KR20060135280A - 선천성 면역에 관여하는 트렘-2의 클로닝 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 선천성 면역계에 중요한 역할을 수행하는 트렘-2(TREM-2, Triggering receptor expressed on myeloid cells 2b) 수용체와 TREM-2-IgG 융합 단백질에 대한 유전자의 클로닝에 관한 것이다.

Description

선천성 면역에 관여하는 트렘-2의 클로닝{A cloning of TREM-2 involving innate immunity}
도 1은 자연살해세포의 전구세포에서 유전자 발현과 SAGE 결과의 일치성을 나타낸 것이다.
도 2는 생쥐 TREM-2 cDNA의 클로닝의 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 TREM-2 발현벡터의 제조결과를 나타낸 것이다.
도 4는 생쥐 TREM-2-IgG 발현벡터의 제조 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 TREM-2-IgG 형질전환체에서 융합 단백질 수용체의 발현 결과를 나타낸 것이다. Tf: TREM-2-IgG 형질감염물, Con: 벡터 대조군, Cell: 세포 용해물, Sup: 배양물 상청액.
도 6은 정제된 TREM-2-IgG 융합 단백질을 SDS-PAGE로 분석한 결과를 나타낸 것이다.
본 발명은 선천성 면역계에 중요한 역할을 수행하는 트렘-2(TREM-2, Triggering receptor expressed on myeloid cells 2b) 수용체와 TREM-2-IgG 융합 단백질에 대한 유전자의 클로닝에 관한 것이다.
자연살해세포(natural killer cell)는 병원균, 암, 동종(allogeneic) 세포 등을 제거하는 선천 성면역(innate immunity)에 관여하며, TNF-α, IFN-γ, IL-12등의 사이토카인을 분비하여 적응성 면역(adaptive immunity)을 매개함으로써 암에 특이적인 기억형성을 조절하는 기능을 가지고 있다. 여러 암들에서 자연살해세포의 기능 및 분화능력에 결함이 있는 것으로 보고되었다.
TREM-2는 자연살해세포의 활성과 분화과정에서 발현되며 DAP12와 함께 대식세포와 수지상세포의 대식작용 및 항원제시(antigen presentation)에도 중요한 역할을 수행하여 선천적 면역에 관여하고 있음이 밝혀졌으며, 뇌신경 및 뇌세포와 골세포의 분화에도 관여하는 것으로 밝혀졌다.
그러나 지금까지도 선천성 면역계에 중요한 역활을 수행하는 단백질에 대한 유전자에 대해서는 충분히 알려져 있지 않았다.
본 발명에서는 유전자 수준에서의 유전자 발현을 양적, 질적으로 분석하기 위해 고안된 전사체(transcript)의 짧은 서열 태그(short sequence tag)을 분석하여 유전자로부터의 거의 모든 전사체를 분석하여 대량의 유전자 정보의 분석이 가능한 세이지 기술(SAGE, serial analysis of gene expression)을 이용하여 얻은 자연살해세포의 분화 및 활성에 관여하는 TREM-2 수용체 및 TREM-2-IgG 융합 단백질 수용체에 대한 유전자를 클로닝하였다.
본 발명은 벡터로서 pcDNA3.1(+)를 사용하였다. 이 벡터는 Invitrogen, Inc.로부터 구입할 수 있는 것으로서, CMV 프로모터, T7 프로모터/프라이밍 부위, BGH 폴리아데닐화 서열, 네오마이신 내성 유전자를 포함한다. 재조합 과정은 본 분야에 잘 알려진 통상의 방법에 따라 수행하였다. 사용된 프라이머는 센스: 5'-ggctggctgctggcaaagga 및 안티센스: 5'-ggctggattgactcctggct이다.
