BR112021003765A2 - célula recombinante tendo baixa fucosilação e anticorpo afucosilado - Google Patents

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Abstract

CÉLULA RECOMBINANTE TENDO BAIXA FUCOSILAÇÃO E ANTICORPO AFUCOSILADO. A presente divulgação é direcionada a métodos para a produção de um anticorpo afucosilado, os anticorpos afucosilados e composição dos mesmos, e células para a produção de anticorpos. O método compreende a introdução de um ácido nucleico que codifica pelo menos uma enzima modificada da via de fucosilação em uma célula hospedeira para produzir o anticorpo afucosilado na célula hospedeira. O método de divulgação pode produzir anticorpos afucosilados de maneira fácil, estável e econômica. Além disso, os anticorpos afucosilados produzidos pelos métodos divulgados aumentaram a atividade de ADCC e não suprimiriam sua CDC e segurança.

Description

CÉLULA RECOMBINANTE TENDO BAIXA FUCOSILAÇÃO E ANTICORPO AFUCOSILADO CAMPO DA INVENÇÃO
[001]A presente divulgação se refere a proteínas afucosiladas, incluindo uma molécula imunologicamente funcional afucosilada tendo atividade e propriedades terapêuticas melhoradas e métodos para preparar proteínas afucosiladas.
ANTECEDENTES DA INVENÇÃO
[002]As glicoproteínas medeiam muitas funções essenciais nos seres humanos, incluindo catálise, sinalização, comunicação célula-célula e reconhecimento e associação moleculares. Muitas glicoproteínas foram exploradas para fins terapêuticos e, durante as últimas duas décadas, versões recombinantes de glicoproteínas secretadas de ocorrência natural têm sido um produto importante da indústria de biotecnologia. Os exemplos incluem eritropoietina (EPO), anticorpos monoclonais terapêuticos (mAbs terapêuticos), ativador de plasminogênio tecidual (tPA), interferon-β, (IFN-β), fator estimulador de colônia de granulócitos e macrófagos (GM-CSF) e gonadotrofina coriônica humana (hCG).
[003]Cinco classes de anticorpos estão presentes em mamíferos, isto é, IgM, IgD, IgG, IgA e IgE. Os anticorpos da classe IgG de humano são usados principalmente no diagnóstico, na prevenção e no tratamento de várias doenças humanas por causa de sua longa meia-vida no sangue e características funcionais, tais como várias funções efetoras e semelhantes. O anticorpo da classe IgG de humano é ainda classificado nas seguintes 4 subclasses: IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4. Um grande número de estudos foi realizado para a atividade de citotoxicidade celular dependente de anticorpo (ADCC) e atividade de citotoxicidade dependente de complemento (CDC) como funções efetoras do anticorpo da classe IgG, e foi relatado que os anticorpos da subclasse IgG1 tiveram a maior atividade de ADCC e atividade de CDC entre os anticorpos da classe IgG de humano.
[004]A expressão da atividade de ADCC e da atividade de CDC dos anticorpos da subclasse IgG1 de humano requer a ligação da região Fc do anticorpo a um receptor de anticorpo presente na superfície de uma célula efetora, tal como uma célula assassina, uma célula assassina natural, um macrófago ativado ou semelhantes (doravante referido como “FcγR”) e vários componentes do complemento. Foi sugerido que vários resíduos de aminoácidos no segundo domínio da região de dobradiça do anticorpo e região C (doravante referida como “domínio Cγ2”) e uma cadeia de açúcar ligada ao domínio Cγ2 também são importantes para essa reação de ligação.
[005]Reduzir ou inibir a fucosilação de N-glicano de anticorpos, ou proteínas de fusão Fc, pode intensificar a atividade de ADCC. ADCC tipicamente envolve a ativação de células assassinas naturais (NK) e é dependente do reconhecimento de células revestidas de anticorpos por receptores Fc na superfície da célula NK. A ligação do domínio Fc aos receptores Fc nas células NK é afetada pelo estado de glicosilação do domínio Fc. Além disso, o tipo de N-glicano no domínio Fc também afeta a atividade de ADCC. Portanto, para uma composição de anticorpo, ou uma composição de proteína de fusão Fc, um aumento da quantidade relativa de afucosil N-glicanos pode intensificar a afinidade de ligação com um FcγRIII ou atividade de ADCC da composição.
[006]Vários fatores que podem influenciar a glicosilação, incluindo a espécie, o tecido e o tipo de célula, mostraram ser importantes na forma como ocorre a glicosilação. Além disso, o ambiente extracelular, por meio de condições alteradas de cultura, como a concentração sérica, pode ter efeito direto na glicosilação. Vários métodos têm sido propostos para alterar o padrão de glicosilação alcançado em um organismo hospedeiro particular, incluindo a introdução ou superexpressão de certas enzimas envolvidas na produção de oligossacarídeos (Patente U.S. N° 5.047.335; Patente U.S. N° 5.510.261). Esses esquemas não se limitam a métodos intracelulares (Patente US N° 5.278.299).
[007]WO98/58964 descreve composições de anticorpos em que substancialmente todo o oligossacarídeo N-ligado é um oligossacarídeo G2. G2 refere-se a uma estrutura biantenária com dois terminais Gals e nenhum NeuAcs. WO99/22764 refere- se a composições de anticorpos que são substancialmente livres de uma glicoproteína tendo um oligossacarídeo G1, G0 ou G-1 ligado a N em seu domínio CH2. G1 refere-se a uma estrutura biantenária tendo um Gal e nenhum NeuAcs, G0 refere-se a uma estrutura biantenária em que nenhum terminal NeuAcs ou Gals está presente e G-1 se refere à unidade central menos um GlcNAc.
[008]WO00/61739 relata que 47% dos anticorpos anti-hIL- 5R expressados por células YB2/0 (mieloma de rato) têm cadeias de açúcar ligadas à α 1-6 fucose, em comparação com 73% dos anticorpos expressados por células NSO (mieloma de rato). A razão relativa de fucose de anticorpos α-hIL-5R expressados por várias células hospedeiras foi YB2
0<CHO/d<NSO.
[009]WO02/31140 e WO03/85118 mostram que a modificação da ligação da fucose a uma cadeia de açúcar pode ser controlada usando um RNAi para suprimir a função da α1,6- fucosiltransferase. Um processo para a produção de uma composição de anticorpo usando uma célula, que compreende o uso de uma célula resistente a uma lectina que reconhece uma cadeia de açúcar na qual a posição 1 da fucose está ligada à posição 6 da N-acetilglucosamina na extremidade redutora através da ligação α em uma cadeia de açúcar ligada a N- glicosídeo complexa.
[0010]A estrutura da cadeia de açúcar desempenha um papel importante na função efetora dos anticorpos da subclasse IgG1 de humano, e pode ser possível preparar um anticorpo tendo uma função efetora maior alterando a estrutura da cadeia de açúcar. No entanto, as estruturas das cadeias de açúcar são diversas e complexas, e a solução dos papéis fisiológicos das cadeias de açúcar seria insuficiente e cara. Assim, é necessário um método para a produção de um anticorpo fucosilado. Referências:
1. PAULSON, James, et al., “Process for controlling intracellular glycosylation of proteins” Patente US N°
5.047.335 (1991)
2. GOOCHEE, Charles F., et al., “Method of controlling the degradation of glycoprotein oligosaccharides produced by cultured Chinese hamster ovary cells” Patente US N° 5.510.261 (1996)
3. WONG, Chi-Huey, et al., “Method and composition for synthesizing sialylated glycosyl compounds” Patente US
N° 5.278.299 (1994)
4. RAJU, T., Shantha, “Methods and compositions for galactosylated glycoproteins” WO/1998/058964 (1998)
5. RAJU, T., Shantha, “Methods and compositions comprising galactosylated glycoproteins” WO/1999/022764 (1999)
6. HANAI, Nobuo, et al., “Method for controlling the activity of immunologically functional molecule” WO/2000/061739 (2000)
7. KANDA, Yutaka, et al., “cells producing antibody compositions” WO/2002/031140 (2002)
8. BLUMBERG, R. S., et al., “Central airway administration for systemic delivery of therapeutics” WO 03/077834 (2002)
9. BLUMBERG, R. S., et al., “Central airway administration for systemic delivery of therapeutics” US Patent Application Publication 2003-0235536 (2003)
10. MÖSSENER, E., et al., “Increasing the efficacy of CD20 antibody therapy through the engineering of a new type II anti-CD20 antibody with enhanced direct and immune effector cell-mediated B-cell cytotoxicity” Blood 115, 4393- 4402 (2010)
11. FERRARA, C., et al., “Unique carbohydrate– carbohydrate interactions are required for high affinity binding between FcγRIII and antibodies lacking core fucose” Proc Natl Acad Sci EUA 108, 12669 – 12674 (2011)
SUMÁRIO DA INVENÇÃO
[0011]A presente divulgação é direcionada a novos métodos para a produção de proteínas afucosiladas, incluindo anticorpos afucosilados, tendo atividade melhorada. A divulgação também é direcionada a proteínas afucosiladas produzidas pelos métodos e células divulgados para a produção de proteínas afucosiladas. Os anticorpos afucosilados divulgados têm atividade aumentada de citotoxicidade celular dependente de anticorpos (ADCC) em comparação com anticorpos afucosilados de ocorrência natural.
[0012]Um aspecto da presente divulgação se refere a um método para produzir uma proteína afucosilada, incluindo um anticorpo afucosilado, em uma célula hospedeira. O método da presente divulgação geralmente compreende a introdução de um ácido nucleico que codifica uma enzima modificada da via de fucosilação para uma célula hospedeira para inibir a fucosilação de um anticorpo na célula hospedeira. A enzima modificada pode ser derivada de uma enzima na via de fucosilação. Em certas modalidades, a enzima modificada pode ser derivada de GDP-manose 4,6-desidratase (GMD), GDP-4- ceto-6-desoxi-D-manose epinierase-redutase (FX) e/ou qualquer uma das fucosiltransferases (FUT1 a FUT12, POFUT1 e POFUT2). Em algumas modalidades, a enzima modificada pode ser derivada de GMD ou FUT. Em modalidades específicas, a enzima modificada pode ser derivada de α-1,6- fucosiltransferase (FUT8). A enzima modificada pode inibir a função da enzima de ocorrência natural da célula hospedeira na via de fucosilação, que, por sua vez, inibe a fucosilação de um anticorpo na célula hospedeira.
[0013]Em algumas modalidades, o método para produzir uma proteína afucosilada, incluindo um anticorpo afucosilado, compreende (a) fornecer uma célula hospedeira, (b) introduzir um ácido nucleico que codifica uma enzima modificada da via de fucosilação para a célula hospedeira,
e (c) produzir uma proteína afucosilada na célula hospedeira.
[0014]Outro aspecto da presente divulgação se refere a uma proteína afucosilada, incluindo um anticorpo afucosilado, produzida pelo método da presente divulgação. O anticorpo afucosilado aumentou e melhorou as atividades em comparação com os anticorpos afucosilados de ocorrência natural. Em algumas modalidades, o anticorpo aumentou e melhorou a ADCC.
[0015]A presente divulgação também se refere a uma célula para a produção da proteína afucosilada, incluindo um anticorpo afucosilado.
[0016]Uma descrição detalhada da presente divulgação é dada nas seguintes modalidades com referência aos desenhos anexos.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS
[0017]A Figura 1 é um perfil de Western blot de proteínas FUT8 produzidas em células RC79 (um clone estável que expressa RITUXAN®) e células RC79 recombinantes que expressam proteína mutante F83M, F8M1, F8M2, F8M3 ou F8D1. A expressão de gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase (GAPDH) é usada como um controle de carga de proteína. O nível de expressão da proteína FUT8 em células recombinantes RC79 que expressam uma enzima FUT8 mutante é similar, ou igual, ao nível de expressão da proteína FUT8 na célula RC79 precursora.
