JPWO2002048349A1 - ヘパリン結合能を有するポリペプチド - Google Patents

Abstract

ラミニンα４鎖Ｇドメイン中のヘパリン結合能を有するポリペプチドおよび該ポリペプチドを用いる、細胞と毛細血管との接触、癌の成長、ヘパリン結合性の情報伝達分子のシグナル伝達、および細胞の増殖、分化、生存維持を阻害する方法を提供する。

Description

技術分野
本発明は、ヘパリン結合能を有するラミニンα４鎖由来のポリペプチド並びにその使用方法に関する。
背景技術
ラミニンはコラーゲンやプロテオグリカンと共に基底膜の主要な構成成分をなす糖蛋白質であり、コラーゲンやプロテオグリカンと結合して、基底膜の構造を形成すると共に、種々の細胞上の蛋白質およびレセプターと結合し、細胞の接着のみならず増殖、分化、生存維持等に関与していると考えられている。
ラミニンは、α鎖、β鎖、γ鎖の３種類のサブユニットからなるヘテロ三量体であり、またそれぞれのサブユニットにはサブタイプが存在し、現在までに５種類のα鎖（α１〜α５）、３種類のβ鎖（β１〜β３）、３種類のγ鎖（γ１〜γ３）が単離されている。これらの各サブタイプの組み合わせにより２０種類以上のラミニンファミリーが形成されると考えられている。これらのラミニンファミリーは、胚発生時に、それぞれ発現の組織特異性が報告されており〔Ｒｏｈｒｂａｃｈ　ＤＨ　＆　Ｔｉｍｐｌｅ　Ｒ　ｅｄｓ．（１９９３）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ａｎｄ　Ｃｅｌｌｕｌａｒ　Ａｓｐｅｃｔｓ　ｏｆ　Ｂａｓｅｍｅｎｔ　Ｍｅｍｂｒａｎｅｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ、Ｈｏｒｔｏｎ　ＭＡ　ｅｄ．（１９９６）Ａｄｈｅｓｉｏｎ　Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ　ａｓ　Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ　Ｔａｒｇｅｔｓ，ＣＲＣ　Ｐｒｅｓｓ〕、それぞれが独自の機能を持っていると考えられているが、その機能の違いはまだ明らかにはなっていない。
α４鎖〔Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２６４，７２７（１９９７）〕は、他のα鎖サブタイプのＮ末端に存在するドメインが欠失した２００〜２４０ｋＤａの低分子のα鎖サブタイプであり、かなり組織特異的な発現を示し、血管内皮細胞等でβ１およびγ１と会合してα４β１γ１を形成することが報告されている〔Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６５，１８１２３（１９９０）〕。血管内皮細胞ではα１鎖と競合して、α４β１γ１とα１β１γ１の２種類のラミニンが形成されるが、血管新生時にはα４β１γ１の形成の方が優勢となる。マウス繊維芽細胞株３Ｔ３−Ｌ１では、ラミニンのα鎖としてα４鎖のみが発現しており、α４β１γ１を形成することと、デキサメタゾンによる脂肪細胞への分化に伴いα４鎖の発現量が増大することが報告されている〔Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６３，１６１６３（１９８８）、Ｍａｔｒｉｘ　Ｂｉｏｌ．，１６，２２３（１９９７）〕。
α４β１γ１脂肪前駆細胞は、新生毛細血管の外表面と約０．２ｍｍの間隙をおいて広範囲に接触構造を形成しているが、この間隙にはα４β１γ１が蓄積しており、脂肪前駆細胞と新生毛細血管の接触構造の形成に関与している可能性が示唆されている。このような、新生毛細血管との接触構造は、癌の成長の際にも想定され、また、マウスの末梢および腸間膜のリンパ節由来の内皮細胞株では、細胞密度が低い状態やサイトカインで刺激した場合に、α４鎖の発現が誘導されることが知られている〔Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２２３，６０３（１９９４）〕。このように間充織由来の細胞株において、α４鎖が特定の機能をもつことが予測される。
５種類のα鎖サブタイプには共通してＣ末端にＧドメインとよばれる大きな球状の高次構造をとる領域があり、前述のようにα４鎖は他のα鎖がもつＮ末端側のドメインを欠いているので、α４鎖を含むラミニンであるα４β１γ１が他のラミニンファミリーと異なる特定の機能を示すのに、Ｃ末端のＧドメインが重要であると考えられる。
Ｇドメインは、α１鎖、α２鎖、α３鎖においてヘパリン結合性を有するドメインであることが報告されているドメインであり、さらにこれらのαサブタイプのＧドメインの中のどの領域がヘパリン結合性を規定しているかが、プロテアーゼによる限定分解や遺伝子組換え法により調製したＧドメインの部分断片ポリペプチドや化学合成したペプチドあるいは抗体を利用して解析されてきた。Ｇドメインは約１９０アミノ酸からなる５つのモジュール（以下ＬＧ１〜ＬＧ５と表す。）からなるが、たとえば、α１鎖ではＬＧ４、α２鎖ではＬＧ５がヘパリンとの結合に重要であると報告されている〔Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２８７，２５３（１９９９）、ＥＭＢＯ　Ｊ．，１８，８６３（１９９９）〕。また、ヘパリン結合能をもつラミニンα１鎖由来のペプチドの報告もある〔Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，３４０，１１９（１９９９）、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．，１７９，１８（１９９９）〕。
しかし、α４鎖についてはＧドメインのヘパリン結合性についての報告はない。α鎖の各サブタイプ間のアミノ酸相同性はそれほど高くなく、α４鎖でヘパリン結合性を規定する領域はα１鎖やα２鎖と同じであるかどうかは不明である。
ヘパリンと結合する分子として、ラミニンα鎖の他に、細胞の増殖、分化、生存維持に関与する情報伝達分子であるＷｎｔ１やＦＧＦが知られている。ヘパリン結合性を示すＷｎｔファミリーの遺伝子は発現パターンやノックアウトマウスの解析からさまざまな器官の形成、例えば、Ｗｎｔ１はマウスで脳の発生と分化に関与していることが報告されている〔Ｃｅｌｌ，６２，１０７３（１９９０）〕。またヘパリン結合性の増殖因子であるＦＧＦファミリーも、多様な細胞の増殖促進作用をもつことが知られている。例えば、ＦＧＦ−２（ｂ−ＦＧＦ）は繊維芽細胞や血管内皮細胞、神経系細胞等の増殖を促進し、血管新生や創傷治癒に働いていると考えられている。
これらのヘパリン結合性情報伝達分子は、ヘパリンを介して細胞表面の膜結合型プロテオグリカンおよび細胞外マトリクス中のプロテオグリカンと結合して捕捉されることにより、細胞および組織での分布や濃度勾配が調節されていると考えられる。
Ｗｎｔ、ＦＧＦの他にも、ヘパリン結合能を有する情報伝達分子は多く知られており、ＨＢ−ＥＧＦ（Ｈｅｐａｒｉｎ−ｂｉｎｄｉｎｇ　ｅｐｉｄｅｒｍａｌ　ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒ）、ＰＤＧＦ（Ｐｌａｔｅｌｅｔ−ｄｅｒｉｖｅｄ　ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒ）ＢＭＰ（Ｂｏｎｅ　ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｉｃ　ｐｒｏｔｅｉｎ）、ＧＭ−ＣＳＦ（Ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅ−ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ　ｃｏｌｏｎｙ　ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ　ｆａｃｔｏｒ）、ＨＧＦ（Ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ　ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒ）、ケモカイン、ＴＮＦ（Ｔｕｍｏｒ　ｎｅｃｒｏｓｉｓ　ｆａｃｔｏｒ）等がそのヘパリン結合能を利用して、細胞の分化や増殖に関与している。
本願発明のラミニンα４鎖のＧドメイン由来のポリペプチドは、強力なヘパリン結合能を有していることから、上記ヘパリン結合性情報伝達分子をはじめとするヘパリン結合性分子のヘパリンへの結合を競合阻害することにより、ヘパリン結合性情報伝達分子を介した情報伝達、細胞と細胞外マトリックスとの結合、細胞と毛細血管との結合、若しくは細胞の増殖、分化などを阻害することが可能であり、血管新生が関与する疾患や癌などの予防薬または治療薬として有用である。
発明の開示
本発明の課題は、ヘパリン結合能を有するポリペプチド、該ポリペプチドをコードするＤＮＡ、該ＤＮＡを用いた該蛋白の製造法、該ポリペプチドを用いた、細胞と毛細血管の接触、血管の新生、癌の成長、細胞の増殖、分化、生存維持またはヘパリン結合性情報伝達分子のシグナル伝達を阻害する方法、該ポリペプチドを含有してなる医薬、該ＤＮＡを含有してなる医薬を提供することである。
本発明者は、遺伝子組換え法により大量に調製したマウスのα１鎖およびα４鎖のＧドメインを用いて、α４鎖のＧドメインが単独でヘパリン結合能を有すること、およびそのα４鎖のＧドメインのヘパリン結合能は、従来知られていたα１鎖のＧドメインのヘパリン結合能の約１０倍の高さであることを見出すことに成功した。さらにα４鎖のＧドメインを酵素分解した部分ポリペプチドを用いて、α４鎖のＧドメインの中でモジュールＬＧ４の領域がα４鎖のＧドメイン全体と同等なヘパリン結合能を有すること、並びにモジュールＬＧ４の部分ペプチドを用いて、ヘパリン結合能を有するＬＧ４の部分ペプチドを同定することに成功し、本発明を完成するに至った。
即ち、本発明は、以下の（１）〜（２２）に関する。
（１）　ラミニン構成成分α４鎖のモジュールＬＧ４領域に存在するヘパリン結合領域のアミノ酸配列を含む、分子量１０８ｋＤａ以下のポリペプチドまたは該ポリペプチドを含有する融合ポリペプチド。
（２）　ヘパリン結合領域のアミノ酸配列が、配列番号３、４、６、１７および３３のいずれかに記載のアミノ酸配列である、（１）記載のポリペプチド。
（３）ポリペプチドが、ラミニン構成成分α４鎖のモジュールＬＧ４領域、またはＬＧ４およびＬＧ５領域を含むポリペプチドである、（１）記載のポリペプチド。
（４）　融合ポリペプチドが、タグペプチド、マーカーペプチド、またはシグナルペプチドより選ばれるペプチドとの融合ポリペプチドである、（１）記載のポリペプチド。
（５）　タグペプチド、マーカーペプチド、またはシグナルペプチドより選ばれるペプチドが、ｍｙｃポリペプチド、β−ガラクトシダーゼ、プロテインＡ、プロテインＡのＩｇＧ結合領域、クロラムフェニコール・アセチルトランスフェラーゼ、ポリ（Ａｒｇ）、ポリ（Ｇｌｕ）、プロテインＧ、マルトース結合ポリペプチド、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ、ポリヒスチジン鎖、Ｓペプチド、ＤＮＡ結合ポリペプチドドメイン、Ｔａｃ抗原、チオレドキシン、グリーン・フルオレッセント・プロテイン、ＦＬＡＧペプチド、任意の抗体のエピトープおよび任意の分泌蛋白質のシグナルペプチドからなる群より選ばれるペプチドである（４）記載のポリペプチド。
（６）　配列番号３、４、６、１７および３３のいずれかに記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド。
（７）　（１）〜（６）のいずれか１項に記載のポリペプチドのアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が欠失、置換および／または付加されたアミノ酸配列からなり、マウスラミニンα４鎖の１５１８番目のヒスチジン残基と１５２０番目のアルギニン残基に相当する２アミノ酸が保存され、かつヘパリン結合能を有するポリペプチド。
（８）　（１）〜（７）のいずれか１項に記載のポリペプチドのアミノ酸配列と６０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、マウスラミニンα４鎖の１５１８番目のヒスチジン残基と１５２０番目のアルギニン残基に相当する２アミノ酸が保存され、かつヘパリン結合能を有するポリペプチド。
（９）　（１）〜（８）のいずれか１項に記載のポリペプチドをコードするＤＮＡ。
（１０）　（９）に記載のＤＮＡをベクターに組み込んで得られる組換え体ＤＮＡ６
（１１）　（９）に記載のＤＮＡまたは（１０）に記載の組換え体ＤＮＡを保有する形質転換体。
（１２）　形質転換体が、微生物、動物細胞、植物細胞、および昆虫細胞からなる群より選ばれる形質転換体である、（１１）に記載の形質転換体。
（１３）　形質転換体が、非ヒトトランスジェニック動物またはトランスジェニック植物である、（１１）に記載の形質転換体。
（１４）　（１１）または（１２）に記載の形質転換体を培地に培養し、培養物中に（１）〜（８）のいずれか１項に記載のポリペプチドを生成、蓄積させ，該培養物から該ポリペプチドを採取することを特徴とする、該ポリペプチドの製造方法。
（１５）　（１３）に記載の非ヒトトランスジェニック動物またはトランスジェニック植物を生育させ、（１）〜（８）のいずれか１項に記載のポリペプチドを該動植物中に生成、蓄積させ、該動植物中より該ポリペプチドを採取することを特徴とする、該ポリペプチドの製造方法。
（１６）　（１）〜（８）のいずれか１項に記載のポリペプチドを有効成分として含有してなる医薬。
（１７）　（９）に記載のＤＮＡまたは（１０）に記載の組換え体ＤＮＡを有効成分として含有してなる医薬。
（１８）　細胞と細胞外マトリックスとの結合の阻害作用、細胞と毛細血管との接触の阻害作用、細胞の増殖の阻害作用または細胞の分化の阻害作用を有する（１６）または（１７）に記載の医薬。
（１９）　医薬が癌、または血管新生が関与する疾患の治療および／または予防のための医薬である、（１６）、（１７）または（１８）に記載の医薬。
（２０）　（１）〜（８）のいずれか１項に記載のポリペプチドを用いて、細胞からヘパリン結合性の情報伝達分子を遊離させる方法。
（２１）　（１）〜（８）のいずれか１項に記載のポリペプチドを用いて、ヘパリン結合性の情報伝達分子の濃度勾配形成またはシグナル伝達を阻害する方法。
（２２）　ヘパリン結合性の情報伝達分子がＷｎｔ１、ＦＧＦ（Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ　ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒ）、ＨＢ−ＥＧＦ（Ｈｅｐａｒｉｎ−ｂｉｎｄｉｎｇ　ｅｐｉｄｅｒｍａｌ　ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒ）、ＰＤＧＦ（Ｐｌａｔｅｌｅｔ−ｄｅｒｉｖｅｄ　ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒ）、ＢＭＰ（Ｂｏｎｅ　ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｉｃ　ｐｒｏｔｅｉｎ）、ＧＭ−ＣＳＦ（Ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅ−ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ　ｃｏｌｏｎｙ　ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ　ｆａｃｔｏｒ）、ＨＧＦ（Ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ　ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒ）、ケモカインおよびＴＮＦ（Ｔｕｍｏｒ　ｎｅｃｒｏｓｉｓ　ｆａｃｔｏｒ）からなる群から選ばれる情報伝達分子である（２０）または（２１）に記載の方法。
（２３）　ラミニン構成成分α４鎖のＧドメインを含むポリペプチドを有効成分として含有してなる医薬。
（２４）　細胞と細胞外マトリックスとの結合の阻害作用、細胞と毛細血管との接触の阻害作用、細胞の増殖の阻害作用または細胞の分化の阻害作用を有する（２３）に記載の医薬。
（２５）　医薬が癌、または血管新生が関与する疾患の治療および／または予防のための医薬である、（２３）または（２４）に記載の医薬。
（２６）　ラミニン構成成分α４鎖のＧドメインを含むポリペプチドを用いて、細胞からヘパリン結合性の情報伝達分子を遊離させる方法。
（２７）　ラミニン構成成分α４鎖のＧドメインを含むポリペプチドを用いて、ヘパリン結合性の情報伝達分子の濃度勾配形成またはシグナル伝達を阻害する方法。
（２８）　ヘパリン結合性の情報伝達分子がＷｎｔ１、ＦＧＦ（Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ　ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒ）、ＨＢ−ＥＧＦ（Ｈｅｐａｒｉｎ−ｂｉｎｄｉｎｇ　ｅｐｉｄｅｒｍａｌ　ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒ）、ＰＤＧＦ（Ｐｌａｔｅｌｅｔ−ｄｅｒｉｖｅｄ　ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒ）、ＢＭＰ（Ｂｏｎｅ　ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｉｃ　ｐｒｏｔｅｉｎ）、ＧＭ−ＣＳＦ（Ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅ−ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ　ｃｏｌｏｎｙ　ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ　ｆａｃｔｏｒ）、ＨＧＦ（Ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ　ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒ）、ケモカインおよびＴＮＦ（Ｔｕｍｏｒ　ｎｅｃｒｏｓｉｓ　ｆａｃｔｏｒ）からなる群から選ばれる情報伝達分子である（２６）または（２７）に記載の方法。
以下、本発明を詳細に説明する。
１．本発明のポリペプチドの製造
本発明のポリペプチドは、ラミニン構成成分α４鎖のモジュールＬＧ４領域に存在するヘパリン結合領域のアミノ酸配列を有する、分子量１０８ｋＤａ以下のポリペプチドまたは該ポリペプチドを含有する融合ポリペプチドである。
該ポリペプチドとして、例えば、配列番号３、４、６、１７および３３のいずれかに記載のアミノ酸配列を有する、ラミニン構成成分α４鎖のヘパリン結合領域のアミノ酸配列を有するポリペプチド、ラミニン構成成分α４鎖のモジュールＬＧ４領域を含むポリペプチド、ＬＧ４およびＬＧ５領域を含むポリペプチド、配列番号３、４、６、１７および３３のいずれかに記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド等を挙げることができる。