본 발명은 TREM-2를 일차 배양(primary culture) 세포에서 일시적으로 과량 발현하기 위한 수단으로서 레트로바이러스 벡터 pLXSN를 사용하였다. 이 벡터는 Clontech로부터 구입할 수 있는 것으로서, 몰로니 쥐 백혈병 바이러스(MoMuLV) 및 몰로니 쥐 육종 바이러스(MoMuSV)로부터 유래된 유전자, Ψ+(연장된 바이러스 패키징 시그날)를 포함한 전사체, 네오마이신 내성 유전자를 포함한다. 사용된 프라이머는 센스(5‘)에 BamHI 링커와 스페이서(ggatccccaggcgac) 염기서열을 포함하는 프라이머와 안티센스(3’)에 Xho I 링커를 포함하는 프라이머이다.
본 발명은 숙주로서 293T 세포를 사용하였다. 이 세포는 ATCC로부터 구입할 수 있다. 이 세포의 특징은 형질감염이 용이하다.
이하에서는 본 발명의 구체적인 실시예들을 참조하여 본 발명을 설명한다.
실시예
실시예 1
자연살해세포의 전구세포에서 특이적으로 발현되는 TREM -2의 확인
C57BL/6생쥐의 전체 골수세포(2×108 개)로부터 분리한 조혈 줄기세포, 자연살해세포의 전구세포 그리고 성숙한 자연살해세포로부터 각각의 분화단계에 따라 특이적으로 발현되는 유전자를 발굴하고자 SAGE를 수행하여 TREM-2 유전자가 자연살해세포의 전구세포에서만 특이적이면서 높은 복제수로 발현됨을 확인하였다(표1).
SAGE 태그 복제수 Matched Unigene Cluster GLGI 검증
CTCTCCCCTC 22 4 Mm.261623(BC033485)
자연살해세포의 전구세포에서 유전자발현이 실제로 SAGE 결과와 일치하는지를 역전사 중합효소 연쇄반응으로 알아본 결과, TREM-2의 유전자발현 양상이 SAGE 태그의 수와 정확하게 일치되는 것으로 확인되었다(도 1).
이러한 결과를 토대로 TREM-2 수용체의 구조와 기능이 자연살해세포로의 분화 및 활성에 영향을 미칠 가능성이 높은 것으로 판단되어 이에 대한 클로닝 및 TREM-2-IgG 융합 단백질을 제작하였다.
실시예 2
생쥐 TREM -2 발현벡터 및 레트로바이러스 벡터 제조
생쥐 TREM-2 cDNA를 클로닝하기 위하여 분화과정 중의 자연살해세포의 전구세포로부터 분리한 RNA와 TREM-2 프라이머(센스: 5'-ggctggctgctggcaaagga; 안티센스: 5'-ggctggattgactcctggct)로 역전사 중합효소 연쇄반응을 수행하여 TREM-2 cDNA를 증폭한 후 pCR4-TOPO(Invitrogen Co.)에 클로닝하였다(도 2).
클로닝된 클론들 중에서 염기서열분석 결과 참조염기서열(유전자 식별번호: AK039477)과 동일한 클론 24번의 cDNA를 TREM-2 발현벡터 제조 및 레트로바이러스 벡터 제조에 사용하였다. 레트로바이러스 벡터 pLXSN을 EcoRI과 송아지 장 알카리성 포스파타제(calf intestinal alkaline phosphatase, CIP) 효소를 처리한 후, pCR4-TREM-2 #24에 EcoRI 제한효소를 처리하여 분리한 TREM-2 cDNA를 첨가하고 T4 DNA 리가제로 연결하여 재조합된 pLXSN-TREM-2를 제조하였으며(도 3, 왼쪽), pcDNA3.1(+)을 EcoRI과 CIP 효소를 처리한 후, pCR4-TREM-2 #24에 EcoRI 제한효소를 처리하여 분리한 TREM-2 cDNA를 첨가하고 T4 DNA 리가제로 연결하여 재조합된 pcDNA3.1-TREM-2를 제조하여 각각의 바이러스 프로모터에 대한 방향성을 역전사 중합효소 연쇄반응으로 확인하였다(도 3, 오른쪽).
