈法〔Virology,52,456−467(1973);Science,209,1414−1422(1980)〕、マイクロインジェクション法〔Proc.Natl.Acad.Sci.USA,77,5399−5403(1980);Proc.Natl.Acad.Sci.USA,77,7380−7384(1980);Cell,27,223−231(1981);Nature,294,92−94(1981)〕、リポソームを介した膜融合−介在移入法〔Proc.Natl.Acad.Sci.USA,84,7413−7417(1987);Biochemistry,28,9508−9514(1989);J.Biol.Chem.,264,12126−12129(1989);Hum.Gene Ther.,3,267−275(1992);Science,249,1285−1288(1990);Circulation,83,2007−2011(1992)〕あるいは直接DNA取り込みおよび受容体−媒介DNA移入法〔Science,247,1465−1468(1990);J.Biol.Chem.,266,14338−14342(1991);Proc.Natl.Acad.Sci.USA,87,3655−3659(1991);J.Biol.Chem.,264,16985−16987(1989);BioTechniques,11,474−485(1991);Proc.Natl.Acad.Sci.USA,87,3410−3414(1990);Proc.Natl.Acad.Sci.USA,88,4255−4259(1991);Proc.Natl.Acad.Sci.USA,87,4033−4037(1990);Proc.Natl.Acad.Sci.USA,88,8850−8854(1991);Hum.Gene Ther.,3,147−154(1991)〕等を挙げることができる。
リポソームを介した膜融合−介在移入法ではリポソーム調製物を標的とする組織に直接投与することにより、当該組織の局所的な遺伝子の取り込みおよび発現が可能であることが癌に関する研究において報告されている〔Hum.Gene Ther.,3,399−410(1992)〕。従って同様の効果が本発明のDNAおよびポリペプチドが関与する疾患病巣でも期待される。DNAを病巣に直接ターゲッティングするには、直接DNA取り込み技術が好ましい。受容体−媒介DNA移入は、例えば、ポリリジンを介して、タンパク質リガンドにDNA(通常、共有的に閉環したスーパーコイル化プラスミドの形態をとる)をコンジュゲートすることによって行う。リガンドは、標的細胞または組織の細胞表面上の対応するリガンド受容体の存在に基づいて選択する。当該リガンド−DNAコンジュゲートは、所望により、血管に直接注射することができ、受容体結合およびDNA−タンパク質コンプレックスの内在化が起こる標的組織に指向し得る。DNAの細胞内破壊を防止するために、アデノウイルスを同時感染させて、エンドソーム機能を崩壊させることもできる。
本発明のDNAまたは該DNAを含む組換え体DNA等を含有する上記の遺伝子治療剤を、細胞へ導入し、該DNAにコードされるポリペプチドを発現させることにより、細胞と細胞外マトリックスとの結合、細胞と毛細血管の接触、血管新生、細胞の増殖、分化、癌の成長、あるいは癌の転移などを制御することができる。
さらに、Wnt1、FGF(Fibroblast growth factor)、HB−EGF(Heparin−binding epidermal growth factor)、PDGF(Platelet−derived growth factor)、BMP(Bone morphogenic protein)、GM−CSF(Granulocyte−macrophage colony stimulating factor)、HGF(Hepatocyte growth factor)、ケモカイン、TNF(Tumor necrosis factor)などのヘパリン結合性の情報伝達分子を細胞から遊離させたり、上記ヘパリン結合性情報伝達分子の濃度勾配形成あるいはシグナル伝達を阻害することができる。これら情報伝達分子の濃度勾配形成やシグナル伝達を阻害することにより細胞の分化や増殖を阻害することができる。
発明を実施するための最良の形態
以下に実施例を挙げて、本発明を具体的に説明する。但し、これらの実施例は説明のためのものであり、本発明の技術的範囲を限定するものではない。
〔実施例1〕 マウスα4Gのヘパリン結合能
(1)マウスα4Gの動物細胞での発現
宿主となるジヒドロ葉酸デヒドロゲナーゼ(dhfr)遺伝子欠損チャイニーズ・ハムスター卵巣細胞株CHO DG44〔Cell,33,405(1983)〕を、核酸含有α−MEMに10%ウシ胎児血清および抗生物質を添加した培地で培養し維持した。
λZAP II(Stratagene社製)をベクターにしたマウス心臓cDNAライブラリーを作製し、マウスラミニンα4鎖cDNA断片〔Matrix Biol.,16,223(1997)〕をプローブにして、プラークハイブリダイゼーションにより選択したポジティブクローンをイン・ビボ・エクシジョン(in vivo excision)によりプラスミドに変換し、マウスラミニンα4鎖のcDNAクローンpA4−3(配列番号34の4261番目以降およびpoly Aに相当する1.4kbのcDNAを有する。配列番号34は、Matrix Biol.,15,433(1996)の記載に基づくマウスラミニンα4鎖cDNAの塩基配列)、pA4−8(配列番号34の3658〜5021番めに相当する1.4kbのcDNAを有する)、pA4−14(配列番号34の2714〜4611番めに相当する1.9kbのcDNAを有する)、pA4−15(配列番号34の840〜3315番目に相当する2.5kbのcDNAを有する)を単離した。
このcDNAクローンから、プラスミドpEFΔβ1S〔FEBS.Lett.,400,71(1997)〕を利用し、以下のようにして、ラミニンα4G(マウスラミニンα4鎖の833Gly〜1815Alaの領域)発現用プラスミドpEFα4Gmycを作製した。pEFΔβ1Sは、EF−1(elongation factor−1)プロモーター、開始コドン、分泌発現のためのエリスロポエチンのシグナルペプチドをコードする配列、クローニングサイト、抗c−myc抗体で発現蛋白を検出するためのmycタグペプチドをコードする配列、終止コドン、ネオマイシン耐性遺伝子発現ユニット、SV40複製オリジン、大腸菌内での複製オリジンとアンピシリン耐性遺伝子発現ユニットを有する動物細胞での外来遺伝子発現型のプラスミドである。