上記ポリペプチドを含有する本発明の融合ポリペプチドとしては、上記ポリペプチドのヘパリン結合能を維持できる異種ポリペプチドとの融合ポリペプチドであればよく、異種ペプチドとしては、例えば、タグペプチド、マーカーペプチド、またはシグナルペプチドより選ばれるペプチドが挙げられ、具体的には、ｍｙｃポリペプチド、β−ガラクトシダーゼ、プロテインＡ、プロテインＡのＩｇＧ結合領域、クロラムフェニコール・アセチルトランスフェラーゼ、ポリ（Ａｒｇ）、ポリ（Ｇｌｕ）、プロテインＧ、マルトース結合ポリペプチド、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ、ポリヒスチジン鎖（Ｈｉｓ−ｔａｇ）、Ｓペプチド、ＤＮＡ結合ポリペプチドドメイン、Ｔａｃ抗原、チオレドキシン、グリーン・フルオレッセント・プロテイン（ＧＦＰ）、ＦＬＡＧペプチド、任意の抗体のエピトープおよび任意の分泌蛋白質のシグナルペプチド等との融合ポリペプチドなどを挙げることができる〔山川彰夫，実験医学，１３，４６９−４７４（１９９５）〕。
更に、本発明のポリペプチドとしては、上記のポリペプチドのアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が欠失、置換および／または付加されたアミノ酸配列からなり、マウスラミニンα４鎖の１５１８番目のヒスチジン残基と１５２０番目のアルギニン残基に相当する２アミノ酸が保存され、かつヘパリン結合能を有するポリペプチド、上記のポリペプチドのアミノ酸配列と６０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、マウスラミニンα４鎖の１５１８番目のヒスチジン残基と１５２０番目のアルギニン残基に相当する２アミノ酸が保存され、かつヘパリン結合能を有するポリペプチド等を挙げることができる。
上記の本発明のポリペプチドのアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が欠失、置換および／または付加されたアミノ酸配列を有するポリペプチドは、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ　Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ，１９８９（以下、モレキュラー・クローニング第２版と略す）、Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ　＆　Ｓｏｎｓ，１９８７−１９９７（以下、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジーと略す）、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１０，６４８７，（１９８２）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，７９，６４０９（１９８２）、Ｇｅｎｅ，３４，３１５（１９８５）、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１３，４４３１（１９８５）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ　ＵＳＡ，８２，４８８（１９８５）等に記載の部位特異的変異導入法を用いて、本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡに部位特異的変異を導入することにより行うことができる。欠失、置換および／または付加されるアミノ酸の数は１から数個であり、その数は特に限定されないが、上記の部位特異的変異導入法などの周知の技術により、欠失、置換もしくは付加できる程度の数であり、例えば、１〜数十個、好ましくは１〜２０個、より好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個である。
また、上記本発明のポリペプチドのアミノ酸配列と６０％以上の相同性を有するポリペプチドは、ＢＬＡＳＴ〔Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２１５，４０３（１９９０）〕やＦＡＳＴＡ（Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１８３，６３−６９）等の解析ソフトで、デフォルト（初期設定）のパラメータを用いて計算したときに、少なくとも６０％以上の相同性を有するポリペプチドであり、好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、特に好ましくは９５％以上、最も好ましくは９７％以上の相同性を有するポリペプチドである。相同性を有するポリペプチドとしては、マウス、ラット、ウシ、サル等の哺乳動物由来のラミニン構成成分α４鎖のホモログポリペプチドを挙げることができる。
本発明のポリペプチドは、モレキュラー・クローニング第２版やカレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー等に記載された方法等を用い、例えば以下の方法により、本発明のＤＮＡを宿主細胞中で発現させて、製造することができる。
本発明のＤＮＡとしては、上記本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡを挙げることができる。
本発明のＤＮＡは、本発明のポリペプチドのアミノ酸配列情報に基づいて、該ポリペプチドをコードするＤＮＡを化学合成することによって調製することができる。
ＤＮＡの化学合成は、チオホスファイト法を利用した島津製作所製のＤＮＡ合成機、フォスフォアミダイト法を利用したパーキン・エルマー社製のＤＮＡ合成機ｍｏｄｅｌ３９２等を用いて行うことができる。
また、本発明のポリペプチドのアミノ酸配列情報に基づいて作製したオリゴヌクレオチドをセンスプライマーおよびアンチセンスプライマーとして用い、これらＤＮＡに相補的なｍＲＮＡを発現している細胞のｍＲＮＡから調製したｃＤＮＡを鋳型として、ＰＣＲを行うことによっても、目的とするＤＮＡを調製することができる。
アンチセンス・オリゴヌクレオチドあるいはセンス・オリゴヌクレオチドはモレキュラー・クローニング第２版等に記載の常法により、あるいは該ＤＮＡの塩基配列情報よりＤＮＡ合成機により調製することができる。
上記オリゴヌクレオチドとしては、本発明のポリペプチドのアミノ酸配列情報より想定される塩基配列中の連続した５〜１２０塩基、より好ましくは連続した５〜６０塩基と同じ配列を有するＤＮＡ、または該ＤＮＡと相補的な配列を有するＤＮＡを挙げることができ、具体的には、配列番号３４で表される塩基配列中の連続した５〜１２０塩基と同じ配列を有するＤＮＡまたは該ＤＮＡと相補的な配列を有するＤＮＡを挙げることができる。センスプライマーおよびアンチセンスプライマーとして用いる場合には、両者の融解温度（Ｔｍ）および塩基数が極端に変わることのない上記記載のオリゴヌクレオチドが好ましい。具体的には配列番号３７〜４０等に示された塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを挙げることができる。
上記の方法で調製した、本発明のポリペプチドをコードする部分を含む適当な長さのＤＮＡ断片を適当な発現ベクターのプロモーターの下流に挿入することにより、組換え体ＤＮＡを作製することができる。
該組換え体ＤＮＡを、該発現ベクターに適合した宿主細胞に導入することにより、本発明のポリペプチドを生産する形質転換体を得ることができる。導入した組換え体ＤＮＡは、形質転換体の染色体ゲノム中に組み込まれて保持される場合と形質転換細胞内で組換え体ＤＮＡとして保持される場合とがある。
本発明の形質転換体としては、本発明の上記ＤＮＡ若しくは組換え体ＤＮＡを適当な宿主細胞または動植物個体に導入して得られる形質転換体を挙げることができる。
宿主細胞としては、細菌などの原核細胞、糸状菌、酵母等の微生物細胞、動物細胞、昆虫細胞、植物細胞等、目的とする遺伝子を発現できるものであればいずれも用いることができる。また、動物個体や植物個体を用いることができる。
酵母、動物細胞、昆虫細胞または植物細胞により発現させた場合には、糖あるいは糖鎖が付加されたポリペプチドを得ることができる。
発現ベクターとしては、上記宿主細胞において自立複製が可能、または染色体中への組込みが可能で、本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡの転写に適した位置にプロモーターを含有しているものを用いることができる。
細菌等の原核生物を宿主細胞として用いる場合、本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡの発現ベクターは、原核生物中で自立複製可能であると同時に、プロモーター、リボソーム結合配列、本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡ、転写終結配列、より構成されていることが好ましい。プロモーターを制御する遺伝子が含まれていてもよい。
発現ベクターとしては、例えば、ｐＢＴｒｐ２、ｐＢＴａｃ１、ｐＢＴａｃ２（いずれもＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｍ社より市販）、ｐＳＥ２８０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、ｐＧＥＭＥＸ−１（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）、ｐＱＥ−８（ＱＩＡＧＥＮ社製）、ｐＫＹＰ１０（特開昭５８−１１０６００）、ｐＫＹＰ２００〔Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，４８，６６９（１９８４）〕、ｐＬＳＡ１〔Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，５３，２７７（１９８９）〕、ｐＧＥＬ１〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８２，４３０６（１９８５）〕、ｐＢｌｕｅ　ＩＩ　ＳＫ（−）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）、ｐＴｒｓ３０（ＦＥＲＭ　ＢＰ−５４０７）、ｐＴｒｓ３２（ＦＥＲＭ　ＢＰ−５４０８）、ｐＧＨＡ２（ＦＥＲＭ　ＢＰ−４００）、ｐＧＫＡ２（ＦＥＲＭ　Ｂ−６７９８）、ｐＴｅｒｍ２（特開平３−２２９７９、ＵＳ４６８６１９１、ＵＳ４９３９０９４、ＵＳ５１６０７３５）、ｐＫＫ２３３−２（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）、ｐＧＥＸ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）、ｐＥＴシステム（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）、ｐＳｕｐｅｘ、ｐＵＢ１１０、ｐＴＰ５、ｐＣ１９４、ｐＴｒｘＦｕｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、ｐＭＡＬ−ｃ２（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ社製）等を例示することができる。
プロモーターとしては、大腸菌等の宿主細胞中で発現できるものであればいかなるものでもよい。例えば、ｔｒｐプロモーター（Ｐｔｒｐ）、ｌａｃプロモーター（Ｐｌａｃ）、Ｐ_Ｌプロモーター、Ｐ_Ｒプロモーター等の、大腸菌やファージ等に由来するプロモーター、ＳＰＯ１プロモーター、ＳＰＯ２プロモーター、ｐｅｎＰプロモーター等を挙げることができる。またＰｔｒｐを２つ直列させたプロモーター（Ｐｔｒｐ　ｘ２）、ｔａｃプロモーター、ｌａｃＴ７プロモーター、ｌｔｅ　Ｉプロモーターのように人為的に設計改変されたプロモーター等も用いることができる。
リボソーム結合配列としては、シャイン−ダルガノ（Ｓｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ）配列と開始コドンとの間を適当な距離（例えば６〜１８塩基）に調節したプラスミドを用いることが好ましい。
本発明のＤＮＡの発現には転写終結配列は必ずしも必要ではないが、好適には構造遺伝子直下に転写終結配列を配置することが望ましい。
宿主細胞としては、エシェリヒア属、セラチア属、バチルス属、ブレビバクテリウム属、コリネバクテリウム属、ミクロバクテリウム属、シュードモナス属等に属する微生物、例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＸＬ１−Ｂｌｕｅ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＸＬ２−Ｂｌｕｅ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＤＨ１、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＭＣ１０００、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＫＹ３２７６、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　Ｗ１４８５、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＪＭ１０９、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＨＢ１０１、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　Ｎｏ．４９、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　Ｗ３１１０、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＮＹ４９、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＢＬ２１（ＤＥ３）、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＨＭＳ１７４（ＤＥ３）、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＨＭＳ１７４（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ、Ｓｅｒｒａｔｉａ　ｆｉｃａｒｉａ、Ｓｅｒｒａｔｉａ　ｆｏｎｔｉｃｏｌａ、Ｓｅｒｒａｔｉａ　ｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ、Ｓｅｒｒａｔｉａ　ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓ、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｉｍｍａｒｉｏｐｈｉｌｕｍ　ＡＴＣＣ１４０６８、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍ　ＡＴＣＣ１４０６６、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｇｌｕｔａｍｉｃｕ ｍ　ＡＴＣＣ１３０３２、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ　ＡＴＣＣ１４０６７、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ　ＡＴＣＣ１３８６９、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ａｃｅｔｏａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｍ　ＡＴＣＣ１３８７０、Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ａｍｍｏｎｉａｐｈｉｌｕｍ　ＡＴＣＣ１５３５４、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｓｐ．Ｄ−０１１０等を挙げることができる。
組換えベクターの導入方法としては、上記宿主細胞へＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、エレクトロポレーション法〔Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．，１６，６１２７（１９８８）〕、カルシウムイオンを用いる方法〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，６９，２１１０（１９７２）〕、プロトプラスト法（特開昭６３−２４８３９４）、Ｇｅｎｅ，１７，１０７（１９８２）やＭｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．，１６８，１１１（１９７９）に記載の方法等を挙げることができる。
酵母菌株を宿主細胞として用いる場合には、発現ベクターとして、例えば、ＹＥｐ１３（ＡＴＣＣ３７１１５）、ＹＥｐ２４（ＡＴＣＣ３７０５１）、ＹＣｐ５０（ＡＴＣＣ３７４１９）、ｐＨＳ１９、ｐＨＳ１５等を例示することができる。
プロモーターとしては、酵母菌株中で発現できるものであればいかなるものでもよく、例えば、ＰＨＯ５プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＧＡＰプロモーター、ＡＤＨプロモーター、ｇａｌ　１プロモーター、ｇａｌ　１０プロモーター、ヒートショック蛋白質プロモーター、ＭＦα１プロモーター、ＣＵＰ　１プロモーター等のプロモーターを挙げることができる。
宿主細胞としては、サッカロマイセス属、シゾサッカロマイセス属、クルイベロミセス属、トリコスポロン属、シワニオミセス属等に属する酵母菌株を挙げることができ、具体的には、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｐｏｍｂｅ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ　ｌａｃｔｉｓ、Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ　ｐｕｌｌｕｌａｎｓ、Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ　ａｌｌｕｖｉｕｓ等を挙げることができる。
組換えベクターの導入方法としては、酵母にＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、エレクトロポレーション法〔Ｍｅｔｈｏｄｓ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１９４，１８２（１９９０）〕、スフェロプラスト法〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８４，１９２９（１９７８）〕、酢酸リチウム法〔Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１５３，１６３（１９８３）〕、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７５，１９２９（１９７８）記載の方法等を挙げることができる。
動物細胞を宿主細胞として用いる場合には、発現ベクターとして、例えば、ｐｃＤＮＡＩ／Ａｍｐ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、ｐｃＤＮＡＩ（フナコシ社製）、ｐＣＤＭ８〔Ｎａｔｕｒｅ，３２９，８４０（１９８７）、フナコシ社製〕、ｐＡＧＥ１０７〔特開平３−２２９７９；Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，３，１３３（１９９０）〕、ｐＲＥＰ４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、ｐＡＧＥ１０３〔Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１０１，１３０７（１９８７）〕、ｐＡＭｏ、ｐＡＭｏＡ、ｐＡＳ３−３（特開平２−２２７０７５）等を例示することができる。