[0018]A Figura 2 é uma análise de citometria de fluxo de células recombinantes RC79 que expressam a proteína mutante F83M e células precursores RC79. O pico com a linha tracejada representa células recombinantes RC79 que expressam F83M coradas com Rodamina-LCA. O pico cinza preenchido representa células recombinantes RC79 que expressam F83M sem coloração com Rodamina-LCA (controle negativo). O pico com a linha pontilhada representa células RC79 (células precursores que não expressam F83M) coradas com Rodamina-LCA (controle positivo).
[0019]As Figuras 3a e 3b são gráficos que mostram os resultados do ensaio de ADCC. As Figuras 3a-3b ilustram a atividade de ADCC de RITUXAN® e mAb anti-CD20 afucosilado por células PBMC do doador 1 (Figura 3a) e doador 2 (Figura 3b), respectivamente. A atividade de ADCC do mAb anti-CD20 afucosilado (clone R1) é significativamente maior do que RITUXAN®.
[0020]As Figuras 4a-4c são gráficos que mostram os sensogramas de SPR do ensaio de afinidade de FcγRIIIa com um biossensor SPR (BIACORE X100). FcγRIIIa etiquetado com His (1 μg/mL) e mAb anti-CD20 afucosilado 5-80 nM (Figura 4a), RITUXAN® 20-320 nM (Figura 4b) ou GAZYVA® 5-80 nM (Figura 4c) fluiu através do chip CM5 imobilizado com anticorpo anti- His sequencialmente na vazão de 30 μL/min. O mAb anti-CD20 afucosilado (clone R1) tinha uma afinidade mais forte com FcγRIIIa do que RITUXAN® e GAZYVA®.
[0021]A Figura 5 é um gráfico que mostra uma atividade de CDC de RITUXAN® e mAb anti-CD20 afucosilado. A atividade de CDC do mAb anti-CD20 afucosilado (clone R1) foi comparável com a do RITUXAN®.
[0022]A Figura 6 é um gráfico que mostra o volume do tumor de camundongos tratados com solução salina (veículo), RITUXAN® ou mAb anti-CD20 afucosilado (clone R1). Os pontos de dados indicam a média ± DP do volume do tumor (n = 5 em cada grupo). A eficácia antitumoral do mAb anti-CD20 afucosilado (clone R1) é significativamente maior do que a do RITUXAN®.
[0023]A Figura 7 é um gráfico que mostra o peso do tumor coletado de camundongos tratados com solução salina (veículo), RITUXAN® ou mAb anti-CD20 afucosilado (clone R1). O peso do tumor dos camundongos tratados com anticorpo anti- CD20 afucosilado (clone R1) é significativamente mais leve do que RITUXAN® e o grupo de veículo.
[0024]A Figura 8 é um gráfico que mostra o peso corporal de camundongos tratados com solução salina (veículo), RITUXAN® ou mAb anti-CD20 afucosilado (clone R1). Os pontos de dados indicam a média ± DP do volume do tumor (n = 5 em cada grupo).
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO
[0025]A presente divulgação é direcionada a novos métodos para a produção de anticorpos afucosilados com atividade melhorada. A divulgação também é direcionada a anticorpos afucosilados produzidos pelos métodos e pelas células divulgados para a produção de anticorpos afucosilados. Os anticorpos afucosilados divulgados têm atividade aumentada de citotoxicidade celular dependente de anticorpos (ADCC) em comparação com anticorpos afucosilados de ocorrência natural.
[0026]O que se segue é uma descrição detalhada fornecida para auxiliar os habilitados na técnica na prática da presente invenção. Aqueles habilitados comuns na técnica entenderiam que as modificações ou variações das modalidades expressamente descritas nesse documento, que não se afastam do espírito ou escopo das informações contidas nesse documento, são abrangidas pela presente divulgação. A terminologia usada na descrição é para descrever modalidades particulares apenas e não se destina a ser uma limitação da invenção. Os títulos das seções usados abaixo são apenas para fins organizacionais e não devem ser interpretados como limitantes do assunto descrito.
[0027]Todas as publicações, os pedidos de patentes, as patentes, as figuras e outras referências, incluindo partes dos mesmos mencionadas nesse documento, são incorporada(o)s por referência em sua totalidade como se divulgada(o)s e recitada(o)s completamente no relatório descritivo.
[0028]A menos que explicado de outra forma, todos os termos técnicos e científicos usados nesse documento têm o mesmo significado como comumente entendido por alguém habilitado na técnica à qual essa invenção pertence. Os termos singulares “um”, “uma” e “o” e “a” incluem referentes plurais, a menos que o contexto indique claramente o contrário. De forma similar, a palavra “ou” pretende incluir “e”, a menos que o contexto indique claramente o contrário. Portanto, “compreendendo A ou B” significa incluindo A, ou B, ou A e B. Deve ainda ser entendido que todos os tamanhos de aminoácidos e todos os valores de peso molecular ou massa molecular, dados para polipeptídeos são aproximados e são fornecidos para descrição. Embora métodos e materiais similares ou equivalentes aos descritos nesse documento possam ser usados na prática ou no teste do(s) método, métodos e materiais divulgado(s) adequado(s) são descritos abaixo. Todas as publicações, os pedidos de patentes, as patentes e outras referências mencionadas nesse documento são incorporada(o)s por referência em sua totalidade. Em caso de conflito, o presente relatório descritivo, incluindo explicações dos termos, prevalecerá. Além disso, os materiais, métodos e exemplos são apenas ilustrativos e não se destinam a ser limitantes.
1. Inibição da fucosilação em uma célula
[0029]Um aspecto da presente divulgação se refere a um método para inibir ou reduzir a fucosilação em uma célula. a. Células Hospedeiras
[0030]Qualquer célula hospedeira apropriada pode ser usada para produzir anticorpos afucosilados, incluindo uma célula hospedeira derivada de levedura, inseto, anfíbio, peixe, réptil, pássaro, mamífero ou humano, ou uma célula de hibridoma. A célula hospedeira pode ser uma célula ou linha de célula não modificada, ou uma linha de célula que foi geneticamente modificada (por exemplo, para facilitar a produção de um produto biológico). Em algumas modalidades, a célula hospedeira é uma linha de célula que foi modificada para permitir o crescimento sob as condições desejadas, como em meio sem soro, em cultura de suspensão de células ou em cultura de células aderentes.
[0031]Uma célula hospedeira de mamífero pode ser vantajosa para uso em anticorpos destinados à administração a humanos. Em algumas modalidades, a célula hospedeira é uma célula de ovário de hamster chinês (CHO), que é uma linha de célula usada para a expressão de muitas proteínas recombinantes. Linhas de célula de mamíferos adicionais comumente usadas para a expressão de proteínas recombinantes incluem células 293HEK, células HeLa, células COS, células NIH/3T3, células Jurkat, células NSO e células HUVEC. Em outras modalidades, a célula hospedeira é uma célula recombinante que expressa um anticorpo.
[0032]Exemplos de linhas de células humanas úteis em métodos fornecidos nesse documento incluem as linhas de células 293T (rim embrionário), 786-0 (renal), A498 (renal), A549 (epitelial basal alveolar), ACHN (renal), BT-549 (mama), BxPC-3 (pancreático), CAKI-1 (renal), Capan-i (pancreático), CCRF-CEM (leucemia), COLO 205 (cólon), DLD-1 (cólon), DMS 114 (pulmão de células pequenas), DU145 (próstata), EKVX (pulmão de células não pequenas), HCC-2998 (cólon), HCT-15 (cólon), HCT-1 16 (cólon), HT29 (cólon), S IT-1080 (fibrossarcoma), HEK 293 (rim embrionário), HeLa (carcinoma cervical), HepG2 (carcinoma hepatocelular), HL- 60(TB) (leucemia), HOP-62 (pulmão de células não pequenas), HOP-92 (pulmão de células não pequenas), HS 578T (mama), HT- 29 (adenocarcinoma do cólon), IG-OV1 (ovário), IMR32 (neuroblastoma), Jurkat (linfócito T), K-562 (leucemia), KM 12 (cólon), KM20L2 (cólon), LANS (neuroblastoma), LNCap.FGC (adenocarcinoma de próstata caucasiana), LOX IMV1 (melanoma), LXFL 529 (pulmão de células não pequenas), M 14 (melanoma), M19-MEL (melanoma), MALME-3M (melanoma), MCF IOA (epitelial mamário), MCI ‘7 (mamário), MDA-MB-453 (epitelial mamário), MDA-MB-468 (mama), MDA-MB-231 (mama), MDA-N (mama), MOLT-4 (leucemia), NCl/ADR-RES (ovário), NCI-1122.0 (pulmão de células não pequenas), NCI-H23 (pulmão de células não pequenas), NC1-H322M (pulmão de células não pequenas), NCI-H460 (pulmão de células não pequenas), NCI-H522 (pulmão de células não pequenas), OVCAR-3 (ovário), QVCAR-4 (ovário), OVCAR-5 (ovário), OVCAR-8 (ovário), P388 (leucemia), P388/ADR (leucemia), PC-3 (próstata), PERC6® (retina embrionária transformada com El), RPMI-7951 (melanoma), RPMI-8226 (leucemia), RXF 393 (renal), RXF-631
(renal), Saos-2 (osso), SF-268 (SNC), SF-295 (SNC), SF-539 (SNC), SHP-77 (pulmão de células pequenas), SH-SY5Y (neuroblastoma), SK-BR3 (mama), SK-MEL-2 (melanoma), SK-MEL- 5 (melanoma), SK-MEL-28 (melanoma), SK-OV-3 (ovariana), SN12K1 (renal), SN12C (renal), SNB-19 (SNC), SNB-75 (SNC) SNB-78 (SNC), SR (leucemia), SW-620 (cólon), T-47D (mama), THP-1 (macrófagos derivados de monócitos), TK-10 (renal), U87 (glioblastoma), U293 (Rim), U251 (SNC), UACC-257 (melanoma), UACC-62 (melanoma), UO-31 (renal), W138 (pulmão) e XF 498 (SNC).
[0033]Exemplos de linhas de células de primatas não humanos úteis nos métodos fornecidos nesse documento incluem as linhas de células de rim de macaco (CVI-76), rim de macaco verde africano (VERO-76), fibroblasto de macaco verde (COS- 1) e rim de macaco (CVI) células transformadas por SV40 (COS- 7). As linhas de células de mamíferos adicionais são conhecidas dos habilitados na técnica e estão catalogadas no catálogo American Type Culture Collection (ATCC) (Manassas, VA). b. Modificação de uma enzima na via de fucosilação
[0034]Os anticorpos afucosilados da presente divulgação podem ser produzidos em uma célula hospedeira na qual a via de fucosilação foi alterada de uma forma que reduz ou inibe a fucosilação de proteínas. i. Enzimas modificadas
[0035]A expressão “enzima modificada”, como usadas nesse documento, refere-se a uma proteína derivada de uma enzima de ocorrência natural ou de tipo selvagem na via de fucosilação que foi alterada de uma forma que altera ou destrói a atividade enzimática natural da proteína após modificação. Uma enzima modificada é capaz de inibir ou interferir com sua contraparte de tipo selvagem para alterar, inibir ou reduzir a atividade da enzima de tipo selvagem em uma célula hospedeira.