pA4−8の0.7kbのEcoRI−XbaI断片と、pA4−14の1.4kbのSacI−EcoRI断片を、EcoRIでつなげるようにしてプラスミドpBluescript SKII(+)(Stratagene社製)のSacI/XbaIサイト間に挿入し、プラスミドpBSA4Sac/Xbaを作製した。また、pA4−3を鋳型にして5’端にEcoRVサイトを有するリバースプライマーを用いてPCRを行うことにより、3’端にEcoRVサイトを有し、マウスラミニンα4cDNAの4954〜5445番目に相当する配列を増幅し、単離した。この断片をXbaIとEcoRVで切断し、pBSA4Sac/XbaのXbaI/EcoRVサイト間に挿入することにより、pBSA4Sac/EcoRVを作製した。また、pA4−15を鋳型にして5’端にSmaIサイトを有するフォワードプライマーを用いてPCRを行うことにより、5’端にSmaIサイトを有する配列番号34の2497〜2758番目に相当する配列を増幅し、単離した。この断片をSmaIとSacIで切断したものと、pBSA4Sac/EcoRVのSacI−EcoRV断片を、SacIでつなげるようにしてベクターpEFΔβ1SのSmaI/EcoRVサイト間に挿入することにより、pEFα4Gmycを作製した。作製後、挿入断片の塩基配列(配列番号34の2497〜5445番目に相当する)を確認した。
pEFα4Gmycは、α4GのC末端にmycタグペプチドの配列が付加したポリペプチドを、エリスロポエチンのシグナルペプチドを利用して、EF−1プロモーターの制御下で分泌発現できるプラスミドである。
また、対照用としてマウスラミニンα1鎖のGドメイン(ラミニンα1鎖の2100Ile〜3060Proの領域、以下α1Gとする)をコードするDNA断片をマウス胚性癌細胞株F9(ATCC CRL−1720)から抽出したRNAを鋳型にして、5’端にBamHIサイトを有するフォワードプライマーおよび5’端にEcoRVサイトを有するリバースプライマーを用いたRT−PCRにより増幅し、BamHIとEcoRVで処理後、pEFΔβ1SのBamHI/EcoRVサイト間に挿入することにより、pEFα1Gmyc作製した。pEFα1Gmycは、pEFα4Gmycと同様に、α1GのC末端にmycタグペプチドの配列が付加したポリペプチドを、エリスロポエチンのシグナルペプチドを利用して、EF−1プロモーターの制御下で分泌発現できるプラスミドである。図1にpEFα4GmycおよびpEFα1Gmycの構造を示した。
以上のように作製したプラスミドを、それぞれdhfrミニ遺伝子発現用プラスミドpGENSVdhfrと共に、リン酸カルシウム法によりCHO DG44株に導入し、Kaufman RJらの方法〔Mol.Cell.Biol.,9,1233(1989)〕に従って、ネオマイシン耐性を有する安定な形質転換体を確立し、さらにメトトレキセートを添加して培養することにより、dhfr遺伝子と共に導入したα4Gまたはα1Gの遺伝子を増幅させた。遺伝子増幅を行った細胞をクローン化し、各クローンの培養上清中に分泌されたα4Gまたはα1Gを、抗c−myc抗血清(Santa Cruz Biotechnology社製;#sc−789)を用いたドット・イムノアッセイによって検出することにより、α4Gまたはα1Gをそれぞれ大量発現するものを選択し、大量発現クローンとして樹立した。なお、安定な形質転換体を確立した後の細胞培養は、核酸不含α−MEM培地を用いて行った。
(2)発現したα4Gまたはα1Gの解析
樹立されたそれぞれのα4Gまたはα1G発現クローンをディッシュで接着培養したものについて、培養上清を除き、ダルベッコ改変PBSで洗浄した後、10μg/mlツニカマイシン(tunicamycin;N結合型糖鎖合成阻害剤)を含む培地と対照としてツニカマイシンを含まない培地それぞれを添加して、12時間培養した。培養後の細胞と培養上清それぞれについて、SDS−PAGE(12%アクリルアミド)を行った後、抗c−myc抗血清を用いたイムノブロットにより発現したα4Gまたはα1Gを検出した。イムノブロットは以下のようにして行った。まず、ゲルからHybond ECLニトロセルロース膜(Amersham Pharmacia Biotech AB社製)にポリペプチドを転写した。膜に5%(w/v)スキムミルクを含むPBS(イムノブロット・ブロッキング液)を乗せて室温で2時間静置し、非特異的結合のブロッキングを行った。0.1%Tween−20を含むPBS(イムノブロット洗浄液)で5回洗浄した後、イムノブロット・ブロッキング液で1/400に希釈した抗c−myc抗血清と室温で2時間反応させた。イムノブロット洗浄液で洗浄後、イムノブロット・ブロッキング液で1/1000に希釈したホースラディッシュ・パーオキシダーゼ標識抗ウサギIgG(Amersham Pharmacia Biotech AB社製)と室温で1時間反応させ、ECLウェスタン・ブロッティング検出試薬(Amersham Pharmacia Biotech AB社製)を用いて、バンドを検出した。
その結果を図2Aに示した。図2Aの右の4レーンがα4G、左の4レーンがα1Gの発現細胞について、Tun+はツニカマイシン添加、Tun−はツニカマイシン非添加での培養を表している。Mは培養上清、Cは細胞を泳動試料とした場合を示し、左の矢印は分子量マーカーの位置を示している。
ツニカマイシンを含む培地では、ツニカマイシンを含まない通常の培地に比較して、α4Gまたはα1G共に分子量がN結合型糖鎖が付加しないため低下した。また、ツニカマイシンを含まない培地で増加する分子量は、α1Gの方がα4Gよりも顕著であった。これは、N結合型糖鎖が付加しうるアミノ酸残基がα4Gが5ヶ所なのに対し、α1Gでは7ヶ所あるためと考えられる。また、ツニカマイシンによりN結合型糖鎖の合成を阻害した場合、α4Gはほとんど培地中に分泌されなかった。
また、ツニカマイシンを含まない通常の培地で培養したα4Gまたはα1G発現細胞の培養上清について、SDS−PAGEを還元条件〔2%(v/v)2−メルカプトエタノール添加〕と非還元条件(2−メルカプトエタノール非添加)で行った後、同様にイムノブロットによりα4Gまたはα1Gを検出した。
その結果を図2Bに示した。図2Bの左の2レーンは非還元条件、右の2レーンは還元条件でSDS−PAGEを行った場合で、α4Gはα4G発現細胞、α1Gはα1G発現細胞の各培養上清を泳動試料とした。右の矢印は分子量マーカーの位置を示している。
α1Gでは、あまり泳動度に変化がないのに対し、α4Gでは還元条件に比べて非還元条件での泳動度が明らかに増加しており、充分にジスルフィド結合の形成が進行していると考えられた。
(3)α4Gおよびα1Gの精製
(1)で作製したα4Gおよびα1G発現細胞を培養し、それぞれから培養液約500mlを回収した。1000×gで10分間遠心分離することにより細胞の断片等の固形物を除いた後の上清に0.5mmol/lの濃度になるようにN−エチルマレイミド(N−ethylmaleimide)を添加した。この培養上清を3ml/分の流速で、緩衝液A〔10mmol/l Tris−HCl(pH7.4)、150mmol/l NaCl、2mmol/lエチレンジアミン4酢酸(ethylene diamine tetraacetate;EDTA)、0.5mmol/l N−エチルマレイミド〕で平衡化したヘパリン・アフィニティー・カラムであるハイトラップ・ヘパリンカラム(Amersham Pharmacia Biotech AB社製、容量5ml)に通した。出てきた流出液を同じ流速で再度カラムに通すことを5回繰り返し、α4Gまたはα1Gをカラムに確実に結合させた。α4Gあるいはα1Gが結合したカラムをfast performance liquid chromatography(以下、FPLC)システム(Amersham Pharmacia Biotech AB社製)に接続し、30mlの緩衝液Aで洗浄後、NaCl直線濃度勾配150−600mmol/lの緩衝液A150mlを流速0.5ml/分で通すことによりα4Gまたはα1Gを溶出させ、溶出液を2.5mlずつ分画して回収した。