プロモーターとしては、動物細胞中で発現できるものであればいずれも用いることができ、例えば、サイトメガロウイルス（ヒトＣＭＶ）のＩＥ（ｉｍｍｅｄｉａｔｅ　ｅａｒｌｙ）遺伝子のプロモーター、ＳＶ４０の初期プロモーター、モロニー・ミュリン・ロイケミア・ウイルス（Ｍｏｌｏｎｅｙ　Ｍｕｒｉｎｅ　Ｌｅｕｋｅｍｉａ　Ｖｉｒｕｓ）のロング・ターミナル・リピート・プロモーター（Ｌｏｎｇ　Ｔｅｒｍｉｎａｌ　Ｒｅｐｅａｔ　Ｐｒｏｍｏｔｅｒ）、レトロウイルスのプロモーター、ヒートショックプロモーター、ＳＲαプロモーター、あるいはメタロチオネインのプロモーター等を挙げることができる。また、ヒトＣＭＶのＩＥ遺伝子のエンハンサーをプロモーターと共に用いてもよい。
宿主細胞としては、ＤＮＡを細胞内に導入できる動物細胞であるならいかなる細胞も用いることができる。例えば、哺乳動物の細胞としてはヒト、サル、マウス、ラット、モルモットまたはミンクの細胞などを用いることができる。具体的には、マウス・ミエローマ細胞、ラット・ミエローマ細胞、マウス・ハイブリドーマ細胞、チャイニーズ・ハムスターの細胞であるＣＨＯ細胞（ＡＴＣＣ　ＣＲＬ−９０９６、ＡＴＣＣ　ＣＣＬ−６１）、ＢＨＫ細胞、アフリカミドリザル腎臓細胞、ヒトの細胞であるＮａｍａｌｗａ細胞（ＡＴＣＣＣＲＬ−１４３２）またはＮａｍａｌｗａ　ＫＪＭ−１細胞、ヒト胎児腎臓細胞、ヒト白血病細胞、ＨＢＴ５６３７（特開昭６３−２９９）、ヒト大腸癌細胞株等を挙げることができる。
マウス・ミエローマ細胞としては、ＳＰ２／０、ＮＳＯ等、ラット・ミエローマ細胞としてはＹＢ２／０等、ヒト胎児腎臓細胞としてはＨＥＫ２９３、２９３〔Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｏｌ．３６，５９−７２（１９７７）〕等、ヒト白血病細胞としてはＢＡＬＬ−１等、アフリカミドリザル腎臓細胞としてはＣＯＳ−１（ＡＴＣＣ　ＣＲＬ−１６５０）、ＣＯＳ−７（ＡＴＣＣ　ＣＲＬ−１６５１）、ヒト大腸癌細胞株としてはＨＣＴ−１５等を挙げることができる。
治療用ポリペプチド性医薬品の製造などが目的の場合は、哺乳動物の細胞、特にＣＨＯ細胞を宿主とすることが好ましい。
組換えベクターの導入方法としては、動物細胞にＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、エレクトロポレーション法〔Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，３，１３３（１９９０）〕、リン酸カルシウム法（特開平２−２２７０７５）、ＤＥＡＥデキストラン法（羊土社　バイオマニュアルシリーズ４，１６）、リポフェクション法〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８４，７４１３（１９８７）〕、マイクロインジェクション法（羊土社　バイオマニュアルシリーズ４，３６）、アデノウイルス法（羊土社　バイオマニュアルシリーズ４，４３）、ワクシニアウイルス（羊土社　バイオマニュアルシリーズ４，５９）レトロウイルスベクター（羊土社　バイオマニュアルシリーズ４，７４）等を用いることができる。
昆虫細胞を宿主として用いる場合には、例えば、バキュロウイルス・イクスプレッション・ベクターズ　ア・ラボラトリー・マニュアル〔Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　Ｖｅｃｔｏｒｓ，Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ　ａｎｄ　Ｃｏｍｐａｎｙ，ＮｅｗＹｏｒｋ（１９９２）〕、モレキュラー・バイオロジーア・ラボラトリー・マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ）、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー・サプルメント１〜３８（Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ）、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，６，４７（１９８８）等に記載された方法によって、ポリペプチドを発現することができる。
即ち、組換え遺伝子導入ベクターおよびバキュロウイルスを昆虫細胞に共導入して昆虫細胞培養上清中に組換えウイルスを得た後、さらに組換えウイルスを昆虫細胞に感染させ、ポリペプチドを発現させることができる。
該方法において用いられる遺伝子導入ベクターとしては、例えば、ｐＶＬ１３９２、ｐＶＬ１３９３、ｐＢｌｕｅＢａｃＩＩＩ（すべてＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）等を挙げることができる。
バキュロウイルスとしては、例えば、夜盗蛾科昆虫に感染するウイルスであるアウトグラファ・カリフォルニカ・ヌクレアー・ポリヘドロシス・ウイルス（Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ　ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ　ｎｕｃｌｅａｒ　ｐｏｌｙｈｅｄｒｏｓｉｓ　ｖｉｒｕｓ）等を用いることができる。
昆虫細胞としては、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ　ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａの卵巣細胞、Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ　ｎｉの卵巣細胞、カイコ卵巣由来の培養細胞等を用いることができる。Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ　ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａの卵巣細胞としてはＳｆ９、Ｓｆ２１（バキュロウイルス・イクスプレッション・ベクターズ　ア・ラボラトリー・マニュアル）等、Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ　ｎｉの卵巣細胞としてはＨｉｇｈ５（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、ＢＴＩ−ＴＮ−５Ｂ１−４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）等、カイコ卵巣由来の培養細胞としてはＢｏｍｂｙｘ　ｍｏｒｉ　Ｎ４等を挙げることができる。
組換えウイルスを調製するための、昆虫細胞への上記組換え遺伝子導入ベクターと上記バキュロウイルスの共導入方法としては、例えば、リン酸カルシウム法（特開平２−２２７０７５）、リポフェクション法〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８４，７４１３（１９８７）〕等を挙げることができる。
また、動物細胞にＤＮＡを導入する方法と同様の方法を用いて、昆虫細胞にＤＮＡを導入することもでき、例えば、エレクトロポレーション法〔Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，３，１３３（１９９０）〕、リン酸カルシウム法（特開平２−２２７０７５）、リポフェクション法〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８４，７４１３（１９８７）〕等を挙げることができる。
植物細胞または植物個体を宿主として用いる場合には、公知の方法〔組織培養，２０（１９９４）、組織培養，２１（１９９５）、Ｔｒｅｎｄｓ　ｉｎ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１５，４５（１９９７）〕に準じてポリペプチドを生産することができる。
遺伝子発現に用いるプロモーターとしては、植物細胞中で発現できるものであればいずれも用いることができ、例えば、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）の３５Ｓプロモーター、イネアクチン１プロモーター等を挙げることができる。また、プロモーターと発現させる遺伝子の間に、トウモロコシのアルコール脱水素酵素遺伝子のイントロン１等を挿入することにより、遺伝子の発現効率を上げることもできる。
宿主細胞としては、ジャガイモ、タバコ、トウモロコシ、イネ、アブラナ、ニンジン、大豆、トマト、小麦、大麦、ライ麦、アルファルファ、亜麻等の植物細胞等を挙げることができる。組換えベクターの導入方法としては、植物細胞にＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）（特開昭５９−１４０８８５、特開昭６０−７００８０、ＷＯ９４／００９７７）、エレクトロポレーション法〔Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，３，１３３（１９９０）、特開昭６０−２５１８８７〕、パーティクルガン（遺伝子銃）を用いる方法（特許第２６０６８５６、特許第２５１７８１３）等を挙げることができる。
遺伝子を導入した植物の細胞や器官は、ジャーファーメンターを用いて大量培養することができる。また、遺伝子導入した植物細胞を再分化させることにより、遺伝子が導入された植物個体（トランスジェニック植物）を造成することもできる。
動物個体を用いて本発明のポリペプチドを生産することもできる。例えば、公知の方法〔Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｃｌｉｎｉｃａｌ　Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ，６３，６３９Ｓ（１９９６）、Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｃｌｉｎｉｃａｌ　Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ，６３，６２７Ｓ（１９９６）、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，９，８３０（１９９１）〕に準じて、遺伝子を導入した動物中に本発明のポリペプチドを生産することができる。
プロモーターとしては、動物で発現できるものであればいずれも用いることができるが、例えば、乳腺細胞特異的なプロモーターであるαカゼインプロモーター、βカゼインプロモーター、βラクトグロブリンプロモーター、ホエー酸性プロテインプロモーター等が好適に用いられる。
本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡを組み込んだ組換え体ベクターを保有する微生物、動物細胞、あるいは植物細胞由来の形質転換体を、通常の培養方法に従って培養し、該ポリペプチドを生成蓄積させ、該培養物より該ポリペプチドを採取することにより、該ポリペプチドを製造することができる。
形質転換体が動物個体または植物個体の場合は、通常の方法に従って、飼育または栽培し、該ポリペプチドを生成蓄積させ、該動物個体または植物個体より該ポリペプチドを採取することにより、該ポリペプチドを製造することができる。
即ち、動物個体の場合、例えば、本発明のＤＮＡを保有する非ヒトトランスジェニック動物を飼育し、該組換え体ＤＮＡのコードする本発明のポリペプチドを該動物中に生成、蓄積させ、該動物中より該ポリペプチドを採取することにより、本発明のポリペプチドを製造することができる。該動物中の生成、蓄積場所としては、例えば、該動物のミルク（特開昭６３−３０９１９２）、卵等を挙げることができる。
植物個体の場合、例えば、本発明のＤＮＡを保有するトランスジェニック植物を栽培し、該組換え体ＤＮＡのコードする本発明のポリペプチドを該植物中に生成、蓄積させ、該植物中より該ポリペプチドを採取することにより、本発明のポリペプチドを製造することができる。
本発明のポリペプチド製造用形質転換体が大腸菌等の原核生物、酵母菌等の真核生物である場合、これら生物を培養する培地は、該生物が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、形質転換体の培養を効率的に行える培地であれば天然培地、合成培地のいずれでもよい。
炭素源としては、該形質転換体が資化し得るものであればよく、グルコース、フラクトース、スクロース、これらを含有する糖蜜、デンプンあるいはデンプン加水分解物等の炭水化物、酢酸、プロピオン酸等の有機酸、エタノール、プロパノール等のアルコール類が用いられる。
窒素源としては、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等の各種無機酸や有機酸のアンモニウム塩、その他含窒素化合物、並びに、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーンスチープリカー、カゼイン加水分解物、大豆粕および大豆粕加水分解物、各種発酵菌体およびその消化物等を用いることができる。
無機物としては、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅、炭酸カルシウム等を用いることができる。
培養は、振盪培養または深部通気攪拌培養等の好気的条件下で行う。培養温度は１５〜４０℃がよく、培養時間は、通常１６〜９６時間である。培養中ｐＨは、３．０〜９．０に保持する。ｐＨの調整は、無機あるいは有機の酸、アルカリ溶液、尿素、炭酸カルシウム、アンモニア等を用いて行う。
また培養中必要に応じて、アンピシリンやテトラサイクリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
プロモーターとして誘導性のプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときには、必要に応じてインデューサーを培地に添加してもよい。例えば、ｌａｃプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときにはイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）等を、ｔｒｐプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときにはインドールアクリル酸（ＩＡＡ）等を培地に添加してもよい。
本発明のポリペプチド製造用形質転換体が動物細胞である場合、該細胞を培養する培地は、一般に使用されているＲＰＭＩ１６４０培地〔Ｔｈｅ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｍｅｄｉｃａｌ　Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ，１９９，５１９（１９６７）〕、ＥａｇｌｅのＭＥＭ培地〔Ｓｃｉｅｎｃｅ，１２２，５０１（１９５２）〕、ＤＭＥＭ培地〔Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，８，３９６（１９５９）〕、１９９培地〔Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｓｏｃｉｅｔｙ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，７３，１（１９５０）〕またはこれら培地に牛胎児血清等を添加した培地等を用いることができる。
培養は、通常ｐＨ６〜８、３０〜４０℃、５％ＣＯ_２存在下等の条件下で１〜７日間行う。
また培養中必要に応じて、カナマイシン、ペニシリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
昆虫細胞を宿主細胞として得られた形質転換体を培養する培地としては、一般に使用されているＴＮＭ−ＦＨ培地（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社）、Ｓｆ−９００　ＩＩ　ＳＦＭ培地（ＧＩＢＣＯ　ＢＲＬ社製）、ＥｘＣｅｌｌ４００、ＥｘＣｅｌｌ４０５〔いずれもＪＲＨ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製〕、Ｇｒａｃｅ’ｓ　Ｉｎｓｅｃｔ　Ｍｅｄｉｕｍ〔Ｎａｔｕｒｅ，１９５，７８８（１９６２）〕等を用いることができる。培養は、ｐＨ６〜７、培養温度２５〜３０℃がよく、培養時間は、通常１〜５日間である。また、培養中必要に応じて、ゲンタマイシン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
植物細胞を宿主として得られた形質転換体は、細胞として、または植物の細胞や器官に分化させて培養することができる。該形質転換体を培養する培地としては、一般に使用されているムラシゲ・アンド・スクーグ（ＭＳ）培地、ホワイト（Ｗｈｉｔｅ）培地、またはこれら培地にオーキシン、サイトカイニン等、植物ホルモンを添加した培地等を用いることができる。培養は、通常ｐＨ５〜９、２０〜４０℃の条件下で３〜６０日間行う。また、培養中必要に応じて、カナマイシン、ハイグロマイシン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
本発明のポリペプチドの生産方法としては、宿主細胞内に生産させる方法、宿主細胞外に分泌させる方法、あるいは宿主細胞外膜上に生産させる方法があり、使用する宿主細胞や、生産させるポリペプチドの構造に応じて適宜、選択することができる。
本発明のポリペプチドが宿主細胞内あるいは宿主細胞外膜上に生産される場合、ポールソンらの方法〔Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６４，１７６１９（１９８９）〕、ロウらの方法〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８６，８２２７（１９８９）、Ｇｅｎｅｓ　Ｄｅｖｅｌｏｐ．，４，１２８８（１９９０）〕、または特開平０５−３３６９６３、ＷＯ９４１２３０２１等に記載の方法を準用することにより、該ポリペプチドを宿主細胞外に積極的に分泌させることができる。
即ち、遺伝子組換えの手法を用いて、本発明のポリペプチドの活性部位を含むポリペプチドの手前にシグナルペプチドを付加した形で発現させることにより、本発明のポリペプチドを宿主細胞外に積極的に分泌させることができる。
具体的には、活性部位を含むと考えられるアミノ酸配列を有するポリペプチドの手前に、シグナルペプチドを付加して発現させることにより、本発明のポリペプチドを宿主細胞外に積極的に分泌させることができると考えられる。さらに、シグナルペプチドと活性部位を含むポリペプチドの間、または活性部位を含むポリペプチドのＣ末端に、精製・検出用のタグを付加することもできる。
精製・検出用のタグとしては、β−ガラクトシダーゼ、プロテインＡ、プロテインＡのＩｇＧ結合領域、クロラムフェニコール・アセチルトランスフェラーゼ、ポリ（Ａｒｇ）、ポリ（Ｇｌｕ）、プロテインＧ、マルトース結合ポリペプチド、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ、ポリヒスチジン鎖（Ｈｉｓ−ｔａｇ）、Ｓペプチド、ＤＮＡ結合ポリペプチドドメイン、Ｔａｃ抗原、チオレドキシン、グリーン・フルオレッセント・プロテイン（ＧＦＰ）、ＦＬＡＧペプチド、および任意の抗体のエピトープなどが挙げることができる山川彰夫，実験医学，１３，４６９−４７４（１９９５）〕。
