KR20210047316A - 비푸코실화된 항체 및 그의 제조법 - Google Patents

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Abstract

비푸코실화된 항체를 생산하는 방법, 비푸코실화된 항체 및 그의 조성물 및 항체를 생산하기 위한 세포가 제공된다. 방법은 푸코실화 경로의 적어도 하나의 변형된 효소를 코딩하는 핵산을 숙주 세포에 도입하여 숙주 세포에서 비푸코실화된 항체를 생산하는 것을 포함한다. 개시된 방법에 의해 생산된 비푸코실화된 항체는 증가된 ADCC 활성을 갖고 이들의 CDC 및 안전성을 저해하지 않을 것이다.

Description

비푸코실화된 항체 및 그의 제조법
본 개시내용은 개선된 활성 및 치료적 특성을 갖는 비푸코실화된 면역학적으로 기능적인 분자를 포함한 비푸코실화된 단백질, 및 비푸코실화된 단백질의 제조 방법에 관한 것이다.
당단백질은 촉매작용, 신호전달, 세포-세포 소통, 및 분자 인식 및 회합을 포함하여 인간에서 많은 필수 기능을 매개한다. 많은 당단백질이 치료적 목적으로 활용되어 왔으며, 지난 20년 동안, 자연 발생 분비된 당단백질의 재조합 버전은 생명공학 산업의 주요 제품이었다. 예는 에리스로포이에틴 (EPO), 치료용 모노클로날 항체 (치료용 mAb), 조직 플라스미노겐 활성화제 (tPA), 인터페론-β, (IFN-β), 과립구-대식세포 콜로니 자극 인자 (GM-CSF), 및 인간 융모성 고나도트로핀 (hCG)을 포함한다.
5가지 클래스의 항체, 즉, IgM, IgD, IgG, IgA 및 IgE가 포유동물에 존재한다. 인간 IgG 클래스의 항체는 혈액에서의 이들의 긴 반감기 및 기능적 특징, 예컨대 다양한 이펙터 기능 등으로 인해 다양한 인간 질환의 진단, 예방 및 치료에 주로 사용된다. 인간 IgG 클래스 항체는 하기 4가지 서브클래스: IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4로 추가로 분류된다. IgG 클래스 항체의 이펙터 기능으로서 항체-의존적 세포성 세포독성 (ADCC) 활성 및 보체-의존적 세포독성 활성 (CDC)에 대해 많은 연구가 수행되었으며, IgG1 서브클래스의 항체가 인간 IgG 클래스 항체 중 가장 큰 ADCC 활성 및 CDC 활성을 갖는 것으로 보고되었다.
인간 IgG1 서브클래스 항체의 ADCC 활성 및 CDC 활성의 발현은 이펙터 세포, 예컨대 살해 세포, 자연 살해 세포, 활성화된 대식세포 등의 표면에 존재하는 항체 수용체 (이하 "FcγR"이라고 함)로의 항체의 Fc 영역의 결합 및 다양한 보체 성분을 필요로 한다. 항체 힌지 영역 및 C 영역의 제2 도메인 (이하 "Cγ2 도메인"이라고 함)에 있는 여러 아미노산 잔기 및 Cγ2 도메인에 연결된 당 쇄가 또한 이 결합 반응에 중요하다고 제안되었다.
항체 또는 Fc-융합 단백질의 N-글리칸 푸코실화의 감소 또는 억제는 ADCC 활성을 향상시킬 수 있다. ADCC는 전형적으로 자연 살해 (NK) 세포의 활성화를 수반하며, NK 세포 표면의 Fc 수용체에 의한 항체-코팅 세포의 인식에 의존적이다. NK 세포 상의 Fc 수용체에 대한 Fc 도메인의 결합은 Fc 도메인의 글리코실화 상태에 의해 영향을 받는다. 또한, Fc 도메인에서 N-글리칸의 유형은 또한 ADCC 활성에 영향을 미친다. 따라서, 항체 조성물 또는 Fc-융합 단백질 조성물의 경우, 비푸코실 N-글리칸의 상대적인 양의 증가는 FcγRIII에 대한 결합 친화성 또는 조성물의 ADCC 활성을 향상시킬 수 있다.
종, 조직 및 세포 유형을 포함하여 글리코실화에 영향을 미칠 수 있는 여러 인자는 모두 글리코실화가 발생하는 방식에서 중요한 것으로 제시되어 있다. 또한, 세포외 환경은 변경된 배양 조건, 예컨대 혈청 농도를 통해 글리코실화에 직접적인 효과를 가질 수 있다. 올리고사카라이드 생산에 수반되는 특정 효소를 도입 또는 과다발현하는 것을 포함하여 특정한 숙주 유기체에서 달성된 글리코실화 패턴을 변경하기 위한 다양한 방법이 제안되었다 (미국 특허 번호 5,047,335; 미국 특허 번호 5,510,261). 이들 스킴은 세포내 방법으로 제한되지 않는다 (미국 특허 번호 5,278,299).
WO98/58964에는 실질적으로 모든 N-연결된 올리고사카라이드가 G2 올리고사카라이드인 항체 조성물이 기재되어 있다. G2는 2개의 말단 Gal을 갖고 NeuAc를 갖지 않는 이중안테나형 구조를 지칭한다. WO99/22764는 그의 CH2 도메인에서 N-연결된 G1, G0, 또는 G-1 올리고사카라이드를 갖는 당단백질이 실질적으로 없는 항체 조성물을 언급한다. G1은 하나의 Gal을 갖고 NeuAc를 갖지 않는 이중안테나형 구조를 지칭하고, G0은 말단 NeuAc 또는 Gal이 존재하지 않는 이중안테나형 구조를 지칭하고, G-1은 코어 단위에서 1개의 GlcNAc를 뺀 것을 지칭한다.
WO00/61739는 NSO (마우스 골수종) 세포에 의해 발현된 항체의 73%와 비교하여 YB2/0 (래트 골수종) 세포에 의해 발현된 항-hIL-5R 항체의 47%가 α 1-6 푸코스-연결된 당 쇄를 갖는 것으로 보고한다. 다양한 숙주 세포에 의해 발현된 α-hIL-5R 항체의 푸코스 상대적 비율은 YB2/0<CHO/d<NSO였다.
WO02/31140 및 WO03/85118은 α1,6-푸코실트랜스퍼라제의 기능을 저해하기 위해 RNAi를 사용함으로써 당 쇄에 대한 푸코스 결합의 변형을 제어할 수 있음을 제시한다. 푸코스의 1-위치가 복합체 N-글리코시드-연결된 당 쇄에서 α-결합을 통해 환원 말단에서 N-아세틸글루코사민의 6-위치에 결합된 당 쇄를 인식하는 렉틴에 저항성이 있는 세포를 사용하는 것을 포함하는, 세포를 사용한 항체 조성물의 제조 방법.
당 쇄의 구조는 인간 IgG1 서브클래스 항체의 이펙터 기능에 중요한 역할을 하며, 당 쇄 구조를 변경함으로써 더 큰 이펙터 기능을 갖는 항체를 제조하는 것이 가능할 수 있다. 그러나, 당 쇄의 구조는 다양하고 복잡하며, 당 쇄의 생리적 역할에 대한 해결책은 불충분하고 고가일 것이다. 그러므로, 비푸코실화된 항체를 생산하는 방법이 필요하다.
참고문헌:
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3. WONG, Chi-Huey, et al., "Method and composition for synthesizing sialylated glycosyl compounds" US Patent No. 5,278,299 (1994)
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10. MOESSENER, E., et al., "Increasing the efficacy of CD20 antibody therapy through the engineering of a new type II anti-CD20 antibody with enhanced direct and immune effector cell-mediated B-cell cytotoxicity" Blood 115, 4393-4402 (2010)
11. FERRARA, C., et al., "Unique carbohydrate-carbohydrate interactions are required for high affinity binding between FcγRIII and antibodies lacking core fucose" Proc Natl Acad Sci U.S.A. 108, 12669 - 12674 (2011)
본 개시내용은 개선된 활성을 갖는 비푸코실화된 항체를 포함한 비푸코실화된 단백질을 생산하는 신규 방법에 관한 것이다. 본 개시내용은 또한 개시된 방법에 의해 생산된 비푸코실화된 단백질 및 비푸코실화된 단백질을 생산하기 위한 세포에 관한 것이다. 개시된 비푸코실화된 항체는 자연 발생 푸코실화된 항체와 비교하여 증가된 항체-의존적 세포성 세포독성 (ADCC) 활성을 갖는다.
본 개시내용의 한 측면은 숙주 세포에서 비푸코실화된 항체를 포함한 비푸코실화된 단백질을 생산하는 방법에 관한 것이다. 본 개시내용의 방법은 일반적으로 푸코실화 경로의 변형된 효소를 코딩하는 핵산을 숙주 세포에 도입하여 숙주 세포에서 항체의 푸코실화를 억제하는 것을 포함한다. 변형된 효소는 푸코실화 경로의 효소로부터 유래될 수 있다. 특정 실시양태에서, 변형된 효소는 GDP-만노스 4,6-데히드라타제 (GMD), GDP-4-케토-6-데옥시-D-만노스 에피머라제-리덕타제 (FX), 및/또는 임의의 푸코실트랜스퍼라제 (FUT1 내지 FUT12, POFUT1, 및 POFUT2)로부터 유래될 수 있다. 일부 실시양태에서, 변형된 효소는 GMD 또는 FUT로부터 유래될 수 있다. 구체적 실시양태에서, 변형된 효소는 α-1,6-푸코실트랜스퍼라제 (FUT8)로부터 유래될 수 있다. 변형된 효소는 푸코실화 경로에서 숙주 세포의 자연 발생 효소의 기능을 억제할 수 있으며, 이는 결국 숙주 세포에서 항체의 푸코실화를 억제한다.
일부 실시양태에서, 비푸코실화된 항체를 포함한 비푸코실화된 단백질을 생산하는 방법은 (a) 숙주 세포를 제공하는 단계, (b) 푸코실화 경로의 변형된 효소를 코딩하는 핵산을 숙주 세포에 도입하는 단계, 및 (c) 숙주 세포에서 비푸코실화된 단백질을 생산하는 단계를 포함한다.
본 개시내용의 또 다른 측면은 본 개시내용의 방법에 의해 생산된 비푸코실화된 항체를 포함한 비푸코실화된 단백질에 관한 것이다. 비푸코실화된 항체는 자연 발생 푸코실화된 항체와 비교하여 증가되고 개선된 활성을 갖는다. 일부 실시양태에서, 항체는 증가되고 개선된 ADCC를 갖는다.
본 개시내용은 또한 비푸코실화된 항체를 포함한 비푸코실화된 단백질을 생산하기 위한 세포에 관한 것이다.
본 개시내용의 상세한 설명은 첨부된 도면을 참조하여 하기 실시양태에서 제공된다.
도 1은 RC79 세포 (리툭산(RITUXAN)®을 발현하는 안정적 클론) 및 F83M, F8M1, F8M2, F8M3 또는 F8D1 돌연변이체 단백질을 발현하는 재조합 RC79 세포에서 생산된 FUT8 단백질의 웨스턴 블롯 프로파일이다. 글리세르알데히드-3-포스페이트 데히드로게나제 (GAPDH)의 발현은 단백질 로딩 대조군으로서 사용된다. 돌연변이체 FUT8 효소를 발현하는 RC79 재조합 세포에서 FUT8 단백질의 발현 수준은 RC79 모세포에서 FUT8 단백질의 발현 수준과 유사하거나 동일하다.
도 2는 F83M 돌연변이체 단백질을 발현하는 RC79 재조합 세포 및 RC79 모세포의 유동 세포계측법 분석이다. 점선의 피크는 로다민-LCA로 염색된 F83M을 발현하는 RC79 재조합 세포를 나타낸다. 채워진 회색 피크는 로다마인-LCA 염색 없이 F83M을 발현하는 RC79 재조합 세포를 나타낸다 (음성 대조군). 점선의 피크는 로다민-LCA로 염색된 RC79 세포 (F83M을 발현하지 않는 모세포)를 나타낸다 (양성 대조군).
도 3a 및 3b는 ADCC 검정의 결과를 제시하는 그래프이다. 도 3a-3b는 각각 공여자 1 (도 3a) 및 공여자 2 (도 3b)로부터의 PBMC 세포에 의한 리툭산® 및 비푸코실화된 항-CD20 mAb의 ADCC 활성을 예시한다. 비푸코실화된 항-CD20 mAb (클론 R1)의 ADCC 활성은 리툭산®보다 유의하게 더 높다.
도 4a-4c는 SPR 바이오센서 (비아코어(BIACORE)™ X100)를 사용한 FcγRIIIa 친화성 검정의 SPR 센서그램을 제시하는 그래프이다. His-태그부착된 FcγRIIIa (1 μg/mL) 및 5-80 nM 비푸코실화된 항-CD20 mAb (도 4a), 20-320 nM 리툭산® (도 4b), 또는 5-80 nM 가지바(GAZYVA)® (도 4c)는 30 μL/분의 유속으로 순차적으로 항-His 항체-고정된 CM5 칩을 통해 유동하였다. 비푸코실화된 항-CD20 mAb (클론 R1)는 리툭산® 및 가지바®보다 FcγRIIIa에 대해 더 강한 친화성을 가졌다.
도 5는 리툭산® 및 비푸코실화된 항-CD20 mAb의 CDC 활성을 제시하는 그래프이다. 비푸코실화된 항-CD20 mAb (클론 R1)의 CDC 활성은 리툭산®과 필적하였다.
도 6은 염수 (비히클), 리툭산® 또는 비푸코실화된 항-CD20 mAb (클론 R1)로 처리된 마우스의 종양 부피를 제시하는 그래프이다. 데이터 포인트는 종양 부피의 평균 ± SD를 나타낸다 (각 그룹에서 n=5). 비푸코실화된 항-CD20 mAb (클론 R1)의 항-종양 효능은 리툭산®보다 유의하게 더 높다.
도 7은 염수 (비히클), 리툭산® 또는 비푸코실화된 항-CD20 mAb (클론 R1)로 처리된 마우스로부터 수집된 종양의 중량을 제시하는 그래프이다. 비푸코실화된 항-CD20 항체 (R1 클론)로 처리된 마우스의 종양 중량은 리툭산® 및 비히클 그룹보다 유의하게 더 가볍다.
도 8은 염수 (비히클), 리툭산® 또는 비푸코실화된 항-CD20 mAb (클론 R1)로 처리된 마우스의 체중을 제시하는 그래프이다. 데이터 포인트는 종양 부피의 평균 ± SD를 나타낸다 (각 그룹에서 n=5).
본 개시내용은 개선된 활성을 갖는 비푸코실화된 항체를 생산하는 신규 방법에 관한 것이다. 본 개시내용은 또한 개시된 방법에 의해 생산된 비푸코실화된 항체 및 비푸코실화된 항체를 생산하기 위한 세포에 관한 것이다. 개시된 비푸코실화된 항체는 자연 발생 푸코실화된 항체와 비교하여 증가된 항체-의존적 세포성 세포독성 (ADCC) 활성을 갖는다.
다음은 본 발명의 실시에서 관련 기술분야의 통상의 기술자를 돕기 위해 제공된 상세한 설명이다. 관련 기술분야의 통상의 기술자는 본원에 포함된 정보의 취지 또는 범주를 벗어나지 않는 본원에 명시적으로 기재된 실시양태의 변형 또는 변경이 본 개시내용에 포함된다는 것을 이해할 것이다. 설명에 사용된 용어는 단지 특정한 실시양태를 설명하기 위한 것일 뿐이며, 본 발명을 제한하려는 것이 아니다. 하기 사용된 섹션 제목은 단지 조직 목적을 위한 것이며, 설명된 주제를 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다.
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1. 세포에서의 푸코실화 억제
본 개시내용의 한 측면은 세포에서 푸코실화를 억제하거나 또는 감소시키는 방법에 관한 것이다.
a. 숙주 세포
효모, 곤충, 양서류, 어류, 파충류, 조류, 포유동물 또는 인간으로부터 유래된 숙주 세포, 또는 하이브리도마 세포를 포함한 임의의 적절한 숙주 세포가 비푸코실화된 항체를 생산하기 위해 사용될 수 있다. 숙주 세포는 변형되지 않은 세포 또는 세포주, 또는 유전적으로 변형된 세포주 (예를 들어, 생물학적 산물의 생산을 용이하게 하기 위해)일 수 있다. 일부 실시양태에서, 숙주 세포는 원하는 조건 하에, 예컨대 무혈청 배지에서, 세포 현탁 배양에서, 또는 부착성 세포 배양에서 성장을 허용하도록 변형된 세포주이다.
포유류 숙주 세포는 인간에게 투여하도록 의도된 항체에 사용하기에 유리할 수 있다. 일부 실시양태에서, 숙주 세포는 많은 재조합 단백질의 발현에 사용되는 세포주인 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포이다. 재조합 단백질의 발현에 일반적으로 사용되는 추가 포유류 세포주는 293HEK 세포, HeLa 세포, COS 세포, NIH/3T3 세포, Jurkat 세포, NSO 세포, 및 HUVEC 세포를 포함한다. 다른 실시양태에서, 숙주 세포는 항체를 발현하는 재조합 세포이다.
본원에 제공된 방법에 유용한 인간 세포주의 예는 세포주 293T (배아 신장), 786-0 (신장), A498 (신장), A549 (폐포 기저 상피), ACHN (신장), BT-549 (유방), BxPC-3 (췌장), CAKI-1 (신장), Capan-i (췌장), CCRF-CEM (백혈병), COLO 205 (결장), DLD-1 (결장), DMS 114 (소세포 폐), DU145 (전립선), EKVX (비소세포 폐), HCC-2998 (결장), HCT-15 (결장), HCT-1 16 (결장), HT29 (결장), S IT- 1080 (섬유육종), HEK 293 (배아 신장), HeLa (자궁경부 암종), HepG2 (간세포 암종), HL-60(TB) (백혈병), HOP-62 (비소세포 폐), HOP-92 (비소세포 폐), HS 578T (유방), HT-29 (결장 선암종), IG -OV1 (난소), IMR32 (신경모세포종), Jurkat (T 림프구), K-562 (백혈병), KM 12 (결장), KM20L2 (결장), LANS (신경모세포종), LNCap.FGC (코카시안 전립선 선암종), LOX IMV1 (흑색종), LXFL 529 (비소세포 폐), M 14 (흑색종), M19-MEL (흑색종), MALME-3M (흑색종), MCFIOA (유선 상피), MCI '7 (유선), MDA-MB-453 (유선 상피), MDA-MB-468 (유방), MDA-MB-231 (유방), MDA-N (유방), MOLT-4 (백혈병), NCl/ADR-RES (난소), NCI- 1122.0 (비소세포 폐), NCI-H23 (비소세포 폐), NC1-H322M (비소세포 폐), NCI-H460 (비소세포 폐), NCI-H522 (비소세포 폐), OVCAR-3 (난소), QVCAR-4 (난소), OVCAR-5 (난소), OVCAR-8 (난소), P388 (백혈병), P388/ADR (백혈병), PC-3 (전립선), PERC6® (El -형질전환 배아 망막), RPMI-7951 (흑색종), RPMI-8226 (백혈병), RXF 393 (신장), RXF-631 (신장), Saos-2 (골), SF-268 (CNS), SF-295 (CNS), SF-539 (CNS), SHP-77 (소세포 폐), SH-SY5Y (신경모세포종), SK-BR3 (유방), SK-MEL-2 (흑색종), SK-MEL-5 (흑색종), SK-MEL-28 (흑색종), SK-OV-3 (난소), SN12K1 (신장), SN12C (신장), SNB-19 (CNS), SNB-75 (CNS) SNB-78 (CNS), SR (백혈병), SW-620 (결장), T-47D (유방), THP-1 (단핵구-유래 대식세포), TK-10 (신장), U87 (교모세포종), U293 (신장), U251 (CNS), UACC-257 (흑색종), UACC-62 (흑색종), UO-31 (신장), W138 (폐), 및 XF 498 (CNS)을 포함한다.