各分画20μlを用いてSDS−PAGE(8%アクリルアミド、還元条件)を行うと共に、各分画の蛋白質濃度を、BSAを標準としたBCA蛋白質アッセイ試薬(Pierce社製)を用いて測定した。その結果を図3に示した。
図3のA、Bはα1Gの発現細胞、C、Dはα4Gの発現細胞の各培養上清についての図である。AとCは各カラム溶出液画分(横軸)の蛋白濃度を示し、点線は溶出液のNaCl濃度(縦右軸)、●は各カラム溶出液画分の蛋白濃度(縦左軸)である。B、Dはその各カラム溶出液画分1つおきのSDS−PAGEの結果を示している。B、Dの横軸の数字はA、Cの横軸の溶出画分の数字と同一であり、Mは分子量マーカーである。縦軸の数字と矢印は分子量マーカーの分子量とバンドの位置を示している。
α1GはNaCl濃度300mmol/lで溶出されたのに対しα4GはNaCl濃度470mmol/lで溶出され、α4Gの方がα1Gよりもヘパリンに対する結合能が強いことが示された。
α4Gまたはα1Gを含む分画を集めて、セントリプレップ(Centriprep)−30(Amicon社製)にかけることにより、濃縮(蛋白質濃度0.4mg/ml以上)と脱塩を行い、精製したα4Gおよびα1Gをそれぞれ約3mgずつ得た。
(4)固相化ヘパリンに対するα4Gおよびα1Gの結合活性
Aumailley Mらの方法〔Eur.J.Biochem.,184,241(1989)〕を一部変更して、固相化ヘパリンに対するα4Gおよびα1Gの結合を測定した。96穴マルチウェルプレート(Nalge Nunc International社製)に10μg/mlのヘパリン−BSA(Sigma−Aldrich社製)を含む緩衝液〔15mmol/l Na2CO3、35mmol/l NaHCO3(pH9.2)、3mmol/l NaN3〕を入れて、4℃で18時間静置することにより、ヘパリンをウェルに固相化した。液を除き、ブロッキング液〔1%(w/v)BSA、50mmol/l Tris−HCl(pH7.4)、150mmol/l NaCl、5mmol/l CaCl2〕を入れて室温で2時間静置して非特異的結合をブロックした後、0.04% Tween−20を含むPBS(10mmol/l Na2HPO4、2mol/l KH2PO4、140mmol/l NaCl、3mmol/l KCl、以降、この0.04%Tween−20含有PBSを「洗浄用緩衝液」と呼ぶ)で5回洗浄した。(1)で得られた精製α4Gおよびα1Gを、ブロッキング液で0.01nmol/l〜1μmol/lに段階的に希釈して、ウェルに入れ、4℃で2時間静置してヘパリンと結合させた。洗浄用緩衝液で5回洗浄した後、抗α4G抗血清(1/1000希釈)または抗α1G抗血清(1/1000希釈)あるいは抗c−myc抗血清(1/400希釈)を反応させた。抗α4G抗血清および抗α1G抗血清は、(1)で得た精製α4Gあるいはα1Gでウサギを免疫して作製した。洗浄用緩衝液で5回洗浄した後、ホースラディッシュ・パーオキシダーゼ標識した抗ウサギIgG抗体(Amersham Pharmacia Biotech AB社製)を反応させた。洗浄後、0.4mg/ml o−フェニレンジアミン二塩酸(Sigma−Aldrich社製)を溶解させた0.01%H2O2を含む50mmol/lリン酸−クエン酸緩衝液を加えてパーオキシダーゼによる発色反応を行い、3mol/l HClを加えて反応を停止させた。波長492nmの吸光度をマイクロプレートリーダー(Bio−Rad Laboratories社製)、モデル3550−UVによって測定することにより、ヘパリンと結合したα4Gおよびα1Gの量を測定した。
その結果を図4に示した。横軸は添加したα4Gまたはα1Gの濃度(nmol/l)、縦軸は492nmの吸光度を示している。●および○はα4Gの結合、▲および△はα1Gの結合を示している。●は抗α4G抗体を、○と△は抗c−myc抗体、▲は抗α1G抗体を検出の1次抗体に用いた場合を示している。
抗α4G抗血清および抗α1G抗血清で検出した場合、α1Gの半飽和(結合量が飽和に達したときの吸光度の半分の値)を与える濃度が14nmol/lなのに対して、α4Gは1.4nmol/lであり、α4Gのヘパリン結合活性はα1Gの約10倍であると考えられた。この値は両者を抗c−myc抗血清を用いて検出した場合にも同様であり、抗血清の反応性による差ではない。このα1Gの半飽和濃度は、Talts JFらによって報告された値とほぼ一致する〔EMBO J.,18,863(1999)〕。
なおα4Gについて、5mmol/l Ca2+存在下で同様の結合測定を行った場合も、半飽和濃度の値はほぼ同じであり、Caイオンはα4Gのヘパリン結合能には影響しなかった。
(5)グリコシダーゼ処理したα4Gのヘパリン結合能
(3)で得た精製α4G溶液(75μg/250μl)にN−グリコシダーゼF(New England BioLabs社製)溶液15μl、10×G7緩衝液〔500mmol/lリン酸ナトリウム緩衝液(pH7.5)〕30μlを添加して37℃で一晩反応させることにより、α4GのN結合型糖鎖を除去した。対照としてN−グリコシダーゼFの代わりに水15μlを添加して同様の条件で反応させたもの(非処理α4G)も調製した。
このグリコシダーゼ処理α4Gについて(2)と同様にしてまず、イムノブロット解析を行った。
その結果を図5Aに示した。図5Aは左からグリコシダーゼ非処理のα4G、グリコシダーゼ処理したα4G、ツニカマイシン非添加のα4G発現細胞、ツニカマイシン添加のα4G発現細胞のSDS−PAGEの結果を示し、左の矢印は分子量マーカーの位置を示している。
グリコシダーゼ処理したα4Gは、対照の非処理のα4Gと比較して分子量が低下しており、この分子量の変化は(2)で行ったツニカマイシン添加によるN結合型糖鎖合成の阻害による分子量の低下と同様であり、N−グリコシダーゼFによりN結合型糖鎖が分解されたと考えられた。
また、該グリコシダーゼ処理α4Gについて(4)と同様にして、固相化ヘパリンに対する結合活性を調べた。
その結果を図5Bに示した。図5Bは固定化ヘパリンに対するグリコシダーゼ処理したα4Gまたはコントロールのグリコシダーゼ非処理のα4Gの結合量を1次抗体として抗c−myc抗体を用いて検出した結果であるが、△はグリコシダーゼ処理したα4G、○はグリコシダーゼ非処理のα4Gの結合量を示し、横軸は添加したα4Gの濃度(nmol/l)、縦軸は492nmの吸光度を示している。
グリコシダーゼ処理したα4Gは、対照の非グリコシダーゼ処理のα4Gと全く同じヘパリン結合能を示し、α4Gのヘパリン結合性にはN結合型糖鎖は関与していないと考えられた。
(6)尿素による変性の影響
ハイトラップ・ヘパリンカラム(Amersham Pharmacia Biotech AB社製、容量1ml)3本を緩衝液B〔10mmol/l Tris−HCl(pH7.4)、2mmol/l EDTA〕で平衡化した後、それぞれに実施例2で得た精製α4Gを0.3mgずつ通してカラムに結合させ、緩衝液B3mlで洗浄した。
