JP7216806B2 - アフコシル化抗体およびその製造法 - Google Patents
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Description
本開示は、活性および治療特性が改善されたアフコシル化免疫機能分子(afucosylated immunologically functional molecule)を含むアフコシル化タンパク質、ならびにアフコシル化タンパク質を作製する方法に関する。
糖タンパク質は、触媒作用、シグナリング、細胞間コミュニケーション、ならびに分子認識および分子集合を含むヒトにおける多くの必須機能を媒介する。治療目的で多数の糖タンパク質が開発されており、かつここ20年で、天然に存在する分泌糖タンパク質の組み換え体(recombinant version)がバイオテクノロジー産業の主要製品となっている。例としては、エリトロポエチン(EPO)、治療用モノクローン抗体(治療用mAb)、組織プラスミノーゲン活性化因子(tPA)、インターフェロン-β(IFN-β)、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子(GM-CSF)、およびヒト絨毛性ゴナドトロピン(hCG)が含まれる。
本開示は、活性が改善されたアフコシル化抗体を製造する新規な方法に関する。本開示はまた、開示された方法により製造されるアフコシル化抗体、およびアフコシル化抗体を製造するのに用いる細胞に関する。開示されるアフコシル化抗体は、天然に存在するフコシル化抗体に比して、抗体依存性細胞傷害(ADCC)活性が高められている。
本開示の1態様は、細胞におけるフコシル化を阻害または低減する方法に関する。
酵母、昆虫、両生類、魚類、爬虫類、鳥類、哺乳類、もしくはヒト、またはハイブリドーマ細胞由来の宿主細胞を含む任意の適した宿主細胞を、アフコシル化抗体を製造するのに用いることができる。宿主細胞は、未改変細胞もしくは細胞株、または遺伝子改変された(例えば、生物学的産物の産生を促進するため)細胞株であってよい。いくつかの実施形態において、宿主細胞は、無血清培地のような所望の条件下、細胞懸濁培養または付着性細胞培養における増殖が可能となるように改変された細胞株である。
本開示のアフコシル化抗体は、タンパク質のフコシル化を低減または阻害するようにフコシル化経路を変えた宿主細胞内で産生され得る。
本明細書で用いられる「改変酵素」という語句は、改変後にタンパク質の天然の酵素活性を改変または破壊するように変化させたフコシル化経路に天然に存在する、または野生型酵素由来のタンパク質を指す。改変酵素は、その野生型対応物を阻害または干渉して、宿主細胞における野生型酵素の活性を変える、抑制する、または低減する能力を有する。
本開示のアフコシル化抗体は、タンパク質のフコシル化を低減または阻害するようにフコシル化経路を変えた宿主細胞内で産生され得る。
本開示の別の態様は、フコシル化経路における改変酵素を発現する宿主細胞に関する。宿主細胞内における改変酵素の発現は野生型酵素の活性を妨害し、その結果としてフコシル化経路が阻害または低減される。よって、改変酵素を発現する宿主細胞内で産生されるタンパク質(例えば抗体)はアフコシル化される。
本開示の別の態様は、アフコシル化タンパク質を製造する方法に関する。いくつかの実施形態において、アフコシル化タンパク質はアフコシル化抗体である。