본원에 제공된 방법에 유용한 비인간 영장류 세포주의 예는 세포주 원숭이 신장 (CVI-76), 아프리카 녹색 원숭이 신장 (VERO-76), 녹색 원숭이 섬유모세포 (COS-1), 및 SV40에 의해 형질전환된 원숭이 신장 (CVI) 세포 (COS- 7)을 포함한다. 추가 포유류 세포주는 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지되어 있으며, 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 (ATCC) 카탈로그 (미국 버지니아주 마나사스)에 분류되어 있다.
b. 푸코실화 경로에서의 효소 변형
본 개시내용의 비푸코실화된 항체는 단백질의 푸코실화를 감소시키거나 또는 억제하는 방식으로 푸코실화 경로가 변경된 숙주 세포에서 생산될 수 있다.
i. 변형된 효소
본원에 사용된 바와 같은 어구 "변형된 효소"는 변형 후 단백질의 자연적 효소 활성을 변경하거나 또는 파괴하는 방식으로 변경된 푸코실화 경로에서 자연 발생 또는 야생형 효소로부터 유래된 단백질을 지칭한다. 변형된 효소는 숙주 세포에서 야생형 효소의 활성을 변경하거나, 억제하거나 또는 감소시키기 위해 그의 야생형 대응부를 억제하거나 또는 방해할 수 있다.
변형된 효소는 자연 발생 효소를 변경함으로써, 예를 들어, 전체 단백질 전하를 변경하고, 화학적 또는 단백질 모이어티를 공유결합으로 부착시키고, 아미노산 치환, 삽입 및/또는 결실, 및/또는 이들의 임의의 조합을 도입함으로써 생산될 수 있다. 일부 실시양태에서, 변형된 효소는 그의 자연 발생 효소 대응부와 비교하여 아미노산 치환, 첨가 및/또는 결실을 갖는다. 일부 실시양태에서, 변형된 효소는 그의 자연 발생 대응부와 비교하여 1개 내지 약 20개의 아미노산 치환, 첨가 및/또는 결실을 갖는다. 아미노산 치환, 첨가 및 삽입은 천연 또는 비천연 아미노산으로 성취될 수 있다. 비자연 발생 아미노산은 ε-N 리신, ß-알라닌, 오르니틴, 노르류신, 노르발린, 히드록시프롤린, 티록신, γ-아미노 부티르산, 호모세린, 시트룰린, 아미노벤조산, 6-아미노카프로산 (Aca; 6-아미노헥산산), 히드록시프롤린, 메르캅토프로피온산 (MPA), 3-니트로-티로신, 피로글루탐산 등을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 자연 발생 아미노산은 알라닌, 아르기닌, 아스파라긴, 아스파르트산, 시스테인, 글루탐산, 글루타민, 글리신, 히스티딘, 이소류신, 류신, 리신, 메티오닌, 페닐알라닌, 프롤린, 세린, 트레오닌, 트립토판, 티로신 및 발린을 포함한다.
변형된 효소는 푸코실화 경로에서 임의의 자연 발생 효소로부터 유래될 수 있다. 예를 들어, 변형된 효소는 GDP-만노스 4,6-데히드라타제 (GMD), GDP-4-케토-6-데옥시-D-만노스 에피머라제-리덕타제 (FX), 및/또는 갈락토시드 2-알파-L-푸코실트랜스퍼라제 1 (FUT1), 갈락토시드 2-알파-L-푸코실트랜스퍼라제 2 (FUT2), 갈락토시드 3(4)-L-푸코실트랜스퍼라제 (FUT3), 알파 (1,3) 푸코실트랜스퍼라제, 골수-특이적 (FUT4), 알파-(1,3)-푸코실트랜스퍼라제 (FUT5), 알파-(1,3)-푸코실트랜스퍼라제 (FUT6), 알파-(1,3)-푸코실트랜스퍼라제 (FUT7), 알파-(1,6)-푸코실트랜스퍼라제 (FUT8), 알파-(1,3)-푸코실트랜스퍼라제 (FUT9), 단백질 O-푸코실트랜스퍼라제 1 (POFUT1), 단백질 O-푸코실트랜스퍼라제 2 (POFUT2)를 포함한 임의의 푸코실트랜스퍼라제로부터 유래될 수 있다.
일부 실시양태에서, 푸코실화 경로에서 하나 초과의 효소가 변형된다. 특정 실시양태에서, 변형된 효소는 GMD, FX 및/또는 FUT8로부터 유래된다.
ii. 변형된 효소를 코딩하는 핵산
본 개시내용의 비푸코실화된 항체는 푸코실화 경로가 단백질의 푸코실화를 감소시키거나 또는 억제하는 방식으로 변경된 숙주 세포에서 생산될 수 있다.
일부 실시양태에서, 숙주 세포의 푸코실화 경로는 푸코실화 경로에서 변형된 효소를 코딩하는 핵산을 세포에 도입함으로써 변경된다. 예를 들어, 변형된 효소를 코딩하는 핵산은 발현 벡터에 삽입되고 숙주 세포로 형질감염될 수 있다. 변형된 효소를 코딩하는 핵산 분자는 숙주 세포에 일시적으로 도입되거나 또는 숙주 세포의 게놈으로 안정적으로 통합될 수 있다. 표준 재조합 DNA 방법론을 사용하여 변형된 효소를 코딩하는 핵산을 생산하고 핵산을 발현 벡터에 혼입하고 벡터를 숙주 세포에 도입할 수 있다.
일부 실시양태에서, 숙주 세포는 2종 이상의 변형된 효소를 발현할 수 있다. 예를 들어, 숙주 세포는 2종 이상의 변형된 효소를 코딩하는 핵산으로 형질감염될 수 있다. 대안적으로, 숙주 세포는 각각 하나 이상의 변형된 효소를 코딩하는 하나 초과의 핵산으로 형질감염될 수 있다.
변형된 효소를 코딩하는 핵산은 추가 핵산 서열을 함유할 수 있다. 예를 들어, 핵산은 단백질 태그, 선택가능한 마커, 또는 숙주 세포에서 단백질의 발현을 제어하는 조절 서열, 예컨대 프로모터, 인핸서 또는 핵산의 전사 또는 번역을 제어하는 다른 발현 제어 요소 (예를 들어, 폴리아데닐화 신호)를 함유할 수 있다. 이러한 조절 서열은 관련 기술분야에 공지되어 있다. 관련 기술분야의 통상의 기술자는 조절 서열의 선택을 포함하여 발현 벡터의 선택이 형질전환될 숙주 세포의 선택, 원하는 단백질의 발현 수준 등을 포함한 여러 인자에 의존할 수 있음을 이해할 것이다. 포유류 숙주 세포 발현을 위한 예시적인 조절인자 서열은 포유류 세포에서 높은 수준의 단백질 발현을 지시하는 바이러스 요소, 예컨대 사이토메갈로바이러스 (CMV) (예컨대 CMV 프로모터/인핸서), 시미안 바이러스 40 (SV40) (예컨대 SV40 프로모터/인핸서), 아데노바이러스, (예를 들어, 아데노바이러스 주요 후기 프로모터 (AdMLP)) 및 폴리오마 바이러스로부터 유래된 프로모터 및/또는 인핸서를 포함한다.
특정 실시양태에서, GMD, FX 및/또는 FUT로부터 유래된 변형된 효소를 함유하는 핵산 서열이 숙주 세포에 도입된다. 푸코실화 경로는 변형된 효소를 발현하는 숙주 세포에서 변경되거나, 억제되거나 또는 감소될 것이다.
c. 변형된 효소를 발현하는 숙주 세포
본 개시내용의 또 다른 측면은 푸코실화 경로에서 변형된 효소를 발현하는 숙주 세포에 관한 것이다. 숙주 세포에서 변형된 효소의 발현은 야생형 효소의 활성을 방해하며, 이는 푸코실화 경로의 억제 또는 감소를 초래한다. 그러므로, 변형된 효소를 발현하는 숙주 세포에서 생산된 단백질 (예를 들어, 항체)은 비푸코실화된다.
본원에 사용된 바와 같은 어구 "낮은 푸코실화 세포" 또는 "낮은 푸코실화 숙주 세포"는 세포가 푸코실화 경로에서 변형된 효소를 발현하기 때문에 푸코실화 경로가 억제되거나 또는 감소된 세포를 지칭한다.
낮은 푸코실화 세포는 푸코실화 경로에서 변형된 효소를 코딩하는 핵산 서열을 함유하는 발현 벡터로 숙주 세포를 형질감염시킴으로써 제조될 수 있다. 형질감염은 관련 기술분야에 공지된 기술을 사용하여 수행될 수 있다. 예를 들어, 형질감염은 화학물질-기반 방법 (예를 들어, 지질, 인산칼슘, 양이온성 폴리머, DEAE-덱스트란, 활성화된 덴드리머, 자성 비드 등)을 사용하여, 기기-기반 방법 (예를 들어, 전기천공, 바이오리스틱 기술, 미세주사, 레이저펙션/옵토인젝션 등)에 의해, 또는 바이러스-기반 방법에 의해 수행될 수 있다.
형질감염된 세포는 발현 벡터에 존재하는 선택가능한 마커를 사용하여 비-형질감염된 세포로부터 선택되고 단리될 수 있다. 또한, 억제되거나 또는 감소된 푸코실화 경로를 갖는 형질감염된 세포는 다양한 기술에 의해 정상적인 푸코실화 경로를 갖는 세포로부터 추가로 선택되고 단리될 수 있다. 예를 들어, 푸코실화는 항체, 렉틴, 대사 표지 또는 화학효소적 전략을 사용하여 결정될 수 있다. 또한, 억제되거나 또는 감소된 푸코실화 경로를 갖는 세포는 형질감염된 세포를 렌즈 쿨리나리스 응집소 (LCA, 벡터 래보러토리즈(Vector laboratories) L-1040)에 노출시킴으로써 선택될 수 있다. LCA는 N-연결된 올리고사카라이드의 α-1,6-푸코실화된 트리만노스-코어 구조를 인식하고, 이 구조를 발현하는 세포를 세포-사멸 경로에 투입한다. 그러므로, LCA에 노출되어 생존한 세포는 억제되거나 또는 감소된 푸코실화 경로를 갖고, 낮은 푸코실화 세포로 간주된다.
2. 비푸코실화된 단백질
본 개시내용의 또 다른 측면은 비푸코실화된 단백질을 생산하는 방법에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 비푸코실화된 단백질은 비푸코실화된 항체이다.
a. 단백질
비푸코실화된 단백질로서 생산될 수 있는 단백질의 비제한적인 예는 GP-73, 헤모펙신, HBsAg, B형 간염 바이러스 입자, 알파-산-당단백질, 알파-1-항키모트립신, 알파-1-항키모트립신 His-Pro-less, 알파-1-항트립신, 세로트랜스페린, 세룰로플라스민, 알파-2-마크로글로불린, 알파-2-HS-당단백질, 알파-태아단백질, 합토글로빈, 피브리노겐 감마 쇄 전구체, 이뮤노글로불린 (IgG, IgA, IgM, IgD, IgE 등 포함), APO-D, 키니노겐, 히스티딘 풍부 당단백질, 보체 인자 1 전구체, 보체 인자 I 중쇄, 보체 인자 I 경쇄, 보체 C1s, 보체 인자 B 전구체, 보체 인자 B Ba 단편, 보체 인자 B Bb 단편, 보체 C3 전구체, 보체 C3 베타 쇄, 보체 C3 알파 쇄, C3a 아나필라톡신, 보체, C3b 알파' 쇄, 보체 C3c 단편, 보체 C3dg 단편, 보체 C3g 단편, 보체 C3d 단편, 보체 C3f 단편, 보체 C5, 보체 C5 베타 쇄, 보체 C5 알파 쇄, C5a 아나필라톡신, 보체 C5 알파' 쇄, 보체 C7, 알파-1 B 당단백질, B-2-당단백질, 비타민 D-결합 단백질, 인터-알파-트립신 억제제 중쇄 H2, 알파-1B-당단백질, 안지오텐시노겐 전구체, 안지오텐신-1, 안지오텐신-2, 안지오텐신-3, GARP 단백질, 베타-2-당단백질, 클루스테린 (Apo J), 인테그린 알파-8 전구체 당단백질, 인테그린 알파-8 중쇄, 인테그린 알파-8 경쇄, C형 간염 바이러스 입자, elf-5, 키니노겐, HSP33-상동체, 리실 엔도펩티다제 및 류신-풍부 반복부-함유 단백질 32 전구체를 포함한다.
b. 항체
본원에 사용된 바와 같은 용어 "항체"는 푸코실화될 수 있는 무손상 항체 분자 뿐만 아니라 그의 단편을 광범위하게 포함한다. 예를 들어, 항체는 완전히 어셈블리된 이뮤노글로불린 (예를 들어, 폴리클로날, 모노클로날, 단일특이적, 다중특이적, 키메라, 탈면역화된, 인간화된, 인간, 영장류화된, 단일-쇄, 단일-도메인, 합성, 및 재조합 항체); 원하는 활성 또는 기능을 갖는 무손상 항체의 부분 (예를 들어, Fab, Fab', F(ab')2, Fv, scFv, 단일 도메인 단편을 함유하는 항체의 면역학적 단편); 뿐만 아니라 푸코실화될 수 있는 Fc 도메인을 함유하는 펩티드 및 단백질 (예를 들어, Fc-융합 단백질)을 포함한다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "비푸코실화된 항체"는 자연 조건 하에 생성된 항체와 비교하여 푸코실화가 억제되거나 또는 유의하게 감소된 조건 하에 생성된 항체 또는 그의 단편을 지칭한다. 본 개시내용의 방법에 의해 생산된 비푸코실화된 항체는 완전히 (100%) 비푸코실화될 수 있거나, 또는 대안적으로 푸코실화된 및 비푸코실화된 분자의 혼합물을 포함할 수 있다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 개시된 방법으로부터 생산된 항체는 약 20% 내지 약 100% 비푸코실화된 분자를 함유할 수 있다. 다른 실시양태에서, 개시된 방법으로부터 생산된 항체는 약 40% 내지 약 100% 비푸코실화된 분자를 함유할 수 있다. 특정 실시양태에서, 개시된 방법으로부터 생산된 항체는 약 적어도 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97, 98%, 99%, 또는 100% 비푸코실화된 분자를 함유한다. 모든 N-글리코실화된 항체 또는 그의 단편 (예를 들어, Fc-융합 단백질)이 비푸코실화될 필요는 없다.
b. 항체의 유형
임의의 항체는 본원에 개시된 방법을 사용하여 비푸코실화된 항체로서 생산될 수 있다. 개시된 방법을 사용하여 생산될 수 있는 항체의 유형에는 제한이 없다. 다음은 생산될 수 있는 항체의 전체 목록이 아니다:
종양-관련 항원을 인식하는 항체의 예는 항-GD2 항체, 항-GD3 항체, 항-GM2 항체, 항-HER2 항체, 항-CD52 항체, 항-MAGE 항체, 항-HM124 항체, 항-부갑상선 호르몬-관련 단백질 (PTHrP) 항체, 항- 염기성 섬유모세포 성장 인자 항체 및 항-FGF8 항체, 항-염기성 섬유모세포 성장 인자 수용체 항체 및 항-FGFS 수용체 항체, 항-인슐린-유사 성장 인자 항체, 항-인슐린-유사 성장 인자 수용체 항체, 항-PMSA 항체, 항-혈관 내피 세포 성장 인자 항체, 항-혈관 내피 세포 성장 인자 수용체 항체 등을 포함한다.
알레르기- 또는 염증-관련 항원을 인식하는 항체의 예는 항-인터류킨 6 항체, 항-인터류킨 6 수용체 항체, 항-인터류킨 5 항체, 항-인터류킨 5 수용체 항체 및 항-인터류킨 4 항체, 항-종양 괴사 인자 항체, 항-종양 괴사 인자 수용체 항체, 항-CCR4 항체, 항-케모카인 항체, 항-케모카인 수용체 항체 등을 포함한다.
순환기 질환-관련 항원을 인식하는 항체의 예는 항-GpIIb/IIIa 항체, 항-혈소판-유래 성장 인자 항체, 항-혈소판-유래 성장 인자 수용체 항체 및 항-혈액 응고 인자 항체 등을 포함한다.
바이러스 또는 박테리아 감염-관련 항원을 인식하는 항체의 예는 항-gpl 20 항체, 항-CD4 항체, 항-CCR4 항체 및 항-베로 독소 항체 등을 포함한다.
여러 치료용 항체는 상업적으로 입수가능하며, 예컨대 VEGF (예를 들어, 베바시주맙 (아바스틴(AVASTIN)®)), EGFR (예를 들어, 세툭시맙 (에르비툭스(ERBITUX)®)), HER2 (예를 들어, 트라스투주맙 (허셉틴(HERCEPTIN)®)), 및 CD20 (예를 들어, 리툭시맙 (리툭산®))에 결합하는 항체, 및 TNFa (예를 들어, TNF 수용체의 수용체-결합 도메인 (p75)을 포함하는 에타너셉트 (엔브렐(ENBREL)®)), CD2 (예를 들어, LFA-3의 CD2-결합 도메인을 함유하는 알레파셉트 (아메비브(AMEVIVE)®)), 또는 B7 (CTLA4의 B7-결합 도메인을 포함하는 아바타셉트 (오렌시아(ORENCIA)®))에 결합하는 Fc-융합 단백질이다.
3. 비푸코실화된 단백질을 생산하는 방법
본 개시내용의 비푸코실화된 항체를 포함한 비푸코실화된 단백질은 낮은 푸코실화 세포에서 생산된다. 비푸코실화된 단백질은, 예를 들어, 단백질을 코딩하는 발현 벡터로 낮은 푸코실화 세포를 형질감염시킴으로써 관련 기술분야에 공지된 기술을 사용하여 낮은 푸코실화 세포에서 발현될 수 있다.
단백질을 코딩하는 발현 벡터는 관련 기술분야에 공지된 기술을 사용하여 제조될 수 있다. 예를 들어, 발현 벡터는 바람직하게는 단백질이 발현될 유기체에 대한 최적화된 코돈을 사용하여 아미노산 서열을 핵산 서열로 역번역함으로써 구축될 수 있다. 그 후, 단백질을 코딩하는 핵산 및 임의의 다른 조절 요소는 어셈블리되고 원하는 발현 벡터에 삽입될 수 있다. 발현 벡터는 변형된 효소를 함유하는 발현 벡터에 대해 상기 기재된 바와 같이 추가 핵산 서열, 예컨대 단백질 태그, 선택가능한 마커, 또는 단백질의 발현을 제어하는 조절 서열을 함유할 수 있다. 그 후, 발현 벡터는 형질감염에 의해 숙주 세포에 도입될 수 있다. 형질감염은 관련 기술분야에 공지된 기술을 사용하여 수행될 수 있다. 예를 들어, 형질감염은 화학물질-기반 방법 (예를 들어, 지질, 인산칼슘, 양이온성 폴리머, DEAE-덱스트란, 활성화된 덴드리머, 자성 비드 등)을 사용하여, 기기-기반 방법 (예를 들어, 전기천공, 바이오리스틱 기술, 미세주사, 레이저펙션/옵토인젝션 등)에 의해, 또는 바이러스-기반 방법에 의해 수행될 수 있다. 그 후, 단백질은 선택된 발현 시스템 및 숙주에 적절한 조건 하에 형질감염된 세포에서 발현될 수 있다. 그 후, 발현된 단백질은 친화성 칼럼 또는 관련 기술분야에 공지된 다른 기술을 사용하여 정제될 수 있다.