1本(カラムA)は緩衝液B3mlを通し、残りの2本(カラムB、C)は8mol/l尿素を含む緩衝液B3mlを通して蛋白質の立体構造を変性させた。それぞれのカラムをFPLCシステムに接続し、カラムAとCはNaCl直線濃度勾配0−800mmol/lの緩衝液B30ml(流速0.1ml/分)でα4Gを溶出させ、カラムBは変性状態のまま溶出させるため8mol/l尿素を含むNaCl直線濃度勾配0−800mmol/lの緩衝液B30mlで溶出させた。それぞれの溶出液は1mlずつ分画して回収し、それぞれに終濃度10%(w/v)になるようにトリクロロ酢酸を添加して、蛋白質を沈殿させた。沈殿した蛋白質をアセトンで洗浄後、SDSサンプル緩衝液に溶解させ、SDS−PAGE(8%アクリルアミド、還元条件)を行った。
その結果を図6に示した。図6のAは、カラム上での尿素による変性を行わず尿素を含まない溶出液で溶出したコントロール、Bはカラム上で8mol/l尿素により変成させ8mol/l尿素を含む溶出液で溶出させた場合、Cはカラム上で8mol/l尿素により変成させ尿素を含まない溶出液で溶出させた場合の各溶出画分のSDS−PAGEの結果を示している。横軸は溶出画分の番号で、点線は各溶出液のNaCl濃度(右縦軸)を示し、最も左のレーンは分子量マーカーで左の矢印と数字は分子量マーカーのバンドの位置と分子量を示している。
カラムBの尿素で変性後に変性状態のまま溶出させたα4Gは、NaCl濃度180mmol/lで溶出がおこり、カラムAの変性させないα4Gの溶出NaCl濃度約400mmol/lと比較して、溶出NaCl濃度が低下していた。
このように尿素による変性はα4Gのヘパリン結合能を低下させることから、α4Gの高いヘパリン結合能には、アミノ酸配列だけでなくその立体構造も重要であると考えられた。また尿素で変性後、溶出時に尿素を除いたCのケースにおける溶出NaCl濃度は、Aのケースと同じになることから、尿素による変性は可逆性であり、尿素を除くことにより立体構造が元に戻り、ヘパリン結合能も回復したと考えられた。
〔実施例2〕 ヘパリン結合能を有するα4G部分ポリペプチド
α4Gをプロテアーゼで断片に切断後、ヘパリン・アフィニティーカラムに結合するα4Gの断片からなる部分ポリペプチドを単離し、構造を解析することにより、α4Gの中でヘパリン結合能を有する領域を特定し、ヘパリン結合能を有する部分ポリペプチドを得ることにした。
(1)α−キモトリプシン分解
実施例1で得た精製α4G1.2mgに、TLCK(n−α−p−tosyl−L−lysine chloromethyl ketone)処理α−キモトリプシン(Sigma C−3142、Sigma−Aldrich社製〕を基質の1/50量添加して、37℃で2時間切断反応させた後、終濃度1mmol/lになるようにプロテアーゼ阻害剤PMSF(phenylmethylsulfonyl fluoride)を添加して反応を停止させた。反応後の溶液を、NaCl濃度150mmol/lの緩衝液Aで平衡化したハイトラップ・ヘパリンカラム(Amersham Pharmacia Biotech AB社製、容量1ml)に乗せた後、5mlの緩衝液Aで洗浄した。FPLCシステムに接続し、NaCl直線濃度勾配150−600mmol/lの緩衝液A30mlで断片を溶出させ、溶出液を1mlずつ分画して回収した。各分画の蛋白質濃度を実施例1(3)と同様にして測定した。
その結果を図7Aに示した。図7Aの●は、各溶出画分(横軸)の蛋白質濃度(左縦軸mg/ml)、点線は、溶出液のNaCl濃度(右縦軸mmol/l)を示している。
大部分の断片はカラムに吸着せず通過画分に出てきたが、NaCl濃度330mmol/l(ピーク1)および480mmol/l(ピーク2)の2つの溶出ピークがあった。これらのピークの分画(ピーク1;画分16,17、ピーク2;画分23,24,25)について実施例1(6)と同様にしてトリクロロ酢酸で蛋白質を沈殿させ、SDS−PAGE(12%アクリルアミド、還元条件)を行った。
その結果を図7Bに示した。図7Bの左はCBB染色による蛋白質の染色、中央は抗LG5ペプチド抗体によるイムノブロット、右は抗c−myc抗体によるイムノブロットの結果を示している。左の矢印は分子量マーカーの位置を示している。
ゲルをCBB R−250(Sigma−Aldrich社製)で染色した結果、低アフィニティーのピーク1には分子量41kDaの1本、高アフィニティーのピーク2には分子量44kDaと39kDaの2本のα4G部分ポリペプチドが存在することがわかった。
SDS−PAGEのゲルを用いて実施例1(2)と同様にして抗c−myc抗体および抗LG5ペプチド抗体を1次抗体としたイムノブロットを行ったところ、高アフィニティーの44kDaの断片は、抗c−myc抗体および抗LG5ペプチド抗体と反応したが、39kDaの断片は抗LG5ペプチド抗体とのみ反応した。また、低アフィニティーの41kDaの断片は、抗c−myc抗体および抗LG5ペプチド抗体のどちらにも反応しなかった。なお、抗LG5ペプチド抗体は化学合成したLG5部分ペプチド(Leu Asp Glu Ser Phe Asn Ile Gly Leu Lys Phe Glu Ile Ala、α4鎖のアミノ酸配列の1652〜1665番目に相当)を抗原としてウサギを免疫として作製した〔Matrix Biol.,16,223(1997)〕。
さらに、Matsudaira Pらの報告〔Matsudaira P.,J.Biol.Chem.,262,10035(1987)〕に基づいて上記のヘパリン結合能をもつα4G部分ポリペプチドのN末端のアミノ酸配列を以下のようにして解析した。SDS−PAGEを行ったゲルから各α4G部分ポリペプチドをPVDF膜に転写し、CBB G−250(Sigma−Aldrich社製)で染色した。分子量44kDa、41kDa、39kDaに相当するバンドを切り出し、ペプチドを膜から溶出させた後、ペプチドシークエンサーを用いて各ペプチドのN末端からのアミノ酸配列を決定した。その結果得られた、低アフィニティーの41kDaの断片のN末端のアミノ酸配列(配列番号7:Thr Gln Ser Arg Ala Ala Ser)はα4鎖の1037Thr以降のアミノ酸配列と一致した。また、高アフィニティーの44kDaと39kDaの断片のN末端のアミノ酸配列(配列番号5:Lys Phe Leu Glu Gln Lys Ala)は1437Lys以降のアミノ酸配列と一致した。この領域はLG3とLG4をつなぐヒンジ領域にあたる。
以上の分子量、抗LG5ペプチド抗体および抗c−myc抗体との反応性、N末端のアミノ酸配列の解析から、低アフィニティーの41kDaの断片は、1037Thr以降のLG2からLG3の前半までにあたる部分のα4G部分ポリペプチドと考えられた。高アフィニティーの44kDaの断片は、1437LysからLG4およびLG5全体とそれに続くmycタグペプチドを含むα4G部分ポリペプチド、高アフィニティーの39kDaの断片は、1437LysからLG4全体およびLG5のC末端部分を除いた大部分(LG5全体の80〜90%)を含むα4G部分ポリペプチドと考えられた。配列番号6に44kDaの断片のmycタグペプチド部分を除いたアミノ酸配列を示した。