アフコシル化タンパク質として製造され得るタンパク質の非限定的な例には、GP-73、ヘモペキシン、HBsAg、B型肝炎ウイルス粒子、アルファ-酸-糖タンパク質、アルファ-1-抗キモトリプシン、アルファ-1-抗キモトリプシンHis-Pro-less、アルファ-1-アンチトリプシン、セロトランスフェリン、セルロプラスミン、アルファ-2-マクログロブリン、アルファ-2-HS-糖タンパク質、アルファ-フェトプロテイン、ハプトグロビン、フィブリノゲンガンマ鎖前駆体、免疫グロブリン(IgG、IgA、IgM、IgD、IgE、および類似のものを含む)、APO-D、キニノゲン、ヒスチジンリッチ糖タンパク質、補体因子1前駆体、補体因子I重鎖、補体因子I軽鎖、補体C1s、補体因子B前駆体、補体因子B Baフラグメント、補体因子B Bbフラグメント、補体C3前駆体、補体C3ベータ鎖、補体C3アルファ鎖、C3aアナフィラトキシン、補体C3bアルファ’鎖、補体C3cフラグメント、補体C3dgフラグメント、補体C3gフラグメント、補体C3dフラグメント、補体C3fフラグメント、補体C5、補体C5ベータ鎖、補体C5アルファ鎖、C5aアナフィラトキシン、補体C5アルファ’鎖、補体C7、アルファ-1 B糖タンパク質、B-2-糖タンパク質、ビタミンD結合タンパク質、インターアルファトリプシンインヒビター重鎖H2、アルファ-1B-糖タンパク質、アンジオテンシノーゲン前駆体、アンジオテンシン-1、アンジオテンシン-2、アンジオテンシン-3、GARPタンパク質、ベータ-2-糖タンパク質、クラステリン(Apo J)、インテグリンアルファ-8前駆体糖タンパク質、インテグリンアルファ-8重鎖、インテグリンアルファ-8軽鎖、C型肝炎ウイルス粒子、elf-5、キニノゲンHSP33-ホモログ、リシルエンドペプチダーゼならびにロイシンリッチリピート含有タンパク質32前駆体が含まれる。
本明細書で用いられる用語「抗体」は、フコシル化され得るインタクト抗体分子およびそのフラグメントを広く包含する。例えば、抗体には、完全集合(fully assembled)免疫グロブリン(例えば、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、単一特異性抗体、多特異性抗体、キメラ抗体、脱免疫化(deimmunized)抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、霊長類化抗体、単鎖抗体、単一ドメイン抗体、合成抗体、および組換抗体);所望の活性または機能を有するインタクト抗体の部分(例えば、Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv、scFv、単一ドメインフラグメントを含む抗体の免疫学的フラグメント);ならびにフコシル化され得るFcドメインを含むペプチドおよびタンパク質(例えばFc融合タンパク質)が含まれる。
本明細書に開示された方法を用い、任意の抗体をアフコシル化抗体として製造することができる。開示された方法を用いて製造され得る抗体のタイプに限定はない。以下は、製造され得る抗体の例示列挙(non-exhaustive list)である:
本開示のアフコシル化抗体を含むアフコシル化タンパク質は低フコシル化細胞内で産生される。当該分野において周知である技術を用い、例えばタンパク質をコードする発現ベクターを低フコシル化細胞にトランスフェクトすることで、アフコシル化タンパク質を低フコシル化細胞内で発現させることができる。
a)タンパク質を発現するのに適した宿主細胞を得る;
b)改変酵素をコードする核酸を宿主細胞にトランスフェクトする;
c)低フコシル化を有するトランスフェクト細胞を選別および/または単離する;
d)タンパク質をコードする核酸を低フコシル化細胞にトランスフェクトする;
e)タンパク質をコードする核酸をトランスフェクトした低フコシル化細胞を選別および/または単離する;
f)低フコシル化細胞内でのタンパク質の発現を誘発する。
a)タンパク質を発現するのに適した宿主細胞を得る;
b)タンパク質をコードする核酸を宿主細胞にトランスフェクトする;
c)タンパク質をコードする核酸をトランスフェクトした細胞を選別および/または単離する;
d)改変酵素をコードする核酸をステップ(c)における細胞にトランスフェクトする;
e)低フコシル化を有するステップ(d)におけるトランスフェクト細胞を選別および/または単離する;
f)低フコシル化細胞内でのタンパク質の発現を誘発する。
a)タンパク質を発現または過剰発現する宿主細胞を得る;