숙주 세포는 변형된 효소를 코딩하는 핵산 (낮은 푸코실화 세포가 되기 위해) 및 단백질을 코딩하는 핵산 (단백질을 발현하기 위해)으로 임의의 순서로 형질감염되어 비푸코실화된 단백질을 생산할 수 있다. 예를 들어, 숙주 세포는 먼저 변형된 효소를 코딩하는 핵산 (낮은 푸코실화 세포가 되기 위해)으로 형질감염된 다음 단백질을 코딩하는 핵산 (단백질을 발현하기 위해)으로 형질감염될 수 있다. 대안적으로, 숙주 세포는 먼저 단백질을 코딩하는 핵산 (단백질을 발현하기 위해)으로 형질감염된 다음 변형된 효소를 코딩하는 핵산 (낮은 푸코실화 세포가 되기 위해)으로 형질감염될 수 있다. 또 다른 변경에서, 숙주 세포는 변형된 효소를 코딩하는 핵산 (낮은 푸코실화 세포가 되기 위해) 및 단백질을 코딩하는 핵산 (단백질을 발현하기 위해)으로 동시에 형질감염될 수 있다.
구체적 실시양태에서, 비푸코실화된 단백질은 하기 단계에 따라 먼저 낮은 푸코실화 세포를 제조한 다음, 단백질을 코딩하는 핵산으로 낮은 푸코실화 세포를 형질감염시킴으로써 생산된다:
a) 단백질을 발현하기에 적절한 숙주 세포를 수득하는 단계;
b) 변형된 효소를 코딩하는 핵산으로 숙주 세포를 형질감염시키는 단계;
c) 낮은 푸코실화를 갖는 형질감염된 세포를 선택하고/거나 단리하는 단계;
d) 단백질을 코딩하는 핵산으로 낮은 푸코실화 세포를 형질감염시키는 단계;
e) 단백질을 코딩하는 핵산으로 형질감염된 낮은 푸코실화 세포를 선택하고/거나 단리하는 단계;
f) 낮은 푸코실화 세포에서 단백질의 발현을 유도하는 단계.
별도의 실시양태에서, 비푸코실화된 단백질은 하기 단계에 따라 먼저 단백질을 코딩하는 핵산으로 숙주 세포를 형질감염시킨 다음, 변형된 효소를 코딩하는 핵산으로 세포를 형질감염시킴으로써 생산된다:
a) 단백질을 발현하기에 적절한 숙주 세포를 수득하는 단계;
b) 단백질을 코딩하는 핵산으로 숙주 세포를 형질감염시키는 단계;
c) 단백질을 코딩하는 핵산으로 형질감염된 세포를 선택하고/거나 단리하는 단계;
d) 변형된 효소를 코딩하는 핵산으로 단계 (c)의 세포를 형질감염시키는 단계;
e) 낮은 푸코실화를 갖는 단계 (d)의 형질감염된 세포를 선택하고/거나 단리하는 단계;
f) 낮은 푸코실화 세포에서 단백질의 발현을 유도하는 단계.
상기 실시양태의 변경에서, 비푸코실화된 단백질은 하기에 의해 생산된다:
a) 단백질을 발현하거나 또는 과다발현하는 숙주 세포를 수득하는 단계;
b) 변형된 효소를 코딩하는 핵산으로 숙주 세포를 형질감염시키는 단계;
c) 낮은 푸코실화를 갖는 형질감염된 숙주 세포를 선택하고/거나 단리하는 단계;
d) 낮은 푸코실화 세포에서 단백질의 발현을 유도하는 단계.
또 다른 실시양태에서, 비푸코실화된 단백질은 하기와 같이 변형된 효소를 코딩하는 핵산 (낮은 푸코실화 세포가 되기 위해) 및 단백질을 코딩하는 핵산 (단백질을 발현하기 위해)으로 숙주 세포를 동시에 형질감염시킴으로써 생산된다:
a) 단백질을 발현하기에 적절한 숙주 세포를 수득하는 단계;
b) 단백질을 코딩하는 제1 핵산 및 변형된 효소를 코딩하는 제2 핵산으로 숙주 세포를 형질감염시키는 단계;
c) 단백질을 발현하고 낮은 푸코실화를 갖는 형질감염된 숙주 세포를 선택하고/거나 단리하는 단계;
d) 낮은 푸코실화 세포에서 단백질의 발현을 유도하는 단계.
상기 기재된 방법을 사용하여 생산된 항체를 포함한 비푸코실화된 단백질은 관련 기술분야에 공지된 방법을 사용하여 정제될 수 있다. 예를 들어, 개시된 방법에 의해 생산된 항체를 포함한 비푸코실화된 단백질은 물리화학적 분획화, 항체 클래스-특이적 친화성, 항원-특이적 친화성 등에 의해 정제될 수 있다.
4. 비푸코실화된 항체의 개선된 특성
본 개시내용의 방법에 의해 생산된 비푸코실화된 항체는 표준 방법을 사용하여 생산된 항체와 비교하여 개선된 특성을 갖는다.
정제된 비푸코실화된 항체의 활성은 ELISA 및 형광 방법 등에 의해 측정될 수 있다. 항원-양성 배양된 세포주에 대한 세포독성 활성은 그의 ADCC 및 CDC 등을 측정함으로써 평가될 수 있다. 인간에서 항체의 안전성 및 치료적 효과는 인간과 상대적으로 가까운 동물 종의 적절한 모델을 사용하여 평가될 수 있다.
a. 증가된 ADCC 활성
본 개시내용의 비푸코실화된 항체는 표준 방법을 사용하여 생산된 항체와 비교하여 증가된 ADCC 활성을 갖는다.
본원에 사용된 바와 같은 "ADCC 활성"은 항체-의존적 세포성 세포독성 (ADCC) 반응을 유도하는 항체의 능력을 지칭한다. ADCC는 FcR을 발현하는 항원-비특이적 세포독성 세포 (예를 들어, 자연 살해 (NK) 세포, 호중구, 및 대식세포)가 표적 세포의 표면에 결합된 항체를 인식하고 후속적으로 표적 세포의 용해 (즉, "사멸")를 유발하는 세포-매개 반응이다. ADCC에서 1차 매개인자 세포는 자연 살해 (NK) 세포이다. NK 세포는 FcγRIII을 발현하며, FcγRIIIA는 활성화 수용체이고 FcγRIIIB는 억제성 수용체이다. 단핵구는 FcγRI, FcγRII 및 FcγRIII을 발현한다. ADCC 활성은 시험관내 검정, 예컨대 실시예 3에 기재된 검정을 사용하여 직접적으로 평가될 수 있다.
ADCC 활성은 시험관내 검정을 사용하여 직접적으로 평가될 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 비푸코실화된 항체의 ADCC 활성은 야생형 대조군 자체보다 적어도 0.5, 1, 2, 3, 5, 10, 20, 50, 100배 더 높다.
비푸코실화된 항체는 증가된 ADCC 활성을 갖기 때문에, 비푸코실화된 치료용 항체는 이들의 푸코실화된 대응부와 비교하여 더 낮은 양 또는 농도로 투여될 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 비푸코실화된 항체의 농도는 그의 푸코실화된 대응부와 비교하여 적어도 2, 3, 5, 10, 20, 30, 50, 또는 100배만큼 저하될 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 비푸코실화된 항체는 그의 야생형 대응부와 비교하여 더 높은 최대 표적 세포 용해를 나타낼 수 있다. 예를 들어, 본 개시내용의 비푸코실화된 항체의 최대 표적 세포 용해는 그의 야생형 대응부보다 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 40%, 50% 또는 그 이상 더 높을 수 있다.
b. 증가된 CDC 활성
본 개시내용의 비푸코실화된 항체는 표준 방법을 사용하여 생산된 항체와 비교하여 증가된 보체-의존적 세포독성 (CDC) 활성을 갖는다.
본원에 사용된 바와 같은 "CDC 활성"은 표적 세포 상의 결합된 항체를 인식하고 후속적으로 표적 세포의 용해를 유발하는 보체 시스템의 하나 이상의 성분의 반응을 지칭한다. 본 개시내용의 비푸코실화된 항체는 CDC 활성을 감소시키거나 또는 저해하지 않지만, 대신, 그의 푸코실화된 대응부와 유사하거나 또는 그보다 더 큰 CDC 활성을 유지한다.
본 발명은 향상된 CDC 기능을 갖는 비푸코실화된 항체를 추가로 제공한다. 한 실시양태에서, 본 발명의 Fc 변이체는 증가된 CDC 활성을 갖는다. 또 다른 실시양태에서 상기 비푸코실화된 항체는 필적하는 분자보다 적어도 2배, 또는 적어도 3배, 또는 적어도 5배 또는 적어도 10배 또는 적어도 50배 또는 적어도 100배 더 큰 CDC 활성을 갖는다.
4. 비푸코실화된 항체 사용
본 개시내용의 비푸코실화된 항체는 정맥내로 (i.v.), 피하로 (s.c.), 근육내로 (i.m.), 피내로 (i.d.), 복강내로 (i.p.), 또는 임의의 점막 표면을 통해, 예를 들어, 경구 (p.o.), 설하 (s.l.), 협측, 비강, 직장, 질 또는 폐 경로를 통해 투여될 수 있다.
비푸코실화된 항체는 암, 염증성 질환, 면역 및 자가면역 질환, 알레르기, 순환기 질환 (예를 들어, 동맥경화증), 및 바이러스 또는 박테리아 감염을 포함한 다양한 질환의 치료 또는 예방에 유용하다.
본 발명의 비푸코실화된 항체의 용량은 대상체 및 특정한 투여 방식에 따라 달라질 것이다. 필요한 투여량은 항체 표적, 대상체의 종 및 대상체의 크기/체중을 포함하나 이에 제한되지는 않는 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 다수의 인자에 따라 달라질 것이다. 투여량은 0.1 내지 100,000 μg/kg 체중의 범위일 수 있다. 비푸코실화된 항체는 단일 용량 또는 다중 용량으로 투여될 수 있다. 비푸코실화된 항체는 24시간 기간에 1회, 24시간 기간에 수회, 또는 연속 주입에 의해 투여될 수 있다. 비푸코실화된 항체는 연속적으로 또는 특정 스케줄로 투여될 수 있다. 유효 용량은 동물 모델로부터 수득된 용량-반응 곡선으로부터 외삽될 수 있다.
4. 구체적 실시양태
본 발명의 구체적 실시양태는 하기를 포함하나 이에 제한되지는 않는다:
(1) 푸코실화 경로의 변형된 효소를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 낮은 푸코실화를 갖는 재조합 세포.
(2) (1)에 있어서, 변형된 효소가 GDP-만노스 4,6-데히드라타제 (GMD), GDP-4-케토-6-데옥시-D-만노스 에피머라제-리덕타제 (FX), 또는 푸코실트랜스퍼라제 (FUT)로부터 유래된 것인 재조합 세포.
(3) (1)에 있어서, 변형된 효소가 푸코실트랜스퍼라제 (FUT)로부터 유래된 것인 재조합 세포.
(4) (1)에 있어서, 변형된 효소가 α-1,6-푸코실트랜스퍼라제 (FUT8)로부터 유래된 것인 재조합 세포.
(5) (1)에 있어서, 핵산 서열이 서열식별번호(SEQ ID NO): 3, 5, 7, 9, 11, 15, 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 재조합 세포.
(6) (1)에 있어서, 변형된 효소가 서열식별번호: 4, 6, 8, 10, 12, 16, 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 것인 재조합 세포.
(7) (1)에 있어서, 변형된 효소가 숙주 세포에서, 변형된 효소가 유래된 야생형 효소의 활성을 감소시키거나 또는 억제하는 것인 재조합 세포.
(8) (1)에 있어서, 변형된 효소가 숙주 세포에서 푸코실화를 억제하거나 또는 감소시키는 것인 재조합 세포.
(9) (1)에 있어서, 세포에서 생산된 단백질의 10% 미만이 푸코실화된 것인 재조합 세포.
(10) (1)에 있어서, 항체를 코딩하는 핵산을 추가로 포함하는 재조합 세포.
(11) (10)에 있어서, 항체가 비푸코실화된 항체로서 세포에서 발현되는 것인 재조합 세포.
(12) (11)의 재조합 세포에서 생산된 비푸코실화된 항체.
(13) (12)에 있어서, 적어도 90% 비푸코실화된 것인 비푸코실화된 항체.
(14) (12)에 있어서, 비푸코실화된 항체가 그의 푸코실화된 대응부와 비교하여 증가된 항체-의존적 세포성 세포독성 (ADCC) 활성을 갖는 것인 비푸코실화된 항체.
(15) (12)에 있어서, 비푸코실화된 항체의 보체 의존적 세포독성 (CDC) 활성이 그의 푸코실화된 대응부와 비교하여 감소 또는 저해되지 않는 것인 비푸코실화된 항체.
5. 추가 실시양태
본 발명의 추가 실시양태는 하기를 포함하나 이에 제한되지는 않는다:
(1) 비푸코실화된 항체를 생산하는 방법으로서:
적어도 하나의 변형된 효소를 코딩하는 핵산을 숙주 세포에 도입하여 숙주 세포에서 비푸코실화된 항체를 생산하는 것을 포함하는 방법.
(2) (1)에 있어서, 변형된 효소가 GDP-만노스 4,6-데히드라타제 (GMD), GDP-4-케토-6-데옥시-D-만노스 에피머라제-리덕타제 (FX), 또는 푸코실트랜스퍼라제 (FUT)로부터 유래된 것인 방법.
(3) (1)에 있어서, 변형된 효소가 푸코실트랜스퍼라제 (FUT)로부터 유래된 것인 방법.
(4) (1)에 있어서, 변형된 효소가 α-1,6-푸코실트랜스퍼라제 (FUT8)로부터 유래된 것인 방법.
(5) (1)에 있어서, 변형된 효소가 숙주 세포에서 야생형 푸코실화 효소의 활성을 억제하는 것인 방법.
(6) (1)에 있어서, 변형된 효소가 숙주 세포에서 항체의 푸코실화를 억제하거나 또는 감소시키는 것인 방법.
(7) (1)에 있어서, 비푸코실화된 항체가 증가된 ADCC를 갖는 것인 방법.
(8) (1)에 있어서, 비푸코실화된 항체의 CDC 활성이 감소 또는 저해되지 않는 것인 방법.
(9) 하기 단계를 포함하는, 비푸코실화된 항체를 생산하는 방법:
a) 숙주 세포를 제공하는 단계,
b) 적어도 하나의 변형된 효소를 코딩하는 핵산을 숙주 세포에 도입하는 단계, 및
c) 숙주 세포에서 비푸코실화된 항체를 생산하는 단계.
(10) (9)에 있어서, 단계 (a)에서, 숙주 세포가 항체를 코딩하는 적어도 하나의 핵산을 포함하는 것인 방법.
(11) (9)에 있어서, 단계 (b) 후에 항체를 코딩하는 핵산을 숙주 세포에 추가로 도입하는 방법.
(12) (9)에 있어서, 변형된 효소가 GDP-만노스 4,6-데히드라타제 (GMD), GDP-4-케토-6-데옥시-D-만노스 에피머라제-리덕타제 (FX), 및/또는 푸코실트랜스퍼라제 (FUT)로부터 유래된 것인 방법.
(13) (9)에 있어서, 변형된 효소가 푸코실트랜스퍼라제 (FUT)로부터 유래된 것인 방법.
(14) (9)에 있어서, 변형된 효소가 α-1,6-푸코실트랜스퍼라제 (FUT8)로부터 유래된 것인 방법.
(15) (9)에 있어서, 변형된 효소가 숙주 세포에서 푸코실화 효소의 활성을 억제하는 것인 방법.
(16) (9)에 있어서, 변형된 효소가 숙주 세포에서 항체의 글리코실화를 억제하고 감소시키는 것인 방법.
(17) (9)에 있어서, 비푸코실화된 항체가 증가된 ADCC를 갖는 것인 방법.
(18) (9)에 있어서, 비푸코실화된 항체의 CDC 활성이 감소 또는 저해되지 않는 것인 방법.
(19) (1) 또는 (9)에 따른 방법에 의해 생산된 비푸코실화된 항체로서, 여기서 비푸코실화된 항체가 증가된 ADCC 활성을 갖는 것인 항체.
(20) (19)에 있어서, 비푸코실화된 항체가 인간 항체 또는 그의 단편인 항체.
(21) (19)에 있어서, 비푸코실화된 항체가 원래의 CDC 활성을 유지하는 것인 항체.
(22) (19)에 따른 비푸코실화된 항체 및 제약상 허용되는 담체 또는 부형제를 포함하는 제약 조성물.
(23) 적어도 하나의 변형된 효소를 코딩하는 핵산을 포함하는, 푸코실화가 없거나 또는 낮은 푸코실화를 갖는 세포.
(24) 하기에 의해 생산된 비푸코실화된 항체:
a) 푸코실화 경로의 적어도 하나의 변형된 효소를 코딩하는 핵산을 푸코스를 갖는 항체를 발현하는 숙주 세포에 도입하는 단계, 및
b) 숙주 세포를 배양하여 숙주 세포에서 비푸코실화된 항체를 생산하는 단계.
(25) (24)에 있어서, 변형된 효소가 GDP-만노스 4,6-데히드라타제 (GMD), GDP-4-케토-6-데옥시-D-만노스 에피머라제-리덕타제 (FX), 또는 푸코실트랜스퍼라제 (FUT)로부터 유래된 것인 비푸코실화된 항체.
(26) (25)에 있어서, 변형된 효소가 푸코실트랜스퍼라제로부터 유래된 것인 비푸코실화된 항체.
(27) (26)에 있어서, 변형된 효소가 α-1,6-푸코실트랜스퍼라제로부터 유래된 것인 비푸코실화된 항-CD20 항체.
(28) (24)에 있어서, 변형된 효소가 숙주 세포에서 야생형 푸코실화 효소의 활성을 억제하는 것인 비푸코실화된 항-CD20 항체.
(29) (24)에 있어서, 변형된 효소가 숙주 세포에서 항체의 글리코실화를 억제하고 감소시키는 것인 비푸코실화된 항-CD20 항체.
(30) (24)에 있어서, 비푸코실화된 항체가 증가된 항체-의존적 세포성 세포독성 (ADCC) 활성을 갖는 것인 비푸코실화된 항-CD20 항체.
(31) (24)에 있어서, 비푸코실화된 항체의 보체 의존적 세포독성 (CDC) 활성이 감소 및 저해되지 않는 것인 비푸코실화된 항-CD20 항체.
(32) (24)에 있어서, 비푸코실화된 항체가 항-CD20 또는 항-ErbB2 항체인 비푸코실화된 항-CD20 항체.
(33) 하기에 의해 생산된 비푸코실화된 항체:
a) 숙주 세포를 제공하는 단계,
b) 푸코실화 경로의 적어도 하나의 변형된 효소를 코딩하는 핵산을 숙주 세포에 도입하는 단계,
c) 푸코스를 갖는 항체를 코딩하는 핵산을 도입하는 단계, 및
d) 숙주 세포에서 비푸코실화된 항체를 생산하는 단계.
(34) (33)에 있어서, 변형된 효소가 GDP-만노스 4,6-데히드라타제 (GMD), GDP-4-케토-6-데옥시-D-만노스 에피머라제-리덕타제 (FX), 및/또는 푸코실트랜스퍼라제 (FUT)로부터 유래된 것인 비푸코실화된 항체.
(35) (33)에 있어서, 변형된 효소가 α-1,6-푸코실트랜스퍼라제로부터 유래된 것인 비푸코실화된 항체.
(36) (33)에 있어서, 항체가 증가된 항체-의존적 세포성 세포독성 (ADCC)을 갖는 것인 비푸코실화된 항체.