また、特開平２−２２７０７５に記載されている方法に準じて、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子等を用いた遺伝子増幅系を利用して生産量を上昇させることもできる。
本発明のポリペプチドの製造法として他に、本発明のＤＮＡを用いたｉｎ　ｖｉｔｒｏでの転写・翻訳系による製造法がある。ｉｎ　ｖｉｔｒｏ転写・翻訳系とは、無細胞システムを用いてＤＮＡからｍＲＮＡへの転写、およびｍＲＮＡから蛋白質への翻訳を行うことによりポリペプチドを生産する系のことであり、目的のＤＮＡまたは目的のｍＲＮＡから目的のポリペプチドを生産できる無細胞システムであればどのようなものでも用いることができる。代表的な無細胞翻訳系として、例えば、ウサギの網状赤血球ライゼート（Ｒａｂｂｉｔ　Ｒｅｔｉｃｕｌｏｃｙｔｅ　Ｌｙｓａｔｅ）や小麦杯ライゼート（Ｗｈｅａｔ　Ｇｅｒｍ　Ｌｙｓａｔｅ）を用いた系などが挙げられる。ｉｎ　ｖｉｔｒｏ転写・翻訳系は各社からキットが販売されており、市販のキットを用いてポリペプチドを比較的容易に製造できるようになっている。市販キットとして例えば、Ｉｎ　Ｖｉｔｒｏ　Ｅｘｐｒｅｓｓ^ＴＭ　Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）が挙げられる。また、本発明のポリペプチドは、公知の方法〔Ｊ．Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ＮＭＲ，６，１２９−１３４、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４２，１１６２−１１６４、Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１１０，１６６−１６８（１９９１）〕に準じたｉｎ　ｖｉｔｒｏ転写・翻訳系を用いて生産することもできる。
本発明ポリペプチド製造用形質転換体の培養物から、本発明のポリペプチドを単離・精製するには、通常の酵素の単離・精製法を用いることができる。例えば、本発明のポリペプチドが本発明のポリペプチド製造用形質転換体の細胞内に溶解状態で蓄積する場合には、培養物を遠心分離することにより、培養物中の細胞を集め、該細胞を洗浄した後に、超音波破砕機、フレンチプレス、マントンガウリンホモゲナイザー、ダイノミル等により細胞を破砕し、無細胞抽出液を得る。
該無細胞抽出液を遠心分離することにより得られた上清から、溶媒抽出法、硫安等による塩析法脱塩法、有機溶媒による沈殿法、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）−セファロース、ＤＩＡＩＯＮ　ＨＰＡ−７５（三菱化成社製）等レジンを用いた陰イオン交換クロマトグラフィー法、Ｓ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ　ＦＦ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）等のレジンを用いた陽イオン交換クロマトグラフィー法、ブチルセファロース、フェニルセファロース等のレジンを用いた疎水性クロマトグラフィー法、分子篩を用いたゲルろ過法、アフィニティークロマトグラフィー法、クロマトフォーカシング法、等電点電気泳動等の電気泳動法等の手法を用い、精製標品を得ることができる。
また、該ポリペプチドが細胞内に不溶体を形成して発現した場合は、同様に細胞を回収後破砕し、遠心分離を行うことにより得られた沈殿画分より、通常の方法により該ポリペプチドを回収後、該ポリペプチドの不溶体をポリペプチド変性剤で可溶化する。該可溶化液を、ポリペプチド変性剤を含まないあるいはポリペプチド変性剤の濃度がポリペプチドが変性しない程度に希薄な溶液に希釈、あるいは透析し、該ポリペプチドを正常な立体構造に構成させた後、上記と同様の単離精製法により精製標品を得ることができる。
本発明のポリペプチドあるいはその糖修飾体等の誘導体が細胞外に分泌される場合には、培養上清に該ポリペプチドあるいはその糖鎖付加体等の誘導体を回収することができる。即ち、該培養物を上記と同様の遠心分離等の手法により処理することにより可溶性画分を取得し、該可溶性画分から、上記と同様の単離精製法を用いることにより、精製標品を得ることができる。
また、本発明のポリペプチドを他のポリペプチドとの融合ポリペプチドとして生産し、融合したポリペプチドに親和性をもつ物質を用いたアフィニティークロマトグラフィーを利用して精製することもできる〔山川彰夫，実験医学，１３，４６９−４７４（１９９５）〕。例えば、ロウらの方法〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８６，８２２７（１９８９）、Ｇｅｎｅｓ　Ｄｅｖｅｌｏｐ．，４，１２８８（１９９０）〕、特開平０５−３３６９６３、特開平０６−８２３０２１に記載の方法に準じて、本発明のポリペプチドをプロテインＡとの融合ポリペプチドとして生産し、イムノグロプリンＧを用いるアフィニティークロマトグラフィーにより精製することができる。また、本発明のポリペプチドをＦＬＡＧペプチドとの融合ポリペプチドとして生産し、抗ＦＬＡＧ抗体を用いるアフィニティークロマトグラフィーにより精製することができる〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８６，８２２７（１９８９）、Ｇｅｎｅｓ　Ｄｅｖｅｌｏｐ．，４，１２８８（１９９０）〕。
更に、該ポリペプチド自身に対する抗体を用いたアフィニティークロマトグラフィーで精製することもできる。
また、本発明のポリペプチドは、Ｆｍｏｃ法（フルオレニルメチルオキシカルボニル法）、ｔＢｏｃ法（ｔ−ブチルオキシカルボニル法）等の化学合成法によっても製造することができる。また、Ａｄｖａｎｃｅｄ　ＣｈｅｍＴｅｃｈ社、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ社、Ａｍｅｒｓｈａｍ　Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｂｉｏｔｅｃｈ社、Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ社、Ｓｙｎｔｈｅｃｅｌｌ−Ｖｅｇａ社、ＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅ社、島津製作所等のペプチド合成機を利用して化学合成することもできる。
形質転換体を培養して培養液を回収し、本発明のポリペプチドのヘパリン結合能を利用し、ヘパリン・アフィニティーカラムを用いて本発明のポリペプチドを精製することが可能である。ヘパリン・アフィニティーカラムとしては例えばハイトラップ（ＨｉＴｒａｐ）ヘパリンカラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ　Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｂｉｏｔｅｃｈ　ＡＢ社製）、ヘパリンセファロースＣＬ−６Ｂ（アマシャム・ファルマシア・バイオテク社製）等を用いることができる。カラムに本発明のポリペプチドを結合させ緩衝液で洗浄後、緩衝液を用いて溶出させ、一定量ずつ分画しながら回収し、本発明のポリペプチドを含有する分画だけを集めることにより、本発明のポリペプチドを精製することができる。
精製した本発明のポリペプチドの構造解析は、蛋白質化学で通常用いられる方法、例えば遺伝子クローニングのためのタンパク質構造解析（平野久著、東京化学同人発行、１９９３年）に記載の方法により実施可能である。
本発明のヘパリン結合能をもつポリペプチドは、上記のように該ポリペプチドをコードする本発明のＤＮＡを用いた組換えＤＮＡ法により、製造することができるが、別法として、ラミニンα４鎖のＧドメインをまず調製した後に、各種プロテアーゼによる分解処理により調製することも可能である。また、該ペプチドについては、ペプチドシンセサイザー等を用いた合成法により簡便に調製することができる。
以下に、本発明のヘパリン結合能をもつラミニンα４鎖由来の部分ポリペプチドのプロテアーゼ処理および合成法による調製、該ポリペプチドのヘパリン結合能の解析法について具体的に記す。
（１）ラミニンα４鎖のＧドメインの大量調製
ラミニンα４鎖のＧドメイン（以下、「α４Ｇ」と表わす。）のｉｎ　ｖｉｔｒｏでの解析のためには、他のラミニンα鎖サブタイプを含まない高純度のラミニンα４Ｇを大量に調製し、解析する必要がある。そのためには、α４ＧをコードするＤＮＡを用いた遺伝子組換え法によりα４Ｇ（マウスα４Ｇ：配列番号１、ヒトα４Ｇ：配列番号２）のみを動物細胞で大量に発現させ、そこから精製する方法が好ましい。
α４ＧをコードするＤＮＡは、ＲＴ−ＰＣＲにより取得できる。すなわちα４鎖を大量に発現している臓器たとえば心臓、肺、骨格筋、胎盤等のＲＮＡからオリゴｄＴプライマーと逆転写酵素を用いてｃＤＮＡを合成し、このｃＤＮＡを鋳型にして、マウスおよびヒトのα４鎖のｃＤＮＡの塩基配列から設計したα４Ｇをコードする部分の塩基配列に対応するプライマーを用いてＰＣＲを行うことにより得られる。α４鎖のｃＤＮＡの塩基配列は、ヒト、マウスとも公知である〔マウスα４：ＧｅｎＢａｎｋアクセス番号Ｕ５９８６５、Ｍａｔｒｉｘ　Ｂｉｏｌ．，１５，４３３（１９９６）、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７２，２７８６２（１９９７）、ヒトα４：ＧｅｎＢａｎｋアクセス番号Ｘ７６９３９、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２３８，８１３（１９９６）〕。
α４Ｇは、上述した方法に従って、マウスおよびヒトのα４ＧをコードするＤＮＡを発現用ベクターに挿入して構築した発現プラスドを宿主細胞に導入して、α４Ｇのみを大量に分泌発現する形質転換体を取得し、その形質転換体を培養することにより生産させることができる。
（２）α４Ｇの部分ポリペプチドおよび部分ペプチドの調製
α４Ｇをαキモトリプシンやトリプシン等のエンドプロテアーゼで処理することによりα４Ｇを断片化することができる。また、α４Ｇのアミノ酸配列のデータに基づいてペプチド合成機を用いて固相化学合成をすることにより、任意の位置および長さのα４Ｇの部分ペプチドを得ることが可能である。このようにして得られたα４Ｇ部分ポリペプチドおよび部分ペプチドについて、（３）に述べるヘパリン結合能の測定を行い、ヘパリン結合能を有する部分ポリペプチドを選択する。
ヘパリン結合能を有するα４Ｇ部分ポリペプチドとしては、例えば、マウスα４Ｇのキモトリプシン分解により得られるＮ末端のアミノ酸配列がＬｙｓ　Ｐｈｅ　Ｌｅｕ　Ｇｌｕ　Ｇｌｎ　Ｌｙｓ　Ａｌａである３９ｋＤａおよび４４ｋＤａのポリペプチド、Ｎ末端のアミノ酸配列がＴｈｒ　Ｇｌｎ　Ｓｅｒ　Ａｒｇ　Ａｌａ　Ａｌａ　Ｓｅｒである４１ｋＤａのポリペプチド、マウスα４Ｇのトリプシン分解により得られる４５ｋＤａおよび４０ｋＤａのポリペプチド、Ｎ末端のアミノ酸配列がＡｌａ　Ｉｌｅ　Ｇｌｕ　Ｈｉｓ　Ａｌａ　Ｔｙｒ　Ｇｌｎである２３ｋＤａおよび３５ｋＤａのポリペプチド、配列番号３、４または６に示すアミノ酸配列を有するポリペプチド、またはα４ＧのモジュールＬＧ４を含むポリペプチドなどを挙げることができる。
ヘパリン結合能を有するα４Ｇの部分ペプチドとして配列番号１７または３３に示すアミノ酸配列を含むペプチドを挙げることができる。
（３）α４Ｇの部分ポリペプチド、部分ペプチドの改変体の調製
ヘパリン結合能を有するポリペプチドとして、上記に挙げたラミニンα４鎖由来のヘパリン結合性ポリペプチドが有するアミノ酸配列において１以上のアミノ酸が欠失、置換および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつヘパリン結合能を保持したポリペプチドを挙げることができる。
上記ポリペプチドの有するアミノ酸配列において１以上のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなり、かつヘパリン結合能を有するポリペプチドは、モレキュラー・クローニング第２版、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１０，６４８７（１９８２）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７９，６４０９（１９８２）、Ｇｅｎｅ，３４，３１５（１９８５）、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１３，４４３１（１９８５）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８２，４８８（１９８５）等に記載の部位特異的変異導入法を用いて、例えば、上記の配列番号で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするＤＮＡに部位特異的変異を導入することにより、取得することができる。
欠失、置換もしくは付加されるアミノ酸の数は特に限定されないが、上記の部位特異的変異法等の周知の方法により欠失、置換もしくは付加できる程度の数であり、１個から数１０個、好ましくは１〜２０個、より好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個である。
上記部位特異的変異法により改変されたポリペプチドにおいて、改変前のヘパリン結合能を有するポリペプチドとしては、改変前のポリペプチドが有するアミノ酸配列と、ＢＬＡＳＴ〔Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２１５，４０３（１９９０）〕やＦＡＳＴＡ〔Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１８３，６３（１９９０）〕などの解析ソフトで計算したときに、少なくとも６０％以上の相同性を有するポリペプチド、好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、特に好ましくは９５％以上、最も好ましくは９７％以上の相同性を有しているポリペプチドを挙げることができる。
尚、本明細書に記載される相同性の数値は、特に明示した場合を除き、当業者に公知の相同性検索プログラムを用いて算出される数値であってよいが、好ましくはＢＬＡＳＴやＦＡＳＴＡにおいてデフォルト（初期設定）のパラメータを用いて算出される数値である。
（４）糖鎖を付加または欠損させたα４Ｇの部分ポリペプチド、部分ペプチドの調製
ラミニンα４鎖のＧドメイン中にはＮ結合型糖鎖が付加される部位が複数存在することから、ヘパリン結合能を有するポリペプチドとして、Ｎ結合型糖鎖を付加または欠損させた上記ポリペプチドを挙げることができる。
上記ポリペプチドにＮ結合型糖鎖を付加させるには、例えば、糖鎖付加能力を有する真核細胞を宿主として、上記ポリペプチドをコードするＤＮＡを含む発現プラスミドを導入した組換え細胞体を作製し、その組換え細胞を培養して、上記ポリペプチドを製造する方法が挙げられる。一方、上記ポリペプチドのＮ結合型糖鎖を欠損させるには、糖鎖付加能力を有さない宿主細胞、またはＮ結合型糖鎖の合成に関与する糖転移酵素を欠損させることにより糖鎖付加能力が無くなった真核細胞を宿主として製造することができる。また、Ｎ結合型糖鎖の分解酵素により糖鎖を分解することにより製造することもできる。Ｎ結合型糖鎖の分解酵素として、例えば、ツニカマイシンやＮ−グルコシダーゼが挙げられる。
（５）ヘパリン結合能の測定
α４Ｇあるいはα４Ｇ部分ポリペプチドおよびα４Ｇ部分ペプチド等について、以下のような方法でヘパリン結合能を測定することができる。以下の記載では、測定するα４Ｇあるいはα４Ｇ部分ポリペプチドおよびα４Ｇ部分ペプチド等を「測定サンプル」とする。
（５−１）ヘパリン・アフィニティーカラムを使用する方法
ハイトラップ・ヘパリンカラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ　Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｂｉｏｔｅｃｈ　ＡＢ社製）等のヘパリン・アフィニティーカラムに、測定サンプルを繰り返し通して結合させた後、ＮａＣｌの直線濃度勾配の緩衝液を一定の流速でカラムに通すことにより溶出させ、一定量ずつ分画しながら回収する。各画分についてＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）を行い、クマージー・ブリリアント・ブルー（ＣＢＢ）染色あるいは測定サンプルと特異的に結合できる抗体を用いたイムノブロット法により、各分画に含まれる測定サンプルを検出し、ヘパリンと解離する塩濃度を算出する。解離塩濃度が高いほどヘパリンとの結合性が強いと判断できる。
（５−２）固相化ヘパリンを使用する方法
抗原の検出に用いられるサンドイッチＥＬＩＳＡ法と同様な手法で、プレートに抗体のかわりにヘパリンを固定化することにより、ヘパリンと結合した測定サンプルを検出することができる。ヘパリンは、マイクロウェルプレートにウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）と結合させたヘパリンの溶液を入れ数時間〜一晩静置することにより固相化できる。ＢＳＡやスキムミルク等により非特異的結合をブロック後、測定サンプルの溶液を接触させて結合させ、洗浄後、結合した測定サンプルの量を測定する。
測定サンプルの量は、以下のようにして測定できる。まず溶液中で測定サンプルと特異的に結合できる抗体（１次抗体）を適当な濃度に希釈して添加し、プレート上のヘパリンと結合した測定サンプルと接触させて結合させる。洗浄後、１次抗体を検出できる標識２次抗体、たとえば１次抗体を作製した動物のＩｇＧに対する抗体をホースラディッシュ・パーオキシダーゼやアルカリ・フォスファターゼ等の酵素で標識したもの等を適当な濃度に希釈して添加して、１次抗体と結合させる。洗浄後、２次抗体の標識物に応じた検出法、たとえばホースラディッシュ・パーオキシダーゼの場合はＨ_２Ｏ_２存在下でｏ−フェニレンジアミン等の発色基質を反応させて分光光度計で発色量を測定する方法等により、ヘパリンと結合した測定サンプルの検出ができる。
この方法では、測定サンプルの濃度がある濃度以上ではプレート上のヘパリンに結合する量が飽和するので、最終的な発色量等の検出値にも飽和値が存在する。段階的に測定サンプルの濃度を変えて測定し、検出値の飽和値を求めて、その半分の検出値（半飽和値）を与える測定サンプルの濃度を算出する。半飽和値の値が低いほどヘパリンとの結合能が強いと判断できる。
（５−３）ヘパリン固定化ビーズを使用する方法
測定サンプルのヘパリン結合能の強さの比較はできないが、ヘパリン結合能の有無を簡便に測定する方法である。ヘパリンを固定化したビーズと測定サンプルを適当な緩衝液中で接触させて結合させた後、ビーズを洗浄してＳＤＳ−ＰＡＧＥ用サンプル緩衝液中に測定サンプルを溶出させる。このＳＤＳ−ＰＡＧＥ用サンプル緩衝液でＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、ＣＢＢ染色あるいは測定サンプルと特異的に結合できる抗体を用いたイムノブロット法により、ヘパリン固定化ビーズに結合した測定サンプルを検出する。
（５−４）α４Ｇのヘパリン結合の阻害
（１）〜（３）において、α４Ｇのヘパリン結合能を、α４Ｇ以外の測定サンプルを共存させた場合と、α４Ｇ以外の測定サンプルを添加しないα４Ｇ単独の場合で測定する。両者を比較し、測定サンプルが存在した場合のα４Ｇのヘパリン結合能が阻害された場合は、測定サンプルはヘパリンと結合能があるといえる。段階的に測定サンプルの濃度を変えて測定し、５０％阻害する測定サンプルの濃度を算出する。５０％阻害濃度の値が低いほどヘパリンとの結合能が強いと判断できる。
２．本発明のポリペプチドの利用