b)改変酵素をコードする核酸を宿主細胞にトランスフェクトする;
c)低フコシル化を有するトランスフェクト宿主細胞を選別および/または単離する;
d)低フコシル化細胞内でのタンパク質の発現を誘発する
ことにより製造する。
a)タンパク質を発現するのに適した宿主細胞を得る;
b)宿主細胞に、タンパク質をコードする第1の核酸および改変酵素をコードする第2の核酸をトランスフェクトする;
c)タンパク質を発現し、かつ低フコシル化を有するトランスフェクト宿主細胞を選別および/または単離する;
d)低フコシル化細胞内でのタンパク質の発現を誘発する。
本開示の方法により製造されるアフコシル化抗体は、標準的な方法を用いて製造された抗体に比べ、特性が改善されている。
本開示のアフコシル化抗体は、標準的な方法を用いて製造された抗体に比べ、ADCC活性が向上している。
本開示のアフコシル化抗体は、標準的な方法を用いて製造された抗体に比べ、補体依存性細胞傷害(CDC)活性が向上している。
本開示のアフコシル化抗体は、静脈内(i.v.)、皮下(s.c.)、筋肉内(i.m.)、皮内(i.d.)、腹腔内(i.p.)、または任意の粘膜表面経由、例えば経口(p.o.)、舌下(s.l.)、口腔、経鼻的、直腸性、経膣的、または経肺経路(via pulmonary route)投与することができる。
本発明の特定の実施形態には、限定はされないが、下記のものが含まれる:
(1)フコシル化経路の改変酵素をコードする核酸配列を含む、低フコシル化を有する組換え細胞。
(2)改変酵素が、GDP-マンノース4,6-デヒドラターゼ(GMD)、GDP-4-ケト-6-デオキシ-D-マンノースエピメラーゼ-還元酵素(FX)、またはフコシルトランスフェラーゼ(FUT)由来である、(1)に記載の組換え細胞。
(3)改変酵素がフコシルトランスフェラーゼ(FUT)由来である、(1)に記載の組換え細胞。
(4)改変酵素がα-1,6-フコシルトランスフェラーゼ(FUT8)由来である、(1)に記載の組換え細胞。
(5)核酸配列が、SEQ ID NO:3、5、7、9、11、15および任意のそれらの組み合わせからなる群より選ばれる、(1)に記載の組換え細胞。
(6)改変酵素が、SEQ ID NO:4、6、8、10、12、16および任意のそれらの組み合わせからなる群より選ばれるアミノ酸配列を有する、(1)に記載の組換え細胞。
(7)改変酵素が、宿主細胞において、改変酵素の由来元である野生型酵素の活性を低減または阻害する、(1)に記載の組換え細胞。
(8)改変酵素が、宿主細胞においてフコシル化を阻害または低減する、(1)に記載の組換え細胞。
(9)細胞内で産生されたタンパク質の10%未満がフコシル化されている、(1)に記載の組換え細胞。
(10)抗体をコードする核酸をさらに含む、(1)に記載の組換え細胞。
(11)抗体が細胞内でアフコシル化抗体として発現される、(10)に記載の組換え細胞。
(12)(11)の組換え細胞内で産生されたアフコシル化抗体。
(13)少なくとも90%アフコシル化されている、(12)に記載のアフコシル化抗体。
(14)そのフコシル化対応物と比較して、アフコシル化抗体は抗体依存性細胞傷害(ADCC)活性が高められている、(12)に記載のアフコシル化抗体。
(15)そのフコシル化対応物と比較して、アフコシル化抗体の補体依存性細胞傷害(CDC)活性が低減または抑制されていない、(12)に記載のアフコシル化抗体。
本発明のさらなる実施形態には、限定はされないが、下記のものが含まれる:
(1)少なくとも1つの改変酵素をコードする核酸を宿主細胞に導入して宿主細胞内でアフコシル化抗体を産生させるステップを含む、アフコシル化抗体を製造するための方法。
(2)改変酵素が、GDP-マンノース4,6-デヒドラターゼ(GMD)、GDP-4-ケト-6-デオキシ-D-マンノースエピメラーゼ-還元酵素(FX)、またはフコシルトランスフェラーゼ(FUT)由来である、(1)に記載の方法。