(37) (33)에 있어서, 비푸코실화된 항체의 보체 의존적 세포독성 (CDC) 활성이 감소 및 저해되지 않는 것인 비푸코실화된 항체.
(38) (33)에 있어서, 비푸코실화된 항체가 항-CD20 또는 항-ErbB2 항체인 비푸코실화된 항체.
(39) 제1항 또는 제10항에 따른 비푸코실화된 항체 및 제약상 허용되는 담체 또는 부형제를 포함하는 제약 조성물.
본 발명의 추가의 구체적 실시양태는 하기 실시예를 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
실시예 1
푸코실화 경로에서 변형된 효소의 제조 및 변형된 효소를 발현하는 안정적 세포주
1. 세포주
디히드로폴레이트 리덕타제 활성이 결핍된 CHO 세포 돌연변이체인 상업적 CHOdhfr(-) 세포주 (ATCC CRL-9096)는 컬쳐 콜렉션 앤 리서치 센터(Culture Collection and Research Center) (CCRC, 타이완)로부터 구입하였다. CHOdhfr(-) 세포주를 3개의 별도의 배양물로 분리하고 하기와 같이 처리하였다:
제1 배양물을 리툭산® (리툭시맙, 단백질 CD20에 대한 키메라 모노클로날 항체)을 코딩하는 발현 벡터로 형질감염시켰다. 리툭산®을 발현하는 안정적 클론을 수득하고 RC79로서 확인하였다.
제2 배양물을 허셉틴® (트라스투주맙, 단백질 HER2에 대한 모노클로날 항체)을 코딩하는 발현 벡터로 형질감염시켰다. 허셉틴®을 발현하는 안정적 클론을 수득하고 HC59로서 확인하였다.
제3 배양물을 미처리 상태로 CHOdhfr(-) 세포주로서 유지하였다.
2. FUT8 및 GMD의 변형된 효소를 코딩하는 발현 벡터의 구축
변형된 효소 FUT8 및 GMD를 코딩하는 여러 발현 벡터를 구축하였다.
F83M, F8M1, F8M2, F8M3 및 F8D1의 돌연변이체는 야생형 FUT8 단백질 (진뱅크(GenBank) 번호 NP_058589.2)인 α-1,6-푸코실트랜스퍼라제의 상이한 변형을 나타낸다. 표 1은 각 FUT8 벡터에 대한 야생형 핵산 서열에 만들어진 변형 뿐만 아니라 발현된 효소의 생성된 아미노산 변화를 요약한다. 구체적으로, F83M은 R365A, D409A 및 D453A에서 야생형 FUT8 단백질에 3개의 변형을 갖는 돌연변이체를 나타낸다. F8M1, F8M2 및 F8M3은 야생형 FUT8 단백질에서 각각 K369E, D409K 및 S469V에 각각 하나의 변형을 갖는 돌연변이체를 나타낸다. F8D1은 야생형 FUT8 단백질에서 위치 365 내지 386에 아미노산 잔기의 결실을 갖는 돌연변이체를 나타낸다.
표 2는 GMD 벡터에 대한 야생형 핵산 서열에 만들어진 변형 뿐만 아니라 발현된 효소의 생성된 아미노산 변화를 요약한다. 구체적으로, 돌연변이체 GMD4M은 T155A, E157A, Y179A, 및 K183A에서 야생형 GMD 단백질에 4개의 돌연변이를 갖는 야생형 GMD 단백질 (진뱅크 번호 NP_001233625.1)인 GDP-만노스 4,6-데히드라타제의 변형을 나타낸다.
F83M, F8M1, F8M2, F8M3, F8D1 및 GMD4M을 코딩하는 모든 핵산 서열은 진디렉스(GeneDireX) 회사에 의해 합성된 다음, pHD 발현 벡터 (pcDNA3.1Hygro, 인비트로젠, 미국 캘리포니아주 칼즈배드, cat. no. V870-20, dhfr 유전자 포함)의 PacI/EcoRv 또는 BamHI/EcoRV 부위로 서브클로닝하여 pHD/F83M, pHD/F8M1, pHD/F8M2, pHD/F8M3, pHD/F8D1, 및 pHD/GMD4M 플라스미드를 형성하였다.
3. 변형된 효소를 발현하는 안정적 재조합 세포주의 제조
pHD/F83M, pHD/F8M1, pHD/F8M2, pHD/F8M3, pHD/F8D1, 및 pHD/GMD4M 플라스미드를 전기천공 (PA4000 펄스아길(PULSEAGILE)® 전기천공기, 사이토 펄스 사이언시스(Cyto Pulse Sciences))에 의해 (a) RC79 세포주 (리툭산®을 발현하는 CHO 세포), (b) HC59 세포주 (허셉틴®을 발현하는 CHO 세포), 및 (c) CHOdhfr(-) 세포 (디히드로폴레이트 리덕타제 활성이 결핍된 CHO 세포 돌연변이체)를 포함한 상이한 세포주로 형질감염시켰다.
a. RC79 세포
형질감염된 RC79 세포주를 초기에 0.1 내지 0.25 mg/mL 히그로마이신을 갖는 RC79 배양 배지 (0.4 μM MTX, 0.5 mg/mL 게네티신, 0.05 mg/mL 제오신, 4mM 글루타맥스-I, 및 0.01% F-68을 함유하는 EX-CELL®302 무혈청 배지)에서 배양하였다. 그 후, 형질감염된 세포를 0.4 μM MTX, 0.5 mg/mL 게네티신, 0.05 mg/mL 제오신, 4mM 글루타맥스-I, 0.01% F-68, 및 0.25 mg/mL 히그로마이신을 함유하는 EX-CELL® 302 무혈청 배지에서 배양하고, 하기 기재된 바와 같이 렌즈 쿨리나리스 응집소 (LCA)에 의해 단리하여 RC79F83M, RC79F8M1, RC79F8M2, RC79F8M3, RC79F8D1, 및 RC79-GMD4M 세포주를 포함한 5개의 세포 풀을 생성하였다.
b. HC59 세포
형질감염된 HC59 세포주를 초기에 0.1 내지 0.25 mg/mL 히그로마이신을 갖는 HC59 배양 배지 (0.8 μM MTX, 0.5 mg/mL 게네티신, 0.05 mg/mL 제오신, 및 4mM 글루타맥스-I을 함유하는 EX- CELL® 325 PF CHO 배지)에서 배양하였다. 그 후, 형질감염된 세포를 0.8 μM MTX, 0.5 mg/mL 게네티신, 0.05 mg/mL 제오신, 4 mM 글루타맥스-I, 및 0.25 mg/mL 히그로마이신을 함유하는 EX-CELL® 325 PF CHO 배지에서 배양하고, 하기 기재된 바와 같이 LCA에 의해 단리하여 HC59F83M 세포주의 세포 풀을 생성하였다.
c. CHOdhfr (-) 세포
형질감염된 CHOdhfr(-) 세포주를 초기에 4 mM 글루타맥스-I, 및 0.1 내지 0.25 mg/mL 히그로마이신을 함유하는 EX-CELL® 325 PF CHO 배지에서 배양하였다. 그 후, 형질감염된 세포를 4 mM 글루타맥스-I, 0.25 mg/mL 히그로마이신, 및 0.01 μM MTX를 함유하는 EX-CELL® 325 PF CHO 배지에서 배양하여 C109F83M 세포주의 세포 풀을 생성하였다.
4. 낮은 푸코실화를 갖는 세포의 단리
낮은 푸코실화를 갖는 세포를 선택하기 위해 본 실시예에서 로다민-표지된 렌즈 쿨리나리스 응집소 (LCA) (벡터 래보러토리즈, Cat. RL-1042)를 사용하였다.
모든 RC79, HC59, 및 CHO 형질감염체를 선택 압력으로서 히그로마이신을 함유하는 1차 선택 배지에 적용한 다음, N-연결된 올리고사카라이드의 α-1,6-푸코실화된 트리만노스-코어 구조를 인식하고 이 구조를 발현하는 세포를 세포-사멸 경로에 투입하는 LCA를 사용하여 최종 선택하였다. RC79, HC59 또는 CHO의 형질감염체를 초기에 0.4 mg/mL LCA와 함께 2.5 mL 신선한 배지에서 1.2 x 105개 세포/mL로 시딩하고, 세포 생존성에 대해 제3일 또는 제4일에 카운팅하였다. 세포 생존성이 80%에 도달할 때까지 이 초기 선택 배지에서 세포를 배양하였다. 세포 생존성이 80%에 도달한 후, 1.2 x 105개 세포/mL에서 LCA의 농도를 점차적으로 증가시키면서 세포를 신선한 선택 배지에 재현탁시켰다. 0.6-1.2 mg/mL의 최종 LCA 농도가 달성되었을 때 LCA 선택을 여러 번 반복하였다.
세포 표면 상의 푸코스 수준을 분석하기 위해, 세포를 LCA로 표지하고 유동 세포계측법에 의해 분석하였다. 먼저, LCA가 없는 완전 배지에서 14일 동안 세포를 시딩하여 선택 작용제 LCA로부터 신호 간섭을 제거하였다. 그 후, 3 x 105개 세포를 1 mL 빙냉 PBS로 2회 세척하고, 1% 소 혈청 알부민 및 5 μg/mL LCA를 함유하는 200 μl 냉 PBS에 재현탁시켰다. 얼음에서 30분 동안 인큐베이션 후, 세포를 1 mL 빙냉 PBS로 2회 세척하였다. 세포를 350 μl 냉 PBS에 재현탁시키고 FACS칼리버(FACScalibur)™ 유동 세포계측기 (BD 바이오사이언시스, 미국 캘리포니아주 산호세)를 사용하여 분석하였다.
다음으로, 1 x 107개 세포를 10 mL 빙냉 PBS로 2회 세척하고, 1% 소 혈청 알부민 및 5 μg/mL LCA를 함유하는 6.5 mL 빙냉 PBS에 재현탁시켰다. 얼음에서 30분 동안 인큐베이션 후, 세포를 10 mL 냉 PBS로 2회 세척하였다. 1% 열-불활성화된 소 태아 혈청 (깁코(GIBCO), Cat. 10091-148) 및 항생제-항진균제 (인비트로젠, Cat.15240062)를 갖는 1 mL 빙냉 PBS에 세포를 재현탁시켰다.
세포를 FACS아리아(FACSAria)™ 또는 인플럭스(Influx)™ 세포 분류기 (BD 바이오사이언시스, 미국 캘리포니아주 산호세)에 의해 분석하고 분류하였다. 상이한 클론의 경우, 낮은 푸코실화 수준을 갖는 세포의 균질한 집단을 생성하기 위해 1-3 라운드의 분류가 필요하였다. 또한, 클론픽스(CLONEPIX)™ 2 시스템 (몰레큘라 디바이시스(MOLECULAR DEVICES)®)을 사용하여 낮은 푸코실화를 갖는 안정적 클론을 단리하고, 96-웰 플레이트로 옮겼다. 대략 2주 동안 배양 후, 세포를 6-웰 플레이트로 옮기고, 유동 세포계측법에 의해 다시 분석하였다. 그 후, 낮은 푸코실화를 갖는 세포를 유가식 배양을 위한 필터 튜브로 옮겨 수득된 세포로부터 정제된 항체의 세포 성능 및 푸코실화 수준을 평가하였다.
5. 리툭산®을 발현하기 위한 C109F83M 세포주의 제조
낮은 푸코실화 CHOdhfr(-) 세포 (C109F83M 세포)를 LCA에 의해 단리한 후, 세포를 전기천공 (PA4000 펄스아길® 전기천공기, 사이토 펄스 사이언시스)에 의해 리툭산®을 코딩하는 핵산으로 형질감염시켰다. C109F83M, AF97의 낮은-푸코스 단일 클론을 단리하고, 리툭산®을 발현하기 위해 전기천공에 의해 리툭산®을 코딩하는 핵산으로 형질감염시켰다. 형질감염체를 회복 성장을 위해 비-선택적 배지를 함유하는 25T 플라스크로 옮겼다. 48시간 후, 4 mM 글루타맥스-I, 히그로마이신-B, 제오신 및 0.01 μM MTX를 함유하는 선택적 배지에서 형질감염체를 배양하였다. AF97항-CD20 클론을 생성하기 위해 클론픽스™ 2 시스템을 사용하여 단일 세포를 선별하였다.
수득된 세포는 리툭산®을 발현하는 낮은 푸코실화 CHOdhfr(-) 세포였으며, 본원에서 AF97항-CD20 세포주로 지칭된다.
실시예 2
비푸코실화된 항체의 발현 및 분석
1. 항체의 발현 및 정제
실시예 1에서 수득된 낮은 푸코실화 활성을 갖는 세포를 항체 발현을 위해 배치 또는 유가식으로 배양하였다. 세포로부터 정제된 항체를 Fc 영역의 당 쇄의 정량 분석을 위해 모노사카라이드 분석으로 처리하였다.
재조합 RC79 세포를 4 mM 글루타맥스 및 0.01% F-68을 함유하는 EX-CELL® 302 무혈청 배지에서 배양하고, 37℃ 및 5% CO2로 진탕기 인큐베이터 (인포르스 멀티트론 프로(Infors Multitron Pro))에서 유지하였다.
재조합 HC79 세포를 0.8 μM MTX, 0.5 mg/mL 게네티신, 0.05 mg/mL 제오신, 4mM 글루타맥스-I, 및 0.25 mg/mL 히그로마이신을 함유하는 EX-CELL® 325 PF CHO 배지에서 배양하고, 37℃ 및 5% CO2로 진탕기 인큐베이터 (인포르스 멀티트론 프로)에서 유지하였다.
세포 배양의 파라미터를 매일 정기적으로 모니터링하였다. 혈구계를 사용하여 트립판 블루 배제에 의해 세포 밀도 및 생존성을 결정하였다. 세포 생존성이 60% 미만이었을 때, 조건화 배지를 원심분리에 의해 수집하고, 발현된 항체를 단백질 A 수지로 정제하였다. 단백질 A 칼럼을 5 칼럼 부피의 경우 0.1 M 트리스, pH 8.3으로 평형화한 다음, 샘플을 칼럼에 로딩하였다. 결합되지 않은 단백질을 0.1 M 트리스, pH 8.3 (2 칼럼 부피의 경우) 및 PBS, pH 6.5 (10 칼럼 부피의 경우)로 세척하였다. 칼럼을 0.1 M 아세트산나트륨, pH 6.5 (10 칼럼 부피의 경우)로 추가로 세척하였다. 최종적으로, 항체를 0.1 M 글리신, pH 2.8로 용리하고, 동등한 용리 부피로 0.1M 트리스, pH 8.3으로 중화하였다.
2. 항체의 N-글리칸 프로파일의 결정
N-글리칸 프로파일을 액퀴티(ACQUITY) UPLC® 시스템에 의해 분석하였다. 먼저, 0.3 mg 항체 샘플을 37℃에서 18시간 동안 0.3 mL 소화 완충제 (15 mM 트리스-HCl, pH 7.0)에서 3 U PNGase-F로 소화시켰다. 방출된 N-글리칸을 13,000 rpm에서 5분 동안 아미콘(AMICON)® Ultra-0.5 mL 30K 장치를 사용하여 한외여과에 의해 항체로부터 분리한 후, 3시간 동안 동결-건조시켰다. 다음으로, 건조된 N-글리칸을 30 μL ddH2O 및 45 μL 2-AB 표지 시약 (DMSO-아세트산 (7:3 v/v) 용매 중 0.34 M 안트라닐아미드 및 1 M 나트륨 시아노보로히드리드)에 용해시키고, 65℃에서 3시간 동안 인큐베이션하였다. PD 미니트랩(MINITRAP)™ G10 크기 배제 칼럼을 사용하여 과량의 2-AB 표지 시약을 제거하였다. 표지된 N-글리칸을 밤새 동결-건조시키고, UPLC 검출을 위해 50 μL ddH2O에 재용해시켰다. N-글리칸 프로파일을 60℃에서 글리칸 BEH 아미드 칼럼을 사용하는 액퀴티 UPLC® 시스템에 의해 획득하였다. 상이한 형태의 N-글리칸을 100 mM 포름산암모늄, pH 4.5/아세토니트릴 선형 구배로 분리하였다.
유동 세포계측법의 결과로부터 모든 세포 유형에서 F83M 단백질을 과다발현하는 세포의 표면에서 LCA의 극히 낮은 결합이 밝혀졌다. 유사하게, LCA 결합은 F8M1, F8M2, F8M3, F8D1 또는 GMD4M 단백질을 과다발현하는 RC79 세포에서 검출되지 않았다 (데이터는 제시되지 않음).
표 3은 변형되지 않은 푸코실화 경로를 갖는 RC79 및 HC59 세포 뿐만 아니라 F83M 변형된 효소의 과다발현에 의해 푸코실화 경로가 변형된 RC79 및 HC59 클론에서 생산된 항체의 N-글리칸 프로파일을 제시한다. 표 3의 데이터는 변형되지 않은 푸코실화 경로를 갖는 세포에서 생산된 대부분의 항-CD20 및 항-ErbB2 항체가 심하게 푸코실화되었음을 제시한다. 구체적으로, 항-CD20의 3.67% 및 항-ErbB2 항체의 3.64%만이 이들 세포에서 비푸코실화되었다. 대조적으로, F83M 변형된 효소를 과다발현하는 세포에서 생산된 항체는 매우 낮은 푸코실화 수준을 가졌다. 구체적으로, 항-CD20의 약 98.86-98.91% 및 항-ErbB2 항체의 약 92.12-96.52%가 F83M 변형된 효소를 과다발현하는 세포에서 비푸코실화되었다.
또한, 표 4는 변형되지 않은 푸코실화 경로를 갖는 RC79 세포 뿐만 아니라 F8M1, F8M2, F8M3, F8D1 또는 GMD4M 변형된 효소 중 하나의 과다발현에 의해 푸코실화 경로가 변형된 RC79 클론에서 생산된 항체의 N-글리칸 프로파일을 제시한다. 표 4의 데이터는 변형되지 않은 푸코실화 경로를 갖는 RC79 세포에서 생산된 대부분의 항-CD20 항체가 심하게 푸코실화되었음을 제시한다. 구체적으로, 항-CD20 항체의 3.67%만이 이들 세포에서 비푸코실화되었다. 대조적으로, 변형된 효소를 과다발현하는 RC79 세포에서 생산된 항체는 매우 낮은 푸코실화 수준을 가졌다. 구체적으로, F8M1, F8M2, F8M3, F8D1 또는 GMD4M 변형된 효소를 과다발현하는 세포에 의해 생산된 항-CD20 항체의 비푸코실화 수준은 표 4에 제시된 바와 같이 약 92.78% 내지 약 97.16%였다.
표 4는 또한 FUT8 변형된 효소 (F8M1, F8M2, F8M3, F8D1) 중 하나를 과다발현하는 세포에 의해 생산된 항체의 비푸코실화 수준이 95.70 내지 97.16%였고, GMD 변형된 효소 (GMD4M)를 과다발현하는 세포에 의해 생산된 항체의 비푸코실화 수준이 92.78%였음을 제시한다. 이들 결과는 FUT8 변형된 효소를 과다발현하는 세포에서 생산된 항체의 비푸코실화 수준이 GMD 돌연변이체 단백질을 과다발현하는 세포에서 생산된 항체보다 더 높았음을 입증한다.
표 3 및 4에 제시된 결과는 항체를 발현하도록 조작된 숙주 세포가 푸코실화 경로에서 변형된 효소를 발현하는 벡터로 형질감염될 수 있음을 입증한다 (FUT8 또는 GMD). 결과는 또한 이들 형질감염된 세포에서 생산된 항체가 비푸코실화됨을 제시한다.