α４鎖の組織や生体における機能は、細胞外マトリックスにおけるヘパリンとの結合が非常に重要であると考えられる。癌の成長時や脂肪細胞の新生毛細血管との接触構造の形成においては、α４鎖が特異的に関与すると考えられるので、本発明のヘパリン結合能を有するα４Ｇを含むポリペプチド、α４Ｇ部分ポリペプチドまたはα４Ｇ部分ペプチドが細胞外マトリックスにおけるヘパリンとの結合を阻害する場合、これらは細胞と毛細血管との接触を阻害し、血管の新生を阻害し、癌の成長を阻害すると考えられる。また、α４鎖のヘパリンとの結合部位の解析、例えばそのアミノ酸配列や高次構造の解析等は、細胞と毛細血管との接触の阻害剤、血管新生阻害剤あるいは抗癌剤のドラッグデザインに役立つと考えられる。
細胞と毛細血管の接触、血管新生が関与する疾患としては、固形癌、癌の転移、糖尿病性網膜症、未熟児網膜症、加齢黄班変性症、血管新生緑内症、慢性関節リウマチ、または乾せん等が挙げられ、本発明のポリペプチドは、該疾患に対する医薬として利用できる。
ヘパリン結合能を有するα４Ｇ、α４Ｇ部分ポリペプチド、α４Ｇ部分ペプチドは、細胞外マトリックスにおいてα４鎖とヘパリンの結合を阻害し、ヘパリン結合性の因子の遊離をもたらす。したがって細胞に外からヘパリン結合能を有するα４Ｇ、α４Ｇ部分ポリペプチド、α４Ｇ部分ペプチドを投与することによりヘパリン結合性の情報伝達分子の濃度勾配形成あるいはシグナル伝達を阻害することができる。ヘパリン結合性の情報伝達分子としてはＷｎｔやＦＧＦの他、ＨＢ−ＥＧＦ（Ｈｅｐａｒｉｎ−ｂｉｎｄｉｎｇ　ｅｐｉｄｅｒｍａｌ　ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒ）、ＰＤＧＦ（Ｐｌａｔｅｌｅｔ−ｄｅｒｉｖｅｄ　ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒ）ＢＭＰ（Ｂｏｎｅ　ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｉｃ　ｐｒｏｔｅｉｎ）、ＧＭ−ＣＳＦ（Ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅ−ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ　ｃｏｌｏｎｙ　ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ　ｆａｃｔｏｒ）、ＨＧＦ（Ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ　ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒ）、ケモカイン、ＴＮＦ（Ｔｕｍｏｒ　ｎｅｃｒｏｓｉｓ　ｆａｃｔｏｒ）等を挙げることができる。これら情報伝達分子の濃度勾配形成やシグナル伝達を阻害することにより細胞の分化や増殖を阻害することができる。
ヘパリン結合能を有する、α４Ｇを含むポリペプチド、α４Ｇ部分ポリペプチドを含むポリペプチドまたはα４Ｇ部分ペプチドを含むポリペプチドを含有する医薬製剤は、活性成分として該ポリペプチドを単独で、あるいは任意の他の治療のための有効成分との混合物として含有することができる。また、それらの医薬製剤は、活性成分を薬理学的に許容される一種あるいはそれ以上の担体と一緒に混合し、製剤学の技術分野においてよく知られる任意の方法により製造される。
投与経路は、治療に際し最も効果的なものを使用するのが望ましく、経口または、例えば静脈内などの非経口をあげることができる。
投与形態としては、錠剤、散剤、顆粒剤、シロップ剤、注射剤などがある。
経口投与に適当な、例えばシロップ剤のような液体調製物は、水、ショ糖、ソルビトール、果糖などの糖類、ポリエチレングリコール、プロピレングリコールなどのグリコール類、ごま油、オリーブ油、大豆油などの油類、ｐ−ヒドロキシ安息香酸エステル類などの防腐剤、ストロベリーフレーバー、ペパーミントなどのフレーバー類などを添加剤として用いて製造できる。また、錠剤、散剤および顆粒などは、乳糖、ブドウ糖、ショ糖、マンニトールなどの賦形剤、デンプン、アルギン酸ナトリウムなどの崩壊剤、ステアリン酸マグネシウム、タルクなどの滑沢剤、ポリビニルアルコール、ヒドロキシプロピルセルロース、ゼラチンなどの結合剤、脂肪酸エステルなどの界面活性剤、グリセリンなどの可塑剤などを添加剤として用いて製造できる。
非経口投与に適当な製剤は、好ましくは受容者の血液と等張である活性成分を含む滅菌水性剤からなる。例えば、注射剤の場合は、塩溶液、ブドウ糖溶液、または塩溶液とブドウ糖溶液の混合物からなる担体などを用いて注射用の溶液を調製する。
また、これらの非経口剤においても経口剤で例示した、糖類、グリコール類、油類、防腐剤、フレーバー類、賦形剤、崩壊剤、添加剤、滑沢剤、結合剤、界面活性剤、可塑剤などから選択される１種もしくはそれ以上の補助成分を添加することもできる。
ヘパリン結合能を有する、α４Ｇを含むポリペプチド、α４Ｇ部分ポリペプチドを含むポリペプチドまたはα４Ｇ部分ペプチドを含むポリペプチドの投与量または投与回数は、投与形態、患者の年齢、体重、治療すべき症状の性質もしくは重篤度により異なるが、通常経口の場合、成人１人当たり１μｇ〜１ｇを１日１回ないし数回投与する。静脈内投与などの非経口投与の場合、成人１人当たり０．１μｇ〜１００ｍｇを１日１回ないし数回投与する。しかしながら、これら投与量および投与回数に関しては、前述の種々の条件により変動する。
３．本発明のＤＮＡまたは組換え体ＤＮＡの医薬としての利用
本発明のＤＮＡを含有するウイルスベクターを用いた遺伝子治療剤は、組換えウイルスベクターおよび遺伝子治療剤に用いる基剤を調合することにより製造することができる〔Ｎａｔｕｒｅ　Ｇｅｎｅｔ．，８，４２（１９９４）〕。
本発明のＤＮＡ断片をウイルスベクター内のプロモーターの下流に挿入することにより、組換えウイルスベクターを造成する。
該組換えウイルスベクターを、該ベクターに適合したパッケージング細胞に導入する。
パッケージング細胞としては、対応する組換えウイルスベクターにおいて欠損しているウイルスのパッケジーングに必要な遺伝子がコードするポリペプチドを補給できる細胞は全て用いることができ、例えば下記ポリペプチドを発現したヒト腎臓由来のＨＥＫ２９３細胞やマウス繊維芽細胞ＮＩＨ３Ｔ３などを用いることができる。
パッケージング細胞で補給するポリペプチドとしては、レトロウイルスベクターの場合はマウスレトロウイルス由来のｇａｇ，ｐｏｌ，ｅｎｖなどのポリペプチドが、レンチウイルスベクターの場合はＨＩＶウイルス由来のｇａｇ，ｐｏｌ，ｅｎｖ，ｖｐｒ，ｖｐｕ，ｖｉｆ，ｔａｔ，ｒｅｖ，ｎｅｆなどのポリペプチド、アデノウイルスベクターの場合はアデノウイルス由来のＥ１Ａ・Ｅ１Ｂなどのポリペプチドが、アデノ随伴ウイルスの場合はＲｅｐ（ｐ５，ｐ１９，ｐ４０），Ｖｐ（Ｃａｐ）などのポリペプチドが、センダイウイルスの場合はＮＰ、Ｐ／Ｃ、Ｌ、Ｍ、Ｆ、ＨＮなどのポリペプチドが挙げられる。
ウイルスベクターとしては上記パッケージング細胞において組換えウイルスが生産でき、標的細胞で本発明のＤＮＡを転写できる位置にプロモーターを含有しているものが用いられる。プラスミドベクターとしてはＭＦＧ〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９２，６７３３−６７３７（１９９５）〕、ｐＢａｂｅＰｕｒｏ〔Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．，１８，３５８７−３５９６（１９９０）〕、ＬＬ−ＣＧ、ＣＬ−ＣＧ、ＣＳ−ＣＧ、ＣＬＧ〔Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，７２，８１５０−８１５７（１９９８）〕、ｐＡｄｅｘ１〔Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．，２３，３８１６−３８２１（１９９５）〕等が用いられる。
プロモーターとしては、ヒト組織中で発現できるものであればいずれも用いることができ、例えば、サイトメガロウイルス（ヒトＣＭＶ）のＩＥ（ｉｍｍｅｄｉａｔｅ　ｅａｒｌｙ）遺伝子のプロモーター、ＳＶ４０の初期プロモーター、レトロウイルスのプロモーター、メタロチオネインプロモーター、ヒートショックタンパク質プロモーター、ＳＲαプロモーター等を挙げることができる。また、ヒトＣＭＶのＩＥ遺伝子のエンハンサーをプロモーターと共に用いてもよい。
パッケージング細胞への組換えウイルスベクターの導入法としては、例えば、リン酸カルシウム法（特開平２−２２７０７５号公報）、リポフェクション法〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８４，７４１３（１９８７）〕等を挙げることができる。
本発明のＤＮＡを含有するウイルスベクターを用いた遺伝子治療剤は、細胞と毛細血管の接触を伴う疾患、血管新生が関与する疾患などの治療または予防のための医薬として利用することができる。
細胞と毛細血管の接触、血管新生が関与する疾患としては、癌、癌の転移、糖尿病性網膜症、未熟児網膜症、加齢黄班変性症、血管新生緑内症、慢性関節リウマチ、または乾せん等が挙げられ、本発明のＤＮＡまたは組換え体ＤＮＡは、該疾患に対する医薬として利用できる。
遺伝子治療剤に用いる基剤としては、通常注射剤に用いる基剤であればどのようなものでもよく、蒸留水、塩化ナトリウムまたは塩化ナトリウムと無機塩との混合物等の塩溶液、マンニトール、ラクトース、デキストラン、グルコース等の糖溶液、グリシン、アルギニン等のアミノ酸溶液、有機酸溶液又は塩溶液とグルコース溶液との混合溶液等があげられる。また常法に従い、これらの基剤に浸透圧調整剤、ｐＨ調整剤、ゴマ油、ダイズ油等の植物油又はレシチンもしくは非イオン界面活性剤等の界面活性剤等の助剤を用いて、溶液、懸濁液、分散液として注射剤を調製してもよい。これらの注射剤を、粉末化、凍結乾燥等の操作により用時溶解用製剤として調製することもできる。本発明の遺伝子治療剤は、液体の場合はそのままで、個体の場合は必要により滅菌処理をした上記の基剤に遺伝子治療の直前に溶解して治療に使用することができる。本発明の遺伝子治療剤の投与方法としては、患者の治療部位に吸収されるように、局所的に投与する方法を挙げることができる。
適当なサイズの本発明のＤＮＡを、アデノウイルス・ヘキソン・タンパク質に特異的なポリリジン−コンジュゲート抗体と組み合わせてコンプレックスを作製し、得られたコンプレックスをアデノウイルスベクターに結合させることにより、ウイルスベクターを調製することができる。該ウイルスベクターは安定に標的細胞に到達し、エンドソームにより細胞内に取り込まれ、細胞内で分解され効率的に遺伝子を発現させることができる。
該ＤＮＡは、非ウイルス遺伝子移入法によっても病巣に輸送することができる。
当該分野で公知の非ウイルス遺伝子移入法には、リン酸カルシウム共沈法〔Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，５２，４５６−４６７（１９７３）；Ｓｃｉｅｎｃｅ，２０９，１４１４−１４２２（１９８０）〕、マイクロインジェクション法〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７７，５３９９−５４０３（１９８０）；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７７，７３８０−７３８４（１９８０）；Ｃｅｌｌ，２７，２２３−２３１（１９８１）；Ｎａｔｕｒｅ，２９４，９２−９４（１９８１）〕、リポソームを介した膜融合−介在移入法〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８４，７４１３−７４１７（１９８７）；Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２８，９５０８−９５１４（１９８９）；Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６４，１２１２６−１２１２９（１９８９）；Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ　Ｔｈｅｒ．，３，２６７−２７５（１９９２）；Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４９，１２８５−１２８８（１９９０）；Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ，８３，２００７−２０１１（１９９２）〕あるいは直接ＤＮＡ取り込みおよび受容体−媒介ＤＮＡ移入法〔Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４７，１４６５−１４６８（１９９０）；Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６６，１４３３８−１４３４２（１９９１）；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８７，３６５５−３６５９（１９９１）；Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６４，１６９８５−１６９８７（１９８９）；ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，１１，４７４−４８５（１９９１）；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８７，３４１０−３４１４（１９９０）；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８８，４２５５−４２５９（１９９１）；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８７，４０３３−４０３７（１９９０）；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８８，８８５０−８８５４（１９９１）；Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ　Ｔｈｅｒ．，３，１４７−１５４（１９９１）〕等を挙げることができる。
リポソームを介した膜融合−介在移入法ではリポソーム調製物を標的とする組織に直接投与することにより、当該組織の局所的な遺伝子の取り込みおよび発現が可能であることが癌に関する研究において報告されている〔Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ　Ｔｈｅｒ．，３，３９９−４１０（１９９２）〕。従って同様の効果が本発明のＤＮＡおよびポリペプチドが関与する疾患病巣でも期待される。ＤＮＡを病巣に直接ターゲッティングするには、直接ＤＮＡ取り込み技術が好ましい。受容体−媒介ＤＮＡ移入は、例えば、ポリリジンを介して、タンパク質リガンドにＤＮＡ（通常、共有的に閉環したスーパーコイル化プラスミドの形態をとる）をコンジュゲートすることによって行う。リガンドは、標的細胞または組織の細胞表面上の対応するリガンド受容体の存在に基づいて選択する。当該リガンド−ＤＮＡコンジュゲートは、所望により、血管に直接注射することができ、受容体結合およびＤＮＡ−タンパク質コンプレックスの内在化が起こる標的組織に指向し得る。ＤＮＡの細胞内破壊を防止するために、アデノウイルスを同時感染させて、エンドソーム機能を崩壊させることもできる。
本発明のＤＮＡまたは該ＤＮＡを含む組換え体ＤＮＡ等を含有する上記の遺伝子治療剤を、細胞へ導入し、該ＤＮＡにコードされるポリペプチドを発現させることにより、細胞と細胞外マトリックスとの結合、細胞と毛細血管の接触、血管新生、細胞の増殖、分化、癌の成長、あるいは癌の転移などを制御することができる。
さらに、Ｗｎｔ１、ＦＧＦ（Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ　ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒ）、ＨＢ−ＥＧＦ（Ｈｅｐａｒｉｎ−ｂｉｎｄｉｎｇ　ｅｐｉｄｅｒｍａｌ　ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒ）、ＰＤＧＦ（Ｐｌａｔｅｌｅｔ−ｄｅｒｉｖｅｄ　ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒ）、ＢＭＰ（Ｂｏｎｅ　ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｉｃ　ｐｒｏｔｅｉｎ）、ＧＭ−ＣＳＦ（Ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅ−ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ　ｃｏｌｏｎｙ　ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ　ｆａｃｔｏｒ）、ＨＧＦ（Ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ　ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒ）、ケモカイン、ＴＮＦ（Ｔｕｍｏｒ　ｎｅｃｒｏｓｉｓ　ｆａｃｔｏｒ）などのヘパリン結合性の情報伝達分子を細胞から遊離させたり、上記ヘパリン結合性情報伝達分子の濃度勾配形成あるいはシグナル伝達を阻害することができる。これら情報伝達分子の濃度勾配形成やシグナル伝達を阻害することにより細胞の分化や増殖を阻害することができる。
発明を実施するための最良の形態
以下に実施例を挙げて、本発明を具体的に説明する。但し、これらの実施例は説明のためのものであり、本発明の技術的範囲を限定するものではない。
〔実施例１〕　マウスα４Ｇのヘパリン結合能
（１）マウスα４Ｇの動物細胞での発現
宿主となるジヒドロ葉酸デヒドロゲナーゼ（ｄｈｆｒ）遺伝子欠損チャイニーズ・ハムスター卵巣細胞株ＣＨＯ　ＤＧ４４〔Ｃｅｌｌ，３３，４０５（１９８３）〕を、核酸含有α−ＭＥＭに１０％ウシ胎児血清および抗生物質を添加した培地で培養し維持した。
λＺＡＰ　ＩＩ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）をベクターにしたマウス心臓ｃＤＮＡライブラリーを作製し、マウスラミニンα４鎖ｃＤＮＡ断片〔Ｍａｔｒｉｘ　Ｂｉｏｌ．，１６，２２３（１９９７）〕をプローブにして、プラークハイブリダイゼーションにより選択したポジティブクローンをイン・ビボ・エクシジョン（ｉｎ　ｖｉｖｏ　ｅｘｃｉｓｉｏｎ）によりプラスミドに変換し、マウスラミニンα４鎖のｃＤＮＡクローンｐＡ４−３（配列番号３４の４２６１番目以降およびｐｏｌｙ　Ａに相当する１．４ｋｂのｃＤＮＡを有する。配列番号３４は、Ｍａｔｒｉｘ　Ｂｉｏｌ．，１５，４３３（１９９６）の記載に基づくマウスラミニンα４鎖ｃＤＮＡの塩基配列）、ｐＡ４−８（配列番号３４の３６５８〜５０２１番めに相当する１．４ｋｂのｃＤＮＡを有する）、ｐＡ４−１４（配列番号３４の２７１４〜４６１１番めに相当する１．９ｋｂのｃＤＮＡを有する）、ｐＡ４−１５（配列番号３４の８４０〜３３１５番目に相当する２．５ｋｂのｃＤＮＡを有する）を単離した。
このｃＤＮＡクローンから、プラスミドｐＥＦΔβ１Ｓ〔ＦＥＢＳ．Ｌｅｔｔ．，４００，７１（１９９７）〕を利用し、以下のようにして、ラミニンα４Ｇ（マウスラミニンα４鎖の^８３３Ｇｌｙ〜^１８１５Ａｌａの領域）発現用プラスミドｐＥＦα４Ｇｍｙｃを作製した。ｐＥＦΔβ１Ｓは、ＥＦ−１（ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ　ｆａｃｔｏｒ−１）プロモーター、開始コドン、分泌発現のためのエリスロポエチンのシグナルペプチドをコードする配列、クローニングサイト、抗ｃ−ｍｙｃ抗体で発現蛋白を検出するためのｍｙｃタグペプチドをコードする配列、終止コドン、ネオマイシン耐性遺伝子発現ユニット、ＳＶ４０複製オリジン、大腸菌内での複製オリジンとアンピシリン耐性遺伝子発現ユニットを有する動物細胞での外来遺伝子発現型のプラスミドである。