(3)改変酵素がフコシルトランスフェラーゼ(FUT)由来である、(1)に記載の方法。
(4)改変酵素がα-1,6-フコシルトランスフェラーゼ(FUT8)由来である、(1)に記載の方法。
(5)改変酵素が宿主細胞における野生型フコシル化酵素の活性を阻害する、(1)に記載の方法。
(6)改変酵素が宿主細胞における抗体のフコシル化を阻害および/または低減する、(1)に記載の方法。
(7)アフコシル化抗体のADCCが高められている、(1)に記載の方法。
(8)アフコシル化抗体のCDC活性が低減または抑制されていない、(1)に記載の方法。
(9)
(a)宿主細胞を準備するステップ、
(b)少なくとも1つの改変酵素をコードする核酸を宿主細胞に導入するステップ、および
(c)宿主細胞内でアフコシル化抗体を産生させるステップ
を含む、アフコシル化抗体を製造するための方法。
(10)ステップ(a)において、宿主細胞は、抗体をコードする少なくとも1つの核酸を含む、(9)に記載の方法。
(11)ステップ(b)の後に、抗体をコードする核酸を宿主細胞にさらに導入する(9)に記載の方法。
(12)改変酵素が、GDP-マンノース4,6-デヒドラターゼ(GMD)、GDP-4-ケト-6-デオキシ-D-マンノースエピメラーゼ-還元酵素(FX)、および/またはフコシルトランスフェラーゼ(FUT)由来である、(9)に記載の方法。
(13)改変酵素がフコシルトランスフェラーゼ(FUT)由来である、(9)に記載の方法。
(14)改変酵素がα-1,6-フコシルトランスフェラーゼ(FUT8)由来である、(9)に記載の方法。
(15)改変酵素が、宿主細胞におけるフコシル化酵素の活性を阻害する、(9)に記載の方法。
(16)改変酵素が、宿主細胞における抗体の糖化を阻害および低減する、(9)に記載の方法。
(17)アフコシル化抗体のADCCが高められている、(9)に記載の方法。
(18)アフコシル化抗体のCDC活性が低減または抑制されていない、(9)に記載の方法。
(19)(1)または(9)に記載の方法で製造されたアフコシル化抗体であって、ADCCが高められている、アフコシル化抗体。
(20)アフコシル化抗体がヒト抗体またはそのフラグメントである、(19)に記載の抗体。
(21)アフコシル化抗体が元のCDC活性を維持する、(19)に記載の抗体。
(22)(19)に記載のアフコシル化抗体と、医薬的に許容される担体または賦形剤とを含む、医薬組成物。
(23)少なくとも1つの改変酵素をコードする核酸を含む低フコシル化を有するか、または有さない、細胞。
(24)アフコシル化抗体であって:
(a)フコシル化経路の少なくとも1つの改変酵素をコードする核酸を、フコースを有する抗体を発現する宿主細胞に導入すること、および
(b)宿主細胞を培養して、宿主細胞内でアフコシル化抗体を産生させること
により製造された、アフコシル化抗体。
(25)改変酵素が、GDP-マンノース4,6-デヒドラターゼ(GMD)、GDP-4-ケト-6-デオキシ-D-マンノースエピメラーゼ-還元酵素(FX)、またはフコシルトランスフェラーゼ(FUT)由来である、(24)に記載のアフコシル化抗体。
(26)改変酵素がフコシルトランスフェラーゼ由来である、(25)に記載のアフコシル化抗体。
(27)改変酵素がα-1,6-フコシルトランスフェラーゼ由来である、(26)に記載の記載のアフコシル化抗体。
(28)改変酵素が、宿主細胞における野生型フコシル化酵素の活性を阻害する、(24)に記載の記載のアフコシル化抗体。
(29)改変酵素が、宿主細胞における抗体のグリコシル化を阻害および低減する、(24)に記載のアフコシル化抗体。
(30)アフコシル化抗体の抗体依存性細胞傷害(ADCC)活性が高められている、(24)に記載の記載のアフコシル化抗体。
(31)アフコシル化抗体の補体依存性細胞傷害(CDC)活性が低減および抑制されていない、(24)に記載の記載のアフコシル化抗体。
(32)アフコシル化抗体が抗CD20抗体または抗ErbB2抗体である(24)に記載の記載のアフコシル化抗体。