실시예 3
생쥐 TREM -2- IgG 융합 단백질 발현벡터의 제조
사람 IgG1 Fc(constant fragment)를 융합시킨 융합 단백질 발현벡터를 제조하기 위하여 5‘에 BamHI 링커와 스페이서(ggatccccaggcgac) 염기서열을 포함하는 프라이머와 3’에 Xho I 링커를 포함하는 프라이머를 첨가하여 중합효소 연쇄반응으로 증폭하고 pCR4-TOPO에 클로닝(pCR4-Fc)하였다. 또한 생쥐 TREM-2 수용체의 세포외 도메인(extracellular domain, ECD)과 3‘에 BamHI 링커를 첨가하여 증폭한 후 pCR4-TOPO에 클로닝(pCR4-TREM-2/ECD)하였다. 그리고 pCR4-Fc에 Xho I과 BamHI을 처리하여 약 820bp의 Fc 유전자 분리하였으며 pCR4-TREM-2/ECD에 EcoRI과 BamHI을 처리하여 약 530bp TREM-2/ECD를 pcDNA3.1 EcoRI-XhoI 부위에 Fc와 TREM-2/ECD 절편을 클로닝하여 BamHI, EcoRI/XhoI 제한효소로 DNA 클론을 확인하여 pcDNA-TREM-2-Fc들을 제작하였다(도 4). 동일한 방법으로 TREM-2-Fc 유전자를 레트로바이러스 벡터인 pLXSN에 클로닝하였다.
실시예 4
TREM -2- IgG 융합 단백질 발현 형질감염체 선별
TREM-2-IgG 융합 단백질 제조 시스템을 구축하기 위하여, pcDNA3.1-TREM-2-IgG 플라스미드를 293T 세포주에 형질감염(Tf) 하고 G418 항생제로 선별하였다. 선별된 클론으로부터 RNA를 분리하고 TREM-2 프라이머로 역전사 중합효소 연쇄반응을 수행하여 TREM-2 유전자를 과량으로 발현하는 클론을 2차 선별하였다. 2차 선별 클론 세포와 세포배양액을 사람 IgG에 대한 항체로 웨스턴블롯(Western blot)을 수행한 결과, 선별된 형질감염체에서 과량의 TREM-2-IgG 융합 단백질을 생산하고 있음을 알 수 있었다(도 5).
실시예 5
TREM -2- IgG 형질감염체 배양액에서 융합 단백질 의 정제
선별된 형질감염체의 배양액으로부터 TREM-2-IgG 융합 단백질의 정제과정을 설정하기 위하여 선별된 1X105 세포를 10cm2 배양용기에서 G418 (750 ug/ml)이 함유된 배양액으로 5일간 배양 후, 배양액으로 세척하고 1X105 세포를 10cm2 배양용기에서 배양액이 노란색으로 변하는 시간까지 배양하여 배양액을 수거하였다. 수거한 배양액을 10,000 rpm으로 30분간 원심분리하고 상층액을 프로테인 A 컬럼을 이용하여 TREM-2-IgG 융합 단백질을 분리하였다. 분리된 융합 단백질을 인산 완충용액에서 24시간 투석하고 센트리콘(centricon)으로 농축하여 정량하고 순도는 SDS-PAGE로 확인한 결과, 배양액 1ml에서 8μg의 융합 단백질이 생산되었고 순도는 약 95% 이상이었다(도 6).
본 발명은 병원균, 암, 동종세포 등을 제거하는 선천성 면역과 관련한 항암제 등의 개발에 유효하다.

Claims (2)

  1. 선천성 면역에 관여하는 트렘-2를 발현하는 재조합 벡터 pcDNA3.1-TREM-2.
  2. 선천성 면역에 관여하는 트렘-2를 발현하는 재조합 벡터pLXSN-TREM-2.
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