또한, AF97 세포주에서 생산된 항체의 푸코실화 수준을 평가하였다. 표 5의 결과는 F83M 변형된 효소를 과다발현하는 AF97 세포에서 생산된 항체가 매우 낮은 푸코실화 수준을 가졌음을 제시한다. 구체적으로, AF97 세포에서 생산된 항-CD20 항체의 97.83%가 비푸코실화되었다. 대조적으로, 상업용 리툭산® (맙테라(MABTHERA)®)은 3.92%의 비푸코실화 수준을 가졌다.
표 5의 결과는 비푸코실화된 항체가 변형된 효소를 코딩하는 핵산으로 먼저 형질감염된 후 항체를 코딩하는 핵산으로 두 번째로 형질감염된 세포에서 생산될 수 있음을 입증한다. 따라서, 세포는 비푸코실화된 항체를 생산하기 위해 개시된 방법을 사용하여 변형될 수 있다.
3. 재조합 세포에서의 FUT8 단백질 발현
FUT8 변형된 효소 (즉, F8M1, F8M2, F8M3 또는 F8D1)를 발현하는 RC79 세포 및 재조합 세포의 펠렛을 포스파타제 억제제 칵테일 (시그마-알드리치(Sigma-Aldrich), Cat.S8820)을 함유하는 1% 트리톤 X-100에서 용해시켰다. 용해된 세포의 상청액 중 단백질 농도를 DC™ (세제 상용성) 단백질 검정 (바이오-라드(BIO-RAD))에 의해 결정하였다. 각 샘플에 대해 30 μg의 단백질을 함유하는 상청액을 12.5% 나트륨 도데실 술페이트-폴리아크릴아미드 겔 전기영동 (SDS-PAGE)을 사용하여 분리하고, 니트로셀룰로스 막으로 옮겼다. 120 mM NaCl, 0.1% 젤라틴 (w/w) 및 0.1% 트윈(TWEEN)® 20 (폴리에틸렌 글리콜 소르비탄 모노라우레이트) (v/w)을 함유하는 25 mM 트리스-HCl (pH7.4)을 사용하여 1시간 동안 실온에서 막을 차단시키고, 밤새 4℃에서 항-FUT8 항체 (압캠(Abcam), Cat.ab204124, 1:500) 및 GAPDH 항체 (진텍스(GeneTex), Cat.GT239, 1:10000)와 함께 각각 인큐베이션하였다. 막을 120 mM NaCl, 0.1% 젤라틴 (w/w) 및 0.1% 트윈® 20 (v/w)을 함유하는 25 mM 트리스-HCl (pH7.4)로 5분 동안 3회 세척한 후, 1시간 동안 실온에서 염소 항-토끼 IgG (잭슨 이뮤노리서치(Jackson ImmunoResearch), Cat.111-035-144) 및 염소 항-마우스 IgG HRP (진텍스, Cat.GTX213111-01, 1:10000)와 함께 각각 인큐베이션하였다. 추가 세척 후, 메탈 인핸서 (시그마, Cat.D0426)를 사용하는 시그마패스트(SIGMAFAST) DAB로 막을 분석하였다.
도 1은 RC79 모세포 및 변형된 효소를 발현하는 RC79 재조합 세포에서 FUT8 단백질 발현을 제시하는 웨스턴 블롯이다. FUT8 단백질의 발현 수준은 재조합 세포 및 RC79 모세포에서 유사하였다. 결과는 변형된 효소를 발현하는 RC79 세포에서 생산된 비푸코실화된 항체의 생산이 FUT8 단백질의 발현 수준과 관련이 없었음을 나타낸다. 이들 결과는 FUT8 변형된 효소가 세포에서 야생형 FUT8 단백질을 방해하여 푸코실화 경로를 억제하고/거나 감소시켜 재조합 세포가 비푸코실화된 항체를 효율적으로 생산함을 시사한다.
개시된 방법을 사용하여 비푸코실화된 항체를 생산하는 메커니즘은 야생형 FUT8 유전자의 저해 또는 하향조절에 의존하거나 RNA 간섭을 사용하여 FUT8 단백질의 발현을 감소시키는 다른 방법과 비교하여 신규하고 독특하다.
4. 재조합 세포의 안정성
F83M 변형된 효소를 발현하는 RC79 재조합 세포의 안정성을 평가하였다.
RC79 재조합 세포를 3개월 동안 선택 시약 없이 배지에서 배양하였다. 세포성 푸코실화를 매주 유동 세포계측법 분석에 의해 모니터링하고, 정제된 항체의 N-글리칸의 조성을 상기 기재된 바와 같이 3개월 동안 매월 글리칸 BEH 아미드 칼럼을 사용한 액퀴티 UPLC® 시스템에 의해 결정하였다. LCA 비-결합 특성은 90일 평가 기간에 걸쳐 유지되었으며, 이는 푸코실화 경로가 연구 과정에 걸쳐 억제되고/거나 감소되었음을 나타낸다 (도 2).
또한, 5종의 안정적 RC79F83M 클론 (R4-R8)에서 생산된 항-CD20 항체의 비푸코실화 수준을 72일 기간에 걸쳐 평가하였다. 표 6에 제시된 바와 같이, 모든 RC79F83M 클론은 72일 연구에 걸쳐 고도로 비푸코실화된 항체를 생산하였다.
본 연구의 결과는 개시된 방법에 의해 제조된 변형된 효소를 발현하는 재조합 세포주가 안정적이고, 장기간 동안 고도로-비푸코실화된 항체를 생산함을 입증한다.
실시예 3
비푸코실화된 항체의 ADCC 활성
실시예 2로부터 수득된 정제된 항-CD20의 시험관내 세포독성 활성을 평가하기 위해, ADCC 활성을 하기 방법에 따라 측정하였다.
1. 이펙터 세포 용액의 제조
건강한 공여자로부터의 인간 말초 혈액 (100 mL)을 나트륨 헤파린을 함유하는 배큐테이너(VACUTAINER)® 튜브에 첨가하였다. 전혈 샘플을 RPMI 1640 무혈청 (SF) 배지로 1:1 희석하고 온화하게 혼합하였다. 24 mL의 희석된 혈액을 피콜-파크(Ficoll-Paque)에 부드럽게 적용하고 400 x g에서 32분 동안 25℃에서 원심분리함으로써 피콜-파크 플러스(Ficoll-Paque PLUS)를 사용하여 단핵 세포를 분리하였다. 버피 코트를 20 mL의 RPMI 1640 배지를 함유하는 2개의 50 mL 원심분리기 튜브에 적절하게 분포시킨 후 2회 혼합하였다. 그 후, 혼합물을 1,200 rpm에서 12분 동안 25℃에서 원심분리하여 상청액을 수득하였다. RPMI 1640 SF 배지 (13 mL)를 상청액에 첨가하여 PBMC 세포를 재현탁시켰다. 세포를 1,200 rpm에서 12분 동안 25℃에서 원심분리하여 상청액을 수득하였다. RPMI 배양 배지 (10 mL)를 상청액에 첨가하여 PBMC 세포를 재현탁시켰다. 적절한 부피의 PBMC 세포 현탁액을 75T 플라스크에 첨가하고, 최종 세포 밀도는 플라스크 당 약 15 mL에 대해 1.5 x 106개 세포/mL였다. IL-2 (2.5 μg/mL)를 3 ng/mL의 최종 농도로 모든 플라스크에 첨가하였다. PBMC 세포를 37℃, 5% CO2 인큐베이터에서 18시간 동안 인큐베이션하였다. IL-2 자극된 PBMC 세포를 수집하고, 1,200 rpm에서 5분 동안 25℃에서 원심분리한 후, 상청액을 폐기하였다. PBS (10 mL)를 첨가하고 세포와 혼합하였다. 세포를 1,200 rpm에서 5분 동안 25℃에서 원심분리하여 상청액을 제거하였다. 세포를 RPMI AM으로 재현탁시키고, 최종 농도를 2 x 107개 세포/mL로 조절하였다.
2. 표적 세포 용액의 제조
75T 플라스크로부터의 세포 현탁액을 1,000 rpm에서 5분 동안 원심분리하여 상청액을 제거한 후, 10 mL의 1X PBS로 세척하였다. 세척된 세포를 1,200 rpm에서 5분 동안 원심분리하여 상청액을 제거하였다. 세포를 RPMI 검정 배지에 의해 재현탁시켜 5 x 105개 세포/mL 표적 세포 용액을 제조하였다. 표적 세포 용액 (40 μL의 5 x 105개 세포/mL)을 V-바닥 96-웰 세포 배양 플레이트의 웰에 첨가하였다. 그 후, 20 μL의 제조된 상업용 리툭산® 용액 (맙테라®) (25-0.0025 μg/mL) (양성 대조군), 비푸코실화된 항체 (R1 클론) 용액 (25-0.0025 μg/mL), 또는 RPMI 검정 배지 (음성 대조군)를 웰에 첨가하고, 각각 표적 세포 용액과 혼합하였다. V-바닥 96-웰 세포 배양 플레이트를 37℃, 5% CO2 인큐베이터에서 30 내지 60분 동안 인큐베이션하였다.
3. ADCC 활성 검정
이펙터 세포 용액 (40 μL의 8 x 105 이펙터 세포/웰) 또는 40 μL의 RPMI 검정 배지를 플레이트에 첨가하여 표적 세포 용액과 혼합하였다. 플레이트를 300 x g에서 4분 동안 원심분리하였다. 플레이트를 37℃, 5% CO2에서 4시간 동안 인큐베이션하였다. 사이토톡스 96 (CYTOTOX 96)®의 용해 용액 (10 μL)을 상청액 수확 전 1시간 동안 Tmax 및 BlkV 그룹의 플레이트에 첨가하였다. V-바닥 96-웰 세포 배양 플레이트를 300 x g에서 4분 동안 원심분리하고, 50 μL의 상청액을 96-웰 세포 배양 플레이트로부터 평평한 바닥 검정 플레이트의 웰로 옮겼다.
락테이트 데히드로게나제 (LDH) (2 μL)를 10 mL의 LDH 양성 대조군 희석액에 첨가하여 LDH 양성 대조군 용액을 제조하였다. 제조된 LDH 양성 대조군 용액 (50 μL)을 96-웰 평평한 바닥 검정 플레이트의 웰에 첨가하였다.
LDH 재구성 기질 믹스 (50 μL)를 검정 플레이트의 각 시험 웰에 첨가하였다. 플레이트를 덮고, 실온에서 암실에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 정지 용액 (50 μL)을 플레이트의 각 시험 웰에 첨가하였다. 490 nm에서의 흡광도는 정지 용액을 첨가한 직후 기록하였다. 각 그룹 (S, PBMC, T, E, 및 Tmax)의 블랭크-제거 흡광도 값을 사용하여 하기 나열된 식에 의해 ADCC 활성을 계산하였다.
Figure pct00001
여기서 S는 샘플 (표적 세포 + PBMC + 항-CD20 항체)의 LDH 방출의 흡광도 값이고; PBMC는 표적 세포 및 PBMC의 LDH 방출의 흡광도 값이고; E는 PBMC의 LDH 방출의 흡광도 값이고; T는 표적 세포 자발적인 LDH 방출의 흡광도 값이고; Tmax는 표적 세포 최대 LDH 방출의 흡광도 값이다.
비푸코실화된 항-CD20 항체 (클론 R1)는 상업용 리툭산® (맙테라®)과 비교하여 공여자 1 (도 3a) 및 공여자 2 (도 3b) 둘 다로부터의 PBMC 세포에서 유의하게 더 강하고 더 높은 ADCC 반응을 유도하였다.
표 7에 제시된 바와 같이, RC79F83M 클론 R1로부터의 비푸코실화된 항-CD20 항체의 EC50은 푸코실화된 항-CD20 항체인 상업용 리툭산®의 EC50보다 유의하게 더 낮았다. 구체적으로, 비푸코실화된 항-CD20 항체 (클론 R1)는 공여자 1 및 2로부터의 PBMC 세포에서 각각 1.7 ng/mL 및 4.6 ng/mL의 EC50을 가졌다. 대조적으로, 푸코실화된 항-CD20 항체 (맙테라®))는 공여자 1 및 2로부터의 PBMC 세포에서 각각 18.2 ng/mL 및 35.0 ng/mL의 EC50을 가졌다.
본 연구의 결과는 비푸코실화된 항-CD20 항체 (클론 R1)가 푸코실화된 항-CD20 항체 (맙테라®)보다 7.68배 내지 10.7배 더 강한 ADCC 활성을 나타내었음을 입증한다.
실시예 4
비푸코실화된 항체의 결합 친화성
아민 커플링 키트를 사용한 비아코어® CM5 칩에 커플링된 항-히스티딘 (항-His) 항체 및 비아코어® X100 컨트롤 소프트웨어의 고정화 마법사를 사용하여, His-태그부착된 FcγRIIIa 재조합 단백질에 대한 비푸코실화된 및 푸코실화된 항-CD20 항체의 결합 친화성을 평가하였다.
His-태그부착된 FcγRIIIa 재조합 단백질 (1 μg/mL)을 항-His 항체-고정된 CM5 칩에 10 μL/분의 유속으로 20초 동안 주입하였다.
클론 1로부터의 비푸코실화된 항-CD20 항체 (5, 10, 20, 40 및 80 nM), 상업용 푸코실화된 항-CD20 항체 리툭산® (맙테라®) (20, 40, 80, 160, 및 320 nM), 및 상업용 비푸코실화된 항-CD20 항체 가지바® (오비누투주맙) (5, 10, 20, 40, 또는 80 nM)를 각각 30 μL/분의 유속으로 3분 동안 칩을 통해 주입하였다. 런닝 완충제는 30 μL/분의 유속으로 5분 동안 칩을 통해 유동하였다. 글리신, pH 1.5 (10mM)을 30 μL/분의 유속으로 60초 동안 칩에 주입하였다.
각 사이클의 센서그램을 비아코어® X100 평가 소프트웨어로 분석하여 평형 해리 상수 (KD), 회합 속도 상수 (Ka) 및 해리 속도 상수 (Kd)의 값을 수득하였다. 각 사이클의 센서그램을 1:1 랭뮤어 결합 모델에 의해 적합화하였다. 카이2 값이 1/10X Rmax 값보다 더 낮으면, 적합화 모델이 적절하고, 동역학적 결합 파라미터는 신뢰할 수 있었다.
도 4a-4c는 시험된 3개의 항체의 고전적인 SPR 센서그램을 제시한다. 고전적인 SPR 센서그램은 본 검정에서 사용된 조건 (예를 들어, 회합 시간, 해리 시간, 및 항체 농도 범위)이 적절하였음을 나타내었다. 또한, 3개의 항체의 카이2 값은 1/10X Rmax 값보다 더 작았으며, 이는 1:1 랭뮤어 모델이 모든 3개의 항체의 센서그램 적합화에 적합하였음을 나타내었다.
표 8에 제시된 바와 같이, 비푸코실화된 항-CD20 항체 (클론 R1)는 맙테라®와 비교하여 FcγRIIIa에 대한 10배 초과의 더 강한 결합 친화성을 가졌다 (R1 클론의 KD = 13.0 nM, 맙테라® = 151.5 nM). 또한, 비푸코실화된 항-CD20 항체 (클론 R1)는 가지바®와 비교하여 FcγRIIIa에 대한 3배 초과의 더 강한 결합 친화성을 가졌다 (R1 클론의 KD = 13.0 nM, 가지바® = 39.9 nM).
본 연구의 결과는 본 개시내용에 따라 제조된 비푸코실화된 항-CD20 항체 (클론 R1)가 상업용 푸코실화된 항-CD20 항체 리툭산® (맙테라®) 뿐만 아니라 상업용 비푸코실화된 항-CD20 항체 (가지바®)와 비교하여 더 큰 FcγRIIIa 결합 친화성을 갖는다는 것을 입증한다.
실시예 5
비푸코실화된 항체의 CDC 활성
개시된 방법에 의해 생산된 비푸코실화된 항체의 CDC 활성을 평가하였다.
Daudi 세포를 RPMI 배양 배지로 배양하고, 세포 밀도가 1 x 106개 세포/mL에 도달하였을 때 계대배양하였다 (계대배양 밀도: 2-3 x 105개 세포/mL). Daudi 세포를 수집하고, 300 rpm에서 5분 동안 원심분리하였다. 세포를 RPMI 배양 배지로 재현탁시켜 1 x 105개 세포/mL의 농도로 세포 현탁액을 제조하였다. 재현탁 후, 100 μL의 세포 현탁액 또는 100 μL의 RPMI 배양 배지를 백색 96-웰 플레이트의 웰에 시딩하였다.
상업적으로 입수가능한 리툭산® (맙테라®) 및 비푸코실화된 항-CD20 항체 (클론 R1)를 120 μg/mL 내지 0.234 μg/mL의 농도로 염수에서 제조하였다. 그 후, Daudi 세포 또는 RPMI 배지를 함유하는 백색 96-웰 플레이트의 웰에 120 μg/mL 내지 0.234 μg/mL의 리툭산® 또는 비푸코실화된 항-CD20 항체 (클론 R1) 용액 25 μL를 첨가하였다. 셀타이터-글로(CELLTITER-GLO)® 시약 (20 μL)을 각 웰에 첨가한 후 혼합하였다. 플레이트를 750 rpm에서 2분 동안 마이크로플레이트 진탕기에 배치한 후, 실온에서 10분 동안 암실에서 인큐베이션하였다. 발광 세기를 고감도 발광 카세트 (통합 시간: 1초)와 접속된 멀티-모드 판독기에 의해 검출하여 항-CD20 항체의 EC50 값 및 항체의 관련 CDC 활성을 계산하였다.
도 5는 비푸코실화된 항-CD20 항체 (클론 R1)의 CDC 활성이 리툭산®과 필적하였음을 제시한다. 비푸코실화된 항-CD20 항체 (R1 클론)의 EC50 값은 0.682 μg/mL였으며, 이는 리툭산® (EC50 = 0.582 μg/mL)보다 더 높았다.
상업용 비푸코실화된 항-CD20 항체인 가지바®는 ADCC 활성을 유도하지만 CDC 활성을 저해하는 것으로 제시된 바 있다 (E. Moessener et al. (2010); C. Ferrara et al. (2011)). 다른 사람들이 수득된 결과는 효율적인 암 치료를 수득하기 위해 가지바®의 양을 증가시켜야 함을 시사한다. 대조적으로, 본 실시예 및 실시예 5로부터의 결과는 개시된 방법에 의해 생산된 비푸코실화된 항-CD20 항체가 그의 푸코실화된 대응부와 유사한 CDC 활성을 유지하면서 ADCC 활성을 유도함을 입증한다. 따라서, 본 개시내용의 비푸코실화된 항-CD20 항체는 가지바®보다 우수한 성능을 보였다.
실시예 6
동물 모델에서의 비푸코실화된 항체에 대한 효능의 증명
본 개시내용의 비푸코실화된 항체의 항종양 효능을 증명하기 위해 본 실시예에서 B-세포 림프종 피하 이종이식 모델을 사용하였다. SU-DHL-4는 세포 막에 높은 수준의 CD20을 발현하는 B-세포 림프종 세포주이며, 피하에서 성장하여 고형 종양을 형성할 수 있다. 그러므로, 비푸코실화된 항체 (R1 클론) 및 상업적으로 입수가능한 리툭산® (맙테라®)의 항종양 효능을 비교하기 위해 SCID/베이지 마우스에서 이종이식 모델을 개발하였다.