(33)
(a)宿主細胞を準備すること、
(b)フコシル化経路の少なくとも1つの改変酵素をコードする核酸を宿主細胞に導入すること、
(c)フコースを有する抗体をコードする核酸を導入すること、および
(d)宿主細胞内でアフコシル化抗体を産生させること、
により製造されるアフコシル化抗体。
(34)改変酵素が、GDP-マンノース4,6-デヒドラターゼ(GMD)、GDP-4-ケト-6-デオキシ-D-マンノースエピメラーゼ-還元酵素(FX)、および/またはフコシルトランスフェラーゼ(FUT)由来である、(33)に記載のアフコシル化抗体。
(35)改変酵素がα-1,6-フコシルトランスフェラーゼ由来である、(33)に記載のアフコシル化抗体。
(36)抗体の抗体依存性細胞傷害(ADCC)が高められている、(33)に記載のアフコシル化抗体。
(37)アフコシル化抗体の補体依存性細胞傷害(CDC)活性が低減および抑制されていない、(33)に記載のアフコシル化抗体。
(38)アフコシル化抗体が抗CD20抗体または抗ErbB2抗体である、(33)に記載のアフコシル化抗体。
(39)(19)、(24)、または(33)に記載のアフコシル化抗体と、医薬的に許容される担体または賦形剤とを含む、医薬組成物。
フコシル化経路における改変酵素および改変酵素を発現する安定細胞株の作製
1.細胞株
ジヒドロ葉酸還元酵素活性が欠乏したCHO細胞変異体である市販のCHOdhfr(-)細胞株(ATCC CRL-9096)をCulture Collection and Research Center(CCRC,台湾)より購入した。そのCHOdhfr(-)細胞株を3つの別々の培養物に分け、次のように処理した。
改変酵素FUT8およびGMDをコードするいくつかの発現ベクターを構築した。
pHD/F83M、pHD/F8M1、pHD/F8M2、pHD/F8M3、pHD/F8D1、およびpHD/GMD4Mプラスミドを、(a)RC79細胞株(RITUXAN(登録商標)を発現するCHO細胞)、(b)HC59細胞株(HERCEPTIN(登録商標)を発現するCHO細胞)、および(c)CHOdhfr(-)細胞(ジヒドロ葉酸還元酵素活性が欠乏したCHO細胞変異体)を含む異なる細胞株に、エレクトロポレーション(PA4000 PULSEAGILE(登録商標)エレクトロポレーター, Cyto Pulse Sciences)によりトランスフェクトした。
先ず、0.1~0.25mg/mLのハイグロマイシンを加えたRC79培地(0.4μMのMTX、0.5mg/mLのGeneticin、0.05mg/mLのZeocin、4mMのGlutamax-I、および0.01% F-68を含有するEX-CELL(登録商標)302無血清培地)でトランスフェクトRC79細胞株を培養した。次いで、0.4μMのMTX、0.5mg/mLのGeneticin、0.05mg/mLのZeocine、4mMのGlutamax-I、0.01% F-68、および0.25mg/mLのハイグロマイシンを含有するEX-CELL(登録商標)302無血清培地中でトランスフェクト細胞を培養し、下記のようにレンズ豆レクチン(LCA)で分離して、RC79F83M、RC79F8M1、RC79F8M2、RC79F8M3、RC79F8D1、およびRC79-GMD4M細胞株を含む5つの細胞プールを生成した。
先ず、0.1~0.25mg/mLのハイグロマイシンを加えたHC59培地(0.8μMのMTX、0.5mg/mLのGeneticin、0.05mg/mLのZeocine、および4mMのGlutamax-Iを含有するEX-CELL(登録商標)325PF CHO培地)中で、トランスフェクトHC59細胞株を培養した。次いで、トランスフェクト細胞を、0.8μMのMTX、0.5mg/mLのGeneticin、0.05mg/mLのZeocine、4mMのGlutamax-I、および0.25mg/mLのハイグロマイシンを含有するEX-CELL(登録商標)325 PF CHO培地中で培養し、下記のようにLCAで分離して、HC59F83M細胞株の細胞プールを生成した。