ｐＡ４−８の０．７ｋｂのＥｃｏＲＩ−ＸｂａＩ断片と、ｐＡ４−１４の１．４ｋｂのＳａｃＩ−ＥｃｏＲＩ断片を、ＥｃｏＲＩでつなげるようにしてプラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ　ＳＫＩＩ（＋）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）のＳａｃＩ／ＸｂａＩサイト間に挿入し、プラスミドｐＢＳＡ４Ｓａｃ／Ｘｂａを作製した。また、ｐＡ４−３を鋳型にして５’端にＥｃｏＲＶサイトを有するリバースプライマーを用いてＰＣＲを行うことにより、３’端にＥｃｏＲＶサイトを有し、マウスラミニンα４ｃＤＮＡの４９５４〜５４４５番目に相当する配列を増幅し、単離した。この断片をＸｂａＩとＥｃｏＲＶで切断し、ｐＢＳＡ４Ｓａｃ／ＸｂａのＸｂａＩ／ＥｃｏＲＶサイト間に挿入することにより、ｐＢＳＡ４Ｓａｃ／ＥｃｏＲＶを作製した。また、ｐＡ４−１５を鋳型にして５’端にＳｍａＩサイトを有するフォワードプライマーを用いてＰＣＲを行うことにより、５’端にＳｍａＩサイトを有する配列番号３４の２４９７〜２７５８番目に相当する配列を増幅し、単離した。この断片をＳｍａＩとＳａｃＩで切断したものと、ｐＢＳＡ４Ｓａｃ／ＥｃｏＲＶのＳａｃＩ−ＥｃｏＲＶ断片を、ＳａｃＩでつなげるようにしてベクターｐＥＦΔβ１ＳのＳｍａＩ／ＥｃｏＲＶサイト間に挿入することにより、ｐＥＦα４Ｇｍｙｃを作製した。作製後、挿入断片の塩基配列（配列番号３４の２４９７〜５４４５番目に相当する）を確認した。
ｐＥＦα４Ｇｍｙｃは、α４ＧのＣ末端にｍｙｃタグペプチドの配列が付加したポリペプチドを、エリスロポエチンのシグナルペプチドを利用して、ＥＦ−１プロモーターの制御下で分泌発現できるプラスミドである。
また、対照用としてマウスラミニンα１鎖のＧドメイン（ラミニンα１鎖の^２１００Ｉｌｅ〜^３０６０Ｐｒｏの領域、以下α１Ｇとする）をコードするＤＮＡ断片をマウス胚性癌細胞株Ｆ９（ＡＴＣＣ　ＣＲＬ−１７２０）から抽出したＲＮＡを鋳型にして、５’端にＢａｍＨＩサイトを有するフォワードプライマーおよび５’端にＥｃｏＲＶサイトを有するリバースプライマーを用いたＲＴ−ＰＣＲにより増幅し、ＢａｍＨＩとＥｃｏＲＶで処理後、ｐＥＦΔβ１ＳのＢａｍＨＩ／ＥｃｏＲＶサイト間に挿入することにより、ｐＥＦα１Ｇｍｙｃ作製した。ｐＥＦα１Ｇｍｙｃは、ｐＥＦα４Ｇｍｙｃと同様に、α１ＧのＣ末端にｍｙｃタグペプチドの配列が付加したポリペプチドを、エリスロポエチンのシグナルペプチドを利用して、ＥＦ−１プロモーターの制御下で分泌発現できるプラスミドである。図１にｐＥＦα４ＧｍｙｃおよびｐＥＦα１Ｇｍｙｃの構造を示した。
以上のように作製したプラスミドを、それぞれｄｈｆｒミニ遺伝子発現用プラスミドｐＧＥＮＳＶｄｈｆｒと共に、リン酸カルシウム法によりＣＨＯ　ＤＧ４４株に導入し、Ｋａｕｆｍａｎ　ＲＪらの方法〔Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，９，１２３３（１９８９）〕に従って、ネオマイシン耐性を有する安定な形質転換体を確立し、さらにメトトレキセートを添加して培養することにより、ｄｈｆｒ遺伝子と共に導入したα４Ｇまたはα１Ｇの遺伝子を増幅させた。遺伝子増幅を行った細胞をクローン化し、各クローンの培養上清中に分泌されたα４Ｇまたはα１Ｇを、抗ｃ−ｍｙｃ抗血清（Ｓａｎｔａ　Ｃｒｕｚ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製；＃ｓｃ−７８９）を用いたドット・イムノアッセイによって検出することにより、α４Ｇまたはα１Ｇをそれぞれ大量発現するものを選択し、大量発現クローンとして樹立した。なお、安定な形質転換体を確立した後の細胞培養は、核酸不含α−ＭＥＭ培地を用いて行った。
（２）発現したα４Ｇまたはα１Ｇの解析
樹立されたそれぞれのα４Ｇまたはα１Ｇ発現クローンをディッシュで接着培養したものについて、培養上清を除き、ダルベッコ改変ＰＢＳで洗浄した後、１０μｇ／ｍｌツニカマイシン（ｔｕｎｉｃａｍｙｃｉｎ；Ｎ結合型糖鎖合成阻害剤）を含む培地と対照としてツニカマイシンを含まない培地それぞれを添加して、１２時間培養した。培養後の細胞と培養上清それぞれについて、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１２％アクリルアミド）を行った後、抗ｃ−ｍｙｃ抗血清を用いたイムノブロットにより発現したα４Ｇまたはα１Ｇを検出した。イムノブロットは以下のようにして行った。まず、ゲルからＨｙｂｏｎｄ　ＥＣＬニトロセルロース膜（Ａｍｅｒｓｈａｍ　Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｂｉｏｔｅｃｈ　ＡＢ社製）にポリペプチドを転写した。膜に５％（ｗ／ｖ）スキムミルクを含むＰＢＳ（イムノブロット・ブロッキング液）を乗せて室温で２時間静置し、非特異的結合のブロッキングを行った。０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０を含むＰＢＳ（イムノブロット洗浄液）で５回洗浄した後、イムノブロット・ブロッキング液で１／４００に希釈した抗ｃ−ｍｙｃ抗血清と室温で２時間反応させた。イムノブロット洗浄液で洗浄後、イムノブロット・ブロッキング液で１／１０００に希釈したホースラディッシュ・パーオキシダーゼ標識抗ウサギＩｇＧ（Ａｍｅｒｓｈａｍ　Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｂｉｏｔｅｃｈ　ＡＢ社製）と室温で１時間反応させ、ＥＣＬウェスタン・ブロッティング検出試薬（Ａｍｅｒｓｈａｍ　Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｂｉｏｔｅｃｈ　ＡＢ社製）を用いて、バンドを検出した。
その結果を図２Ａに示した。図２Ａの右の４レーンがα４Ｇ、左の４レーンがα１Ｇの発現細胞について、Ｔｕｎ＋はツニカマイシン添加、Ｔｕｎ−はツニカマイシン非添加での培養を表している。Ｍは培養上清、Ｃは細胞を泳動試料とした場合を示し、左の矢印は分子量マーカーの位置を示している。
ツニカマイシンを含む培地では、ツニカマイシンを含まない通常の培地に比較して、α４Ｇまたはα１Ｇ共に分子量がＮ結合型糖鎖が付加しないため低下した。また、ツニカマイシンを含まない培地で増加する分子量は、α１Ｇの方がα４Ｇよりも顕著であった。これは、Ｎ結合型糖鎖が付加しうるアミノ酸残基がα４Ｇが５ヶ所なのに対し、α１Ｇでは７ヶ所あるためと考えられる。また、ツニカマイシンによりＮ結合型糖鎖の合成を阻害した場合、α４Ｇはほとんど培地中に分泌されなかった。
また、ツニカマイシンを含まない通常の培地で培養したα４Ｇまたはα１Ｇ発現細胞の培養上清について、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを還元条件〔２％（ｖ／ｖ）２−メルカプトエタノール添加〕と非還元条件（２−メルカプトエタノール非添加）で行った後、同様にイムノブロットによりα４Ｇまたはα１Ｇを検出した。
その結果を図２Ｂに示した。図２Ｂの左の２レーンは非還元条件、右の２レーンは還元条件でＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った場合で、α４Ｇはα４Ｇ発現細胞、α１Ｇはα１Ｇ発現細胞の各培養上清を泳動試料とした。右の矢印は分子量マーカーの位置を示している。
α１Ｇでは、あまり泳動度に変化がないのに対し、α４Ｇでは還元条件に比べて非還元条件での泳動度が明らかに増加しており、充分にジスルフィド結合の形成が進行していると考えられた。
（３）α４Ｇおよびα１Ｇの精製
（１）で作製したα４Ｇおよびα１Ｇ発現細胞を培養し、それぞれから培養液約５００ｍｌを回収した。１０００×ｇで１０分間遠心分離することにより細胞の断片等の固形物を除いた後の上清に０．５ｍｍｏｌ／ｌの濃度になるようにＮ−エチルマレイミド（Ｎ−ｅｔｈｙｌｍａｌｅｉｍｉｄｅ）を添加した。この培養上清を３ｍｌ／分の流速で、緩衝液Ａ〔１０ｍｍｏｌ／ｌ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、１５０ｍｍｏｌ／ｌ　ＮａＣｌ、２ｍｍｏｌ／ｌエチレンジアミン４酢酸（ｅｔｈｙｌｅｎｅ　ｄｉａｍｉｎｅ　ｔｅｔｒａａｃｅｔａｔｅ；ＥＤＴＡ）、０．５ｍｍｏｌ／ｌ　Ｎ−エチルマレイミド〕で平衡化したヘパリン・アフィニティー・カラムであるハイトラップ・ヘパリンカラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ　Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｂｉｏｔｅｃｈ　ＡＢ社製、容量５ｍｌ）に通した。出てきた流出液を同じ流速で再度カラムに通すことを５回繰り返し、α４Ｇまたはα１Ｇをカラムに確実に結合させた。α４Ｇあるいはα１Ｇが結合したカラムをｆａｓｔ　ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ　ｌｉｑｕｉｄ　ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ（以下、ＦＰＬＣ）システム（Ａｍｅｒｓｈａｍ　Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｂｉｏｔｅｃｈ　ＡＢ社製）に接続し、３０ｍｌの緩衝液Ａで洗浄後、ＮａＣｌ直線濃度勾配１５０−６００ｍｍｏｌ／ｌの緩衝液Ａ１５０ｍｌを流速０．５ｍｌ／分で通すことによりα４Ｇまたはα１Ｇを溶出させ、溶出液を２．５ｍｌずつ分画して回収した。
各分画２０μｌを用いてＳＤＳ−ＰＡＧＥ（８％アクリルアミド、還元条件）を行うと共に、各分画の蛋白質濃度を、ＢＳＡを標準としたＢＣＡ蛋白質アッセイ試薬（Ｐｉｅｒｃｅ社製）を用いて測定した。その結果を図３に示した。
図３のＡ、Ｂはα１Ｇの発現細胞、Ｃ、Ｄはα４Ｇの発現細胞の各培養上清についての図である。ＡとＣは各カラム溶出液画分（横軸）の蛋白濃度を示し、点線は溶出液のＮａＣｌ濃度（縦右軸）、●は各カラム溶出液画分の蛋白濃度（縦左軸）である。Ｂ、Ｄはその各カラム溶出液画分１つおきのＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示している。Ｂ、Ｄの横軸の数字はＡ、Ｃの横軸の溶出画分の数字と同一であり、Ｍは分子量マーカーである。縦軸の数字と矢印は分子量マーカーの分子量とバンドの位置を示している。
α１ＧはＮａＣｌ濃度３００ｍｍｏｌ／ｌで溶出されたのに対しα４ＧはＮａＣｌ濃度４７０ｍｍｏｌ／ｌで溶出され、α４Ｇの方がα１Ｇよりもヘパリンに対する結合能が強いことが示された。
α４Ｇまたはα１Ｇを含む分画を集めて、セントリプレップ（Ｃｅｎｔｒｉｐｒｅｐ）−３０（Ａｍｉｃｏｎ社製）にかけることにより、濃縮（蛋白質濃度０．４ｍｇ／ｍｌ以上）と脱塩を行い、精製したα４Ｇおよびα１Ｇをそれぞれ約３ｍｇずつ得た。
（４）固相化ヘパリンに対するα４Ｇおよびα１Ｇの結合活性
Ａｕｍａｉｌｌｅｙ　Ｍらの方法〔Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１８４，２４１（１９８９）〕を一部変更して、固相化ヘパリンに対するα４Ｇおよびα１Ｇの結合を測定した。９６穴マルチウェルプレート（Ｎａｌｇｅ　Ｎｕｎｃ　Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ社製）に１０μｇ／ｍｌのヘパリン−ＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社製）を含む緩衝液〔１５ｍｍｏｌ／ｌ　Ｎａ_２ＣＯ_３、３５ｍｍｏｌ／ｌ　ＮａＨＣＯ_３（ｐＨ９．２）、３ｍｍｏｌ／ｌ　ＮａＮ_３〕を入れて、４℃で１８時間静置することにより、ヘパリンをウェルに固相化した。液を除き、ブロッキング液〔１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ、５０ｍｍｏｌ／ｌ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、１５０ｍｍｏｌ／ｌ　ＮａＣｌ、５ｍｍｏｌ／ｌ　ＣａＣｌ_２〕を入れて室温で２時間静置して非特異的結合をブロックした後、０．０４％　Ｔｗｅｅｎ−２０を含むＰＢＳ（１０ｍｍｏｌ／ｌ　Ｎａ_２ＨＰＯ_４、２ｍｏｌ／ｌ　ＫＨ_２ＰＯ_４、１４０ｍｍｏｌ／ｌ　ＮａＣｌ、３ｍｍｏｌ／ｌ　ＫＣｌ、以降、この０．０４％Ｔｗｅｅｎ−２０含有ＰＢＳを「洗浄用緩衝液」と呼ぶ）で５回洗浄した。（１）で得られた精製α４Ｇおよびα１Ｇを、ブロッキング液で０．０１ｎｍｏｌ／ｌ〜１μｍｏｌ／ｌに段階的に希釈して、ウェルに入れ、４℃で２時間静置してヘパリンと結合させた。洗浄用緩衝液で５回洗浄した後、抗α４Ｇ抗血清（１／１０００希釈）または抗α１Ｇ抗血清（１／１０００希釈）あるいは抗ｃ−ｍｙｃ抗血清（１／４００希釈）を反応させた。抗α４Ｇ抗血清および抗α１Ｇ抗血清は、（１）で得た精製α４Ｇあるいはα１Ｇでウサギを免疫して作製した。洗浄用緩衝液で５回洗浄した後、ホースラディッシュ・パーオキシダーゼ標識した抗ウサギＩｇＧ抗体（Ａｍｅｒｓｈａｍ　Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｂｉｏｔｅｃｈ　ＡＢ社製）を反応させた。洗浄後、０．４ｍｇ／ｍｌ　ｏ−フェニレンジアミン二塩酸（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社製）を溶解させた０．０１％Ｈ_２Ｏ_２を含む５０ｍｍｏｌ／ｌリン酸−クエン酸緩衝液を加えてパーオキシダーゼによる発色反応を行い、３ｍｏｌ／ｌ　ＨＣｌを加えて反応を停止させた。波長４９２ｎｍの吸光度をマイクロプレートリーダー（Ｂｉｏ−Ｒａｄ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）、モデル３５５０−ＵＶによって測定することにより、ヘパリンと結合したα４Ｇおよびα１Ｇの量を測定した。
その結果を図４に示した。横軸は添加したα４Ｇまたはα１Ｇの濃度（ｎｍｏｌ／ｌ）、縦軸は４９２ｎｍの吸光度を示している。●および○はα４Ｇの結合、▲および△はα１Ｇの結合を示している。●は抗α４Ｇ抗体を、○と△は抗ｃ−ｍｙｃ抗体、▲は抗α１Ｇ抗体を検出の１次抗体に用いた場合を示している。
抗α４Ｇ抗血清および抗α１Ｇ抗血清で検出した場合、α１Ｇの半飽和（結合量が飽和に達したときの吸光度の半分の値）を与える濃度が１４ｎｍｏｌ／ｌなのに対して、α４Ｇは１．４ｎｍｏｌ／ｌであり、α４Ｇのヘパリン結合活性はα１Ｇの約１０倍であると考えられた。この値は両者を抗ｃ−ｍｙｃ抗血清を用いて検出した場合にも同様であり、抗血清の反応性による差ではない。このα１Ｇの半飽和濃度は、Ｔａｌｔｓ　ＪＦらによって報告された値とほぼ一致する〔ＥＭＢＯ　Ｊ．，１８，８６３（１９９９）〕。
なおα４Ｇについて、５ｍｍｏｌ／ｌ　Ｃａ^２＋存在下で同様の結合測定を行った場合も、半飽和濃度の値はほぼ同じであり、Ｃａイオンはα４Ｇのヘパリン結合能には影響しなかった。
（５）グリコシダーゼ処理したα４Ｇのヘパリン結合能
（３）で得た精製α４Ｇ溶液（７５μｇ／２５０μｌ）にＮ−グリコシダーゼＦ（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　ＢｉｏＬａｂｓ社製）溶液１５μｌ、１０×Ｇ７緩衝液〔５００ｍｍｏｌ／ｌリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．５）〕３０μｌを添加して３７℃で一晩反応させることにより、α４ＧのＮ結合型糖鎖を除去した。対照としてＮ−グリコシダーゼＦの代わりに水１５μｌを添加して同様の条件で反応させたもの（非処理α４Ｇ）も調製した。
このグリコシダーゼ処理α４Ｇについて（２）と同様にしてまず、イムノブロット解析を行った。
その結果を図５Ａに示した。図５Ａは左からグリコシダーゼ非処理のα４Ｇ、グリコシダーゼ処理したα４Ｇ、ツニカマイシン非添加のα４Ｇ発現細胞、ツニカマイシン添加のα４Ｇ発現細胞のＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示し、左の矢印は分子量マーカーの位置を示している。
グリコシダーゼ処理したα４Ｇは、対照の非処理のα４Ｇと比較して分子量が低下しており、この分子量の変化は（２）で行ったツニカマイシン添加によるＮ結合型糖鎖合成の阻害による分子量の低下と同様であり、Ｎ−グリコシダーゼＦによりＮ結合型糖鎖が分解されたと考えられた。
また、該グリコシダーゼ処理α４Ｇについて（４）と同様にして、固相化ヘパリンに対する結合活性を調べた。
その結果を図５Ｂに示した。図５Ｂは固定化ヘパリンに対するグリコシダーゼ処理したα４Ｇまたはコントロールのグリコシダーゼ非処理のα４Ｇの結合量を１次抗体として抗ｃ−ｍｙｃ抗体を用いて検出した結果であるが、△はグリコシダーゼ処理したα４Ｇ、○はグリコシダーゼ非処理のα４Ｇの結合量を示し、横軸は添加したα４Ｇの濃度（ｎｍｏｌ／ｌ）、縦軸は４９２ｎｍの吸光度を示している。
グリコシダーゼ処理したα４Ｇは、対照の非グリコシダーゼ処理のα４Ｇと全く同じヘパリン結合能を示し、α４Ｇのヘパリン結合性にはＮ結合型糖鎖は関与していないと考えられた。
（６）尿素による変性の影響
ハイトラップ・ヘパリンカラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ　Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｂｉｏｔｅｃｈ　ＡＢ社製、容量１ｍｌ）３本を緩衝液Ｂ〔１０ｍｍｏｌ／ｌ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、２ｍｍｏｌ／ｌ　ＥＤＴＡ〕で平衡化した後、それぞれに実施例２で得た精製α４Ｇを０．３ｍｇずつ通してカラムに結合させ、緩衝液Ｂ３ｍｌで洗浄した。
１本（カラムＡ）は緩衝液Ｂ３ｍｌを通し、残りの２本（カラムＢ、Ｃ）は８ｍｏｌ／ｌ尿素を含む緩衝液Ｂ３ｍｌを通して蛋白質の立体構造を変性させた。それぞれのカラムをＦＰＬＣシステムに接続し、カラムＡとＣはＮａＣｌ直線濃度勾配０−８００ｍｍｏｌ／ｌの緩衝液Ｂ３０ｍｌ（流速０．１ｍｌ／分）でα４Ｇを溶出させ、カラムＢは変性状態のまま溶出させるため８ｍｏｌ／ｌ尿素を含むＮａＣｌ直線濃度勾配０−８００ｍｍｏｌ／ｌの緩衝液Ｂ３０ｍｌで溶出させた。それぞれの溶出液は１ｍｌずつ分画して回収し、それぞれに終濃度１０％（ｗ／ｖ）になるようにトリクロロ酢酸を添加して、蛋白質を沈殿させた。沈殿した蛋白質をアセトンで洗浄後、ＳＤＳサンプル緩衝液に溶解させ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（８％アクリルアミド、還元条件）を行った。
その結果を図６に示した。図６のＡは、カラム上での尿素による変性を行わず尿素を含まない溶出液で溶出したコントロール、Ｂはカラム上で８ｍｏｌ／ｌ尿素により変成させ８ｍｏｌ／ｌ尿素を含む溶出液で溶出させた場合、Ｃはカラム上で８ｍｏｌ／ｌ尿素により変成させ尿素を含まない溶出液で溶出させた場合の各溶出画分のＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示している。横軸は溶出画分の番号で、点線は各溶出液のＮａＣｌ濃度（右縦軸）を示し、最も左のレーンは分子量マーカーで左の矢印と数字は分子量マーカーのバンドの位置と分子量を示している。