(2)トリプシン分解
TPCK処理トリプシン(Sigma T−8642、Sigma−Aldrich社製)を(1)のα−キモトリプシンの代わりに用いて、全く同様に反応を行った。キモトリプシンとトリプシンの切断認識部位は異なるが、やはり2つの溶出ピークが見られ、低アフィニティーのピーク1には分子量45kDaの1本、高アフィニティーのピーク2には分子量40kDaと35kDaの2本のα4G部分ポリペプチドが存在していた。N末端アミノ酸配列分析、抗体とのイムノブロット解析の結果、やはり低アフィニティーのα4G部分ポリペプチドはLG2−LG3の領域、高アフィニティーの2本のα4G部分ポリペプチドはLG4−LG5の領域にあたると推定された。
(3)ヘパリンカラム上でのトリプシン分解
実施例1で得た精製α4G0.4mgをハイトラップ・ヘパリンカラム(Amersham Pharmacia Biotech AB社製、1ml)に結合させ、TPCK処理トリプシン15μgを溶解させた緩衝液〔50mmol/l Tris−HCl(pH7.4)、100mmol/l NaCl、2mmol/l CaCl2〕1mlをカラムにのせ、カラムを37℃で2時間保温して切断反応させた後、FPLCシステムに接続した。6mlの緩衝液Aで洗浄し、NaCl直線濃度勾配150−600mmol/lの緩衝液A25ml、流速0.1ml/分でα4G部分ポリペプチドを溶出させ、溶出液を1mlずつ分画して回収した。実施例1(6)と同様にしてトリクロロ酢酸で蛋白質を沈殿させ、トリシン(tricine)−アクリルアミドゲル電気泳動〔Anal.Biochem.,166,368(1987)〕を行い、CBB G−250で染色した。
その結果を図8Aに示した。図8のAはα4Gをヘパリンカラムに結合させてキモトリプシンで消化後、溶出させたヘパリン結合性を有するトリプシン断片を含む溶出画分(画分18,19,20)のトリシンゲル電気泳動の結果であり、左の矢印は分子量マーカーの位置を示し、下の数字は各溶出画分のNaCl濃度(mmol/l)を示している。
NaCl濃度370〜400mmol/lで溶出される画分には、35kDaおよび23kDaのα4G部分ポリペプチドが検出された。
またイムノブロットの結果を図8Bに示した。図8Bはトリプシン断片の溶出画分を、左から抗c−myc抗体、抗LG5ペプチド抗体、抗α4G抗体を用いたイムノブロットにより検出した結果であり、左の矢印は分子量マーカーの位置を示している。
両者とも抗α4G抗体では検出され、抗c−myc抗体には反応しなかった。また、抗LG5ペプチド抗体には35kDaの断片のみ反応し、23kDaの断片は反応しなかった。
N末端からのアミノ酸配列の解析の結果、両断片ともN末端のアミノ酸配列はAla Ile Glu His Ala Tyr Gln(配列番号8)であり、α4鎖のLG4の開始部分から7アミノ酸残基下流に存在する1457Ala以降の配列と一致していた。23kDaの断片はその分子量と抗LG5ペプチド抗体と反応しないことから、LG4の始めの7アミノ酸を除いたほぼ全体とLG5の開始部分を含むが1652Leu以降のLG5の配列は含まないα4G部分ポリペプチドと推測された。したがって、α4GはLG4が結合部位となって、強いアフィニティーでヘパリンと結合すると考えられた。
なお、この23kDaの断片の溶出NaCl濃度は(1)で得られた高アフィニティーのα4G部分ポリペプチド(LG4−LG5の領域)の溶出NaCl濃度480mmol/lよりも少し低いことから、LG5はLG4のヘパリンへの結合を助けると考えられた。配列番号3にマウスα4GのLG4のアミノ酸配列、配列番号4にヒトα4GのLG4のアミノ酸配列を示した。
〔実施例3〕 ヘパリン結合性ペプチド
LG4からLG5の開始部分の中でさらにヘパリンとの結合能を規定する領域を特定するため、LG4およびLG5の開始部分の中の連続した12アミノ酸残基からなるペプチド24種類(A4G−74、A4G−75、A4G−76、A4G−77、A4G−78、A4G−79、A4G−80、A4G−81、A4G−82、A4G−83、A4G−84、A4G−85、A4G−86、A4G−87、A4G−88、A4G−89、A4G−90、A4G−91、A4G−92、A4G−93、A4G−94、A4G−95、A4G−96、A4G−97)をFmoc法により合成し、Nomizu Mらの方法〔J.Biol.Chem.,273,32491(1998)〕に基づいてHPLCで精製した。これらのペプチドのアミノ酸配列をそれぞれ配列番号9から32に示した。これらのペプチドの純度はHPLCによる分析でアミノ酸配列はイオンスプレー質量分析法により確認した。これらのペプチドのうち、水溶性が悪いA4G−80、A4G−81、A4G−93、A4G−94、A4G−95、A4G−97を除いた18種類のペプチドについて、各ペプチド21μg(約200μmol/l)と実施例2で得た精製α4G 3.4μg(約0.4μmol/l)およびヘパリンセファロースCL−6B(Amersham Pharmacia Biotech AB社製)ビーズ1mgを緩衝液〔Tris−HCl(pH7.4)、100mmol/l NaCl〕70μl中で混合し4℃で1時間おき、ビーズ上のヘパリンにα4Gを結合させた。ビーズをカラムに移し、同緩衝液100μlで3回洗浄後、ビーズにSDSサンプル緩衝液を添加してSDSサンプル緩衝液中にビーズと結合した蛋白を溶出させた。このSDSサンプル緩衝液についてSDS−PAGEを行い、結合したα4Gの量を比較することにより、各ペプチドがα4Gのヘパリン結合性を阻害するかどうかを調べた。
その結果を図9に示した。A4G−82(配列番号17)だけは完全にα4Gのヘパリンへの結合を阻害した。このペプチド以外には、A4G−83が非常に弱い阻害を示しただけで、他のペプチドは阻害を示さなかった。
なお、阻害アッセイを行わなかった6ペプチドのうちA4G−93以外の5ペプチドには塩基性アミノ酸が含まれていないので、これらのペプチドの部位はα4Gのヘパリン結合部位ではないと考えられた。α4鎖の1513Thrから1524Metのアミノ酸配列に対応するA4G−82がα4Gのヘパリンとの結合を阻害したことおよび、ヘパリンが塩基性アミノ酸と結合することから、1518Hisおよび1520Argがα4Gのヘパリン結合部位と推定された。
なお、A4G−82と全く同じアミノ酸組成だが、配列をランダムに変えたペプチドA4G−82S(配列番号35)、A4G−82T(配列番号36)は全く阻害を示さないことから、塩基性アミノ酸残基だけでなく、アミノ酸配列全体が結合に関与していると考えられた。なお、A4G−82のペプチド濃度を20μmol/lまで低下させるとほとんど阻害がみられず、A4G−82がα4Gと同等にヘパリンに結合するためにはα4Gの50倍以上の濃度が必要であった。A4G−82はマウスα4Gの配列由来のペプチドであるが、ヒトα4Gにおいてもその配列相同性から1514Thrから1525Metの配列番号33に示すアミノ酸配列のペプチドはヘパリン結合能を有すると考えられる。