SU-DHL-4 세포를 플라스크에서 RPMI 배양 배지 (CM)와 함께 배양하였다. 세포 농도가 0.8 - 1.0 x 106개 세포/mL에 도달했을 때, 세포 현탁액을 수집하고 300g에서 5분 동안 원심분리하여 상청액을 제거하였다. 조건 배지의 일부를 함유하는 새로운 배양 배지 (신선한 CM : 조건 CM = 9 : 1의 비율)로 세포를 재현탁시켰다. 세포를 1 : 2 내지 1 : 10의 비율로 계대배양하였으며 (시딩 세포 수 : 총 수확물 세포 수), 세포 농도는 적어도 1 x 105개 세포/mL였다. 배양 접시를 37℃에서 인큐베이션하였다. SU-DHL-4 세포를 5개의 150T 플라스크에서 배양하였다. 세포 농도가 0.8 내지 1.0 x 106개 세포/mL에 도달하였을 때, 세포 현탁액을 50 mL 튜브에 수집한 후, 1,200 rpm에서 5분 동안 원심분리하여 상청액을 제거하였다. 무혈청 RPMI 배지를 사용하여 세포 농도를 1 x 108개 세포/mL로 조절하였다. 얼음 위에 18 G 바늘을 갖는 미리 냉각된 주사기를 사용하여 50 mL-센트리튜브에서 세포 현탁액을 동등한 부피의 매트리겔(MATRIGEL)®과 혼합하였다. 최종 세포 농도는 5 x 107개 세포/mL였다. 23G*1" 바늘을 갖는 미리 냉각된 1 mL 주사기를 사용하여 각 마우스 (SCID/베이지 마우스)의 등쪽 영역의 오른쪽에 5 x 107개 세포/mL 농도의 매트리겔-SU-DHL-4 세포 혼합물 (100 uL)을 피하로 주사하였다. 총 접종 세포 수는 5 x 106개 세포였다. 3 또는 4일마다 캘리퍼를 사용하여 각 마우스의 종양 부피를 측정하고, 방정식: V= 0.5 x ab2 (여기서 a 및 b는 각각 종양 길이 및 너비임)에 의해 계산하였다.
종양 부피가 약 200 ㎣ (198.25 ± 55.53 ㎣)에 도달하였을 때 (종양 접종 후 대략 20일에 발생함), 마우스를 5마리씩 3개의 그룹으로 분포시킨 후, 염수 (비히클), 상업적으로 입수가능한 리툭산® (맙테라®), 또는 비푸코실화된 항-CD20 항체 (클론 R1)로 처리하였다. 마우스에게 3주 동안 매주 0.1 mg/mL 항체 0.2 mL를 주사하였다. 모든 마우스의 체중 및 종양 크기를 전자 저울 및 디지털 캘리퍼에 의해 매주 2회 측정하였다. 처리 기간의 종료시, 마우스를 희생시키고, 종양 조직을 제거하고 중량을 측정하였다. 그 후, 종양 조직을 추가 검사를 위해 실온에서 10% 포르말린 완충제에서 고정시켰다.
도 6에 제시된 바와 같이, 비푸코실화된 항-CD20 항체 (클론 R1)는 리툭산®보다 유의하게 더 강한 항-종양 효능을 나타내었다. 비히클 그룹 및 비푸코실화된 항-CD20 항체 (클론 R1)로 처리된 그룹 사이에 종양 부피의 통계적으로 유의한 차이 (P < 0.001, 스튜던트 t-검정에 의해)가 있었다. 반대로, 리툭산®은 비히클-단독 그룹과 비교할 때 종양 부피의 통계적으로 유의한 차이를 나타내지 않았다. 비푸코실화된 항-CD20 항체 (클론 R1)는 표 9에 제시된 바와 같이 1 mg/kg의 용량에서 리툭산®과 비교하여 종양 성장을 더 효과적으로 저해하였다 (R1 클론 = 468 ± 148 ㎣; 리툭산® = 1407 ± 241 ㎣). 비푸코실화된 항-CD20 항체 (클론 R1) 및 리툭산® 그룹 사이에 종양 부피의 통계적으로 유의한 차이가 있었다 (P < 0.001).
비푸코실화된 항-CD20 항체 (R1 클론)로 처리된 그룹의 종양 중량은 도 7에 제시된 바와 같이 비히클-단독 그룹보다 유의하게 적었다 (P < 0.001). 그러나, 리툭산®은 비히클 그룹과 비교하여 동일한 용량에서 종양 중량의 통계적으로 유의한 차이를 나타내지 않았다. 그러므로, 표 9에 제시된 바와 같이 리툭산® 그룹과 비교하여 비푸코실화된 항-CD20 항체 (클론 R1) 그룹에서 종양 중량의 통계적으로 유의한 감소가 있었다 (R1 클론 = 0.27 ± 0.15 g; 리툭산® = 0.62 ± 0.09 g, P < 0.01). 비푸코실화된 항-CD20 항체 (클론 R1)는 리툭산®보다 훨씬 더 효율적으로 종양 성장을 억제하였으며, 이는 종양 부피로 수득된 결과에 상응한다.
모든 그룹의 마우스의 체중은 도 8에 제시된 바와 같이 처리 기간 동안 점차적으로 증가하였다.
연구의 결과는 비푸코실화된 항-CD20 항체 (클론 R1)가 안전하였음을 시사한다.
표 1
검정에서 이용된 FUT8 효소의 변형
Figure pct00002
1 서열식별번호: 1의 야생형 FUT8 DNA 서열을 기준으로 한 DNA 서열 위치
2 서열식별번호: 2의 야생형 FUT8 단백질 서열을 기준으로 한 아미노산 위치
3 N/A = 해당 없음
표 2
검정에서 이용된 GMD 효소의 변형
Figure pct00003
1 서열식별번호: 13의 야생형 서열을 기준으로 한 DNA 서열 위치
2 서열식별번호: 14의 야생형 서열을 기준으로 한 아미노산 위치
표 3
CHO 세포에서 생산된 항체의 N-글리칸 프로파일
F83M 변형된 효소의 과다발현의 존재 하 및 부재 하
Figure pct00004
w/o Fuc.: (총 글리칸의 양 - 푸코스의 양) / 총 글리칸의 양 x 100%
표 4
세포에 의해 생산된 항-CD20 항체의 N-글리칸 프로파일
F8M1, F8M2, F8M3, F8D1 또는 GMD4M 변형된 효소의 과다발현의 존재 하 및 부재 하
Figure pct00005
w/o Fuc.: (총 글리칸의 양 - 푸코스의 양) / 총 글리칸의 양 x 100%
표 5
세포에 의해 생산된 항-CD20 항체의 N-글리칸 프로파일
F83M 변형된 효소의 과다발현의 존재 하 및 부재 하
Figure pct00006
w/o Fuc.: (총 글리칸의 양 - 푸코스의 양) / 총 글리칸의 양 x 100%
표 6
F83M 변형된 효소를 과다발현하는 세포에 의해 생산된 비푸코실화된 항-CD20 항체의 안정성
Figure pct00007
표 7
푸코실화된 및 비푸코실화된 항-CD20 항체의 EC 50 값 및 ADCC 활성
Figure pct00008
표 8
리툭산®, 가지바® 및 비푸코실화된 항체의 FcγRIIIa 결합 친화성
Figure pct00009
표 9
각 그룹에서 처리된 마우스의 종양 부피, 종양 중량 및 체중
Figure pct00010
값은 평균 ± S.D. (S.C.)를 나타냄
SEQUENCE LISTING <110> UBI Pharma Inc. United BioPharma Inc. Peng, Wen-Jiun Chen, Hui-Jung <120> AFUCOSYLATED ANTIBODIES AND MANUFACTURE THEREOF <130> UBIP1004B-US <140> TBD <141> 2018-05-08 <160> 17 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 1728 <212> DNA <213> mouse <400> 1 atgagggcct ggaccggctc ctggaggtgg atcatgctga tcctgttcgc ctggggcacc 60 ctgctgttct acatcggcgg ccacctggtg agggacaacg accaccccga ccactcctcc 120 agggagctgt ccaagatcct ggccaagctg gagaggctga agcagcagaa cgaggacctg 180 aggaggatgg ccgagtccct gaggatcccc gagggcccca tcgaccaggg caccgccacc 240 ggcagggtga gggtgctgga ggagcagctg gtgaaggcca aggagcagat cgagaactac 300 aagaagcagg ccaggaacgg cctgggcaag gaccacgaga tcctgaggag gaggatcgag 360 aacggcgcca aggagctgtg gttcttcctg cagtccgagc tgaagaagct gaagcacctg 420 gagggcaacg agctgcagag gcacgccgac gagatcctgc tggacctggg ccaccacgag 480 aggtccatca tgaccgacct gtactacctg tcccagaccg acggcgccgg cgactggagg 540 gagaaggagg ccaaggacct gaccgagctg gtgcagagga ggatcaccta cctgcagaac 600 cccaaggact gctccaaggc caggaagctg gtgtgcaaca tcaacaaggg ctgcggctac 660 ggctgccagc tgcaccacgt ggtgtactgc ttcatgatcg cctacggcac ccagaggacc 720 ctgatcctgg agtcccagaa ctggaggtac gccaccggcg gctgggagac cgtgttcagg 780 cccgtgtccg agacctgcac cgacaggtcc ggcctgtcca ccggccactg gtccggcgag 840 gtgaacgaca agaacatcca ggtggtggag ctgcccatcg tggactccct gcaccccagg 900 cccccctacc tgcccctggc cgtgcccgag gacctggccg acaggctgct gagggtgcac 960 ggcgaccccg ccgtgtggtg ggtgtcccag ttcgtgaagt acctgatcag gccccagccc 1020 tggctggaga aggagatcga ggaggccacc aagaagctgg gcttcaagca ccccgtgatc 1080 ggcgtgcacg tgaggaggac cgacaaggtg ggcaccgagg ccgccttcca ccccatcgag 1140 gagtacatgg tgcacgtgga ggagcacttc cagctgctgg ccaggaggat gcaggtggac 1200 aagaagaggg tgtacctggc caccgacgac cccaccctgc tgaaggaggc caagaccaag 1260 tactccaact acgagttcat ctccgacaac tccatctcct ggtccgccgg cctgcacaac 1320 aggtacaccg agaactccct gaggggcgtg atcctggaca tccacttcct gtcccaggcc 1380 gacttcctgg tgtgcacctt ctcctcccag gtgtgcaggg tggcctacga gatcatgcag 1440 accctgcacc ccgacgcctc cgccaacttc cactccctgg acgacatcta ctacttcggc 1500 ggccagaacg cccacaacca gatcgccgtg tacccccaca agcccaggac cgaggaggag 1560 atccccatgg agcccggcga catcatcggc gtggccggca accactggga cggctactcc 1620 aagggcatca acaggaagct gggcaagacc ggcctgtacc cctcctacaa ggtgagggag 1680 aagatcgaga ccgtgaagta ccccacctac cccgaggccg agaagtga 1728 <210> 2 <211> 575 <212> PRT <213> human <400> 2 Met Arg Ala Trp Thr Gly Ser Trp Arg Trp Ile Met Leu Ile Leu Phe 1 5 10 15 Ala Trp Gly Thr Leu Leu Phe Tyr Ile Gly Gly His Leu Val Arg Asp 20 25 30 Asn Asp His Pro Asp His Ser Ser Arg Glu Leu Ser Lys Ile Leu Ala 35 40 45 Lys Leu Glu Arg Leu Lys Gln Gln Asn Glu Asp Leu Arg Arg Met Ala 50 55 60 Glu Ser Leu Arg Ile Pro Glu Gly Pro Ile Asp Gln Gly Thr Ala Thr 65 70 75 80 Gly Arg Val Arg Val Leu Glu Glu Gln Leu Val Lys Ala Lys Glu Gln 85 90 95 Ile Glu Asn Tyr Lys Lys Gln Ala Arg Asn Gly Leu Gly Lys Asp His 100 105 110 Glu Ile Leu Arg Arg Arg Ile Glu Asn Gly Ala Lys Glu Leu Trp Phe 115 120 125 Phe Leu Gln Ser Glu Leu Lys Lys Leu Lys His Leu Glu Gly Asn Glu 130 135 140 Leu Gln Arg His Ala Asp Glu Ile Leu Leu Asp Leu Gly His His Glu 145 150 155 160 Arg Ser Ile Met Thr Asp Leu Tyr Tyr Leu Ser Gln Thr Asp Gly Ala 165 170 175 Gly Asp Trp Arg Glu Lys Glu Ala Lys Asp Leu Thr Glu Leu Val Gln 180 185 190 Arg Arg Ile Thr Tyr Leu Gln Asn Pro Lys Asp Cys Ser Lys Ala Arg 195 200 205 Lys Leu Val Cys Asn Ile Asn Lys Gly Cys Gly Tyr Gly Cys Gln Leu 210 215 220 His His Val Val Tyr Cys Phe Met Ile Ala Tyr Gly Thr Gln Arg Thr 225 230 235 240 Leu Ile Leu Glu Ser Gln Asn Trp Arg Tyr Ala Thr Gly Gly Trp Glu 245 250 255 Thr Val Phe Arg Pro Val Ser Glu Thr Cys Thr Asp Arg Ser Gly Leu 260 265 270 Ser Thr Gly His Trp Ser Gly Glu Val Asn Asp Lys Asn Ile Gln Val 275 280 285 Val Glu Leu Pro Ile Val Asp Ser Leu His Pro Arg Pro Pro Tyr Leu 290 295 300 Pro Leu Ala Val Pro Glu Asp Leu Ala Asp Arg Leu Leu Arg Val His 305 310 315 320 Gly Asp Pro Ala Val Trp Trp Val Ser Gln Phe Val Lys Tyr Leu Ile 325 330 335 Arg Pro Gln Pro Trp Leu Glu Lys Glu Ile Glu Glu Ala Thr Lys Lys 340 345 350 Leu Gly Phe Lys His Pro Val Ile Gly Val His Val Arg Arg Thr Asp 355 360 365 Lys Val Gly Thr Glu Ala Ala Phe His Pro Ile Glu Glu Tyr Met Val 370 375 380 His Val Glu Glu His Phe Gln Leu Leu Ala Arg Arg Met Gln Val Asp 385 390 395 400 Lys Lys Arg Val Tyr Leu Ala Thr Asp Asp Pro Thr Leu Leu Lys Glu 405 410 415 Ala Lys Thr Lys Tyr Ser Asn Tyr Glu Phe Ile Ser Asp Asn Ser Ile 420 425 430 Ser Trp Ser Ala Gly Leu His Asn Arg Tyr Thr Glu Asn Ser Leu Arg 435 440 445 Gly Val Ile Leu Asp Ile His Phe Leu Ser Gln Ala Asp Phe Leu Val 450 455 460 Cys Thr Phe Ser Ser Gln Val Cys Arg Val Ala Tyr Glu Ile Met Gln 465 470 475 480 Thr Leu His Pro Asp Ala Ser Ala Asn Phe His Ser Leu Asp Asp Ile 485 490 495 Tyr Tyr Phe Gly Gly Gln Asn Ala His Asn Gln Ile Ala Val Tyr Pro 500 505 510 His Lys Pro Arg Thr Glu Glu Glu Ile Pro Met Glu Pro Gly Asp Ile 515 520 525 Ile Gly Val Ala Gly Asn His Trp Asp Gly Tyr Ser Lys Gly Ile Asn 530 535 540 Arg Lys Leu Gly Lys Thr Gly Leu Tyr Pro Ser Tyr Lys Val Arg Glu 545 550 555 560 Lys Ile Glu Thr Val Lys Tyr Pro Thr Tyr Pro Glu Ala Glu Lys 565 570 575 <210> 3 <211> 1728 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleic acid sequence of F83M modified enzyme, where positions 1093-1095, 1225-1227, and 1357-1359 in wild-type FUT8 gene have been changed <400> 3 atgagggcct ggaccggctc ctggaggtgg atcatgctga tcctgttcgc ctggggcacc 60 ctgctgttct acatcggcgg ccacctggtg agggacaacg accaccccga ccactcctcc 120 agggagctgt ccaagatcct ggccaagctg gagaggctga agcagcagaa cgaggacctg 180 aggaggatgg ccgagtccct gaggatcccc gagggcccca tcgaccaggg caccgccacc 240 ggcagggtga gggtgctgga ggagcagctg gtgaaggcca aggagcagat cgagaactac 300 aagaagcagg ccaggaacgg cctgggcaag gaccacgaga tcctgaggag gaggatcgag 360 aacggcgcca aggagctgtg gttcttcctg cagtccgagc tgaagaagct gaagcacctg 420 gagggcaacg agctgcagag gcacgccgac gagatcctgc tggacctggg ccaccacgag 480 aggtccatca tgaccgacct gtactacctg tcccagaccg acggcgccgg cgactggagg 540 gagaaggagg ccaaggacct gaccgagctg gtgcagagga ggatcaccta cctgcagaac 600 cccaaggact gctccaaggc caggaagctg gtgtgcaaca tcaacaaggg ctgcggctac 660 ggctgccagc tgcaccacgt ggtgtactgc ttcatgatcg cctacggcac ccagaggacc 720 ctgatcctgg agtcccagaa ctggaggtac gccaccggcg gctgggagac cgtgttcagg 780 cccgtgtccg agacctgcac cgacaggtcc ggcctgtcca ccggccactg gtccggcgag 840 gtgaacgaca agaacatcca ggtggtggag ctgcccatcg tggactccct gcaccccagg 900 cccccctacc tgcccctggc cgtgcccgag gacctggccg acaggctgct gagggtgcac 960 ggcgaccccg ccgtgtggtg ggtgtcccag ttcgtgaagt acctgatcag gccccagccc 1020 tggctggaga aggagatcga ggaggccacc aagaagctgg gcttcaagca ccccgtgatc 1080 ggcgtgcacg tggccaggac cgacaaggtg ggcaccgagg ccgccttcca ccccatcgag 1140 gagtacatgg tgcacgtgga ggagcacttc cagctgctgg ccaggaggat gcaggtggac 1200 aagaagaggg tgtacctggc caccgccgac cccaccctgc tgaaggaggc caagaccaag 1260 tactccaact acgagttcat ctccgacaac tccatctcct ggtccgccgg cctgcacaac 1320 aggtacaccg agaactccct gaggggcgtg atcctggcca tccacttcct gtcccaggcc 1380 gacttcctgg tgtgcacctt ctcctcccag gtgtgcaggg tggcctacga gatcatgcag 1440 accctgcacc ccgacgcctc cgccaacttc cactccctgg acgacatcta ctacttcggc 1500 ggccagaacg cccacaacca gatcgccgtg tacccccaca agcccaggac cgaggaggag 1560 atccccatgg agcccggcga catcatcggc gtggccggca accactggga cggctactcc 1620 aagggcatca acaggaagct gggcaagacc ggcctgtacc cctcctacaa ggtgagggag 1680 aagatcgaga ccgtgaagta ccccacctac cccgaggccg agaagtga 1728 <210> 4 <211> 575 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of F83M modified enzyme, where the residues at positions 365, 409, and 453 in wild-type FUT8 protein have been chagned <400> 4 Met Arg Ala Trp Thr Gly Ser Trp Arg Trp Ile Met Leu Ile Leu Phe 1 5 10 15 Ala Trp Gly Thr Leu Leu Phe Tyr Ile Gly Gly His Leu Val Arg Asp 20 25 30 Asn Asp His Pro Asp His Ser Ser Arg Glu Leu Ser Lys Ile Leu Ala 35 40 45 Lys Leu Glu Arg Leu Lys Gln Gln Asn Glu Asp Leu Arg Arg Met Ala 50 55 60 Glu Ser Leu Arg Ile Pro Glu Gly Pro Ile Asp Gln Gly Thr Ala Thr 65 70 75 80 Gly Arg Val Arg Val Leu Glu Glu Gln Leu Val Lys Ala Lys Glu Gln 85 90 95 Ile Glu Asn Tyr Lys Lys Gln Ala Arg Asn Gly Leu Gly Lys Asp His 100 105 110 Glu Ile Leu Arg Arg Arg Ile Glu Asn Gly Ala Lys Glu Leu Trp Phe 115 120 125 Phe Leu Gln Ser Glu Leu Lys Lys Leu Lys His Leu Glu Gly Asn Glu 130 135 140 Leu Gln Arg His Ala Asp Glu Ile Leu Leu Asp Leu Gly His His Glu 145 150 155 160 Arg Ser Ile Met Thr Asp Leu Tyr Tyr Leu Ser Gln Thr Asp Gly Ala 165 170 175 Gly Asp Trp Arg Glu Lys Glu Ala Lys Asp Leu Thr Glu Leu Val Gln 180 185 190 Arg Arg Ile Thr Tyr Leu Gln Asn Pro Lys Asp Cys Ser Lys Ala Arg 195 200 205 Lys Leu Val Cys Asn Ile Asn Lys Gly Cys Gly Tyr Gly Cys Gln Leu 210 215 220 His His Val Val Tyr Cys Phe Met Ile Ala Tyr Gly Thr Gln Arg Thr 225 230 235 240 Leu Ile Leu Glu Ser Gln Asn Trp Arg Tyr Ala Thr Gly Gly Trp Glu 245 250 255 Thr Val Phe Arg Pro Val Ser Glu Thr Cys Thr Asp Arg Ser Gly Leu 260 265 270 Ser Thr Gly His Trp Ser Gly Glu Val Asn Asp Lys Asn Ile