カラムＢの尿素で変性後に変性状態のまま溶出させたα４Ｇは、ＮａＣｌ濃度１８０ｍｍｏｌ／ｌで溶出がおこり、カラムＡの変性させないα４Ｇの溶出ＮａＣｌ濃度約４００ｍｍｏｌ／ｌと比較して、溶出ＮａＣｌ濃度が低下していた。
このように尿素による変性はα４Ｇのヘパリン結合能を低下させることから、α４Ｇの高いヘパリン結合能には、アミノ酸配列だけでなくその立体構造も重要であると考えられた。また尿素で変性後、溶出時に尿素を除いたＣのケースにおける溶出ＮａＣｌ濃度は、Ａのケースと同じになることから、尿素による変性は可逆性であり、尿素を除くことにより立体構造が元に戻り、ヘパリン結合能も回復したと考えられた。
〔実施例２〕　ヘパリン結合能を有するα４Ｇ部分ポリペプチド
α４Ｇをプロテアーゼで断片に切断後、ヘパリン・アフィニティーカラムに結合するα４Ｇの断片からなる部分ポリペプチドを単離し、構造を解析することにより、α４Ｇの中でヘパリン結合能を有する領域を特定し、ヘパリン結合能を有する部分ポリペプチドを得ることにした。
（１）α−キモトリプシン分解
実施例１で得た精製α４Ｇ１．２ｍｇに、ＴＬＣＫ（ｎ−α−ｐ−ｔｏｓｙｌ−Ｌ−ｌｙｓｉｎｅ　ｃｈｌｏｒｏｍｅｔｈｙｌ　ｋｅｔｏｎｅ）処理α−キモトリプシン（Ｓｉｇｍａ　Ｃ−３１４２、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社製〕を基質の１／５０量添加して、３７℃で２時間切断反応させた後、終濃度１ｍｍｏｌ／ｌになるようにプロテアーゼ阻害剤ＰＭＳＦ（ｐｈｅｎｙｌｍｅｔｈｙｌｓｕｌｆｏｎｙｌ　ｆｌｕｏｒｉｄｅ）を添加して反応を停止させた。反応後の溶液を、ＮａＣｌ濃度１５０ｍｍｏｌ／ｌの緩衝液Ａで平衡化したハイトラップ・ヘパリンカラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ　Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｂｉｏｔｅｃｈ　ＡＢ社製、容量１ｍｌ）に乗せた後、５ｍｌの緩衝液Ａで洗浄した。ＦＰＬＣシステムに接続し、ＮａＣｌ直線濃度勾配１５０−６００ｍｍｏｌ／ｌの緩衝液Ａ３０ｍｌで断片を溶出させ、溶出液を１ｍｌずつ分画して回収した。各分画の蛋白質濃度を実施例１（３）と同様にして測定した。
その結果を図７Ａに示した。図７Ａの●は、各溶出画分（横軸）の蛋白質濃度（左縦軸ｍｇ／ｍｌ）、点線は、溶出液のＮａＣｌ濃度（右縦軸ｍｍｏｌ／ｌ）を示している。
大部分の断片はカラムに吸着せず通過画分に出てきたが、ＮａＣｌ濃度３３０ｍｍｏｌ／ｌ（ピーク１）および４８０ｍｍｏｌ／ｌ（ピーク２）の２つの溶出ピークがあった。これらのピークの分画（ピーク１；画分１６，１７、ピーク２；画分２３，２４，２５）について実施例１（６）と同様にしてトリクロロ酢酸で蛋白質を沈殿させ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１２％アクリルアミド、還元条件）を行った。
その結果を図７Ｂに示した。図７Ｂの左はＣＢＢ染色による蛋白質の染色、中央は抗ＬＧ５ペプチド抗体によるイムノブロット、右は抗ｃ−ｍｙｃ抗体によるイムノブロットの結果を示している。左の矢印は分子量マーカーの位置を示している。
ゲルをＣＢＢ　Ｒ−２５０（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社製）で染色した結果、低アフィニティーのピーク１には分子量４１ｋＤａの１本、高アフィニティーのピーク２には分子量４４ｋＤａと３９ｋＤａの２本のα４Ｇ部分ポリペプチドが存在することがわかった。
ＳＤＳ−ＰＡＧＥのゲルを用いて実施例１（２）と同様にして抗ｃ−ｍｙｃ抗体および抗ＬＧ５ペプチド抗体を１次抗体としたイムノブロットを行ったところ、高アフィニティーの４４ｋＤａの断片は、抗ｃ−ｍｙｃ抗体および抗ＬＧ５ペプチド抗体と反応したが、３９ｋＤａの断片は抗ＬＧ５ペプチド抗体とのみ反応した。また、低アフィニティーの４１ｋＤａの断片は、抗ｃ−ｍｙｃ抗体および抗ＬＧ５ペプチド抗体のどちらにも反応しなかった。なお、抗ＬＧ５ペプチド抗体は化学合成したＬＧ５部分ペプチド（Ｌｅｕ　Ａｓｐ　Ｇｌｕ　Ｓｅｒ　Ｐｈｅ　Ａｓｎ　Ｉｌｅ　Ｇｌｙ　Ｌｅｕ　Ｌｙｓ　Ｐｈｅ　Ｇｌｕ　Ｉｌｅ　Ａｌａ、α４鎖のアミノ酸配列の１６５２〜１６６５番目に相当）を抗原としてウサギを免疫として作製した〔Ｍａｔｒｉｘ　Ｂｉｏｌ．，１６，２２３（１９９７）〕。
さらに、Ｍａｔｓｕｄａｉｒａ　Ｐらの報告〔Ｍａｔｓｕｄａｉｒａ　Ｐ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６２，１００３５（１９８７）〕に基づいて上記のヘパリン結合能をもつα４Ｇ部分ポリペプチドのＮ末端のアミノ酸配列を以下のようにして解析した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行ったゲルから各α４Ｇ部分ポリペプチドをＰＶＤＦ膜に転写し、ＣＢＢ　Ｇ−２５０（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社製）で染色した。分子量４４ｋＤａ、４１ｋＤａ、３９ｋＤａに相当するバンドを切り出し、ペプチドを膜から溶出させた後、ペプチドシークエンサーを用いて各ペプチドのＮ末端からのアミノ酸配列を決定した。その結果得られた、低アフィニティーの４１ｋＤａの断片のＮ末端のアミノ酸配列（配列番号７：Ｔｈｒ　Ｇｌｎ　Ｓｅｒ　Ａｒｇ　Ａｌａ　Ａｌａ　Ｓｅｒ）はα４鎖の^１０３７Ｔｈｒ以降のアミノ酸配列と一致した。また、高アフィニティーの４４ｋＤａと３９ｋＤａの断片のＮ末端のアミノ酸配列（配列番号５：Ｌｙｓ　Ｐｈｅ　Ｌｅｕ　Ｇｌｕ　Ｇｌｎ　Ｌｙｓ　Ａｌａ）は^１４３７Ｌｙｓ以降のアミノ酸配列と一致した。この領域はＬＧ３とＬＧ４をつなぐヒンジ領域にあたる。
以上の分子量、抗ＬＧ５ペプチド抗体および抗ｃ−ｍｙｃ抗体との反応性、Ｎ末端のアミノ酸配列の解析から、低アフィニティーの４１ｋＤａの断片は、^１０３７Ｔｈｒ以降のＬＧ２からＬＧ３の前半までにあたる部分のα４Ｇ部分ポリペプチドと考えられた。高アフィニティーの４４ｋＤａの断片は、^１４３７ＬｙｓからＬＧ４およびＬＧ５全体とそれに続くｍｙｃタグペプチドを含むα４Ｇ部分ポリペプチド、高アフィニティーの３９ｋＤａの断片は、^１４３７ＬｙｓからＬＧ４全体およびＬＧ５のＣ末端部分を除いた大部分（ＬＧ５全体の８０〜９０％）を含むα４Ｇ部分ポリペプチドと考えられた。配列番号６に４４ｋＤａの断片のｍｙｃタグペプチド部分を除いたアミノ酸配列を示した。
（２）トリプシン分解
ＴＰＣＫ処理トリプシン（Ｓｉｇｍａ　Ｔ−８６４２、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社製）を（１）のα−キモトリプシンの代わりに用いて、全く同様に反応を行った。キモトリプシンとトリプシンの切断認識部位は異なるが、やはり２つの溶出ピークが見られ、低アフィニティーのピーク１には分子量４５ｋＤａの１本、高アフィニティーのピーク２には分子量４０ｋＤａと３５ｋＤａの２本のα４Ｇ部分ポリペプチドが存在していた。Ｎ末端アミノ酸配列分析、抗体とのイムノブロット解析の結果、やはり低アフィニティーのα４Ｇ部分ポリペプチドはＬＧ２−ＬＧ３の領域、高アフィニティーの２本のα４Ｇ部分ポリペプチドはＬＧ４−ＬＧ５の領域にあたると推定された。
（３）ヘパリンカラム上でのトリプシン分解
実施例１で得た精製α４Ｇ０．４ｍｇをハイトラップ・ヘパリンカラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ　Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｂｉｏｔｅｃｈ　ＡＢ社製、１ｍｌ）に結合させ、ＴＰＣＫ処理トリプシン１５μｇを溶解させた緩衝液〔５０ｍｍｏｌ／ｌ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、１００ｍｍｏｌ／ｌ　ＮａＣｌ、２ｍｍｏｌ／ｌ　ＣａＣｌ_２〕１ｍｌをカラムにのせ、カラムを３７℃で２時間保温して切断反応させた後、ＦＰＬＣシステムに接続した。６ｍｌの緩衝液Ａで洗浄し、ＮａＣｌ直線濃度勾配１５０−６００ｍｍｏｌ／ｌの緩衝液Ａ２５ｍｌ、流速０．１ｍｌ／分でα４Ｇ部分ポリペプチドを溶出させ、溶出液を１ｍｌずつ分画して回収した。実施例１（６）と同様にしてトリクロロ酢酸で蛋白質を沈殿させ、トリシン（ｔｒｉｃｉｎｅ）−アクリルアミドゲル電気泳動〔Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１６６，３６８（１９８７）〕を行い、ＣＢＢ　Ｇ−２５０で染色した。
その結果を図８Ａに示した。図８のＡはα４Ｇをヘパリンカラムに結合させてキモトリプシンで消化後、溶出させたヘパリン結合性を有するトリプシン断片を含む溶出画分（画分１８，１９，２０）のトリシンゲル電気泳動の結果であり、左の矢印は分子量マーカーの位置を示し、下の数字は各溶出画分のＮａＣｌ濃度（ｍｍｏｌ／ｌ）を示している。
ＮａＣｌ濃度３７０〜４００ｍｍｏｌ／ｌで溶出される画分には、３５ｋＤａおよび２３ｋＤａのα４Ｇ部分ポリペプチドが検出された。
またイムノブロットの結果を図８Ｂに示した。図８Ｂはトリプシン断片の溶出画分を、左から抗ｃ−ｍｙｃ抗体、抗ＬＧ５ペプチド抗体、抗α４Ｇ抗体を用いたイムノブロットにより検出した結果であり、左の矢印は分子量マーカーの位置を示している。
両者とも抗α４Ｇ抗体では検出され、抗ｃ−ｍｙｃ抗体には反応しなかった。また、抗ＬＧ５ペプチド抗体には３５ｋＤａの断片のみ反応し、２３ｋＤａの断片は反応しなかった。
Ｎ末端からのアミノ酸配列の解析の結果、両断片ともＮ末端のアミノ酸配列はＡｌａ　Ｉｌｅ　Ｇｌｕ　Ｈｉｓ　Ａｌａ　Ｔｙｒ　Ｇｌｎ（配列番号８）であり、α４鎖のＬＧ４の開始部分から７アミノ酸残基下流に存在する^１４５７Ａｌａ以降の配列と一致していた。２３ｋＤａの断片はその分子量と抗ＬＧ５ペプチド抗体と反応しないことから、ＬＧ４の始めの７アミノ酸を除いたほぼ全体とＬＧ５の開始部分を含むが^１６５２Ｌｅｕ以降のＬＧ５の配列は含まないα４Ｇ部分ポリペプチドと推測された。したがって、α４ＧはＬＧ４が結合部位となって、強いアフィニティーでヘパリンと結合すると考えられた。
なお、この２３ｋＤａの断片の溶出ＮａＣｌ濃度は（１）で得られた高アフィニティーのα４Ｇ部分ポリペプチド（ＬＧ４−ＬＧ５の領域）の溶出ＮａＣｌ濃度４８０ｍｍｏｌ／ｌよりも少し低いことから、ＬＧ５はＬＧ４のヘパリンへの結合を助けると考えられた。配列番号３にマウスα４ＧのＬＧ４のアミノ酸配列、配列番号４にヒトα４ＧのＬＧ４のアミノ酸配列を示した。
〔実施例３〕　ヘパリン結合性ペプチド
ＬＧ４からＬＧ５の開始部分の中でさらにヘパリンとの結合能を規定する領域を特定するため、ＬＧ４およびＬＧ５の開始部分の中の連続した１２アミノ酸残基からなるペプチド２４種類（Ａ４Ｇ−７４、Ａ４Ｇ−７５、Ａ４Ｇ−７６、Ａ４Ｇ−７７、Ａ４Ｇ−７８、Ａ４Ｇ−７９、Ａ４Ｇ−８０、Ａ４Ｇ−８１、Ａ４Ｇ−８２、Ａ４Ｇ−８３、Ａ４Ｇ−８４、Ａ４Ｇ−８５、Ａ４Ｇ−８６、Ａ４Ｇ−８７、Ａ４Ｇ−８８、Ａ４Ｇ−８９、Ａ４Ｇ−９０、Ａ４Ｇ−９１、Ａ４Ｇ−９２、Ａ４Ｇ−９３、Ａ４Ｇ−９４、Ａ４Ｇ−９５、Ａ４Ｇ−９６、Ａ４Ｇ−９７）をＦｍｏｃ法により合成し、Ｎｏｍｉｚｕ　Ｍらの方法〔Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７３，３２４９１（１９９８）〕に基づいてＨＰＬＣで精製した。これらのペプチドのアミノ酸配列をそれぞれ配列番号９から３２に示した。これらのペプチドの純度はＨＰＬＣによる分析でアミノ酸配列はイオンスプレー質量分析法により確認した。これらのペプチドのうち、水溶性が悪いＡ４Ｇ−８０、Ａ４Ｇ−８１、Ａ４Ｇ−９３、Ａ４Ｇ−９４、Ａ４Ｇ−９５、Ａ４Ｇ−９７を除いた１８種類のペプチドについて、各ペプチド２１μｇ（約２００μｍｏｌ／ｌ）と実施例２で得た精製α４Ｇ　３．４μｇ（約０．４μｍｏｌ／ｌ）およびヘパリンセファロースＣＬ−６Ｂ（Ａｍｅｒｓｈａｍ　Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｂｉｏｔｅｃｈ　ＡＢ社製）ビーズ１ｍｇを緩衝液〔Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、１００ｍｍｏｌ／ｌ　ＮａＣｌ〕７０μｌ中で混合し４℃で１時間おき、ビーズ上のヘパリンにα４Ｇを結合させた。ビーズをカラムに移し、同緩衝液１００μｌで３回洗浄後、ビーズにＳＤＳサンプル緩衝液を添加してＳＤＳサンプル緩衝液中にビーズと結合した蛋白を溶出させた。このＳＤＳサンプル緩衝液についてＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、結合したα４Ｇの量を比較することにより、各ペプチドがα４Ｇのヘパリン結合性を阻害するかどうかを調べた。
その結果を図９に示した。Ａ４Ｇ−８２（配列番号１７）だけは完全にα４Ｇのヘパリンへの結合を阻害した。このペプチド以外には、Ａ４Ｇ−８３が非常に弱い阻害を示しただけで、他のペプチドは阻害を示さなかった。
なお、阻害アッセイを行わなかった６ペプチドのうちＡ４Ｇ−９３以外の５ペプチドには塩基性アミノ酸が含まれていないので、これらのペプチドの部位はα４Ｇのヘパリン結合部位ではないと考えられた。α４鎖の^１５１３Ｔｈｒから^１５２４Ｍｅｔのアミノ酸配列に対応するＡ４Ｇ−８２がα４Ｇのヘパリンとの結合を阻害したことおよび、ヘパリンが塩基性アミノ酸と結合することから、^１５１８Ｈｉｓおよび^１５２０Ａｒｇがα４Ｇのヘパリン結合部位と推定された。
なお、Ａ４Ｇ−８２と全く同じアミノ酸組成だが、配列をランダムに変えたペプチドＡ４Ｇ−８２Ｓ（配列番号３５）、Ａ４Ｇ−８２Ｔ（配列番号３６）は全く阻害を示さないことから、塩基性アミノ酸残基だけでなく、アミノ酸配列全体が結合に関与していると考えられた。なお、Ａ４Ｇ−８２のペプチド濃度を２０μｍｏｌ／ｌまで低下させるとほとんど阻害がみられず、Ａ４Ｇ−８２がα４Ｇと同等にヘパリンに結合するためにはα４Ｇの５０倍以上の濃度が必要であった。Ａ４Ｇ−８２はマウスα４Ｇの配列由来のペプチドであるが、ヒトα４Ｇにおいてもその配列相同性から^１５１４Ｔｈｒから^１５２５Ｍｅｔの配列番号３３に示すアミノ酸配列のペプチドはヘパリン結合能を有すると考えられる。
ＬＧ４全体においても^１５１８Ｈｉｓおよび^１５２０Ａｒｇが結合に重要であることを確認するために、ＬＧ４（配列番号３、^１４５３Ｓｅｒ〜^１６３６Ｐｒｏ）、^１５１８ＨｉｓをＡｌａに置換したＬＧ４変異体（以下ＬＧ４　Ｈ１５１８Ａとする）、^１５２０ＡｒｇをＡｌａに置換した変異体（以下ＬＧ４　Ｒ１５２０Ａとする）を大腸菌で発現させ、それぞれのヘパリン結合性を比較した。
まず、５’にＢａｍＨＩサイトを付加したフォワードプライマーと５’にＥｃｏＲＩサイトを付加したリバースプライマーを用いてｐＥＦα４ｍｙｃに対してＰＣＲを行い、配列番号３４の４３５７番目〜４９０８番目に相当するＬＧ４断片を増幅し単離した。この断片をグルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）との融合蛋白発現ベクターｐＧＥＸ−３Ｔ（Ａｍｅｒｓｈａｍ　Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｂｉｏｔｅｃｈ　ＡＢ社製）のＢａｍＨＩ／ＥｃｏＲＩサイト間に挿入することにより、ＧＳＴとＬＧ４の融合蛋白質の発現プラスミドを作製した。
このプラスミドに対して、配列番号３７および３８に配列を示したプライマーを用いて、部位特異的変異を行うことによりＬＧ４　Ｈ１５１８ＡのＧＳＴとの融合蛋白質の発現プラスミドを作製した。また、配列番号３９および４０に配列を示したプライマーを用いて、部位特異的変異を行うことによりＬＧ４　Ｒ１５２０ＡのＧＳＴとの融合蛋白質の発現プラスミドを作製した。部位特異的変異は、クイック・チェンジ部位特異的変異キット（Ｑｕｉｃｋ　Ｃｈａｎｇｅ　Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ　Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ　Ｋｉｔ；Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）により行った。
これらのプラスミドおよびコントロールのｐＧＥＸ−３Ｔで大腸菌を形質転換し、培養することによりＬＧ４、ＬＧ４Ｈ１５１８Ａ、ＬＧ４Ｒ１５２０Ａの各ＧＳＴとの融合蛋白質およびコントロールのＧＳＴを大腸菌の細胞中に発現させた。培養後の大腸菌を緩衝液〔１０ｍｍｏｌ／ｌ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、２ｍｍｏｌ／ｌ　ＥＤＴＡ〕中で超音波破砕し、得られた細胞破砕液５ｍｌを、同緩衝液０．５ｍｌで平衡化したヘパリンセファロースＣＬ−６Ｂカラムに通し、ＬＧ４、ＬＧ４Ｈ１５１８Ａ、ＬＧ４Ｒ１５２０Ａの各ＧＳＴとの融合蛋白質を結合させた後、同緩衝液５ｍｌで洗浄した。カラムにＮａＣｌ濃度を１００、２００、４００、５００、６００、１０００ｍｍｏｌ／ｌと段階的に上げた同緩衝液を５ｍｌずつ通すことにより、結合したＬＧ４、ＬＧ４　Ｈ１５１８Ａ、ＬＧ４　Ｒ１５２０Ａの各ＧＳＴとの融合蛋白質をカラムから溶出させた。
細胞破砕液、細胞破砕液のカラム通過後の画分、洗浄液の画分、各ＮａＣｌ濃度の溶出画分それぞれ１０μｌについて、ＬＧ４、ＬＧ４　Ｈ１５１８Ａ、ＬＧ４　Ｒ１５２０Ａは抗α４Ｇ抗体、ＧＳＴは抗ＧＳＴ抗体（大腸菌で発現させたＧＳＴを抗原としてウサギを免疫して作製した抗血清）を用いてイムノブロットによりそれぞれの蛋白質を検出した。
その結果を図１０に示した。上段から、ＧＳＴとＬＧ４の融合蛋白、ＧＳＴとＬＧ４　Ｒ１５２０Ａの融合蛋白、ＧＳＴとＬＧ４　Ｈ１５１８Ａの融合蛋白、ＧＳＴについて、各段の左から各蛋白質を発現させた大腸菌の細胞破砕液、ヘパリンセファロースＣＬ−６Ｂに通した後の細胞破砕液、洗浄液の画分、ＮａＣｌ濃度が１００、２００、４００、５００、６００、１０００ｍｍｏｌ／ｌの緩衝液での各溶出画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥし、それぞれの蛋白質をイムノブロットで検出した結果を示している。
ＬＧ４はＮａＣｌ濃度４００および５００ｍｍｏｌ／ｌで溶出されたのに対し、ＬＧ４　Ｈ１５１８Ａは細胞破砕液のカラム通過後の画分と洗浄液の画分にしか検出されず、ヘパリン結合性がなくなっていた。また、ＬＧ４　Ｒ１５２０ＡはＮａＣｌ濃度１００および２００ｍｍｏｌ／ｌで溶出され、ヘパリンに対する結合がＬＧ４と比較して弱くなっていた。
なお、コントロールのＧＳＴはヘパリンとの結合能は示さなかった。この結果からＬＧ４のみならずラミニンα４鎖においても^１５１８Ｈｉｓおよび^１５２０Ａｒｇがヘパリンとの強い結合能を規定していると考えられた。ＬＧ４のＧＳＴとの融合蛋白質の結合性はアフィニティーカラムから溶出する塩濃度からα４Ｇの４４ｋＤａおよび３３ｋＤａの断片と同程度であり、３５ｋＤａおよび２３ｋＤａの断片よりも強いと考えられた。
〔実施例４〕　α４Ｇ部分ポリペプチドによるＷｎｔ１の遊離
ヘパリン結合能をもつα４Ｇ部分ポリペプチドのＷｎｔ１の細胞からの遊離に対する影響を検討した。
動物細胞発現用ベクターｐＭＫＩＴ〔Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１２０，２３６（１９９６）〕に、ｃ−ｍｙｃタグペプチドの配列を付加したマウスＷｎｔ１　ｃＤＮＡ〔Ｃｅｌｌ，３９，２３３（１９８４）〕を挿入し、Ｗｎｔ１発現用プラスミドを作製してヒト細胞株２９３Ｔ〔２９３ｔｓＡ１６０７ｎｅｏ；Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，７，３７９（１９８７）〕に導入した。このＷｎｔ１発現細胞を１０％ウシ胎児血清を含む培地ＤＭＥＭで１日間培養した後、培地を除いてダルベッコ改変ＰＢＳで３回細胞を洗浄し、実施例２（３）で得られたヘパリンに高い結合能を有する２３ｋＤａおよび３５ｋＤａのα４Ｇトリプシン断片２０ｎｍｏｌ／ｌまたは４０ｎｍｏｌ／ｌを含むＤＭＥＭ（血清を含まない）２ｍｌあるいは２ｍｌのＤＭＥＭ（血清およびα４Ｇ部分ポリペプチドを含まない）を加えて４時間培養した。それぞれの培養後の培地を回収し、終濃度１０％（ｗ／ｖ）になるようにトリクロロ酢酸を添加して、蛋白質を沈殿させた。