LG4全体においても1518Hisおよび1520Argが結合に重要であることを確認するために、LG4(配列番号3、1453Ser〜1636Pro)、1518HisをAlaに置換したLG4変異体(以下LG4 H1518Aとする)、1520ArgをAlaに置換した変異体(以下LG4 R1520Aとする)を大腸菌で発現させ、それぞれのヘパリン結合性を比較した。
まず、5’にBamHIサイトを付加したフォワードプライマーと5’にEcoRIサイトを付加したリバースプライマーを用いてpEFα4mycに対してPCRを行い、配列番号34の4357番目〜4908番目に相当するLG4断片を増幅し単離した。この断片をグルタチオンSトランスフェラーゼ(GST)との融合蛋白発現ベクターpGEX−3T(Amersham Pharmacia Biotech AB社製)のBamHI/EcoRIサイト間に挿入することにより、GSTとLG4の融合蛋白質の発現プラスミドを作製した。
このプラスミドに対して、配列番号37および38に配列を示したプライマーを用いて、部位特異的変異を行うことによりLG4 H1518AのGSTとの融合蛋白質の発現プラスミドを作製した。また、配列番号39および40に配列を示したプライマーを用いて、部位特異的変異を行うことによりLG4 R1520AのGSTとの融合蛋白質の発現プラスミドを作製した。部位特異的変異は、クイック・チェンジ部位特異的変異キット(Quick Change Site−Directed Mutagenesis Kit;Stratagene社製)により行った。
これらのプラスミドおよびコントロールのpGEX−3Tで大腸菌を形質転換し、培養することによりLG4、LG4H1518A、LG4R1520Aの各GSTとの融合蛋白質およびコントロールのGSTを大腸菌の細胞中に発現させた。培養後の大腸菌を緩衝液〔10mmol/l Tris−HCl(pH7.4)、2mmol/l EDTA〕中で超音波破砕し、得られた細胞破砕液5mlを、同緩衝液0.5mlで平衡化したヘパリンセファロースCL−6Bカラムに通し、LG4、LG4H1518A、LG4R1520Aの各GSTとの融合蛋白質を結合させた後、同緩衝液5mlで洗浄した。カラムにNaCl濃度を100、200、400、500、600、1000mmol/lと段階的に上げた同緩衝液を5mlずつ通すことにより、結合したLG4、LG4 H1518A、LG4 R1520Aの各GSTとの融合蛋白質をカラムから溶出させた。
細胞破砕液、細胞破砕液のカラム通過後の画分、洗浄液の画分、各NaCl濃度の溶出画分それぞれ10μlについて、LG4、LG4 H1518A、LG4 R1520Aは抗α4G抗体、GSTは抗GST抗体(大腸菌で発現させたGSTを抗原としてウサギを免疫して作製した抗血清)を用いてイムノブロットによりそれぞれの蛋白質を検出した。
その結果を図10に示した。上段から、GSTとLG4の融合蛋白、GSTとLG4 R1520Aの融合蛋白、GSTとLG4 H1518Aの融合蛋白、GSTについて、各段の左から各蛋白質を発現させた大腸菌の細胞破砕液、ヘパリンセファロースCL−6Bに通した後の細胞破砕液、洗浄液の画分、NaCl濃度が100、200、400、500、600、1000mmol/lの緩衝液での各溶出画分をSDS−PAGEし、それぞれの蛋白質をイムノブロットで検出した結果を示している。
LG4はNaCl濃度400および500mmol/lで溶出されたのに対し、LG4 H1518Aは細胞破砕液のカラム通過後の画分と洗浄液の画分にしか検出されず、ヘパリン結合性がなくなっていた。また、LG4 R1520AはNaCl濃度100および200mmol/lで溶出され、ヘパリンに対する結合がLG4と比較して弱くなっていた。
なお、コントロールのGSTはヘパリンとの結合能は示さなかった。この結果からLG4のみならずラミニンα4鎖においても1518Hisおよび1520Argがヘパリンとの強い結合能を規定していると考えられた。LG4のGSTとの融合蛋白質の結合性はアフィニティーカラムから溶出する塩濃度からα4Gの44kDaおよび33kDaの断片と同程度であり、35kDaおよび23kDaの断片よりも強いと考えられた。
〔実施例4〕 α4G部分ポリペプチドによるWnt1の遊離
ヘパリン結合能をもつα4G部分ポリペプチドのWnt1の細胞からの遊離に対する影響を検討した。
動物細胞発現用ベクターpMKIT〔J.Biochem.,120,236(1996)〕に、c−mycタグペプチドの配列を付加したマウスWnt1 cDNA〔Cell,39,233(1984)〕を挿入し、Wnt1発現用プラスミドを作製してヒト細胞株293T〔293tsA1607neo;Mol.Cell.Biol.,7,379(1987)〕に導入した。このWnt1発現細胞を10%ウシ胎児血清を含む培地DMEMで1日間培養した後、培地を除いてダルベッコ改変PBSで3回細胞を洗浄し、実施例2(3)で得られたヘパリンに高い結合能を有する23kDaおよび35kDaのα4Gトリプシン断片20nmol/lまたは40nmol/lを含むDMEM(血清を含まない)2mlあるいは2mlのDMEM(血清およびα4G部分ポリペプチドを含まない)を加えて4時間培養した。それぞれの培養後の培地を回収し、終濃度10%(w/v)になるようにトリクロロ酢酸を添加して、蛋白質を沈殿させた。
培養後の細胞はダルベッコ改変PBSで3回洗浄した。沈殿させた培地中の蛋白質および細胞にSDS−PAGE用サンプルバッファーを添加して溶解させ、SDS−PAGE(10%アクリルアミド)を行った後、実施例1(2)と同様に1次抗体としてc−myc抗血清を用いたイムノブロット法により培地中および細胞中のWnt1を検出した。
その結果を図11に示した。図11は、Wnt1発現細胞、ヘパリン結合能を有するα4Gトリプシン断片を20nmol/l(左から3、7番目のレーン)および40nmol/l(左から4、8番目のレーン)添加して培養した場合(+)と添加しなかった場合(−)の、培地中のWnt1をイムノブロット法により検出した結果であり、左の4レーンは培地中、右の4レーンは細胞中のWnt1を示している。
α4G部分ポリペプチド非添加では培地中にWnt1はほとんど検出されなかったのに対し、α4G部分ポリペプチドを添加した場合は20nmol/lおよび40nmol/l共に明らかにWnt1が培地中に検出され、ヘパリン結合能をもつα4G部分ポリペプチドにより細胞からWnt1が遊離することが確認された。なお、細胞中のWnt1については、α4G部分ポリペプチド添加・非添加でほとんど量に変化はみられなかった。
〔実施例5〕 ラミニンα4Gの抗腫瘍活性
実施例1に記載の方法に従い、ラミニンα4Gを精製し、以下の実験に用いた。
(1)皮下腫瘍モデルでの抗腫瘍活性
マウスメラノーマ細胞B16/F10(ATCC番号:CRL1581)5×105細胞をPBS(GIBCO−BRL)またはラミニンα4G(23、115、231μg)と混ぜてC57BL/6ブラックマウス(SPF、オス6〜8週齢、日本クレア社より購入)の右胸部に皮下移植した(各群n=4又は5)。移植後2、3、4、5日目にPBSを混合して移植したマウスにはPBSを、ラミニンα4Gを混合して移植したマウスには移植時と同量のラミニンα4G(23、115、231μg)を尾静注した。移植後4〜6日目より黒色の腫瘍径を経時的に測定した。その結果を図12aに示す。PBS投与群に比べラミニンα4Gの231μg投与群では腫瘍増殖阻害効果が認められた。