Gln Val 275 280 285 Val Glu Leu Pro Ile Val Asp Ser Leu His Pro Arg Pro Pro Tyr Leu 290 295 300 Pro Leu Ala Val Pro Glu Asp Leu Ala Asp Arg Leu Leu Arg Val His 305 310 315 320 Gly Asp Pro Ala Val Trp Trp Val Ser Gln Phe Val Lys Tyr Leu Ile 325 330 335 Arg Pro Gln Pro Trp Leu Glu Lys Glu Ile Glu Glu Ala Thr Lys Lys 340 345 350 Leu Gly Phe Lys His Pro Val Ile Gly Val His Val Ala Arg Thr Asp 355 360 365 Lys Val Gly Thr Glu Ala Ala Phe His Pro Ile Glu Glu Tyr Met Val 370 375 380 His Val Glu Glu His Phe Gln Leu Leu Ala Arg Arg Met Gln Val Asp 385 390 395 400 Lys Lys Arg Val Tyr Leu Ala Thr Ala Asp Pro Thr Leu Leu Lys Glu 405 410 415 Ala Lys Thr Lys Tyr Ser Asn Tyr Glu Phe Ile Ser Asp Asn Ser Ile 420 425 430 Ser Trp Ser Ala Gly Leu His Asn Arg Tyr Thr Glu Asn Ser Leu Arg 435 440 445 Gly Val Ile Leu Ala Ile His Phe Leu Ser Gln Ala Asp Phe Leu Val 450 455 460 Cys Thr Phe Ser Ser Gln Val Cys Arg Val Ala Tyr Glu Ile Met Gln 465 470 475 480 Thr Leu His Pro Asp Ala Ser Ala Asn Phe His Ser Leu Asp Asp Ile 485 490 495 Tyr Tyr Phe Gly Gly Gln Asn Ala His Asn Gln Ile Ala Val Tyr Pro 500 505 510 His Lys Pro Arg Thr Glu Glu Glu Ile Pro Met Glu Pro Gly Asp Ile 515 520 525 Ile Gly Val Ala Gly Asn His Trp Asp Gly Tyr Ser Lys Gly Ile Asn 530 535 540 Arg Lys Leu Gly Lys Thr Gly Leu Tyr Pro Ser Tyr Lys Val Arg Glu 545 550 555 560 Lys Ile Glu Thr Val Lys Tyr Pro Thr Tyr Pro Glu Ala Glu Lys 565 570 575 <210> 5 <211> 1728 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleic acids sequence of F8M1 modified enzyme, where positions 1105-1107 in wild-type FUT8 gene have been changed <400> 5 atgagggcct ggaccggctc ctggaggtgg atcatgctga tcctgttcgc ctggggcacc 60 ctgctgttct acatcggcgg ccacctggtg agggacaacg accaccccga ccactcctcc 120 agggagctgt ccaagatcct ggccaagctg gagaggctga agcagcagaa cgaggacctg 180 aggaggatgg ccgagtccct gaggatcccc gagggcccca tcgaccaggg caccgccacc 240 ggcagggtga gggtgctgga ggagcagctg gtgaaggcca aggagcagat cgagaactac 300 aagaagcagg ccaggaacgg cctgggcaag gaccacgaga tcctgaggag gaggatcgag 360 aacggcgcca aggagctgtg gttcttcctg cagtccgagc tgaagaagct gaagcacctg 420 gagggcaacg agctgcagag gcacgccgac gagatcctgc tggacctggg ccaccacgag 480 aggtccatca tgaccgacct gtactacctg tcccagaccg acggcgccgg cgactggagg 540 gagaaggagg ccaaggacct gaccgagctg gtgcagagga ggatcaccta cctgcagaac 600 cccaaggact gctccaaggc caggaagctg gtgtgcaaca tcaacaaggg ctgcggctac 660 ggctgccagc tgcaccacgt ggtgtactgc ttcatgatcg cctacggcac ccagaggacc 720 ctgatcctgg agtcccagaa ctggaggtac gccaccggcg gctgggagac cgtgttcagg 780 cccgtgtccg agacctgcac cgacaggtcc ggcctgtcca ccggccactg gtccggcgag 840 gtgaacgaca agaacatcca ggtggtggag ctgcccatcg tggactccct gcaccccagg 900 cccccctacc tgcccctggc cgtgcccgag gacctggccg acaggctgct gagggtgcac 960 ggcgaccccg ccgtgtggtg ggtgtcccag ttcgtgaagt acctgatcag gccccagccc 1020 tggctggaga aggagatcga ggaggccacc aagaagctgg gcttcaagca ccccgtgatc 1080 ggcgtgcacg tgaggaggac cgacgaggtg ggcaccgagg ccgccttcca ccccatcgag 1140 gagtacatgg tgcacgtgga ggagcacttc cagctgctgg ccaggaggat gcaggtggac 1200 aagaagaggg tgtacctggc caccgacgac cccaccctgc tgaaggaggc caagaccaag 1260 tactccaact acgagttcat ctccgacaac tccatctcct ggtccgccgg cctgcacaac 1320 aggtacaccg agaactccct gaggggcgtg atcctggaca tccacttcct gtcccaggcc 1380 gacttcctgg tgtgcacctt ctcctcccag gtgtgcaggg tggcctacga gatcatgcag 1440 accctgcacc ccgacgcctc cgccaacttc cactccctgg acgacatcta ctacttcggc 1500 ggccagaacg cccacaacca gatcgccgtg tacccccaca agcccaggac cgaggaggag 1560 atccccatgg agcccggcga catcatcggc gtggccggca accactggga cggctactcc 1620 aagggcatca acaggaagct gggcaagacc ggcctgtacc cctcctacaa ggtgagggag 1680 aagatcgaga ccgtgaagta ccccacctac cccgaggccg agaagtga 1728 <210> 6 <211> 575 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of F8M1 modified, where the residue at position 369 in wild-type FUT8 protein has been changed <400> 6 Met Arg Ala Trp Thr Gly Ser Trp Arg Trp Ile Met Leu Ile Leu Phe 1 5 10 15 Ala Trp Gly Thr Leu Leu Phe Tyr Ile Gly Gly His Leu Val Arg Asp 20 25 30 Asn Asp His Pro Asp His Ser Ser Arg Glu Leu Ser Lys Ile Leu Ala 35 40 45 Lys Leu Glu Arg Leu Lys Gln Gln Asn Glu Asp Leu Arg Arg Met Ala 50 55 60 Glu Ser Leu Arg Ile Pro Glu Gly Pro Ile Asp 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gaggatcgag 360 aacggcgcca aggagctgtg gttcttcctg cagtccgagc tgaagaagct gaagcacctg 420 gagggcaacg agctgcagag gcacgccgac gagatcctgc tggacctggg ccaccacgag 480 aggtccatca tgaccgacct gtactacctg tcccagaccg acggcgccgg cgactggagg 540 gagaaggagg ccaaggacct gaccgagctg gtgcagagga ggatcaccta cctgcagaac 600 cccaaggact gctccaaggc caggaagctg gtgtgcaaca tcaacaaggg ctgcggctac 660 ggctgccagc tgcaccacgt ggtgtactgc ttcatgatcg cctacggcac ccagaggacc 720 ctgatcctgg agtcccagaa ctggaggtac gccaccggcg gctgggagac cgtgttcagg 780 cccgtgtccg agacctgcac cgacaggtcc ggcctgtcca ccggccactg gtccggcgag 840 gtgaacgaca agaacatcca ggtggtggag ctgcccatcg tggactccct gcaccccagg 900 cccccctacc tgcccctggc cgtgcccgag gacctggccg acaggctgct gagggtgcac 960 ggcgaccccg ccgtgtggtg ggtgtcccag ttcgtgaagt acctgatcag gccccagccc 1020 tggctggaga aggagatcga ggaggccacc aagaagctgg gcttcaagca ccccgtgatc 1080 ggcgtgcacg tgaggaggac cgacaaggtg ggcaccgagg ccgccttcca ccccatcgag 1140 gagtacatgg tgcacgtgga ggagcacttc cagctgctgg ccaggaggat gcaggtggac 1200 aagaagaggg tgtacctggc caccaaggac cccaccctgc tgaaggaggc caagaccaag 1260 tactccaact acgagttcat ctccgacaac tccatctcct ggtccgccgg cctgcacaac 1320 aggtacaccg agaactccct gaggggcgtg atcctggaca tccacttcct gtcccaggcc 1380 gacttcctgg tgtgcacctt ctcctcccag gtgtgcaggg tggcctacga gatcatgcag 1440 accctgcacc ccgacgcctc cgccaacttc cactccctgg acgacatcta ctacttcggc 1500 ggccagaacg cccacaacca gatcgccgtg tacccccaca agcccaggac cgaggaggag 1560 atccccatgg agcccggcga catcatcggc gtggccggca accactggga cggctactcc 1620 aagggcatca acaggaagct gggcaagacc ggcctgtacc cctcctacaa ggtgagggag 1680 aagatcgaga ccgtgaagta ccccacctac cccgaggccg agaagtga 1728 <210> 8 <211> 575 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of F8M2 modified enzyme, where the residue at position 409 in wild-type FUT8 protein has been chagned <400> 8 Met Arg Ala Trp Thr Gly Ser Trp Arg Trp Ile Met Leu Ile Leu Phe 1 5 10 15 Ala Trp Gly Thr Leu Leu Phe Tyr Ile Gly Gly His Leu Val Arg Asp 20 25 30 Asn Asp His Pro Asp His Ser Ser Arg Glu Leu Ser Lys Ile Leu Ala 35 40 45 Lys Leu Glu Arg Leu Lys Gln Gln Asn Glu Asp Leu Arg Arg Met Ala 50 55 60 Glu Ser Leu Arg Ile Pro Glu Gly Pro Ile Asp Gln Gly Thr Ala Thr 65 70 75 80 Gly Arg Val Arg Val Leu Glu Glu Gln Leu Val Lys Ala Lys Glu Gln 85 90 95 Ile Glu Asn Tyr Lys Lys Gln Ala Arg Asn Gly Leu Gly Lys Asp His 100 105 110 Glu Ile Leu Arg Arg Arg Ile Glu Asn Gly Ala Lys Glu Leu Trp Phe 115 120 125 Phe Leu Gln Ser Glu Leu Lys Lys Leu Lys His Leu Glu Gly Asn Glu 130 135 140 Leu Gln Arg His Ala Asp Glu Ile Leu Leu Asp Leu Gly His His Glu 145 150 155 160 Arg Ser Ile Met Thr Asp Leu Tyr Tyr Leu Ser Gln Thr Asp Gly Ala 165 170 175 Gly Asp Trp Arg Glu Lys Glu Ala Lys Asp Leu Thr Glu Leu Val Gln 180 185 190 Arg Arg Ile Thr Tyr Leu Gln Asn Pro Lys Asp Cys Ser Lys Ala Arg 195 200 205 Lys Leu Val Cys Asn Ile Asn Lys Gly Cys Gly Tyr Gly Cys Gln Leu 210 215 220 His His Val Val Tyr Cys Phe Met Ile Ala Tyr Gly Thr Gln Arg Thr 225 230 235 240 Leu Ile Leu Glu Ser Gln Asn Trp Arg Tyr Ala 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gagggcccca tcgaccaggg caccgccacc 240 ggcagggtga gggtgctgga ggagcagctg gtgaaggcca aggagcagat cgagaactac 300 aagaagcagg ccaggaacgg cctgggcaag gaccacgaga tcctgaggag gaggatcgag 360 aacggcgcca aggagctgtg gttcttcctg cagtccgagc tgaagaagct gaagcacctg 420 gagggcaacg agctgcagag gcacgccgac gagatcctgc tggacctggg ccaccacgag 480 aggtccatca tgaccgacct gtactacctg tcccagaccg acggcgccgg cgactggagg 540 gagaaggagg ccaaggacct gaccgagctg gtgcagagga ggatcaccta cctgcagaac 600 cccaaggact gctccaaggc caggaagctg gtgtgcaaca tcaacaaggg ctgcggctac 660 ggctgccagc tgcaccacgt ggtgtactgc ttcatgatcg cctacggcac ccagaggacc 720 ctgatcctgg agtcccagaa ctggaggtac gccaccggcg gctgggagac cgtgttcagg 780 cccgtgtccg agacctgcac cgacaggtcc ggcctgtcca ccggccactg gtccggcgag 840 gtgaacgaca agaacatcca ggtggtggag ctgcccatcg tggactccct gcaccccagg 900 cccccctacc tgcccctggc cgtgcccgag gacctggccg acaggctgct gagggtgcac 960 ggcgaccccg ccgtgtggtg ggtgtcccag ttcgtgaagt acctgatcag gccccagccc 1020 tggctggaga aggagatcga ggaggccacc aagaagctgg gcttcaagca ccccgtgatc 1080 ggcgtgcacg tgaggaggac cgacaaggtg ggcaccgagg ccgccttcca ccccatcgag 1140 gagtacatgg tgcacgtgga ggagcacttc cagctgctgg ccaggaggat gcaggtggac 1200 aagaagaggg tgtacctggc caccgacgac cccaccctgc tgaaggaggc caagaccaag 1260 tactccaact acgagttcat ctccgacaac tccatctcct ggtccgccgg cctgcacaac 1320 aggtacaccg agaactccct gaggggcgtg atcctggaca tccacttcct gtcccaggcc 1380 gacttcctgg tgtgcacctt cgtgtcccag gtgtgcaggg tggcctacga gatcatgcag 1440 accctgcacc ccgacgcctc cgccaacttc cactccctgg acgacatcta ctacttcggc 1500 ggccagaacg cccacaacca gatcgccgtg tacccccaca agcccaggac cgaggaggag 1560 atccccatgg agcccggcga catcatcggc gtggccggca accactggga cggctactcc 1620 aagggcatca acaggaagct gggcaagacc ggcctgtacc cctcctacaa ggtgagggag 1680 aagatcgaga ccgtgaagta ccccacctac cccgaggccg agaagtga 1728 <210> 10 <211> 575 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of F83M modified enzyme, where the residue at position 469 in wild-type FUT8 protein has been changed <400> 10 Met Arg Ala Trp Thr Gly Ser Trp Arg Trp Ile Met Leu Ile Leu Phe 1 5 10 15 Ala Trp Gly Thr Leu Leu Phe Tyr Ile Gly Gly His Leu Val Arg Asp 20 25 30 Asn Asp His Pro Asp His Ser Ser Arg Glu Leu Ser Lys Ile Leu Ala 35 40 45 Lys Leu Glu Arg Leu Lys Gln Gln Asn Glu Asp Leu Arg Arg Met Ala 50 55 60 Glu Ser Leu Arg Ile Pro Glu Gly Pro Ile Asp Gln Gly Thr Ala Thr 65 70 75 80 Gly Arg Val Arg Val Leu Glu Glu Gln Leu Val Lys Ala Lys Glu Gln 85 90 95 Ile Glu Asn Tyr Lys Lys Gln Ala Arg Asn Gly Leu Gly Lys Asp His 100 105 110 Glu Ile Leu Arg Arg Arg Ile Glu Asn Gly Ala Lys Glu Leu Trp Phe 115 120 125 Phe Leu Gln Ser Glu Leu Lys Lys Leu Lys His Leu Glu Gly Asn Glu 130 135 140 Leu Gln Arg His Ala Asp Glu Ile Leu Leu Asp Leu Gly His His Glu 145 150 155 160 Arg Ser Ile Met Thr Asp Leu Tyr Tyr Leu Ser Gln Thr Asp Gly Ala 165 170 175 Gly Asp Trp Arg Glu Lys Glu Ala Lys Asp Leu Thr Glu Leu Val Gln 180 185 190 Arg Arg Ile Thr Tyr Leu Gln Asn Pro Lys Asp Cys Ser Lys Ala Arg 195 200 205 Lys Leu Val Cys Asn Ile Asn Lys Gly Cys Gly Tyr Gly Cys Gln Leu 210 215 220 His His Val Val Tyr Cys Phe Met Ile Ala Tyr Gly Thr Gln Arg Thr 225 230 235 240 Leu Ile Leu Glu Ser Gln Asn Trp Arg Tyr Ala Thr Gly Gly Trp Glu 245 250 255 Thr Val Phe Arg Pro Val Ser Glu Thr Cys Thr Asp Arg Ser Gly Leu 260 265 270 Ser Thr Gly His Trp Ser Gly Glu Val Asn Asp Lys Asn Ile Gln Val 275 280 285 Val Glu Leu Pro Ile Val Asp Ser Leu His Pro Arg Pro Pro Tyr Leu 290 295 300 Pro Leu Ala Val Pro Glu Asp Leu Ala Asp Arg Leu Leu Arg Val His 305 310 315 320 Gly Asp Pro Ala Val Trp Trp Val Ser Gln Phe Val Lys Tyr Leu Ile 325 330 335 Arg Pro Gln Pro Trp Leu Glu Lys Glu Ile Glu Glu Ala Thr Lys Lys 340 345 350 Leu Gly Phe Lys His Pro Val Ile Gly Val His Val Arg Arg Thr Asp 355 360 365 Lys Val Gly Thr Glu Ala Ala Phe His Pro Ile Glu Glu Tyr Met Val 370 375 380 His Val Glu Glu His Phe Gln Leu Leu Ala Arg Arg Met Gln Val Asp 385 390 395 400 Lys Lys Arg Val Tyr Leu Ala Thr Asp Asp Pro Thr Leu Leu Lys Glu 405 410 415 Ala Lys Thr Lys Tyr Ser Asn 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ctgctgttct acatcggcgg ccacctggtg agggacaacg accaccccga ccactcctcc 120 agggagctgt ccaagatcct ggccaagctg gagaggctga agcagcagaa cgaggacctg 180 aggaggatgg ccgagtccct gaggatcccc gagggcccca tcgaccaggg caccgccacc 240 ggcagggtga gggtgctgga ggagcagctg gtgaaggcca aggagcagat cgagaactac 300 aagaagcagg ccaggaacgg cctgggcaag gaccacgaga tcctgaggag gaggatcgag 360 aacggcgcca aggagctgtg gttcttcctg cagtccgagc tgaagaagct gaagcacctg 420 gagggcaacg agctgcagag gcacgccgac gagatcctgc tggacctggg ccaccacgag 480 aggtccatca tgaccgacct gtactacctg tcccagaccg acggcgccgg cgactggagg 540 gagaaggagg ccaaggacct gaccgagctg gtgcagagga ggatcaccta cctgcagaac 600 cccaaggact gctccaaggc caggaagctg gtgtgcaaca tcaacaaggg ctgcggctac 660 ggctgccagc tgcaccacgt ggtgtactgc ttcatgatcg