先ず、トランスフェクトCHOdhfr(-)細胞株を、4mMのGlutamax-I、および0.1~0.25mg/mLのハイグロマイシンを含有するEX-CELL(登録商標)325 PF CHO培地中で培養した。次いで、トランスフェクト細胞を、4mMのGlutamax-I、0.25mg/mLのハイグロマイシン、および0.01μMのMTXを含有するEX-CELL(登録商標)325 PF CHO培地で培養し、C109F83M細胞株の細胞プールを生成した。
本実施例では、ローダミン標識レンズ豆レクチン(LCA)(Vector Laboratories, Cat. RL-1042)を用い、低フコシル化を有する細胞を選別した。
LCAにより低フコシル化CHOdhfr(-)細胞(C109F83M細胞)を単離した後、RITUXAN(登録商標)をコードする核酸をエレクトロポレーション(PA4000 PULSEAGILE(登録商標)エレクトロポレーター, Cyto Pulse Sciences)により細胞にトランスフェクトした。C109F83Mの低フコース単一クローン、AF97を単離し、RITUXAN(登録商標)をコードする核酸をエレクトロポレーションによりトランスフェクトして、RITUXAN(登録商標)を発現させるようにした。トランスフェクタントを、非選択培地の入った25Tフラスコに移し、回復・成長させた。48時間後、4mMのGlutaMAX-I、ハイグロマイシン-B、Zeocinおよび0.01μMのMTXを含有する選択培地でトランスフェクタントを培養した。CLONEPIX(商標)2システムを用いて単一の細胞を選び取り、AF97抗CD20クローンを生成した。
アフコシル化抗体の発現および分析
1.抗体の発現および精製
実施例1で得られた低フコシル化活性を有する細胞を、抗体を発現させるためにバッチまたは流加培養した。細胞から精製した抗体に単糖分析を行って、Fc領域における糖鎖を定量分析した。
ACQUITY UPLC(登録商標)システムによりN-グリカンプロファイルを分析した。先ず、0.3mgの抗体サンプルを、3U PNGase-Fが入った0.3mLの消化緩衝液(15mM Tris-HCl、pH7.0)で37℃18時間消化した。放出されたN-グリカンを、AMICON(登録商標)Ultra-0.5mL 30Kデバイスを用い13000rpmで5分限外濾過することにより抗体から分離した後、3時間凍結乾燥した。次いで、乾燥したN-グリカンを30μLのddH2Oおよび45μLの2-AB標識試薬(0.34Mのアントラニルアミドおよび1Mのシアノ水素化ホウ素ナトリウムの入ったDMSO-酢酸(7:3v/v)溶媒)中に溶解し、65℃で3時間インキュベートした。過剰量の2-AB標識試薬をPD MINITRAP(商標)G10サイズ排除カラムで除去した。標識されたN-グリカンを一晩凍結乾燥し、50μLのddH2O中に再溶解してUPLC検出に供した。ACQUITY UPLC(登録商標)システムによりグリカンBEH Amideカラムを用い60℃でN-グリカンプロファイルを得た。100mMのぎ酸アンモニウム、pH4.5/アセトニトリル直線勾配を用い、異なる形態のN-グリカンを分離した。
RC79細胞、およびFUT8改変酵素(つまり、F8M1、F8M2、F8M3、またはF8D1)を発現する組換え細胞のペレットを、ホスファターゼ阻害剤カクテル(Sigma-Aldrich, Cat.S8820)を含有する1% Triton X-100中に溶解させた。溶解した細胞の上清におけるタンパク質濃度をDC(商標)(洗浄剤互換)タンパク質アッセイ(BIO-RAD)により測定した。各サンプルにつき30μgのタンパク質を含む上清を、12.5%ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS-PAGE)を用いて分離し、ニトロセルロース膜に転写した。