(2)肺転移腫瘍モデルでの抗腫瘍活性
マウスメラノーマ細胞B16/F10 2.5×105細胞をPBSまたはラミニンα4G(23、115、231μg)と混ぜてC57BL/6ブラックマウス(SPF、オス6〜8週齢、日本クレア社より購入)に尾静注した(各群n=5)。尾静注後2、3、4、5日目にPBSを尾静注したマウスにはPBSを、ラミニンα4Gを尾静注したマウスには尾静注時と同量のラミニンα4G(23、115、231μg)をさらに尾静注した。最初の尾静注から14日目に肺を摘出し転移腫瘍数を測定した。その結果を図12bに示す。PBS投与群に比べラミニンα4Gの231μg投与群では肺腫瘍転移数の減少が認められた。
〔実施例6〕 ラミニンα4Gによる血管新生および脂肪細胞の誘導の阻害
実施例1に記載の方法に従い、ラミニンα4Gを精製し、以下に記載するマトリゲル・プラーグアッセイに用いた。
マトリゲル(Becton Dickinson社製)0.5mlに150ng/ml b−FGF(Pepro Tech社製)、20U/mlヘパリン(Sigma−Aldrich社製)を混ぜたもの、あるいは、マトリゲル0.5mlに150ng/ml b−FGF、20U/mlヘパリンおよび100μg/ml α4Gを混ぜたものを、それぞれC57BL/6ブラックマウス(SPF、オス6〜8週齢、日本クレア社より購入)の右腹部に皮下投与した。コントロールとして、マトリゲルのみも同様にマウスに投与した。
14日後にマトリゲルを取り出し10%中性ホルマリン緩衝液(ナカライテスク社製)で約12時間固定化操作を行い2〜3mmの切片にした。続いてバキュームロータリーを用いて24時間脱水・パラフィン置換を行い、ヒストエンブダーによりパラフィンブロックを作成した。パラフィンブロックは約2〜3□mに薄切しスライドグラスに伸展させ、ヘマトキシリン・エオジン染色を以下のように行った。まず、切片を伸展させたスライドグラスをキシレンに10分間×2回、100%エタノールに30秒間×2回、95%エタノールに30秒間、70%エタノールに30秒間それぞれ漬けて脱パラフィン処理をした。ついで、流水で5分間洗浄し、ヘマトキシリン(Sigma−Aldrich社製)で1分間染色した後、流水で5分間洗浄し、エオジン(ムトウ社製)で5分間染色した。さらに、70%エタノールに30秒間、95%エタノールに30秒間、100%エタノールに5分間×3回、キシレンに10分間×2回それぞれ漬けて脱水を行った。作成したスライドグラスを検鏡した。
その結果を図13に示す。コントロールのマトリゲルのみを投与したマウスに比べマトリゲルにb−FGFおよびヘパリンを添加して投与したマウスは、マトリゲル中に血管新生及び脂肪細胞が誘導された。マトリゲル、b−FGF、ヘパリンに100μg/ml α4Gを添加して投与したマウスではb−FGFにより誘導されたマトリゲル中の血管新生、及び脂肪細胞の誘導が阻害された。
産業上の利用の可能性
本発明により、ラミニンα4鎖のヘパリン結合能を有するポリペプチドが提供される。本発明のポリペプチドは、α1鎖の約10倍ものヘパリン結合能を有し、ヘパリン結合性の情報伝達分子の濃度勾配形成やシグナル伝達を阻害し、細胞と毛細血管との接触、癌の成長、および細胞の増殖、分化、生存維持を阻害する作用を有する。
配列表フリーテキスト
配列番号35−人工配列の説明:配列番号16と同じアミノ酸組成のランダムな配列
配列番号36−人工配列の説明:配列番号16と同じアミノ酸組成のランダムな配列
配列番号37−人工配列の説明:ラミニンα4鎖のモジュールLG4の1518−HisをAlaに置換する部位特異変異のためのプライマー
配列番号38−人工配列の説明:ラミニンα4鎖のモジュールLG4の1518−HisをAlaに置換する部位特異変異のためのプライマー
配列番号39−人工配列の説明:ラミニンα4鎖のモジュールLG4の1520−ArgをAlaに置換する部位特異変異のためのプライマー
配列番号40−人工配列の説明:ラミニンα4鎖のモジュールLG4の1520−ArgをAlaに置換する部位特異変異のためのプライマー
【配列表】
【図面の簡単な説明】
図1は、pEFα4GmycおよびpEFα1Gmycの構造を示す図である。
図2は、α4Gまたはα1Gを発現させた動物細胞についての、ウェスタン・ブロットによるα4Gおよびα1Gの検出を示す写真である。Aはツニカマイシン添加・非添加で培養した場合の結果であり、Bは非還元条件と還元条件でSDS−PAGEを行った場合の結果を示す写真である。
図3は、α4Gまたはα1Gを発現させた動物細胞の培養上清からヘパリン・アフィニティーカラムによる精製を示す図および写真である。A、Bはα1Gの発現細胞、C、Dはα4Gの発現細胞の各培養上清についての図および写真である。
図4は、固相化ヘパリンに対するα4Gまたはα1Gの結合を示す図である。
図5は、グリコシダーゼ処理がα4Gのヘパリン結合性に及ぼす影響を示す図および写真である。Aはグリコシダーゼ処理、非処理α4G、ツニカマイシン添加、非添加α4G発現細胞のSDS−PAGEの結果を示す写真であり、Bは固定化ヘパリンに対するグリコシダーゼ処理、未処理のα4Gの結合量を1次抗体として抗c−myc抗体を用いて検出した結果を示す図である。
図6は、尿素による変性がα4Gのヘパリン結合性に及ぼす影響を示す写真である。α4Gをヘパリンカラムに結合後、Aはカラム上での尿素による変性を行わず尿素を含まない溶出液で溶出したコントロール、Bはカラム上で8mol/l尿素により変成させ8mol/l尿素を含む溶出液で溶出させた場合、Cはカラム上で8mol/l尿素により変成させ尿素を含まない溶出液で溶出させた場合の各溶出画分のSDS−PAGEの結果を示す写真である。
図7は、ヘパリン結合性を有するα4Gのキモトリプシン断片の単離を示す図および写真である。Aはα4Gをヘパリンカラムに結合させてキモトリプシンで消化後、溶出させた場合で、Bはpeak1(画分16,17)、peak2(画分23,24,25)の画分をSDS−PAGEし蛋白質を検出した写真である。
図8は、ヘパリン結合性を有するα4Gのトリプシン断片の単離を示す写真である。Aはα4Gをヘパリンカラムに結合させてキモトリプシンで消化後、溶出させたヘパリン結合性を有するトリプシン断片を含む溶出画分(画分18,19,20)のトリシンゲル電気泳動の結果であり、Bはトリプシン断片の溶出画分を、左から抗c−myc抗体、抗LG5ペプチド抗体、抗α4G抗体を用いたイムノブロットにより検出した結果を示す写真である。
図9は、α4G部分ペプチドのヘパリン結合性を示す写真である。
図10は、LG4、LG4 R1520A、LG4 H1518Aの各GSTとの融合蛋白質のヘパリン結合性を示す写真である。
図11は、α4G部分ポリペプチドによるWnt1の細胞からの遊離を示す写真である。
図12は、α4Gの抗腫瘍活性を示す図である。aは皮下腫瘍モデルで、●はPBS、▲はα4G 23μg、◆はα4G 115μg、■はα4G 231μgをそれぞれメラノーマ細胞と混合して移植した場合の結果を表す。横軸はメラノーマ細胞移植後の日数、縦軸は形成された腫瘍の容積を示す。グラフ上の棒は標準偏差を示す。bは肺転移腫瘍モデルで、左からPBS、α4G 23μg、α4G 115μg、α4G 231μgをそれぞれ混合して尾静注した場合の結果を表す。縦軸は肺に転移した腫瘍の数を示す。グラフ上の棒は標準偏差を示す。