培養後の細胞はダルベッコ改変ＰＢＳで３回洗浄した。沈殿させた培地中の蛋白質および細胞にＳＤＳ−ＰＡＧＥ用サンプルバッファーを添加して溶解させ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１０％アクリルアミド）を行った後、実施例１（２）と同様に１次抗体としてｃ−ｍｙｃ抗血清を用いたイムノブロット法により培地中および細胞中のＷｎｔ１を検出した。
その結果を図１１に示した。図１１は、Ｗｎｔ１発現細胞、ヘパリン結合能を有するα４Ｇトリプシン断片を２０ｎｍｏｌ／ｌ（左から３、７番目のレーン）および４０ｎｍｏｌ／ｌ（左から４、８番目のレーン）添加して培養した場合（＋）と添加しなかった場合（−）の、培地中のＷｎｔ１をイムノブロット法により検出した結果であり、左の４レーンは培地中、右の４レーンは細胞中のＷｎｔ１を示している。
α４Ｇ部分ポリペプチド非添加では培地中にＷｎｔ１はほとんど検出されなかったのに対し、α４Ｇ部分ポリペプチドを添加した場合は２０ｎｍｏｌ／ｌおよび４０ｎｍｏｌ／ｌ共に明らかにＷｎｔ１が培地中に検出され、ヘパリン結合能をもつα４Ｇ部分ポリペプチドにより細胞からＷｎｔ１が遊離することが確認された。なお、細胞中のＷｎｔ１については、α４Ｇ部分ポリペプチド添加・非添加でほとんど量に変化はみられなかった。
〔実施例５〕　ラミニンα４Ｇの抗腫瘍活性
実施例１に記載の方法に従い、ラミニンα４Ｇを精製し、以下の実験に用いた。
（１）皮下腫瘍モデルでの抗腫瘍活性
マウスメラノーマ細胞Ｂ１６／Ｆ１０（ＡＴＣＣ番号：ＣＲＬ１５８１）５×１０^５細胞をＰＢＳ（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ）またはラミニンα４Ｇ（２３、１１５、２３１μｇ）と混ぜてＣ５７ＢＬ／６ブラックマウス（ＳＰＦ、オス６〜８週齢、日本クレア社より購入）の右胸部に皮下移植した（各群ｎ＝４又は５）。移植後２、３、４、５日目にＰＢＳを混合して移植したマウスにはＰＢＳを、ラミニンα４Ｇを混合して移植したマウスには移植時と同量のラミニンα４Ｇ（２３、１１５、２３１μｇ）を尾静注した。移植後４〜６日目より黒色の腫瘍径を経時的に測定した。その結果を図１２ａに示す。ＰＢＳ投与群に比べラミニンα４Ｇの２３１μｇ投与群では腫瘍増殖阻害効果が認められた。
（２）肺転移腫瘍モデルでの抗腫瘍活性
マウスメラノーマ細胞Ｂ１６／Ｆ１０　２．５×１０^５細胞をＰＢＳまたはラミニンα４Ｇ（２３、１１５、２３１μｇ）と混ぜてＣ５７ＢＬ／６ブラックマウス（ＳＰＦ、オス６〜８週齢、日本クレア社より購入）に尾静注した（各群ｎ＝５）。尾静注後２、３、４、５日目にＰＢＳを尾静注したマウスにはＰＢＳを、ラミニンα４Ｇを尾静注したマウスには尾静注時と同量のラミニンα４Ｇ（２３、１１５、２３１μｇ）をさらに尾静注した。最初の尾静注から１４日目に肺を摘出し転移腫瘍数を測定した。その結果を図１２ｂに示す。ＰＢＳ投与群に比べラミニンα４Ｇの２３１μｇ投与群では肺腫瘍転移数の減少が認められた。
〔実施例６〕　ラミニンα４Ｇによる血管新生および脂肪細胞の誘導の阻害
実施例１に記載の方法に従い、ラミニンα４Ｇを精製し、以下に記載するマトリゲル・プラーグアッセイに用いた。
マトリゲル（Ｂｅｃｔｏｎ　Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社製）０．５ｍｌに１５０ｎｇ／ｍｌ　ｂ−ＦＧＦ（Ｐｅｐｒｏ　Ｔｅｃｈ社製）、２０Ｕ／ｍｌヘパリン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社製）を混ぜたもの、あるいは、マトリゲル０．５ｍｌに１５０ｎｇ／ｍｌ　ｂ−ＦＧＦ、２０Ｕ／ｍｌヘパリンおよび１００μｇ／ｍｌ　α４Ｇを混ぜたものを、それぞれＣ５７ＢＬ／６ブラックマウス（ＳＰＦ、オス６〜８週齢、日本クレア社より購入）の右腹部に皮下投与した。コントロールとして、マトリゲルのみも同様にマウスに投与した。
１４日後にマトリゲルを取り出し１０％中性ホルマリン緩衝液（ナカライテスク社製）で約１２時間固定化操作を行い２〜３ｍｍの切片にした。続いてバキュームロータリーを用いて２４時間脱水・パラフィン置換を行い、ヒストエンブダーによりパラフィンブロックを作成した。パラフィンブロックは約２〜３□ｍに薄切しスライドグラスに伸展させ、ヘマトキシリン・エオジン染色を以下のように行った。まず、切片を伸展させたスライドグラスをキシレンに１０分間×２回、１００％エタノールに３０秒間×２回、９５％エタノールに３０秒間、７０％エタノールに３０秒間それぞれ漬けて脱パラフィン処理をした。ついで、流水で５分間洗浄し、ヘマトキシリン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社製）で１分間染色した後、流水で５分間洗浄し、エオジン（ムトウ社製）で５分間染色した。さらに、７０％エタノールに３０秒間、９５％エタノールに３０秒間、１００％エタノールに５分間×３回、キシレンに１０分間×２回それぞれ漬けて脱水を行った。作成したスライドグラスを検鏡した。
その結果を図１３に示す。コントロールのマトリゲルのみを投与したマウスに比べマトリゲルにｂ−ＦＧＦおよびヘパリンを添加して投与したマウスは、マトリゲル中に血管新生及び脂肪細胞が誘導された。マトリゲル、ｂ−ＦＧＦ、ヘパリンに１００μｇ／ｍｌ　α４Ｇを添加して投与したマウスではｂ−ＦＧＦにより誘導されたマトリゲル中の血管新生、及び脂肪細胞の誘導が阻害された。
産業上の利用の可能性
本発明により、ラミニンα４鎖のヘパリン結合能を有するポリペプチドが提供される。本発明のポリペプチドは、α１鎖の約１０倍ものヘパリン結合能を有し、ヘパリン結合性の情報伝達分子の濃度勾配形成やシグナル伝達を阻害し、細胞と毛細血管との接触、癌の成長、および細胞の増殖、分化、生存維持を阻害する作用を有する。
配列表フリーテキスト
配列番号３５−人工配列の説明：配列番号１６と同じアミノ酸組成のランダムな配列
配列番号３６−人工配列の説明：配列番号１６と同じアミノ酸組成のランダムな配列
配列番号３７−人工配列の説明：ラミニンα４鎖のモジュールＬＧ４の１５１８−ＨｉｓをＡｌａに置換する部位特異変異のためのプライマー
配列番号３８−人工配列の説明：ラミニンα４鎖のモジュールＬＧ４の１５１８−ＨｉｓをＡｌａに置換する部位特異変異のためのプライマー
配列番号３９−人工配列の説明：ラミニンα４鎖のモジュールＬＧ４の１５２０−ＡｒｇをＡｌａに置換する部位特異変異のためのプライマー
配列番号４０−人工配列の説明：ラミニンα４鎖のモジュールＬＧ４の１５２０−ＡｒｇをＡｌａに置換する部位特異変異のためのプライマー
【配列表】

【図面の簡単な説明】
図１は、ｐＥＦα４ＧｍｙｃおよびｐＥＦα１Ｇｍｙｃの構造を示す図である。
図２は、α４Ｇまたはα１Ｇを発現させた動物細胞についての、ウェスタン・ブロットによるα４Ｇおよびα１Ｇの検出を示す写真である。Ａはツニカマイシン添加・非添加で培養した場合の結果であり、Ｂは非還元条件と還元条件でＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った場合の結果を示す写真である。
図３は、α４Ｇまたはα１Ｇを発現させた動物細胞の培養上清からヘパリン・アフィニティーカラムによる精製を示す図および写真である。Ａ、Ｂはα１Ｇの発現細胞、Ｃ、Ｄはα４Ｇの発現細胞の各培養上清についての図および写真である。
図４は、固相化ヘパリンに対するα４Ｇまたはα１Ｇの結合を示す図である。
図５は、グリコシダーゼ処理がα４Ｇのヘパリン結合性に及ぼす影響を示す図および写真である。Ａはグリコシダーゼ処理、非処理α４Ｇ、ツニカマイシン添加、非添加α４Ｇ発現細胞のＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す写真であり、Ｂは固定化ヘパリンに対するグリコシダーゼ処理、未処理のα４Ｇの結合量を１次抗体として抗ｃ−ｍｙｃ抗体を用いて検出した結果を示す図である。
図６は、尿素による変性がα４Ｇのヘパリン結合性に及ぼす影響を示す写真である。α４Ｇをヘパリンカラムに結合後、Ａはカラム上での尿素による変性を行わず尿素を含まない溶出液で溶出したコントロール、Ｂはカラム上で８ｍｏｌ／ｌ尿素により変成させ８ｍｏｌ／ｌ尿素を含む溶出液で溶出させた場合、Ｃはカラム上で８ｍｏｌ／ｌ尿素により変成させ尿素を含まない溶出液で溶出させた場合の各溶出画分のＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す写真である。
図７は、ヘパリン結合性を有するα４Ｇのキモトリプシン断片の単離を示す図および写真である。Ａはα４Ｇをヘパリンカラムに結合させてキモトリプシンで消化後、溶出させた場合で、Ｂはｐｅａｋ１（画分１６，１７）、ｐｅａｋ２（画分２３，２４，２５）の画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥし蛋白質を検出した写真である。
図８は、ヘパリン結合性を有するα４Ｇのトリプシン断片の単離を示す写真である。Ａはα４Ｇをヘパリンカラムに結合させてキモトリプシンで消化後、溶出させたヘパリン結合性を有するトリプシン断片を含む溶出画分（画分１８，１９，２０）のトリシンゲル電気泳動の結果であり、Ｂはトリプシン断片の溶出画分を、左から抗ｃ−ｍｙｃ抗体、抗ＬＧ５ペプチド抗体、抗α４Ｇ抗体を用いたイムノブロットにより検出した結果を示す写真である。
図９は、α４Ｇ部分ペプチドのヘパリン結合性を示す写真である。
図１０は、ＬＧ４、ＬＧ４　Ｒ１５２０Ａ、ＬＧ４　Ｈ１５１８Ａの各ＧＳＴとの融合蛋白質のヘパリン結合性を示す写真である。
図１１は、α４Ｇ部分ポリペプチドによるＷｎｔ１の細胞からの遊離を示す写真である。
図１２は、α４Ｇの抗腫瘍活性を示す図である。ａは皮下腫瘍モデルで、●はＰＢＳ、▲はα４Ｇ　２３μｇ、◆はα４Ｇ　１１５μｇ、■はα４Ｇ　２３１μｇをそれぞれメラノーマ細胞と混合して移植した場合の結果を表す。横軸はメラノーマ細胞移植後の日数、縦軸は形成された腫瘍の容積を示す。グラフ上の棒は標準偏差を示す。ｂは肺転移腫瘍モデルで、左からＰＢＳ、α４Ｇ　２３μｇ、α４Ｇ　１１５μｇ、α４Ｇ　２３１μｇをそれぞれ混合して尾静注した場合の結果を表す。縦軸は肺に転移した腫瘍の数を示す。グラフ上の棒は標準偏差を示す。
図１３は、α４Ｇによる血管新生および脂肪細胞の誘導の阻害を示す写真である。上から、マトリゲルのみ、マトリゲルに１５０ｎｇ／ｍｌ　ｂ−ＦＧＦおよび２０Ｕ／ｍｌヘパリンを添加したもの、マトリゲル、ｂ−ＦＧＦ、ヘパリンに１００μｇ／ｍｌ　α４Ｇを添加したものをそれぞれ移植した場合のマトリゲル・プラーグアッセイの結果を表す。Ａは脂肪細胞、Ｖは血管を示す。

Claims (28)

1. ラミニン構成成分α４鎖のモジュールＬＧ４領域に存在するヘパリン結合領域のアミノ酸配列を含む、分子量１０８ｋＤａ以下のポリペプチドまたは該ポリペプチドを含有する融合ポリペプチド。
2. ヘパリン結合領域のアミノ酸配列が、配列番号３、４、６、１７および３３のいずれかに記載のアミノ酸配列である、請求項１記載のポリペプチド。
3. ポリペプチドが、ラミニン構成成分α４鎖のモジュールＬＧ４領域、またはＬＧ４およびＬＧ５領域を含むポリペプチドである、請求項１記載のポリペプチド。
4. 融合ポリペプチドが、タグペプチド、マーカーペプチド、またはシグナルペプチドより選ばれるペプチドとの融合ポリペプチドである、請求項１記載のポリペプチド。
5. タグペプチド、マーカーペプチド、またはシグナルペプチドより選ばれるペプチドが、ｍｙｃポリペプチド、β−ガラクトシダーゼ、プロテインＡ、プロテインＡのＩｇＧ結合領域、クロラムフェニコール・アセチルトランスフェラーゼ、ポリ（Ａｒｇ）、ポリ（Ｇｌｕ）、プロテインＧ、マルトース結合ポリペプチド、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ、ポリヒスチジン鎖、Ｓペプチド、ＤＮＡ結合ポリペプチドドメイン、Ｔａｃ抗原、チオレドキシン、グリーン・フルオレッセント・プロテイン、ＦＬＡＧペプチド、任意の抗体のエピトープおよび任意の分泌蛋白質のシグナルペプチドからなる群より選ばれるペプチドである請求項４記載のポリペプチド。
6. 配列番号３、４、６、１７および３３のいずれかに記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド。
7. 請求項１〜６のいずれか１項に記載のポリペプチドのアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が欠失、置換および／または付加されたアミノ酸配列からなり、マウスラミニンα４鎖の１５１８番目のヒスチジン残基と１５２０番目のアルギニン残基に相当する２アミノ酸が保存され、かつヘパリン結合能を有するポリペプチド。
8. 請求項１〜７のいずれか１項に記載のポリペプチドのアミノ酸配列と６０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、マウスラミニンα４鎖の１５１８番目のヒスチジン残基と１５２０番目のアルギニン残基に相当する２アミノ酸が保存され、かつヘパリン結合能を有するポリペプチド。
9. 請求項１〜８のいずれか１項に記載のポリペプチドをコードするＤＮＡ。
10. 請求項９に記載のＤＮＡをベクターに組み込んで得られる組換え体ＤＮＡ。
11. 請求項９に記載のＤＮＡまたは請求項１０に記載の組換え体ＤＮＡを保有する形質転換体。
12. 形質転換体が、微生物、動物細胞、植物細胞、および昆虫細胞からなる群より選ばれる形質転換体である、請求項１１に記載の形質転換体。
13. 形質転換体が、非ヒトトランスジェニック動物またはトランスジェニック植物である、請求項１１に記載の形質転換体。
14. 請求項１１または１２に記載の形質転換体を培地に培養し、培養物中に請求項１〜８のいずれか１項に記載のポリペプチドを生成、蓄積させ、該培養物から該ポリペプチドを採取することを特徴とする、該ポリペプチドの製造方法。
15. 請求項１３に記載の非ヒトトランスジェニック動物またはトランスジェニック植物を生育させ、請求項１〜８のいずれか１項に記載のポリペプチドを該動植物中に生成、蓄積させ、該動植物中より該ポリペプチドを採取することを特徴とする、該ポリペプチドの製造方法。
16. 請求項１〜８のいずれか１項に記載のポリペプチドを有効成分として含有してなる医薬。
17. 請求項９に記載のＤＮＡまたは請求項１０に記載の組換え体ＤＮＡを有効成分として含有してなる医薬。
18. 細胞と細胞外マトリックスとの結合の阻害作用、細胞と毛細血管との接触の阻害作用、細胞の増殖の阻害作用または細胞の分化の阻害作用を有する請求項１６または１７に記載の医薬。
19. 医薬が癌、または血管新生が関与する疾患の治療および／または予防のための医薬である、請求項１６、１７または１８に記載の医薬。
20. 請求項１〜８のいずれか１項に記載のポリペプチドを用いて、細胞からヘパリン結合性の情報伝達分子を遊離させる方法。
21. 請求項１〜８のいずれか１項に記載のポリペプチドを用いて、ヘパリン結合性の情報伝達分子の濃度勾配形成またはシグナル伝達を阻害する方法。
22. ヘパリン結合性の情報伝達分子がＷｎｔ１、ＦＧＦ（Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ　ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒ）、ＨＢ−ＥＧＦ（Ｈｅｐａｒｉｎ−ｂｉｎｄｉｎｇ　ｅｐｉｄｅｒｍａｌ　ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒ）、ＰＤＧＦ（Ｐｌａｔｅｌｅｔ−ｄｅｒｉｖｅｄ　ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒ）、ＢＭＰ（Ｂｏｎｅ　ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｉｃ　ｐｒｏｔｅｉｎ）、ＧＭ−ＣＳＦ（Ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅ−ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ　ｃｏｌｏｎｙ　ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ　ｆａｃｔｏｒ）、ＨＧＦ（Ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ　ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒ）、ケモカインおよびＴＮＦ（Ｔｕｍｏｒ　ｎｅｃｒｏｓｉｓ　ｆａｃｔｏｒ）からなる群から選ばれる情報伝達分子である請求項２０または２１に記載の方法。
23. ラミニン構成成分α４鎖のＧドメインを含むポリペプチドを有効成分として含有してなる医薬。
24. 細胞と細胞外マトリックスとの結合の阻害作用、細胞と毛細血管との接触の阻害作用、細胞の増殖の阻害作用または細胞の分化の阻害作用を有する請求項２３に記載の医薬。
25. 医薬が癌、または血管新生が関与する疾患の治療および／または予防のための医薬である、請求項２３または２４に記載の医薬。
26. ラミニン構成成分α４鎖のＧドメインを含むポリペプチドを用いて、細胞からヘパリン結合性の情報伝達分子を遊離させる方法。
27. ラミニン構成成分α４鎖のＧドメインを含むポリペプチドを用いて、ヘパリン結合性の情報伝達分子の濃度勾配形成またはシグナル伝達を阻害する方法。
28. ヘパリン結合性の情報伝達分子がＷｎｔ１、ＦＧＦ（Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ　ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒ）、ＨＢ−ＥＧＦ（Ｈｅｐａｒｉｎ−ｂｉｎｄｉｎｇ　ｅｐｉｄｅｒｍａｌ　ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒ）、ＰＤＧＦ（Ｐｌａｔｅｌｅｔ−ｄｅｒｉｖｅｄ　ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒ）、ＢＭＰ（Ｂｏｎｅ　ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｉｃ　ｐｒｏｔｅｉｎ）、ＧＭ−ＣＳＦ（Ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅ−ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ　ｃｏｌｏｎｙ　ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ　ｆａｃｔｏｒ）、ＨＧＦ（Ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ　ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒ）、ケモカインおよびＴＮＦ（Ｔｕｍｏｒ　ｎｅｃｒｏｓｉｓ　ｆａｃｔｏｒ）からなる群から選ばれる情報伝達分子である請求項２６または２７に記載の方法。

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