[0036]Uma enzima modificada pode ser produzida alterando a enzima de ocorrência natural, por exemplo, alterando a carga de proteína total, anexando covalentemente um produto químico ou porção de proteína, introduzindo substituições de aminoácidos, inserções e/ou eliminações e/ou qualquer combinação dos mesmos. Em algumas modalidades, a enzima modificada tem substituições, adições e/ou eliminações de aminoácidos em comparação com sua contraparte enzimática de ocorrência natural. Em algumas modalidades, a enzima modificada tem entre uma a cerca de vinte substituições, adições e/ou eliminações de aminoácidos em comparação com sua contraparte de ocorrência natural. A substituição, adição e inserção de aminoácidos podem ser realizadas com aminoácidos naturais ou não naturais. Os aminoácidos de ocorrência não natural incluem, mas não estão limitados a, ε-N lisina, β-alanina, ornitina, norleucina, norvalina, hidroxiprolina, tiroxina, ácido γ-amino butírico, homoserina, citrulina, ácido aminobenzoico, ácido 6- aminocaproico (Aca; ácido 6-aminohexanoico), hidroxiprolina, ácido mercaptopropiônico (MPA), 3-nitro-tirosina, ácido piroglutâmico e semelhantes. Os aminoácidos de ocorrência natural incluem alanina, arginina, asparagina, ácido aspártico, cisteína, ácido glutâmico, glutamina, glicina, histidina, isoleucina, leucina, lisina, metionina, fenilalanina, prolina, serina, treonina, triptofano, tirosina e valina.
[0037]A enzima modificada pode ser derivada de qualquer enzima de ocorrência natural na via de fucosilação. Por exemplo, a enzima modificada pode ser derivada de GDP-manose 4,6-desidratase (GMD), GDP-4-ceto-6-desoxi-D-manose epinierase-redutase (FX) e/ou qualquer uma das fucosiltransferases, incluindo: galactosídeo 2-alfa-L- fucosiltransferase 1 (FUT1), galactosídeo 2-alfa-L- fucosiltransferase 2 (FUT2), galactosídeo 3(4)-L- fucosiltransferase (FUT3), alfa-(1,3)-fucosiltransferase, mieloide-específico (FUT4), alfa-(1,3)-fucosiltransferase (FUT5), alfa-(1,3)-fucosiltransferase (FUT6), alfa-(1,3)- fucosiltransferase (FUT7), alfa-(1,6)-fucosiltransferase (FUT8), alfa-(1,3)-fucosiltransferase (FUT9), proteína O- fucosiltransferase 1 (POFUT1), proteína O-fucosiltransferase 2 (POFUT2).
[0038]Em algumas modalidades, mais de uma enzima na via de fucosilação é modificada. Em certas modalidades, a enzima modificada é derivada de GMD, FX e/ou FUT8. ii. Ácidos nucleicos que codificam uma enzima modificada
[0039]Os anticorpos afucosilados da presente divulgação podem ser produzidos em uma célula hospedeira na qual a via de fucosilação foi alterada de uma forma que reduz ou inibe a fucosilação de proteínas.
[0040]Em algumas modalidades, a via de fucosilação de uma célula hospedeira é alterada pela introdução na célula de um ácido nucleico que codifica uma enzima modificada na via de fucosilação. Por exemplo, um ácido nucleico que codifica a enzima modificada pode ser inserido em um vetor de expressão e transfectado em uma célula hospedeira. A molécula de ácido nucleico que codifica a enzima modificada pode ser introduzida transitoriamente na célula hospedeira ou integrada de forma estável no genoma da célula hospedeira. As metodologias de DNA recombinante padrão podem ser usadas para produzir um ácido nucleico que codifica a enzima modificada, incorporar o ácido nucleico em um vetor de expressão e introduzir o vetor em uma célula hospedeira.
[0041]Em algumas modalidades, uma célula hospedeira pode expressar duas ou mais enzimas modificadas. Por exemplo, uma célula hospedeira pode ser transfectada com um ácido nucleico que codifica duas ou mais enzimas modificadas. Alternativamente, uma célula hospedeira pode ser transfectada com mais de um ácido nucleico, cada um dos quais codifica uma ou mais enzimas modificadas.
[0042]O ácido nucleico que codifica uma enzima modificada pode conter sequência de ácidos nucleicos adicionais. Por exemplo, o ácido nucleico pode conter uma etiqueta de proteína, um marcador selecionável ou uma sequência reguladora que controla a expressão das proteínas em uma célula hospedeira, tais como, promotores, potencializadores ou outros elementos de controle de expressão que controlam a transcrição ou tradução dos ácidos nucleicos (por exemplo, sinais de poliadenilação). Essas sequências regulatórias são conhecidas na técnica. Os versados na técnica apreciariam que a escolha do vetor de expressão, incluindo a seleção de uma sequência reguladora, pode depender de vários fatores, incluindo a escolha da célula hospedeira a ser transformada, o nível de expressão da proteína desejada, etc. sequências reguladoras para expressão de células hospedeiras de mamíferos incluem elementos virais que direcionam altos níveis de expressão de proteínas em células de mamíferos, como promotores e/ou potencializadores derivados de citomegalovírus (CMV) (como o promotor/intensificador de CMV), Vírus Símio 40 (SV40) (tal como o promotor/intensificador de SV40), adenovírus (por exemplo, o promotor tardio principal de adenovírus (AdMLP)) e poliomavírus.
[0043]Em certas modalidades, uma sequência de ácidos nucleicos contendo uma enzima modificada derivada de GMD, FX e/ou FUT é introduzida em uma célula hospedeira. A via de fucosilação será alterada, inibida ou reduzida em uma célula hospedeira que expressa uma enzima modificada. c. Células hospedeiras que expressam enzimas modificadas
[0044]Outro aspecto da presente divulgação se refere a uma célula hospedeira que expressa uma enzima modificada na via de fucosilação. A expressão da enzima modificada na célula hospedeira interfere na atividade da enzima de tipo selvagem, o que resulta na inibição ou redução da via de fucosilação. Assim, as proteínas (por exemplo, anticorpos) produzidas em uma célula hospedeira que expressa a enzima modificada são afucosiladas.
[0045]A expressão “célula de baixa fucosilação” ou “célula hospedeira de baixa fucosilação”, como usada nesse documento, refere-se a uma célula na qual a via de fucosilação foi inibida ou reduzida porque a célula expressa uma enzima modificada na via de fucosilação.
[0046]Uma célula de baixa fucosilação pode ser preparada por transfecção de uma célula hospedeira com um vetor de expressão contendo uma sequência de ácidos nucleicos que codifica uma enzima modificada na via de fucosilação. A transfecção pode ser realizada usando técnicas conhecidas na área. Por exemplo, a transfecção pode ser realizada usando métodos baseados em produtos químicos (por exemplo, lipídios, fosfato de cálcio, polímeros catiônicos, DEAE- dextrano, dendrímeros ativados, esferas magnéticas, etc.), por métodos baseados em instrumentos (por exemplo, eletroporação, tecnologia biolística, microinjeção, laserinfecção/optoinjeção, etc.) ou por métodos baseados em vírus.
[0047]As células transfectadas podem ser selecionadas e isoladas de células não transfectadas usando um marcador selecionável presente no vetor de expressão. Além disso, as células transfectadas tendo uma via de fucosilação inibida ou reduzida podem ser adicionalmente selecionadas e isoladas de células com uma via de fucosilação normal por várias técnicas. Por exemplo, a fucosilação pode ser determinada usando anticorpos, lectinas, rotulação metabólica ou estratégias quimioenzimáticas. Além disso, as células tendo uma via de fucosilação inibida ou reduzida podem ser selecionadas expondo as células transfectadas à aglutinina de Lens culinaris (LCA, Vector laboratories L-1040). O LCA reconhece a estrutura do núcleo da trimanose α-1,6-fucosilada de oligossacarídeos N- ligados e compromete a expressão da célula em uma via de morte celular. Assim, as células que sobrevivem à exposição ao LCA têm uma via de fucosilação inibida ou reduzida e são consideradas células de baixa fucosilação.
2. Proteínas afucosiladas
[0048]Outro aspecto da presente divulgação se refere a um método para a produção de proteínas afucosiladas. Em algumas modalidades, a proteína afucosiladas é um anticorpo afucosilado.
a. Proteínas
[0049]Exemplos não limitativos de proteínas que podem ser produzidas como proteínas afucosiladas incluem GP-73, hemopexina, HBsAg, partícula viral da hepatite B, alfa- ácido-glicoproteína, alfa-1-antiquimotripsina, alfa-1- antiquimotripsina His-Pro-less, alfa-1-antitripsina, serotransferrina, ceruloplasmina, alfa-2-macroglobulina, alfa-2-HS-glicoproteína, alfa-fetoproteína, Haptoglobina, precursor da cadeia gama de fibrinogênio, imunoglobulina (incluindo IgG, IgA, IgM, IgD, IgE e semelhantes), APO-D, cininogênio, glicoproteína rica em histidina, precursor do fator de complemento 1, cadeia pesada do fator de complemento I, cadeia leve do fator de complemento I, complemento C1s, precursor do fator de complemento B, fragmento de fator de complemento B Ba, fragmento de fator de complemento B Ba, precursor do Complemento C3, Complemento C3 cadeia beta, Complemento C3 cadeia alfa, anafilotoxina C3a, Complemento, cadeia alfa’ C3b, fragmento do Complemento C3c, fragmento do Complemento C3dg, fragmento do Complemento C3g, fragmento do Complemento C3d, fragmento do Complemento C3f, Complemento C5, Complemento C5 Cadeia beta, complemento C5 cadeia alfa, anafilatoxina C5a, complemento C5 cadeia alfa’, complemento C7, glicoproteína B alfa-1, glicoproteína B-2, proteína de ligação à vitamina D, cadeia pesada H2 do inibidor da inter- alfa-tripsina, alfa-1B-glicoproteína, precursor do angiotensinogênio, angiotensina-1, angiotensina-2, angiotensina-3, proteína GARP, beta-2-glicoproteína, clusterina (Apo J), glicoproteína precursora alfa-8 da integrina, cadeia pesada alfa-8 da integrina, cadeia leve alfa-8 da integrina, partícula viral da hepatite C, elf-5,
cininogênio, homólogo de HSP33, lisil endopeptidase e precursor da proteína 32 contendo repetição rica em leucina. b. Anticorpos
[0050]O termo “anticorpo”, como usado nesse documento, abrange amplamente moléculas de anticorpo intactas, bem como fragmentos das mesmas que são capazes de ser fucosilados. Por exemplo, um anticorpo inclui imunoglobulinas totalmente montadas (por exemplo, anticorpos policlonais, monoclonais, monoespecíficos, poliespecíficos, quiméricos, desimunizados, humanizados, humanos, primatizados, de cadeia única, de domínio único, sintéticos e recombinantes); porções de anticorpos intactos que têm uma atividade ou função desejada (por exemplo, fragmentos imunológicos de anticorpos que contêm Fab, Fab’, F(ab’)2, Fv, scFv, fragmentos de domínio único); bem como peptídeos e proteínas que contêm um domínio Fc capaz de ser fucosilado (por exemplo, proteínas de fusão Fc).