図13は、α4Gによる血管新生および脂肪細胞の誘導の阻害を示す写真である。上から、マトリゲルのみ、マトリゲルに150ng/ml b−FGFおよび20U/mlヘパリンを添加したもの、マトリゲル、b−FGF、ヘパリンに100μg/ml α4Gを添加したものをそれぞれ移植した場合のマトリゲル・プラーグアッセイの結果を表す。Aは脂肪細胞、Vは血管を示す。
Claims (28)
- ラミニン構成成分α4鎖のモジュールLG4領域に存在するヘパリン結合領域のアミノ酸配列を含む、分子量108kDa以下のポリペプチドまたは該ポリペプチドを含有する融合ポリペプチド。
- ヘパリン結合領域のアミノ酸配列が、配列番号3、4、6、17および33のいずれかに記載のアミノ酸配列である、請求項1記載のポリペプチド。
- ポリペプチドが、ラミニン構成成分α4鎖のモジュールLG4領域、またはLG4およびLG5領域を含むポリペプチドである、請求項1記載のポリペプチド。
- 融合ポリペプチドが、タグペプチド、マーカーペプチド、またはシグナルペプチドより選ばれるペプチドとの融合ポリペプチドである、請求項1記載のポリペプチド。
- タグペプチド、マーカーペプチド、またはシグナルペプチドより選ばれるペプチドが、mycポリペプチド、β−ガラクトシダーゼ、プロテインA、プロテインAのIgG結合領域、クロラムフェニコール・アセチルトランスフェラーゼ、ポリ(Arg)、ポリ(Glu)、プロテインG、マルトース結合ポリペプチド、グルタチオンS−トランスフェラーゼ、ポリヒスチジン鎖、Sペプチド、DNA結合ポリペプチドドメイン、Tac抗原、チオレドキシン、グリーン・フルオレッセント・プロテイン、FLAGペプチド、任意の抗体のエピトープおよび任意の分泌蛋白質のシグナルペプチドからなる群より選ばれるペプチドである請求項4記載のポリペプチド。
- 配列番号3、4、6、17および33のいずれかに記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド。
- 請求項1〜6のいずれか1項に記載のポリペプチドのアミノ酸配列において、1以上のアミノ酸が欠失、置換および/または付加されたアミノ酸配列からなり、マウスラミニンα4鎖の1518番目のヒスチジン残基と1520番目のアルギニン残基に相当する2アミノ酸が保存され、かつヘパリン結合能を有するポリペプチド。
- 請求項1〜7のいずれか1項に記載のポリペプチドのアミノ酸配列と60%以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、マウスラミニンα4鎖の1518番目のヒスチジン残基と1520番目のアルギニン残基に相当する2アミノ酸が保存され、かつヘパリン結合能を有するポリペプチド。
- 請求項1〜8のいずれか1項に記載のポリペプチドをコードするDNA。
- 請求項9に記載のDNAをベクターに組み込んで得られる組換え体DNA。
- 請求項9に記載のDNAまたは請求項10に記載の組換え体DNAを保有する形質転換体。
- 形質転換体が、微生物、動物細胞、植物細胞、および昆虫細胞からなる群より選ばれる形質転換体である、請求項11に記載の形質転換体。
- 形質転換体が、非ヒトトランスジェニック動物またはトランスジェニック植物である、請求項11に記載の形質転換体。
- 請求項11または12に記載の形質転換体を培地に培養し、培養物中に請求項1〜8のいずれか1項に記載のポリペプチドを生成、蓄積させ、該培養物から該ポリペプチドを採取することを特徴とする、該ポリペプチドの製造方法。
- 請求項13に記載の非ヒトトランスジェニック動物またはトランスジェニック植物を生育させ、請求項1〜8のいずれか1項に記載のポリペプチドを該動植物中に生成、蓄積させ、該動植物中より該ポリペプチドを採取することを特徴とする、該ポリペプチドの製造方法。
- 請求項1〜8のいずれか1項に記載のポリペプチドを有効成分として含有してなる医薬。
- 請求項9に記載のDNAまたは請求項10に記載の組換え体DNAを有効成分として含有してなる医薬。
- 細胞と細胞外マトリックスとの結合の阻害作用、細胞と毛細血管との接触の阻害作用、細胞の増殖の阻害作用または細胞の分化の阻害作用を有する請求項16または17に記載の医薬。
- 医薬が癌、または血管新生が関与する疾患の治療および/または予防のための医薬である、請求項16、17または18に記載の医薬。
- 請求項1〜8のいずれか1項に記載のポリペプチドを用いて、細胞からヘパリン結合性の情報伝達分子を遊離させる方法。
- 請求項1〜8のいずれか1項に記載のポリペプチドを用いて、ヘパリン結合性の情報伝達分子の濃度勾配形成またはシグナル伝達を阻害する方法。
- ヘパリン結合性の情報伝達分子がWnt1、FGF(Fibroblast growth factor)、HB−EGF(Heparin−binding epidermal growth factor)、PDGF(Platelet−derived growth factor)、BMP(Bone morphogenic protein)、GM−CSF(Granulocyte−macrophage colony stimulating factor)、HGF(Hepatocyte growth factor)、ケモカインおよびTNF(Tumor necrosis factor)からなる群から選ばれる情報伝達分子である請求項20または21に記載の方法。
- ラミニン構成成分α4鎖のGドメインを含むポリペプチドを有効成分として含有してなる医薬。
- 細胞と細胞外マトリックスとの結合の阻害作用、細胞と毛細血管との接触の阻害作用、細胞の増殖の阻害作用または細胞の分化の阻害作用を有する請求項23に記載の医薬。
- 医薬が癌、または血管新生が関与する疾患の治療および/または予防のための医薬である、請求項23または24に記載の医薬。
- ラミニン構成成分α4鎖のGドメインを含むポリペプチドを用いて、細胞からヘパリン結合性の情報伝達分子を遊離させる方法。
- ラミニン構成成分α4鎖のGドメインを含むポリペプチドを用いて、ヘパリン結合性の情報伝達分子の濃度勾配形成またはシグナル伝達を阻害する方法。
- ヘパリン結合性の情報伝達分子がWnt1、FGF(Fibroblast growth factor)、HB−EGF(Heparin−binding epidermal growth factor)、PDGF(Platelet−derived growth factor)、BMP(Bone morphogenic protein)、GM−CSF(Granulocyte−macrophage colony stimulating factor)、HGF(Hepatocyte growth factor)、ケモカインおよびTNF(Tumor necrosis factor)からなる群から選ばれる情報伝達分子である請求項26または27に記載の方法。
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