その膜を、120mMのNaCl、0.1%ゼラチン(w/w)および0.1%TWEEN(登録商標)20(ポリエチレングリコールソルビタンモノラウレート)(v/w)を含有する25mMのTris-HCl(pH7.4)を用いて室温で1時間ブロックし、抗FUT8抗体(Abcam, Cat.ab204124, 1:500)およびGAPDH抗体(GeneTex, Cat.GT239, 1:10000)と共にそれぞれ一晩4℃でインキュベートした。その膜を、120mMのNaCl、0.1%ゼラチン(w/w)および0.1%TWEEN(登録商標)20(v/w)を含有する25mMのTris-HCl(pH7.4)で5分、3回洗浄してから、ヤギ抗ウサギIgG(Jackson ImmunoResearch, Cat.111-035-144)およびヤギ抗マウスIgG HRP(GeneTex, Cat.GTX213111-01, 1:10000)と共にそれぞれ室温で1時間インキュベートした。さらなる洗浄の後、メタルエンハンサー (Sigma, Cat.D0426)を備えるSIGMAFAST DABでその膜を分析した。
F83M改変酵素を発現するRC79組換え細胞の安定性を評価した。
アフコシル化抗体のADCC活性
実施例2で得られた精製抗CD20抗体のin vitro細胞傷害活性を評価するため、以下の方法にしたがってADCC活性を測定した。
健康なドナー(100mL)由来のヒト末梢血を、ヘパリンナトリウムを含むVACUTAINER(登録商標)チューブに加えた。全血サンプルをRPMI 1640無血清(SF)培地で1:1に希釈し、穏やかに混合した。Ficoll-Paque PLUSを用い、24mLの希釈した血液をFicoll-Paque上にスムーズに加えると共に、400×g、32分、25℃で遠心分離することにより、単核細胞を分離した。20mLのRPMI 1640培地を含む2つの50mL遠心管中にバフィーコートを適度に分配してから、2回混合を行った。次いで、その混合物を1,200rpm、12分、25℃で遠心分離して上清を得た。RPMI 1640 SF培地(13mL)をその上清に加え、PBMC細胞を再懸濁させた。その細胞を1,200rpm、12分、25℃で遠心分離して上清を得た。RPMI培地(10mL)をその上清に加え、PBMC細胞を再懸濁させた。十分な体積のPBMC細胞懸濁液を75Tフラスコに加え、フラスコごとに、約15mLで、最終細胞濃度1.5×106細胞/mLとした。IL-2(2.5μg/mL)を最終濃度3ng/mLで全てのフラスコに加えた。37℃、5% CO2のインキュベーター中で18時間PBMC細胞をインキュベートした。IL-2で刺激されたPBMC細胞を収集し、1,200rpm、5分、25℃で遠心分離してから、その上清を捨てた。PBS(10mL)を加えて細胞と混合した。その細胞を1,200rpm、5分、25℃で遠心分離し、上清を除去した。その細胞をRPMI AMで再懸濁させ、最終濃度を2×107細胞/mLに調節した。
75Tフラスコからの細胞懸濁液を1,000rpmで5分遠心分離して上清を除去してから、10mLの1×PBSで洗浄した。洗浄した細胞を1,200rpmで5分遠心分離して上清を除去した。その細胞をRPMIアッセイ培地で再懸濁させ、5×105細胞/mLの標的細胞溶液を調製した。その標的細胞溶液(40μL、5×105細胞/mL)をV底96ウェル細胞培養プレートのウェルに加えた。次いで、20μLの調製された市販のRITUXAN(登録商標)溶液(MABTHERA(登録商標))(25~0.0025μg/mL)(陽性対照)、アフコシル化抗体(R1クローン)溶液(25~0.0025μg/mL)、またはRPMIアッセイ培地(陰性対照)をウェルに加え、標的細胞溶液とそれぞれ混合した。V底96ウェル細胞培養プレートを37℃、5% CO2のインキュベーター中で30分~60分インキュベートした。