[0051]O termo “anticorpo afucosilado”, como usado nesse documento, refere-se a um anticorpo ou fragmento do mesmo que é produzido sob condições em que a fucosilação é inibida ou significativamente reduzida em comparação com anticorpos produzidos sob condições naturais. Os anticorpos afucosilados produzidos por métodos da presente divulgação podem ser completamente (100%) afucosilados ou, alternativamente, podem compreender uma mistura de moléculas fucosiladas e afucosiladas. Por exemplo, em algumas modalidades, os anticorpos produzidos dos métodos divulgados podem conter de cerca de 20% a cerca de 100% de moléculas afucosiladas. Em outras modalidades, os anticorpos produzidos dos métodos divulgados podem conter de cerca de
40% a cerca de 100% de moléculas afucosiladas. Em certas modalidades, os anticorpos produzidos dos métodos divulgados contêm cerca de pelo menos 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97, 98%, 99% ou 100% das moléculas afucosiladas. Não é necessário que todos os anticorpos N-glicosilados ou fragmentos dos mesmos (por exemplo, proteínas de fusão Fc) sejam afucosilados. b. Tipos de anticorpos
[0052]Qualquer anticorpo pode ser produzido como um anticorpo afucosilado usando os métodos divulgados nesse documento. Não há limitação sobre os tipos de anticorpos que podem ser produzidos usando os métodos divulgados. A seguir está uma lista não exaustiva de anticorpos que podem ser produzidos: Exemplos de anticorpos que reconhecem um antígeno relacionado ao tumor incluem anticorpo anti-GD2, anticorpo anti-GD3, anticorpo anti-GM2, anticorpo anti-HER2, anticorpo anti-CD52, anticorpo anti-MAGE, anticorpo anti-HM124, hormônio anti-paratireóide, anticorpo de proteína relacionada (PTHrP), anticorpo anti-fator de crescimento de fibroblasto básico e anticorpo anti-FGF8, anticorpo anti- receptor do fator de crescimento de fibroblasto básico e anticorpo anti-receptor de FGFS, anticorpo anti-fator de crescimento semelhante à insulina, anticorpo anti-receptor do fator de crescimento de insulina, anticorpo anti-PMSA, anticorpo anti-fator de crescimento de células endoteliais vasculares, anticorpo anti-receptor do fator de crescimento de células endoteliais vasculares e semelhantes.
[0053]Exemplos de anticorpos que reconhecem um antígeno relacionado à alergia ou inflamação incluem anticorpo anti-
interleucina 6, anticorpo anti-receptor de interleucina 6, anticorpo anti-interleucina 5, anticorpo anti-receptor de interleucina 5 e anticorpo anti-interleucina 4, anticorpo de fator de necrose tumoral, anticorpo anti-receptor do fator de necrose tumoral, anticorpo anti-CCR4, anticorpo anti- quimiocina, anticorpo anti-receptor de quimiocina e semelhantes.
[0054]Exemplos de anticorpos que reconhecem um antígeno relacionado à doença de órgão circulatório incluem anticorpo anti-GpIIb/IIIa, anticorpo anti-fator de crescimento derivado de plaquetas, anticorpo anti-receptor do fator de crescimento derivado de plaquetas e anticorpo anti-fator de coagulação sanguínea e semelhantes.
[0055]Exemplos de anticorpos que reconhecem um antígeno relacionado à infecção viral ou bacteriana incluem anticorpo anti-gpl 20, anticorpo anti-CD4, anticorpo anti-CCR4 e anticorpo anti-toxina Vero e semelhantes.
[0056]Vários anticorpos terapêuticos estão disponíveis comercialmente, tal como anticorpos que se ligam a VEGF (por exemplo, Bevacizumab (AVASTIN®)), EGFR (por exemplo, Cetuximab (ERBITUX®)), HER2 (por exemplo, Trastuzumab (HERCEPTIN®)) e CD20 (por exemplo, Rituximab (RITUXAN®)) e proteínas de fusão Fc que se ligam a TNFa (por exemplo, Etanecept (ENBREL®), que compreende o domínio de ligação ao receptor de um receptor de TNF (p75)), CD2 (por exemplo, Alefacept (AMEVIVE®), que contém o domínio de ligação a CD2 de LFA-3), ou B7 (Abatacept (ORENCIA®), que compreende o domínio de ligação a B7 de CTLA4)
3. Métodos para produzir proteínas afucosiladas
[0057]As proteínas afucosiladas, incluindo anticorpos afucosilados, da presente divulgação são produzidas em uma célula de baixa fucosilação. As proteínas afucosiladas podem ser expressadas em uma célula de baixa fucosilação usando técnicas conhecidas na área, por exemplo, por transfecção de células de baixa fucosilação com um vetor de expressão que codifica a proteína.
[0058]Um vetor de expressão que codifica uma proteína pode ser preparado usando técnicas conhecidas na área. Por exemplo, um vetor de expressão pode ser construído por tradução reversa da sequência de aminoácidos em uma sequência de ácidos nucleicos, de preferência, usando códons otimizados para o organismo no qual a proteína será expressada. O ácido nucleico que codifica a proteína, e quaisquer outros elementos reguladores, podem então ser montados e inseridos no vetor de expressão desejado. O vetor de expressão pode conter sequência de ácidos nucleicos adicionais, tal como uma etiqueta de proteína, um marcador selecionável ou uma sequência reguladora que controla a expressão das proteínas, como descrito acima para vetores de expressão contendo a enzima modificada. O vetor de expressão pode então ser introduzido em uma célula hospedeira por transfecção. A transfecção pode ser realizada usando técnicas conhecidas na área. Por exemplo, a transfecção pode ser realizada usando métodos baseados em produtos químicos (por exemplo, lipídios, fosfato de cálcio, polímeros catiônicos, DEAE-dextrano, dendrímeros ativados, esferas magnéticas, etc.), por métodos baseados em instrumentos (por exemplo, eletroporação, tecnologia biolística, microinjeção, laserfecção/optoinjeção, etc.) ou por métodos baseados em vírus. A proteína pode então ser expressada na célula transfectada sob condições apropriadas para o sistema de expressão e o hospedeiro selecionados. A proteína expressada pode então ser purificada usando uma coluna de afinidade ou outra técnica conhecida na área.
[0059]Uma célula hospedeira pode ser transfectada com um ácido nucleico que codifica uma enzima modificada (para se tornar uma célula de baixa fucosilação) e um ácido nucleico que codifica uma proteína (para expressar a proteína) em qualquer ordem, para produzir uma proteína afucosilada. Por exemplo, uma célula hospedeira pode ser transfectada com um ácido nucleico que codifica uma enzima modificada (para se tornar uma célula de baixa fucosilação) primeiro e depois transfectada com um ácido nucleico que codifica uma proteína (para expressar a proteína). Alternativamente, uma célula hospedeira pode ser transfectada com um ácido nucleico que codifica uma proteína (para expressar a proteína) primeiro e depois transfectada com um ácido nucleico que codifica uma enzima modificada (para se tornar uma célula de baixa fucosilação). Em outra variação, uma célula hospedeira pode ser transfectada com um ácido nucleico que codifica uma enzima modificada (para se tornar uma célula de baixa fucosilação) e um ácido nucleico que codifica uma proteína (para expressar a proteína) ao mesmo tempo.
[0060]Em uma modalidade específica, uma proteína fucosilada é produzida preparando primeiro uma célula de baixa fucosilação e, em seguida, transfectando a célula de baixa fucosilação com um ácido nucleico que codifica uma proteína de acordo com as seguintes etapas: a) obter células hospedeiras apropriadas para expressar uma proteína;
b) transfectar as células hospedeiras com um ácido nucleico que codifica uma enzima modificada; c) selecionar e/ou isolar células transfectadas tendo baixa fucosilação; d) transfecção das células de baixa fucosilação com um ácido nucleico que codifica uma proteína; e) selecionar e/ou isolar células de baixa fucosilação transfectadas com o ácido nucleico que codifica a proteína; f) indução da expressão da proteína nas células de baixa fucosilação.
[0061]Em uma modalidade separada, uma proteína afucosilada é produzida por transfecção de uma célula hospedeira com um ácido nucleico que codifica uma proteína primeiro e, em seguida, transfectando a célula com um ácido nucleico que codifica uma enzima modificada de acordo com as seguintes etapas: a) obter células hospedeiras apropriadas para expressar uma proteína; b) transfectar as células hospedeiras com um ácido nucleico que codifica uma proteína; c) selecionar e/ou isolar células transfectadas com o ácido nucleico que codifica a proteína; d) transfectar as células na etapa (c) com um ácido nucleico que codifica uma enzima modificada; e) selecionar e/ou isolar as células transfectadas na etapa (d) tendo baixa fucosilação; f) induzir a expressão da proteína nas células de baixa fucosilação.
[0062]Em uma variação da modalidade acima, uma proteína afucosilada é produzida por:
a) obter células hospedeiras que expressam ou superexpressam uma proteína; b) transfectar as células hospedeiras com um ácido nucleico que codifica uma enzima modificada; c) selecionar e/ou isolar as células hospedeiras transfectadas tendo baixa fucosilação; d) induzir a expressão da proteína nas células de baixa fucosilação.
[0063]Em ainda outra modalidade, uma proteína afucosilada é produzida transfectando simultaneamente uma célula hospedeira com um ácido nucleico que codifica uma enzima modificada (para se tornar uma célula de baixa fucosilação) e um ácido nucleico que codifica uma proteína (para expressar a proteína) como a seguir: a) obter células hospedeiras apropriadas para expressar uma proteína; b) transfectar as células hospedeiras com um primeiro ácido nucleico que codifica uma proteína e um segundo ácido nucleico que codifica uma enzima modificada; c) selecionar e/ou isolar as células hospedeiras transfectadas que expressam a proteína e têm baixa fucosilação; d) induzir expressão da proteína nas células de baixa fucosilação.
[0064]As proteínas afucosiladas, incluindo anticorpos, produzidas usando os métodos descritos acima, podem ser purificadas usando métodos conhecidos na área. Por exemplo, proteínas fucosiladas, incluindo anticorpos, produzidas pelos métodos divulgados podem ser purificadas por fracionamento físico-químico, afinidade específica de classe de anticorpo, afinidade específica de antígeno, etc.
4. Propriedades melhoradas de anticorpos afucosilados
[0065]Os anticorpos afucosilados produzidos pelo método da presente divulgação têm propriedades melhoradas em comparação com os anticorpos produzidos usando métodos padrão.
[0066]A atividade de anticorpos afucosilados purificados pode ser medida pelo ELISA e método de fluorescência e semelhantes. A atividade citotóxica para linhas de células cultivadas com antígeno positivo pode ser avaliada medindo sua ADCC e sua CDC e semelhantes. A segurança e o efeito terapêutico do anticorpo em humanos podem ser avaliados usando um modelo apropriado de uma espécie animal relativamente próxima à humana. a. Aumento da atividade de ADCC
[0067]Os anticorpos afucosilados da presente divulgação têm atividade de ADCC aumentada em comparação com os anticorpos produzidos usando métodos padrão.
[0068]“Atividade de ADCC”, como usado nesse documento, refere-se à capacidade de um anticorpo de induzir uma reação de citotoxicidade celular dependente de anticorpo (ADCC). ADCC é uma reação mediada por células em que as células citotóxicas não específicas do antígeno que expressam FcRs (por exemplo, células exterminadoras naturais (NK), neutrófilos e macrófagos) reconhecem anticorpos ligados à superfície de uma célula alvo e subsequentemente causam lise da (isto é, “Matar”) célula alvo. As células mediadoras primárias em ADCC são células assassinas naturais (NK). As células NK expressam FcγRIII, com FcγRIIIa sendo um receptor de ativação e FcγRIIIB um receptor de inibição. Os monócitos expressam FcγRI, FcγRII e FcγRIII. A atividade de ADCC pode ser avaliada diretamente usando um ensaio in vitro, como o ensaio descrito no Exemplo 3.
[0069]A atividade de ADCC pode ser avaliada diretamente usando um ensaio in vitro. Em algumas modalidades, a atividade de ADCC de anticorpos afucosilados da divulgação é pelo menos 0,5, 1, 2, 3, 5, 10, 20, 50, 100 vezes maior do que a do próprio controle de tipo selvagem.