cctacggcac ccagaggacc 720 ctgatcctgg agtcccagaa ctggaggtac gccaccggcg gctgggagac cgtgttcagg 780 cccgtgtccg agacctgcac cgacaggtcc ggcctgtcca ccggccactg gtccggcgag 840 gtgaacgaca agaacatcca ggtggtggag ctgcccatcg tggactccct gcaccccagg 900 cccccctacc tgcccctggc cgtgcccgag gacctggccg acaggctgct gagggtgcac 960 ggcgaccccg ccgtgtggtg ggtgtcccag ttcgtgaagt acctgatcag gccccagccc 1020 tggctggaga aggagatcga ggaggccacc aagaagctgg gcttcaagca ccccgtgatc 1080 ggcgtggtgc acgtggagga gcacttccag ctgctggcca ggaggatgca ggtggacaag 1140 aagagggtgt acctggccac cgacgacccc accctgctga aggaggccaa gaccaagtac 1200 tccaactacg agttcatctc cgacaactcc atctcctggt ccgccggcct gcacaacagg 1260 tacaccgaga actccctgag gggcgtgatc ctggacatcc acttcctgtc ccaggccgac 1320 ttcctggtgt gcaccttctc ctcccaggtg tgcagggtgg cctacgagat catgcagacc 1380 ctgcaccccg acgcctccgc caacttccac tccctggacg acatctacta cttcggcggc 1440 cagaacgccc acaaccagat cgccgtgtac ccccacaagc ccaggaccga ggaggagatc 1500 cccatggagc ccggcgacat catcggcgtg gccggcaacc actgggacgg ctactccaag 1560 ggcatcaaca ggaagctggg caagaccggc ctgtacccct cctacaaggt gagggagaag 1620 atcgagaccg tgaagtaccc cacctacccc gaggccgaga agtga 1665 <210> 12 <211> 548 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of F8D1 modified enzyme, where the residues at positions 365-386 in wild-type FUT8 protein have been deleted <400> 12 Met Arg Ala Trp Thr Gly Ser Trp Arg Trp Ile Met Leu Ile Leu Phe 1 5 10 15 Ala Trp Gly Thr Leu Leu Phe Tyr Ile Gly Gly His Leu Val Arg Asp 20 25 30 Asn Asp His Pro Asp His Ser Ser Arg Glu Leu Ser Lys Ile Leu Ala 35 40 45 Lys Leu Glu Arg Leu Lys Gln Gln Asn Glu Asp Leu Arg Arg Met Ala 50 55 60 Glu Ser Leu Arg Ile Pro Glu Gly Pro Ile Asp Gln Gly Thr Ala Thr 65 70 75 80 Gly Arg Val Arg Val Leu Glu Glu Gln Leu Val Lys Ala Lys Glu Gln 85 90 95 Ile Glu Asn Tyr Lys Lys Gln Ala Arg Asn Gly Leu Gly Lys Asp His 100 105 110 Glu Ile Leu Arg Arg Arg Ile Glu Asn Gly Ala Lys Glu Leu Trp Phe 115 120 125 Phe Leu Gln Ser Glu Leu Lys Lys Leu Lys His Leu Glu Gly Asn Glu 130 135 140 Leu Gln Arg His Ala Asp Glu Ile Leu Leu Asp Leu Gly His His Glu 145 150 155 160 Arg Ser Ile Met Thr Asp Leu Tyr Tyr Leu Ser Gln Thr Asp Gly Ala 165 170 175 Gly Asp Trp Arg Glu Lys Glu Ala Lys Asp Leu Thr Glu Leu Val Gln 180 185 190 Arg Arg Ile Thr Tyr Leu Gln Asn Pro Lys Asp Cys Ser Lys Ala Arg 195 200 205 Lys Leu Val Cys Asn Ile Asn Lys Gly Cys Gly Tyr Gly Cys Gln Leu 210 215 220 His His Val Val Tyr Cys Phe Met Ile Ala Tyr Gly Thr Gln Arg Thr 225 230 235 240 Leu Ile Leu Glu Ser Gln Asn Trp Arg Tyr Ala Thr Gly Gly Trp Glu 245 250 255 Thr Val Phe Arg Pro Val Ser Glu Thr Cys Thr Asp Arg Ser Gly Leu 260 265 270 Ser Thr Gly His Trp Ser Gly Glu Val Asn Asp Lys Asn Ile Gln Val 275 280 285 Val Glu Leu Pro Ile Val Asp Ser Leu His Pro Arg Pro Pro Tyr Leu 290 295 300 Pro Leu Ala Val Pro Glu Asp Leu Ala Asp Arg Leu Leu Arg Val His 305 310 315 320 Gly Asp Pro Ala Val Trp Trp Val Ser Gln Phe Val Lys Tyr Leu Ile 325 330 335 Arg Pro Gln Pro Trp Leu Glu Lys Glu Ile Glu Glu Ala Thr Lys Lys 340 345 350 Leu Gly Phe Lys His Pro Val Ile Gly His Phe Gln Leu Leu Ala Arg 355 360 365 Arg Met Gln Val Asp Lys Lys Arg Val Tyr Leu Ala Thr Asp Asp Pro 370 375 380 Thr Leu Leu Lys Glu Ala Lys Thr Lys Tyr Ser Asn Tyr Glu Phe Ile 385 390 395 400 Ser Asp Asn Ser Ile Ser Trp Ser Ala Gly Leu His Asn Arg Tyr Thr 405 410 415 Glu Asn Ser Leu Arg Gly Val Ile Leu Asp Ile His Phe Leu Ser Gln 420 425 430 Ala Asp Phe Leu Val Cys Thr Phe Ser Ser Gln Val Cys Arg Val Ala 435 440 445 Tyr Glu Ile Met Gln Thr Leu His Pro Asp Ala Ser Ala Asn Phe His 450 455 460 Ser Leu Asp Asp Ile Tyr Tyr Phe Gly Gly Gln Asn Ala His Asn Gln 465 470 475 480 Ile Ala Val Tyr Pro His Lys Pro Arg Thr Glu Glu Glu Ile Pro Met 485 490 495 Glu Pro Gly Asp Ile Ile Gly Val Ala Gly Asn His Trp Asp Gly Tyr 500 505 510 Ser Lys Gly Ile Asn Arg Lys Leu Gly Lys Thr Gly Leu Tyr Pro Ser 515 520 525 Tyr Lys Val Arg Glu Lys Ile Glu Thr Val Lys Tyr Pro Thr Tyr Pro 530 535 540 Glu Ala Glu Lys 545 <210> 13 <211> 1119 <212> DNA <213> Mouse <400> 13 atggcccacg cccccgcctc ctgcccctcc tccaggaact ccggcgacgg cgacaagggc 60 aagcccagga aggtggccct gatcaccggc atcaccggcc aggacggctc ctacctggcc 120 gagttcctgc tggagaaggg ctacgaggtg cacggcatcg tgaggaggtc ctcctccttc 180 aacaccggca ggatcgagca cctgtacaag aacccccagg cccacatcga gggcaacatg 240 aagctgcact acggcgacct gaccgactcc acctgcctgg tgaagatcat caacgaggtg 300 aagcccaccg agatctacaa cctgggcgcc cagtcccacg tgaagatctc cttcgacctg 360 gccgagtaca ccgccgacgt ggacggcgtg ggcaccctga ggctgctgga cgccatcaag 420 acctgcggcc tgatcaactc cgtgaagttc taccaggcct ccacctccga gctgtacggc 480 aaggtgcagg agatccccca gaaggagacc acccccttct accccaggtc cccctacggc 540 gccgccaagc tgtacgccta ctggatcgtg gtgaacttca gggaggccta caacctgttc 600 gccgtgaacg gcatcctgtt caaccacgag tcccccagga ggggcgccaa cttcgtgacc 660 aggaagatct ccaggtccgt ggccaagatc tacctgggcc agctggagtg cttctccctg 720 ggcaacctgg acgccaagag ggactggggc cacgccaagg actacgtgga ggccatgtgg 780 ctgatgctgc agaacgacga gcccgaggac ttcgtgatcg ccaccggcga ggtgcactcc 840 gtgagggagt tcgtggagaa gtccttcatg cacatcggca agaccatcgt gtgggagggc 900 aagaacgaga acgaggtggg caggtgcaag gagaccggca agatccacgt gaccgtggac 960 ctgaagtact acaggcccac cgaggtggac ttcctgcagg gcgactgctc caaggcccag 1020 cagaagctga actggaagcc cagggtggcc ttcgacgagc tggtgaggga gatggtgcag 1080 gccgacgtgg agctgatgag gaccaacccc aacgcctga 1119 <210> 14 <211> 372 <212> PRT <213> Mouse <400> 14 Met Ala His Ala Pro Ala Ser Cys Pro Ser Ser Arg Asn Ser Gly Asp 1 5 10 15 Gly Asp Lys Gly Lys Pro Arg Lys Val Ala Leu Ile Thr Gly Ile Thr 20 25 30 Gly Gln Asp Gly Ser Tyr Leu Ala Glu Phe Leu Leu Glu Lys Gly Tyr 35 40 45 Glu Val His Gly Ile Val Arg Arg Ser Ser Ser Phe Asn Thr Gly Arg 50 55 60 Ile Glu His Leu Tyr Lys Asn Pro Gln Ala His Ile Glu Gly Asn Met 65 70 75 80 Lys Leu His Tyr Gly Asp Leu Thr Asp Ser Thr Cys Leu Val Lys Ile 85 90 95 Ile Asn Glu Val Lys Pro Thr Glu Ile Tyr Asn Leu Gly Ala Gln Ser 100 105 110 His Val Lys Ile Ser Phe Asp Leu Ala Glu Tyr Thr Ala Asp Val Asp 115 120 125 Gly Val Gly Thr Leu Arg Leu Leu Asp Ala Ile Lys Thr Cys Gly Leu 130 135 140 Ile Asn Ser Val Lys Phe Tyr Gln Ala Ser Thr Ser Glu Leu Tyr Gly 145 150 155 160 Lys Val Gln Glu Ile Pro Gln Lys Glu Thr Thr Pro Phe Tyr Pro Arg 165 170 175 Ser Pro Tyr Gly Ala Ala Lys Leu Tyr Ala Tyr Trp Ile Val Val Asn 180 185 190 Phe Arg Glu Ala Tyr Asn Leu Phe Ala Val Asn Gly Ile Leu Phe Asn 195 200 205 His Glu Ser Pro Arg Arg Gly Ala Asn Phe Val Thr Arg Lys Ile Ser 210 215 220 Arg Ser Val Ala Lys Ile Tyr Leu Gly Gln Leu Glu Cys Phe Ser Leu 225 230 235 240 Gly Asn Leu Asp Ala Lys Arg Asp Trp Gly His Ala Lys Asp Tyr Val 245 250 255 Glu Ala Met Trp Leu Met Leu Gln Asn Asp Glu Pro Glu Asp Phe Val 260 265 270 Ile Ala Thr Gly Glu Val His Ser Val Arg Glu Phe Val Glu Lys Ser 275 280 285 Phe Met His Ile Gly Lys Thr Ile Val Trp Glu Gly Lys Asn Glu Asn 290 295 300 Glu Val Gly Arg Cys Lys Glu Thr Gly Lys Ile His Val Thr Val Asp 305 310 315 320 Leu Lys Tyr Tyr Arg Pro Thr Glu Val Asp Phe Leu Gln Gly Asp Cys 325 330 335 Ser Lys Ala Gln Gln Lys Leu Asn Trp Lys Pro Arg Val Ala Phe Asp 340 345 350 Glu Leu Val Arg Glu Met Val Gln Ala Asp Val Glu Leu Met Arg Thr 355 360 365 Asn Pro Asn Ala 370 <210> 15 <211> 1119 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleic acid sequence of GMD4M modified enzyme, where positions 463-465, 469-471, 535-537, and 547-549 in wild-type GMD gene have been changed <400> 15 atggcccacg cccccgcctc ctgcccctcc tccaggaact ccggcgacgg cgacaagggc 60 aagcccagga aggtggccct gatcaccggc atcaccggcc aggacggctc ctacctggcc 120 gagttcctgc tggagaaggg ctacgaggtg cacggcatcg tgaggaggtc ctcctccttc 180 aacaccggca ggatcgagca cctgtacaag aacccccagg cccacatcga gggcaacatg 240 aagctgcact acggcgacct gaccgactcc acctgcctgg tgaagatcat caacgaggtg 300 aagcccaccg agatctacaa cctgggcgcc cagtcccacg tgaagatctc cttcgacctg 360 gccgagtaca ccgccgacgt ggacggcgtg ggcaccctga ggctgctgga cgccatcaag 420 acctgcggcc tgatcaactc cgtgaagttc taccaggcct ccgcctccgc cctgtacggc 480 aaggtgcagg agatccccca gaaggagacc acccccttct accccaggtc ccccgccggc 540 gccgccgccc tgtacgccta ctggatcgtg gtgaacttca gggaggccta caacctgttc 600 gccgtgaacg gcatcctgtt caaccacgag tcccccagga ggggcgccaa cttcgtgacc 660 aggaagatct ccaggtccgt ggccaagatc tacctgggcc agctggagtg cttctccctg 720 ggcaacctgg acgccaagag ggactggggc cacgccaagg actacgtgga ggccatgtgg 780 ctgatgctgc agaacgacga gcccgaggac ttcgtgatcg ccaccggcga ggtgcactcc 840 gtgagggagt tcgtggagaa gtccttcatg cacatcggca agaccatcgt gtgggagggc 900 aagaacgaga acgaggtggg caggtgcaag gagaccggca agatccacgt gaccgtggac 960 ctgaagtact acaggcccac cgaggtggac ttcctgcagg gcgactgctc caaggcccag 1020 cagaagctga actggaagcc cagggtggcc ttcgacgagc tggtgaggga gatggtgcag 1080 gccgacgtgg agctgatgag gaccaacccc aacgcctga 1119 <210> 16 <211> 372 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of GMD4M modified enzyme, where at positions 155, 157, 179, and 183 in wild-type GMD protein have been changed <400> 16 Met Ala His Ala Pro Ala Ser Cys Pro Ser Ser Arg Asn Ser Gly Asp 1 5 10 15 Gly Asp Lys Gly Lys Pro Arg Lys Val Ala Leu Ile Thr Gly Ile Thr 20 25 30 Gly Gln Asp Gly Ser Tyr Leu Ala Glu Phe Leu Leu Glu Lys Gly Tyr 35 40 45 Glu Val His Gly Ile Val Arg Arg Ser Ser Ser Phe Asn Thr Gly Arg 50 55 60 Ile Glu His Leu Tyr Lys Asn Pro Gln Ala His Ile Glu Gly Asn Met 65 70 75 80 Lys Leu His Tyr Gly Asp Leu Thr Asp Ser Thr Cys Leu Val Lys Ile 85 90 95 Ile Asn Glu Val Lys Pro Thr Glu Ile Tyr Asn Leu Gly Ala Gln Ser 100 105 110 His Val Lys Ile Ser Phe Asp Leu Ala Glu Tyr Thr Ala Asp Val Asp 115 120 125 Gly Val Gly Thr Leu Arg Leu Leu Asp Ala Ile Lys Thr Cys Gly Leu 130 135 140 Ile Asn Ser Val Lys Phe Tyr Gln Ala Ser Ala Ser Ala Leu Tyr Gly 145 150 155 160 Lys Val Gln Glu Ile Pro Gln Lys Glu Thr Thr Pro Phe Tyr Pro Arg 165 170 175 Ser Pro Ala Gly Ala Ala Ala Leu Tyr Ala Tyr Trp Ile Val Val Asn 180 185 190 Phe Arg Glu Ala Tyr Asn Leu Phe Ala Val Asn Gly Ile Leu Phe Asn 195 200 205 His Glu Ser Pro Arg Arg Gly Ala Asn Phe Val Thr Arg Lys Ile Ser 210 215 220 Arg Ser Val Ala Lys Ile Tyr Leu Gly Gln Leu Glu Cys Phe Ser Leu 225 230 235 240 Gly Asn Leu Asp Ala Lys Arg Asp Trp Gly His Ala Lys Asp Tyr Val 245 250 255 Glu Ala Met Trp Leu Met Leu Gln Asn Asp Glu Pro Glu Asp Phe Val 260 265 270 Ile Ala Thr Gly Glu Val His Ser Val Arg Glu Phe Val Glu Lys Ser 275 280 285 Phe Met His Ile Gly Lys Thr Ile Val Trp Glu Gly Lys Asn Glu Asn 290 295 300 Glu Val Gly Arg Cys Lys Glu Thr Gly Lys Ile His Val Thr Val Asp 305 310 315 320 Leu Lys Tyr Tyr Arg Pro Thr Glu Val Asp Phe Leu Gln Gly Asp Cys 325 330 335 Ser Lys Ala Gln Gln Lys Leu Asn Trp Lys Pro Arg Val Ala Phe Asp 340 345 350 Glu Leu Val Arg Glu Met Val Gln Ala Asp Val Glu Leu Met Arg Thr 355 360 365 Asn Pro Asn Ala 370 <210> 17 <211> 63 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleic acid sequence deleted in F8D1 mutant gene <400> 17 cacgtgagga ggaccgacaa ggtgggcacc gaggccgcct tccaccccat cgaggagtac 60 atg 63

Claims (15)

  1. 푸코실화 경로의 변형된 효소를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 낮은 푸코실화를 갖는 재조합 세포.
  2. 제1항에 있어서, 변형된 효소가 GDP-만노스 4,6-데히드라타제 (GMD), GDP-4-케토-6-데옥시-D-만노스 에피머라제-리덕타제 (FX), 또는 푸코실트랜스퍼라제 (FUT)로부터 유래된 것인 재조합 세포.
  3. 제1항에 있어서, 변형된 효소가 푸코실트랜스퍼라제 (FUT)로부터 유래된 것인 재조합 세포.
  4. 제1항에 있어서, 변형된 효소가 α-1,6-푸코실트랜스퍼라제 (FUT8)로부터 유래된 것인 재조합 세포.
  5. 제1항에 있어서, 핵산 서열이 서열식별번호: 3, 5, 7, 9, 11, 15, 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 재조합 세포.
  6. 제1항에 있어서, 변형된 효소가 서열식별번호: 4, 6, 8, 10, 12, 16, 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 것인 재조합 세포.
  7. 제1항에 있어서, 변형된 효소가 숙주 세포에서, 변형된 효소가 유래된 야생형 효소의 활성을 감소시키거나 또는 억제하는 것인 재조합 세포.
  8. 제1항에 있어서, 변형된 효소가 숙주 세포에서 푸코실화를 억제하거나 또는 감소시키는 것인 재조합 세포.
  9. 제1항에 있어서, 세포에서 생산된 단백질의 10% 미만이 푸코실화된 것인 재조합 세포.
  10. 제1항에 있어서, 항체를 코딩하는 핵산을 추가로 포함하는 재조합 세포.
  11. 제10항에 있어서, 항체가 비푸코실화된 항체로서 세포에서 발현되는 것인 재조합 세포.
  12. 제11항의 재조합 세포에서 생산된 비푸코실화된 항체.
  13. 제12항에 있어서, 적어도 90% 비푸코실화된 것인 비푸코실화된 항체.
  14. 제12항에 있어서, 그의 푸코실화된 대응부와 비교하여 증가된 항체-의존적 세포성 세포독성 (ADCC) 활성을 갖는 비푸코실화된 항체.
  15. 제12항에 있어서, 비푸코실화된 항체의 보체 의존적 세포독성 (CDC) 활성이 그의 푸코실화된 대응부와 비교하여 감소 또는 저해되지 않는 것인 비푸코실화된 항체.
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