エフェクター細胞溶液(40μLの8×105エフェクター細胞/well)または40μLのRPMIアッセイ培地をプレートに加え、標的細胞溶液と混合した。プレートを300×gで4分遠心分離した。プレートを37℃、5% CO2で4時間インキュベートした。CYTOTOX 96(登録商標)の溶解液(10μL)をTmaxおよびBlkV群のプレートに加え、上清を回収する前に1時間置いた。V底96ウェル細胞培養プレートを300×gで4分遠心分離し、その上清50μLを96ウェル細胞培養プレートから平底アッセイプレートのウェルに移した。
アフコシル化抗体の結合親和性
Hisタグ化FcγRIIIa組換えタンパク質に対するアフコシル化およびフコシル化抗CD20抗体の結合親和性を、BIACORE(登録商標)X100コントロールソフトウェアの固定化ウィザード(immobilization wizard)およびアミンカップリングキットにより、BIACORE(登録商標)CM5チップに結合した抗ヒスチジン(抗His)抗体を用いて評価した。
アフコシル化抗体のCDC活性
開示された方法により製造されたアフコシル化抗体のCDC活性を評価した。
動物モデルにおけるアフコシル化抗体の有効性の証明
この実施例では、B細胞リンパ腫皮下異種移植(lymphoma subcutaneous xenograft)モデルを用い、本開示のアフコシル化抗体の抗腫瘍効率を証明した。SU-DHL-4は、細胞膜上に高レベルのCD20を発現するB細胞リンパ腫細胞株であり、かつ皮下で増殖して固形腫瘍を形成し得るものである。よって、SCID/Beigeマウスにおける異種移植モデルを開発し、アフコシル化抗体(R1クローン)および市販のRITUXAN(登録商標)(MABTHERA(登録商標))の抗腫瘍効率を比較した。
1SEQ ID NO:1の野生型FUT8DNA配列に基づくDNA配列位置
2SEQ ID NO:2の野生型FUT8タンパク質配列に基づくアミノ酸の位置
3N/A=該当なし
w/o Fuc.:(総グリカン量-フコースの量)/総グリカン量×100%
Claims (13)
- フコシル化経路の改変酵素をコードする核酸を含む、宿主細胞であって、
前記改変酵素が、GDP-マンノース4,6-デヒドラターゼ(GMD)またはα-1,6-フコシルトランスフェラーゼ(FUT8)に由来し、前記核酸が、SEQ ID NO:3、5、7、9、11、15および任意のそれらの組み合わせからなる群より選択され、前記改変酵素が、前記宿主細胞において、前記改変酵素の由来元である野生型酵素の活性を低減または阻害する、前記宿主細胞。 - 前記改変酵素が、SEQ ID NO:4、6、8、10、12、16および任意のそれらの組み合わせからなる群より選ばれるアミノ酸配列を有する、請求項1に記載の宿主細胞。
- 前記改変酵素が、前記宿主細胞においてフコシル化を阻害または低減する、請求項1に記載の宿主細胞。
- 前記細胞内で産生されたタンパク質の10%未満がフコシル化されている、請求項1に記載の宿主細胞。
- 抗体をコードする核酸をさらに含む、請求項1に記載の宿主細胞。
- 前記抗体が前記細胞内でアフコシル化抗体として発現される、請求項5に記載の宿主細胞。
- アフコシル化抗体を製造するための、請求項1に記載の宿主細胞の使用。
- 産生されるべきタンパク質をコードする核酸を宿主細胞にトランスフェクトするステップ
を含む、請求項1に記載の宿主細胞を使用するための方法。 - 前記産生されるべきタンパク質が、抗体である、請求項8に記載の方法。
- 前記抗体が、アフコシル化抗体である、請求項9に記載の方法。
- 前記アフコシル化抗体が、90%アフコシル化されている、請求項10に記載の方法。
- 前記アフコシル化抗体が、そのフコシル化対応物と比較して、抗体依存性細胞傷害(ADCC)活性が高められている、請求項10に記載の方法。
- 前記アフコシル化抗体の補体依存性細胞傷害(CDC)活性が、そのフコシル化対応物と比較して、低減または抑制されていない、請求項10に記載の方法。
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