[0070]Uma vez que os anticorpos afucosilados têm uma atividade de ADCC aumentada, os anticorpos terapêuticos que são afucosilados podem ser administrados em quantidades ou concentrações mais baixas em comparação com suas contrapartes fucosiladas. Em algumas modalidades, a concentração de um anticorpo afucosilado da presente divulgação pode ser reduzida em pelo menos 2, 3, 5, 10, 20, 30, 50 ou 100 vezes em comparação com sua contraparte fucosilada. Em algumas modalidades, um anticorpo afucosilado da presente divulgação pode exibir uma maior lise celular alvo máxima em comparação com sua contraparte de tipo selvagem. Por exemplo, a lise máxima de células alvo de um anticorpo afucosilado da presente divulgação pode ser 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 40%, 50% ou superior do que sua contraparte de tipo selvagem. b. Aumento da atividade de CDC
[0071]Os anticorpos afucosilados da presente divulgação têm maior atividade de citotoxicidade dependente do complemento (CDC) em comparação com anticorpos produzidos usando métodos padrão.
[0072]“Atividade de CDC”, como usada nesse documento, refere-se à reação de um ou mais de componentes do sistema do complemento que reconhece o anticorpo ligado a uma célula alvo e, subsequentemente, causa a lise da célula alvo. Os anticorpos afucosilados da presente divulgação não reduzem ou suprimem a atividade de CDC, mas, em vez disso, eles mantêm a atividade de CDC similar à, ou maior do que, sua contraparte fucosilada.
[0073]A presente invenção fornece adicionalmente anticorpos afucosilados com função CDC intensificada. Em uma modalidade, as variantes Fc da invenção aumentaram a atividade de CDC. Em outra modalidade, os referidos anticorpos afucosilados têm atividade de CDC que é pelo menos 2 vezes, ou pelo menos 3 vezes, ou pelo menos 5 vezes ou pelo menos 10 vezes ou pelo menos 50 vezes ou pelo menos 100 vezes maior do que aquela de uma molécula comparável.
4. Uso de anticorpos afucosilados
[0074]Os anticorpos afucosilados da presente divulgação podem ser administrados por via intravenosa (iv), subcutânea (sc), intramuscular (im), intradérmica (id), intraperitoneal (ip) ou por meio de qualquer superfície mucosa, por exemplo, oralmente (p.o.), sublingualmente (sl), bucal, nasal, retal, vaginal ou por via pulmonar.
[0075]Os anticorpos afucosilados são úteis para o tratamento ou a prevenção de várias doenças incluindo câncer, doenças inflamatórias, doenças imunes e autoimunes, alergias, doenças de órgãos circuladores (por exemplo, arteriosclerose) e infecções virais ou bacterianas.
[0076]A dose dos anticorpos afucosilados da invenção irá variar dependendo do indivíduo e do modo particular de administração. A dosagem necessária irá variar de acordo com uma série de fatores conhecidos pelos habilitados na técnica,
incluindo o, mas não se limitando ao, anticorpo alvo, a espécie do indivíduo e, o tamanho/peso do indivíduo. As dosagens podem variar de 0,1 a 100.000 μg/kg de peso corporal. Os anticorpos afucosilados podem ser administrados em dose única ou em doses múltiplas. Os anticorpos afucosilados podem ser administrados uma vez em um período de 24 horas, várias vezes durante um período de 24 horas ou por infusão contínua. Os anticorpos afucosilados podem ser administrados continuamente ou em um horário específico. As doses eficazes podem ser extrapoladas a partir de curvas dose-resposta obtidas a partir de modelos animais.
4. Modalidades específicas
[0077]As modalidades específicas da presente invenção incluem o, mas não estão limitadas ao, seguinte: (1) uma célula recombinante tendo baixa fucosilação que compreende uma sequência de ácidos nucleicos que codifica uma enzima modificada da via de fucosilação.
[0078](2) A célula recombinante de acordo com (1), em que a enzima modificada é derivada de GDP-manose 4,6- desidratase (GMD), GDP-4-ceto-6-desoxi-D-manose epinierase- redutase (FX) ou fucosiltransferase (FUT).
[0079](3) A célula recombinante de acordo com (1), em que a enzima modificada é derivada de fucosiltransferase (FUT).
[0080](4) A célula recombinante de acordo com (1), em que a enzima modificada é derivada de α-1,6- fucosiltransferase (FUT8).
[0081](5) A célula recombinante de acordo com (1), em que a sequência de ácidos nucleicos é selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 3, 5, 7, 9, 11, 15 e qualquer combinação das mesmas.
[0082](6) A célula recombinante, de acordo com (1), em que a enzima modificada tem uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 4, 6, 8, 10, 12, 16 e qualquer combinação das mesmas.
[0083](7) A célula recombinante de acordo com (1), em que a enzima modificada reduz ou inibe a atividade da enzima de tipo selvagem, da qual a enzima modificada é derivada, na célula hospedeira.
[0084](8) A célula recombinante de acordo com (1), em que a enzima modificada inibe ou reduz a fucosilação na célula hospedeira.
[0085](9) A célula recombinante de acordo com (1), em que menos de 10% das proteínas produzidas na célula é fucosilado.
[0086](10) A célula recombinante de acordo com (1) compreendendo adicionalmente um ácido nucleico que codifica um anticorpo.
[0087](11) A célula recombinante de acordo com (10), em que o anticorpo é expressado na célula como um anticorpo afucosilado.
[0088](12) Um anticorpo afucosilado produzido na célula recombinante de (11).
[0089](13) O anticorpo afucosilado de acordo com (12) que é pelo menos 90% afucosilado.
[0090](14) O anticorpo afucosilado de acordo com (12), em que o anticorpo afucosilado tem atividade de citotoxicidade celular dependente de anticorpo (ADCC) aumentada em comparação com sua contraparte fucosilada.
[0091](15) O anticorpo afucosilado de acordo com (12),
em que a atividade de citotoxicidade dependente do complemento (CDC) do anticorpo afucosilado não é reduzida ou suprimida em comparação com sua contraparte fucosilada.
5. Modalidades adicionais
[0092]Modalidades adicionais da presente invenção incluem o, mas não estão limitadas ao, seguinte: (1) Um método para a produção de um anticorpo afucosilado, que compreende: introduzir um ácido nucleico que codifica pelo menos uma enzima modificada para uma célula hospedeira para produzir o anticorpo afucosilado na célula hospedeira.
[0093](2) O método de acordo com (1), em que a enzima modificada é derivada de GDP-manose 4,6-desidratase (GMD), GDP-4-ceto-6-desoxi-D-manose epinierase-redutase (FX), ou fucosiltransferase (FUT).
[0094](3) O método de acordo com (1), em que a enzima modificada é derivada de fucosiltransferase (FUT).
[0095](4) O método de acordo com (1), em que a enzima modificada é derivada de α-1,6-fucosiltransferase (FUT8).
[0096](5) O método de acordo com (1), em que a enzima modificada inibe a atividade das enzimas de fucosilação de tipo selvagem na célula hospedeira.
[0097](6) O método de acordo com (1), em que a enzima modificada inibe e/ou reduz a fucosilação do anticorpo na célula hospedeira.
[0098](7) O método de acordo com (1), em que o anticorpo afucosilado aumentou ADCC.
[0099](8) O método de acordo com (1), em que a atividade de CDC do anticorpo afucosilado não é reduzida ou suprimida.
[00100](9) Um método para produzir um anticorpo afucosilado, que compreende: a) fornecer uma célula hospedeira, b) introduzir um ácido nucleico que codifica pelo menos uma enzima modificada na célula hospedeira, e c) produzir um anticorpo afucosilado na célula hospedeira.
[00101](10) O método de acordo com (9), em que na etapa (a), a célula hospedeira compreende pelo menos um ácido nucleico que codifica um anticorpo.
[00102](11) O método de acordo com (9), a introdução adicional de um ácido nucleico que codifica um anticorpo para a célula hospedeira após a etapa (b).
[00103](12) O método de acordo com (9), em que a enzima modificada é derivada de GDP-manose 4,6-desidratase (GMD), GDP-4-ceto-6-desoxi-D-manose epinierase-redutase (FX), e/ou fucosiltransferase (FUT).
[00104](13) O método de acordo com (9), em que a enzima modificada é derivada de fucosiltransferase (FUT).
[00105](14) O método de acordo com (9), em que a enzima modificada é derivada de α-1,6-fucosiltransferase (FUT8).
[00106](15) O método de acordo com (9), em que a enzima modificada inibe a atividade das enzimas de fucosilação na célula hospedeira.
[00107](16) O método de acordo com (9), em que a enzima modificada inibe e reduz a glicosilação do anticorpo na célula hospedeira.
[00108](17) O método de acordo com (9), em que o anticorpo afucosilado aumentou ADCC.
[00109](18) O método de acordo com (9), em que a atividade de CDC do anticorpo afucosilado não é reduzida ou suprimida.
[00110](19) Um anticorpo afucosilado produzido por um método de acordo com (1) ou (9), em que o anticorpo afucosilado tem atividade de ADCC aumentada.
[00111](20) O anticorpo, de acordo com (19), em que o anticorpo afucosilado é um anticorpo humano ou um fragmento do mesmo.
[00112](21) O anticorpo de acordo com (19), em que o anticorpo afucosilado mantém a atividade de CDC original.
[00113](22) Uma composição farmacêutica compreendendo o anticorpo afucosilado de acordo com (19) e um carreador ou excipiente farmaceuticamente aceitável.
[00114](23) Uma célula sem ou com baixa fucosilação compreendendo um ácido nucleico que codifica pelo menos uma enzima modificada.
[00115](24) Um anticorpo afucosilado produzido por: a) introdução de um ácido nucleico que codifica pelo menos uma enzima modificada da via de fucosilação em uma célula hospedeira que expressa um anticorpo com fucose, e b) cultivar a célula hospedeira para produzir o anticorpo fucosilado na célula hospedeira.
[00116](25) O anticorpo afucosilado de acordo com (24), em que a enzima modificada é derivada de GDP-manose 4,6- desidratase (GMD), GDP-4-ceto-6-desoxi-D-manose epinierase- redutase (FX) ou Fucosiltransferase (FUT).
[00117](26) O anticorpo afucosilado de acordo com (25), em que a enzima modificada é derivada da fucosiltransferase.
[00118](27) O anticorpo anti-CD20 afucosilado de acordo com (26), em que a enzima modificada é derivada de α-1,6- fucosiltransferase.
[00119](28) O anticorpo anti-CD20 afucosilado, de acordo com (24), em que a enzima modificada inibe a atividade das enzimas de fucosilação de tipo selvagem na célula hospedeira.
[00120](29) O anticorpo anti-CD20 afucosilado, de acordo com (24), em que a enzima modificada inibe e reduz a glicosilação do anticorpo na célula hospedeira.
[00121](30) O anticorpo anti-CD20 afucosilado de acordo com (24), em que o anticorpo afucosilado tem atividade aumentada de citotoxicidade celular dependente de anticorpo (ADCC).
[00122](31) O anticorpo anti-CD20 afucosilado de acordo com (24), em que a atividade de citotoxicidade dependente do complemento (CDC) do anticorpo afucosilado não é reduzida e suprimida.
[00123](32) O anticorpo anti-CD20 afucosilado de acordo com (24), em que o anticorpo afucosilado é um anticorpo anti- CD20 ou anti-ErbB2.
[00124](33) Um anticorpo afucosilato produzido por: a) fornecer uma célula hospedeira, b) introduzir um ácido nucleico que codifica pelo menos uma enzima modificada da via de fucosilação na célula hospedeira, c) introduzir um ácido nucleico que codifica um anticorpo com fucose, e d) produzir um anticorpo afucosilado na célula hospedeira.
[00125](34) O anticorpo afucosilado, de acordo com (33), em que a enzima modificada é derivada de GDP-manose 4,6- desidratase (GMD), GDP-4-ceto-6-desoxi-D-manose epinierase- redutase (FX) e/ou Fucosiltransferase (FUT).
[00126](35) O anticorpo afucosilado de acordo com (33), em que a enzima modificada é derivada de α-1,6- fucosiltransferase.
[00127](36) O anticorpo afucosilado de acordo com (33), em que o anticorpo tem citotoxicidade celular dependente de anticorpo (ADCC) aumentada.
[00128](37) O anticorpo afucosilado de acordo com (33), em que a atividade de citotoxicidade dependente do complemento (CDC) do anticorpo afucosilado não é reduzida e suprimida.
[00129](38) O anticorpo afucosilado de acordo com (33), em que o anticorpo afucosilado é um anticorpo anti-CD20 ou anti-ErbB2.
[00130](39) Composição farmacêutica, que compreende o anticorpo afucosilado de acordo com a reivindicação 1 ou 10 e um carreador ou excipiente farmaceuticamente aceitável.
[00131]Modalidades específicas adicionais da presente invenção incluem os, mas não estão limitadas aos, seguintes exemplos. EXEMPLO 1
PREPARAÇÃO DE UMA ENZIMA MODIFICADA NA VIA DE FUCOSILAÇÃO E LINHAS DE CÉLULA ESTÁVEIS QUE EXPRESSAM A ENZIMA MODIFICADA
1. Linhas de célula
[00132]A linha de célula comercial CHOdhfr(-) (ATCC CRL- 9096), que é um mutante de células CHO deficiente na atividade da di-hidrofolato redutase, foi adquirida no Culture Collection and Research Center (CCRC, Taiwan). A linha de célula CHOdhfr(-) foi separada em três culturas separadas e tratadas como a seguir:
[00133]A primeira cultura foi transfectada com um vetor de expressão que codifica RITUXAN® (Rituximab, um anticorpo monoclonal quimérico contra a proteína CD20). Um clone estável que expressa RITUXAN® foi obtido e identificado como RC79.
[00134]A segunda cultura foi transfectada com um vetor de expressão que codifica HERCEPTIN® (Trastuzumab, um anticorpo monoclonal contra a proteína HER2). Um clone estável expressando HERCEPTIN® foi obtido e identificado como HC59.
[00135]A terceira cultura não foi tratada e mantida como uma linha de célula CHOdhfr(-).
2. Construção de vetores de expressão que codificam enzimas modificadas de FUT8 e GMD
[00136]Vários vetores de expressão que codificam as enzimas modificadas de FUT8 e GMD foram construídos.
[00137]Os mutantes de F83M, F8M1, F8M2, F8M3 e F8D1 representam diferentes modificações de α-1,6- fucosiltransferase, a proteína FUT8 de tipo selvagem (Banco de Gene N° NP_058589.2). A Tabela 1 resume as modificações que foram feitas na sequência de ácidos nucleicos de tipo selvagem para cada vetor FUT8, bem como as alterações de aminoácidos resultantes na enzima expressada. Especificamente, F83M representa um mutante que possui três modificações na proteína FUT8 de tipo selvagem em R365A, D409A e D453A. F8M1, F8M2 e F8M3 representam mutantes que têm uma modificação, cada um em K369E, D409K e S469V na proteína FUT8 de tipo selvagem, respectivamente. F8D1 representa um mutante que tem uma eliminação de resíduos de aminoácidos na posição 365 a 386 na proteína FUT8 de tipo selvagem.
[00138]A Tabela 2 resume as modificações que foram feitas na sequência de ácidos nucleicos de tipo selvagem para o vetor GMD, bem como as alterações de aminoácidos resultantes na enzima expressada. Especificamente, o GMD4M mutante representa uma modificação de GDP-manose 4,6-desidratase, a proteína GMD de tipo selvagem (Banco de Gene N° NP_001233625.1), que tem quatro mutações na proteína GMD de tipo selvagem em T155A, E157A, Y179A e K183A.
[00139]Todas as sequência de ácidos nucleicos que codificam F83M, F8M1, F8M2, F8M3, F8D1 e GMD4M foram sintetizadas pela empresa GeneDireX e, em seguida, subclonadas no sítio PacI/EcoRv ou BamHI/EcoRV do vetor de expressão pHD (pcDNA3.1Hygro, Invitrogen, Carlsbad, CA, cat. N° V870-20 com gene dhfr) para formar plasmídeos pHD/F83M, pHD/F8M1, pHD/F8M2, pHD/F8M3, pHD/F8D1 e pHD/GMD4M.
3. Preparação de linhas de células recombinantes estáveis que expressam uma enzima modificada
[00140]Os plasmídeos pHD/F83M, pHD/F8M1, pHD/F8M2, pHD/F8M3, pHD/F8D1 e pHD/GMD4M foram transfectados em diferentes linhas de células, incluindo (a) uma linha de célula RC79 (célula CHO que expressa RITUXAN®), (b) uma linha de célula HC59 (célula CHO que expressa HERCEPTIN®), e (c) células CHOdhfr(-) (mutantes de células CHO deficientes em atividade de dihidrofolato redutase) por eletroporação (eletroporador PA4000 PULSEAGILE®, Cyto Pulse Sciences). a. Células RC79
[00141]As linhas de células transfectadas RC79 foram inicialmente cultivadas em meio de cultura RC79 (meio sem soro EX-CELL®302 contendo MTX 0,4 μM, 0,5 mg/mL de Geneticina, 0,05 mg/mL de Zeocina, Glutamax-I 4 mM e F-68 a 0,01%) com 0,1 a 0,25 mg/mL de Higromicina. Em seguida, as células transfectadas foram cultivadas em meio sem soro EX- CELL® 302 contendo 0,4 μM de MTX, 0,5 mg/mL de Geneticina, 0,05 mg/mL de Zeocina, Glutamax-I 4mM, F-68 a 0,01% e 0,25 mg/mL de Higromicina e isoladas pela aglutinina de Lens culinaris (LCA), como descrito abaixo, para gerar cinco grupamentos de células, incluindo RC79F83M, RC79F8M1, RC79F8M2, RC79F8M3, RC79F8D1 e linhas de células RC79-GMD4M. b. Células HC59
[00142]As linhas de células HC59 transfectadas foram inicialmente cultivadas em meio de cultura HC59 (Meio EX- CELL® 325 PF CHO contendo MTX 0,8 μM, 0,5 mg/mL de Geneticina, 0,05 mg/mL de Zeocina e Glutamax-I 4 mM) com 0,1 a 0,25 mg/mL de Higromicina. Em seguida, as células transfectadas foram cultivadas em meio EX-CELL® 325 PF CHO contendo MTX 0,8 μM, 0,5 mg/mL de Geneticina, 0,05 mg/mL de Zeocina, Glutamax-I 4 mM e 0,25 mg/mL de Higromicina e isoladas por LCA, como descrito abaixo, para gerar conjuntos de células da linha de célula HC59F83M. c. Células CHOdhfr(-)
[00143]As linhas de células CHOdhfr(-) transfectadas foram inicialmente cultivadas em Meio EX-CELL® 325 PF CHO contendo Glutamax-I 4 mM e 0,1 a 0,25 mg/mL de Higromicina. Em seguida, as células transfectadas foram cultivadas em meio EX-CELL® 325 PF CHO contendo Glutamax-I 4 mM, 0,25 mg/mL de higromicina e MTX 0,01 µM para gerar grupamentos de células da linha de células C109F83M.
4. Isolamento de células com baixa fucosilação
[00144]Aglutinina de Lens Culinaris rotulada com rodamina (LCA) (Vector Laboratories, Cat. RL-1042) foi usada nesse exemplo para selecionar as células com baixa fucosilação.
[00145]Todos os transfectantes de RC79, HC59 e CHO foram submetidos a meio de seleção primário contendo Higromicina como uma pressão de seleção seguida por seleção final usando LCA, que reconhece a estrutura de núcleo de trimanose α-1,6- fucosilada de oligossacarídeos N-ligados e compromete a expressão de células essa estrutura para uma via de morte celular. Transfectantes de RC79, HC59 ou CHO foram semeados a 1,2 x 105 células/mL em 2,5 mL de meio fresco com 0,4 mg/mL de LCA inicialmente e contados no dia 3 ou 4 para a viabilidade celular. As células foram cultivadas nesse meio de seleção inicial até a viabilidade celular atingir 80%. Após a viabilidade celular atingir 80%, as células foram recolocadas em suspensão em meio de seleção fresco com concentrações gradualmente crescentes de LCA a 1,2 x 105 células/mL. A seleção de LCA foi repetida várias vezes, até que uma concentração final de LCA de 0,6-1,2 mg/mL fosse atingida.
[00146]Para analisar o nível de fucose na superfície celular, as células foram rotuladas com LCA e analisadas por citometria de fluxo. Primeiro, as células foram semeadas em meio completo sem LCA por 14 dias para remover a interferência de sinal do agente de seleção LCA. Em seguida, 3 x 105 células foram lavadas com 1 mL de PBS gelado duas vezes e recolocadas em suspensão em 200 mL de PBS frio contendo 1% de albumina de soro bovino e 5 μg/mL de LCA. Após incubação em gelo por 30 min, as células foram lavadas com 1 mL de PBS gelado duas vezes. As células foram recolocadas em suspensão em 350 μl de PBS frio e analisadas usando um citômetro de fluxo FACScalibur (BD Biosciences, San Jose, CA).
[00147]Em seguida, 1 x 107 células foram lavadas com 10 mL de PBS gelado duas vezes e recolocadas em suspensão em 6,5 mL de PBS gelado contendo 1% de albumina de soro bovino e 5 μg/mL de LCA. Após incubação em gelo por 30 min, as células foram lavadas com 10 mL de PBS frio duas vezes. As células foram recolocadas em suspensão em 1 mL de PBS gelado com 1% de soro fetal bovino inativado pelo calor (GIBCO, Cat. 10091-148) e Antibiótico-Antimicótico (Invitrogen, Cat.15240062).
[00148]As células foram analisadas e classificadas por Classificador de Células FACSAria ou Influx (BD Biosciences, San Jose, CA). Para clones diferentes, 1-3 rodadas de classificação foram necessárias para gerar uma população homogênea de células com baixos níveis de fucosilação. Além disso, os clones estáveis com baixa fucosilação foram isolados usando um sistema CLONEPIX 2 (MOLECULAR DEVICES®) e transferidos para placas de 96 poços. Após cultura por aproximadamente duas semanas, as células foram transferidas para placas de 6 poços e analisadas novamente por citometria de fluxo. As células com baixa fucosilação foram então transferidas para um tubo de filtro para cultura em batelada semicontínua para avaliar o desempenho celular e o nível de fucosilação do anticorpo purificado a partir das células obtidas.
5. Preparação da linha de célula C109F83M para expressar RITUXAN
[00149]Após as células CHOdhfr(-) de baixa fucosilação (células C109F83M) serem isoladas por LCA, as células foram transfectadas com um ácido nucleico que codifica RITUXAN® por eletroporação (eletroporador PA4000 PULSEAGILE, Cyto Pulse Sciences). O único clone de baixa fucose de C109F83M,
AF97, foi isolado e transfectado com um ácido nucleico que codifica RITUXAN® por eletroporação para expressar RITUXAN®. O transfectante foi transferido para um frasco 25T contendo meio não seletivo para crescimento de recuperação. Após 48 horas, os transfectantes foram cultivados em meio seletivo contendo Glutamax-I 4 mM, Higromicina-B, Zeocina e MTX a 0,01 μM. Uma única célula foi coletada usando o Sistema CLONEPIX 2 para gerar o clone AF97anti-CD20.
[00150]As células obtidas eram células CHOdhfr(-) de baixa fucosilação que expressam RITUXAN e são referidas aqui como a linha de célula AF97anti-CD20. EXEMPLO 2
EXPRESSÃO E ANÁLISE DE ANTICORPOS AFUCOSILADOS
1. Expressão e purificação do anticorpo
[00151]As células com atividade de baixa fucosilação obtidas no Exemplo 1 foram cultivadas em lote ou batelada semicontínua para expressão de anticorpos. Os anticorpos purificados das células foram submetidos a uma análise de monossacarídeo para análise de quantificação das cadeias de açúcar nas regiões Fc.
[00152]Células RC79 recombinantes foram cultivadas em meio livre de soro EX-CELL® 302 contendo Glutamax a 4 mM e 0,01% de F-68, e mantidas em incubadora agitadora (Infors Multitron Pro) com 37°C e CO2 a 5%.
[00153]As células HC79 recombinantes foram cultivadas em meio EX-CELL® 325 PF CHO contendo MTX a 0,8 μM, 0,5 mg/mL de Geneticina, 0,05 mg/mL de Zeocina, Glutamax-I a 4mM e 0,25 mg/mL de Higromicina, e mantidas em incubadora de agitação (Infors Multitron Pro) com 37°C e CO2 a 5%.
[00154]Os parâmetros da cultura celular foram monitorados rotineiramente todos os dias. A densidade celular e a viabilidade foram determinadas por exclusão por azul de tripan usando um hemocitômetro. Quando a viabilidade celular estava abaixo de 60%, o meio condicionado foi coletado por centrifugação e os anticorpos expressados foram purificados com resina de proteína A. A coluna de proteína A foi equilibrada com Tris 0,1 M, pH 8,3 para 5 volumes de coluna e depois carrega a amostra na coluna. As proteínas não ligadas foram removidas por lavagem com Tris 0,1 M, pH 8,3 (para 2 volumes de coluna) e PBS, pH 6,5 (para 10 volumes de coluna). A coluna foi adicionalmente lavada com acetato de sódio 0,1 M, pH 6,5 (para 10 volumes de coluna). Finalmente, os anticorpos foram eluídos com glicina 0,1 M, pH 2,8 e neutralizados com Tris 0,1 M, pH 8,3 para igual volume de eluição.
2. Determinação do perfil de N-glicano do anticorpo
[00155]O perfil de N-glicano foi analisado pelo Sistema ACQUITY UPLC®. Primeiro, 0,3 mg de amostra de anticorpo foi digerida com PNGase-F de 3 U em 0,3 mL de tampão de digestão (Tris-HCl 15 mM, pH 7,0) a 37°C por 18 horas. Os N-glicanos liberados foram separados do anticorpo por ultrafiltração usando um dispositivo AMICON® Ultra-0,5 mL 30K a 13.000 rpm por 5 min e depois liofilizados por 3 h. Em seguida, os N- glicanos secos foram dissolvidos em 30 μL de ddH2O e 45 μL de reagente de rotulação 2-AB (solvente antranilamida 0,34 M e cianoboro-hidreto de sódio 1 M em DMSO-ácido acético (7:3 v/v)) e incubados a 65°C por 3 horas. O excesso de reagente de rotulação 2-AB foi removido com uma coluna de exclusão de tamanho PD MINITRAP G10. Os N-glicanos rotulados foram liofilizados durante a noite e redissolvidos em 50 μL de ddH2O para detecção por UPLC. Os perfis de N- glicano foram adquiridos pelo Sistema ACQUITY UPLC® com Coluna de Amida Glycan BEH a 60°C. As diferentes formas de N-glicanos foram separadas com formato de amônio 100 mM, pH 4,5/gradiente linear de acetonitrila.
[00156]Os resultados da citometria de fluxo revelaram ligação extremamente baixa de LCA na superfície das células que superexpressam a proteína F83M em todos os tipos de células. De forma similar, a ligação LCA não foi detectada nas células RC79 que superexpressam as proteínas F8M1, F8M2, F8M3, F8D1 ou GMD4M (dados não mostrados).
[00157]A Tabela 3 mostra o perfil de N-glicano de anticorpos produzidos em células RC79 e HC59 com uma via de fucosilação não modificada, bem como clones RC79 e HC59, cuja via de fucosilação foi modificada por superexpressão da enzima modificada de F83M. Os dados na Tabela 3 mostram que a maioria dos anticorpos anti-CD20 e anti-ErbB2 produzidos nas células com uma via de fucosilação não modificada foram fortemente fucosilados. Especificamente, apenas 3,67% dos anticorpos anti-CD20 e 3,64% dos anticorpos anti-ErbB2 foram afucosulados nessas células. Em contraste, os anticorpos produzidos nas células que superexpressam a enzima modificada de F83M tinham níveis de fucosilação muito baixos. Especificamente, cerca de 98,86-98,91% do anti-CD20 e cerca de 92,12-96,52% dos anticorpos anti-ErbB2 foram afucosilados nas células que superexpressam a enzima modificada de F83M.
[00158]Além disso, a Tabela 4 mostra o perfil de N- glicano de anticorpos produzidos em células RC79 tendo uma via de fucosilação não modificada, bem como clones RC79 cuja via de fucosilação foi modificada por superexpressão de uma das enzimas modificadas de F8M1, F8M2, F8M3, F8D1 ou GMD4M. Os dados na Tabela 4 mostram que a maioria dos anticorpos anti-CD20 produzidos nas células RC79 com uma via de fucosilação não modificada foram fortemente fucosilados. Especificamente, apenas 3,67% dos anticorpos anti-CD20 estavam afucosulados nessas células. Em contraste, os anticorpos produzidos nas células RC79, que superexpressam uma enzima modificada, tinham níveis de fucosilação muito baixos. Especificamente, o nível de afucosilação de anticorpos anti-CD20 produzidos por células que superexpressam a enzima modificada de F8M1, F8M2, F8M3, F8D1 ou GMD4M estava entre cerca de 92,78% a cerca de 97,16%, como mostrado na Tabela 4.
[00159]A Tabela 4 também mostra que o nível de afucosilação de anticorpo produzido por células que expressam em excesso uma das enzimas modificadas de FUT8 (F8M1, F8M2, F8M3, F8D1) estava entre 95,70 a 97,16% e o nível de afucosilação de anticorpo produzido por células que superexpressam enzima modificada de GMD (GMD4M) foi de 92,78%. Esses resultados demonstram que o nível de afucosilação de um anticorpo produzido em células que superexpressam uma enzima modificada de FUT8 foi maior do que o de um anticorpo produzido em células que superexpressam a proteína mutante GMD.
[00160]Os resultados mostrados nas Tabelas 3 e 4 demonstram que as células hospedeiras, que foram manipuladas geneticamente para expressar anticorpos, podem ser transfectadas com um vetor que expressa uma enzima modificada na via de fucosilação (FUT8 ou GMD). Os resultados também mostram que os anticorpos produzidos nessas células transfectadas são afucosiladas.
[00161]Além disso, o nível de fucosilação de anticorpos produzidos na linha de células AF97 foi avaliado. Os resultados na Tabela 5 mostram que os anticorpos produzidos nas células AF97 que superexpressam a enzima modificada de F83M tinham níveis de fucosilação muito baixos. Especificamente, 97,83% do anticorpo anti-CD20 produzido nas células AF97 foram afucosilados. Em contraste, o RITUXAN® comercial (MABTHERA®) apresentou um nível de fucosilação de 3,92%.
[00162]Os resultados na Tabela 5 demonstram que os anticorpos afucosilados podem ser produzidos em células que são transfectadas primeiro com um ácido nucleico que codifica uma enzima modificada e, em seguida, transfectadas uma segunda vez com um ácido nucleico que codifica um anticorpo. Portanto, as células podem ser modificadas usando os métodos divulgados para produzir anticorpos afucosilados.
3. Expressão da proteína FUT8 em célula recombinante
[00163]O sedimento de células RC79 e células recombinantes que expressam a enzima modificada de FUT8 (isto é, F8M1, F8M2, F8M3 ou F8D1) foram lisados em 1% de Triton X-100 contendo um coquetel de inibidor de fosfatase (Sigma- Aldrich, Cat.S8820). A concentração de proteína nos sobrenadantes das células lisadas foi determinada por ensaio de proteína DC (compatível com detergente) (BIO-RAD). Os sobrenadantes, contendo 30 μg de proteína para cada amostra, foram separados por eletroforese em gel de dodecilsulfato de sódio-poliacrilamida a 12,5% (SDS-PAGE) e transferidos para membranas de nitrocelulose. As membranas foram bloqueadas por 1 h em temperatura ambiente usando Tris-HCl 25 mM (pH
7,4) contendo NaCl 120 mM, gelatina a 0,1% (p/p) e TWEEN® 20 a 0,1% (polietilenoglicol monolaurato de sorbitano) (v/p) e incubado durante a noite a 4°C com anticorpo anti-FUT8 (Abcam, Cat.ab204124, 1:500) e anticorpo de GAPDH (GeneTex, Cat.GT239, 1:10000), respectivamente. As membranas foram lavadas 3 vezes por 5 min com Tris-HCl 25 mM (pH 7,4) contendo NaCl 120 mM, gelatina 0,1% (p/p) e TWEEN® 20 0,1% (v/p), e então incubadas com IgG de cabra anti-coelho (Jackson ImmunoResearch, Cat.111-035-144) e HRP IgG de cabra anti- camundongo (GeneTex, Cat.GTX213111-01, 1:10000), respectivamente, por 1 h em temperatura ambiente. Após lavagens adicionais, as membranas foram analisadas com SIGMAFAST DAB com Intensificador de Metal (Sigma, Cat.D0426).
[00164]A Figura 1 é um western blot que mostra a expressão da proteína FUT8 nas células precursoras RC79 e nas células recombinantes RC79 que expressam uma enzima modificada. O nível de expressão da proteína FUT8 foi similar nas células recombinantes e nas células parentais RC79. Os resultados indicam que a produção de anticorpo afucosilado produzido nas células RC79 que expressam uma enzima modificada não foi relacionada ao nível de expressão da proteína FUT8. Esses resultados sugerem que as enzimas modificadas de FUT8 interferem com a proteína FUT8 de tipo selvagem nas células para inibir e/ou reduzir a via de fucosilação de modo que as células recombinantes produzam o anticorpo afucosilado de forma eficiente.
[00165]O mecanismo de produção de anticorpos afucosilados usando os métodos divulgados é novo e único em comparação com outros métodos que dependem da supressão ou regulação negativa do gene FUT8 de tipo selvagem ou utilizam interferência de RNA para reduzir a expressão da proteína FUT8.
4. Estabilidade da célula recombinante
[00166]A estabilidade das células recombinantes RC79 que expressam a enzima modificada de F83M foi avaliada.
[00167]As células recombinantes RC79 foram cultivadas em meio sem reagente de seleção por três meses. A fucosilação celular foi monitorada por análise de citometria de fluxo todas as semanas e a composição de N-glicano do anticorpo purificado foi determinada pelo Sistema ACQUITY UPLC® com Coluna de Amida Glycan BEH todos os meses durante três meses, como descrito acima. As propriedades de não ligação do LCA foram mantidas ao longo do período de avaliação de 90 dias, indicando que a via de fucosilação foi inibida e/ou reduzida ao longo do estudo (Figura 2).
[00168]Além disso, o nível de afucosilação de anticorpos anti-CD20 produzidos em cinco clones RC79F83M estáveis (R4- R8) foi avaliado ao longo de um período de 72 dias. Como mostrado na Tabela 6, todos os clones RC79F83M produziram anticorpos altamente afucosilados ao longo do estudo de 72 dias.
[00169]Os resultados desse estudo demonstram que as linhas de células recombinantes que expressam uma enzima modificada preparada pelos métodos divulgados são estáveis e produzem anticorpos altamente afucosilados por um longo período de tempo. EXEMPLO 3
ATIVIDADE DE ADCC DE ANTICORPOS AFUCOSILADOS
[00170]De modo a avaliar a atividade citotóxica in vitro do anti-CD20 purificado obtido do Exemplo 2, a atividade de ADCC foi medida de acordo com o método a seguir.
1. Preparação da solução de células de efeito
[00171]Sangue periférico humano de doadores saudáveis (100 mL) foi adicionado a tubos VACUTAINER® contendo heparina sódica. A amostra de sangue total foi diluída a 1:1 com meio RPMI 1640 sem soro (SF) e misturada suavemente. As células mononucleares foram separadas usando Ficoll-Paque PLUS aplicando suavemente 24 mL do sangue diluído no Ficoll-Paque e centrifugando a 400 x g por 32 min a 25°C. A camada leucocitária foi adequadamente distribuída em dois tubos de centrífuga de 50 mL contendo 20 mL de meio RPMI 1640 e então misturada duas vezes. Em seguida, a mistura foi centrifugada a 1.200 rpm por 12 min a 25°C para obter o sobrenadante. Meio RPMI 1640 SF (13 mL) foi adicionado ao sobrenadante para recolocar em suspensão as células PBMC. As células foram centrifugadas a 1.200 rpm por 12 min a 25°C para obter o sobrenadante. Meio de cultura RPMI (10 mL) foi adicionado ao sobrenadante para recolocar em suspensão as células PBMC. Um volume adequado de suspensão de células PBMC foi adicionado a um frasco 75T e a densidade celular final foi de 1,5 x 106 células/mL para cerca de 15 mL por frasco. IL-2 (2,5 μg/mL) foi adicionado a todos os frascos a uma concentração final de 3 ng/mL. As células PBMC foram incubadas em uma incubadora a 37ºC, CO2 a 5% por 18 horas. Células PBMC estimuladas com IL-2 foram coletadas e centrifugadas a 1.200 rpm por 5 min a 25°C e, em seguida, o sobrenadante foi descartado. PBS (10 mL) foi adicionado e misturado com as células. As células foram centrifugadas a 1.200 rpm por 5 min a 25°C para remover o sobrenadante. As células foram recolocadas em suspensão com RPMI AM e a concentração final foi ajustada para 2 x 107 células/mL.
2. Preparação da solução de células alvo
[00172]A suspensão de células de frascos 75T foi centrifugada a 1.000 rpm por 5 min para remover o sobrenadante e então lavada com 10 mL de 1X PBS. As células lavadas foram centrifugadas a 1.200 rpm por 5 min para remover o sobrenadante. As células foram recolocadas em suspensão por meio de ensaio RPMI para preparar 5 x 105 células/mL de solução de células alvo. A solução de células alvo (40 μL de 5 x 105 células/mL) foi adicionada aos poços da placa de cultura de células de 96 poços com fundo em V. Em seguida, 20 μL de solução RITUXAN® comercial preparada (MABTHERA®) (25-0,0025 μg/mL) (controle positivo), solução de anticorpo fucosilado (clone R1) (25-0,0025 μg/mL) ou meio de ensaio RPMI (controle negativo) foram adicionados aos poços e misturados com a solução de células alvo, respectivamente. As placas de cultura de células de 96 poços com fundo em V foram incubadas em incubadora a 37°C, CO2 a 5% por 30 a 60 min.
3. Ensaio de atividade de ADCC
[00173]A solução de célula efetora (40 μL de 8 x 105 células efetoras/poço) ou 40 μL de meio de ensaio RPMI foi(foram) adicionada(os) às placas para misturar com a solução de célula alvo. As placas foram centrifugadas a 300 x g por 4 min. As placas foram incubadas a 37°C, CO2 a 5% por 4 horas. Solução de lise (10 μL) de CYTOTOX 96® foi adicionada às placas dos grupos Tmax e BlkV por uma hora antes da coleta do sobrenadante. A placa de cultura de células de 96 poços de fundo em V foi centrifugada a 300 x g por 4 min, e os 50 μL do sobrenadante foram transferidos para os poços da placa de ensaio de fundo plano de placas de cultura de células de 96 poços.
[00174]Lactato desidrogenase (LDH) (2 μL) foi adicionado a 10 mL de diluente de controle positivo de LDH para preparar a solução de controle positivo de LDH. A solução de controle positivo de LDH preparada (50 μL) foi adicionada aos poços da placa de ensaio de fundo plano de 96 poços.
[00175]A mistura de substrato reconstituído com LDH (50 μL) foi adicionada a cada poço de teste das placas de ensaio. As placas foram cobertas e incubadas em temperatura ambiente no escuro por 30 min. A solução de parada (50 μL) foi adicionada a cada poço de teste das placas. A absorbância a 490 nm foi registrada imediatamente após a adição da solução de parada. Os valores de absorbância removidos do branco de cada grupo (S, PBMC, T, E Tmax) foram usados para calcular a atividade de ADCC pela fórmula listada abaixo. − = % = 100% − em que S é o valor de absorbância da liberação de LDH da amostra (célula alvo + PBMC + anticorpo anti-CD20); PBMC é o valor de absorbância da liberação de LDH da célula alvo e PBMC; E é o valor de absorbância da liberação de LDH de PBMC; T é o valor de absorbância da liberação espontânea de LDH da célula alvo; e Tmax é o valor de absorbância da liberação máxima de LDH da célula alvo.
[00176]O anticorpo anti-CD20 afucosilado (clone R1) induziu uma resposta DE ADCC significativamente mais forte e superior em células PBMC do doador 1 (Figura 3a) e do doador 2 (Figura 3b) em comparação com RITUXAN® comercial (MABTHERA®).
[00177]Como mostrado na Tabela 7, o EC50 do anticorpo anti-CD20 afucosilado do RC79F83M clone R1 foi significativamente menor do que o EC50 do RITUXAN® comercial, que é um anticorpo anti-CD20 fucosilado. Especificamente, o anticorpo anti-CD20 afucosilado (clone R1) tinha um EC50 de 1,7 ng/mL e 4,6 ng/mL em células PBMC dos doadores 1 e 2, respectivamente. Em contraste, o anticorpo anti-CD20 fucosilado (MABTHERA®)) teve um EC50 de 18,2 ng/mL e 35,0 ng/mL em células PBMC dos doadores 1 e 2, respectivamente.
[00178]Os resultados desse estudo demonstram que o anticorpo anti-CD20 afucosilado (clone R1) exibiu atividade de ADCC entre 7,68 vezes a 10,7 vezes mais forte do que o anticorpo anti-CD20 fucosilado (MABTHERA®). EXEMPLO 4
AFINIDADE DE LIGAÇÃO DE ANTICORPO AFUCOSILADO
[00179]A afinidade de ligação de anticorpos anti-CD20 afucosilados e fucosilados à proteína recombinante FcγRIIIa rotulada com His foi avaliada usando anticorpo anti- histidina (anti-His) acoplado a um chip BIACORE® CM5 com kit de acoplamento de amina e o assistente de imobilização do software de controle BIACORE® X100 Programas.
[00180]A proteína recombinante FcγRIIIa rotulada com His (1 μg/mL) foi injetada no chip CM5 imobilizado com anticorpo anti-His a uma vazão de 10 μL/min por 20 segundos.
[00181]Anticorpo anti-CD20 afucosilado do clone 1 (5, 10, 20, 40 e 80 nM), um anticorpo anti-CD20 fucosilado comercial RITUXAN® (MABTHERA®) (20, 40, 80, 160 e 320 nM), e um anticorpo anti-CD20 comercial afucosilado GAZYVA® (obinutuzumab) (5, 10, 20, 40 ou 80 nM) foram injetados através dos chips na vazão de 30 μL/min por 3 min,
respectivamente. O tampão de corrida fluiu através dos chips na vazão de 30 μL/min por 5 min. Glicina, pH 1,5 (10mM) foi injetada nos chips na vazão de 30 μL/min por 60 segundos.
[00182]O sensograma de cada ciclo foi analisado com o software de avaliação BIACORE® X100 para obter o valor da constante de dissociação de equilíbrio (KD), constante de taxa de associação (Ka) e constante de taxa de dissociação (Kd). O sensograma de cada ciclo foi ajustado pelo modelo de ligação Langmuir 1:1. Se o valor de Qui2 fosse menor que o valor de Rmax 1/10X, o modelo de ajuste era adequado e os parâmetros de ligação cinética eram confiáveis.
[00183]As Figuras 4a-4c mostram os sensogramas de SPR clássicos dos três anticorpos testados. Os sensogramas de SPR clássicos indicaram que as condições usadas nesse ensaio (por exemplo, tempo de associação, tempo de dissociação e faixa de concentração de anticorpo) eram adequadas. Além disso, os valores de Qui2 dos três anticorpos eram menores do que os valores de 1/10X Rmax, o que indicava que o modelo de Langmuir 1:1 era adequado para o ajuste do sensograma de todos os três anticorpos.
[00184]Como mostrado na Tabela 8, o anticorpo anti-CD20 afucosilado (clone R1) tinha uma afinidade de ligação mais de 10 vezes mais forte com FcγRIIIa em comparação com MABTHERA® (KD do clone R1 = 13,0 nM, MABTHERA® = 151,5 nM). Adicionalmente, o anticorpo anti-CD20 afucosilado (clone R1) tinha uma afinidade de ligação mais do que 3 vezes mais forte com FcγRIIIa em comparação com GAZYVA® (KD do clone R1 = 13,0 nM, GAZYVA® = 39,9 nM).
[00185]Os resultados deste estudo demonstram que o anticorpo anti-CD20 afucosilado (clone R1), preparado de acordo com a presente divulgação, tem uma maior afinidade de ligação com FcγRIIIa em comparação com um anticorpo anti- CD20 fucosilado comercial RITUXAN® (MABTHERA®), bem como o anticorpo anti-CD20 afucosilado comercial (GAZYVA®). EXEMPLO 5
ATIVIDADE DE CDC DE ANTICORPO AFUCOSILADO
[00186]A atividade de CDC de anticorpos afucosilados produzidos pelos métodos divulgados foi avaliada.
[00187]As células Daudi foram cultivadas com meio de cultura RPMI e subcultivadas quando a densidade celular atingiu 1 x 106 células/mL (densidade de subcultura: 2-3 x 105 células/mL). As células Daudi foram coletadas e centrifugadas a 300 rpm por 5 min. As células foram recolocadas em suspensão com meio de cultura RPMI para preparar uma suspensão de células a uma concentração de 1 x 105 células/mL. Após a ressuspensão, 100 μL de suspensão de células ou 100 μL de meio de cultura RPMI foram semeados nos poços das placas brancas de 96 poços.
[00188]RITUXAN® (MABTHERA®) comercialmente disponível e anticorpo anti-CD20 afucosilado (clone R1) foram preparados em solução salina em concentrações entre 120 μg/mL a 0,234 μg/mL. Em seguida, 25 μL de solução de RITUXAN® ou anticorpo anti-CD20 afucosilado (clone R1) a 120 μg/mL a 0,234 μg/mL foram adicionados aos poços de placas brancas de 96 poços contendo as células Daudi ou meio RPMI. O reagente CELLTITER- GLO® (20 μL) foi adicionado a cada poço e depois misturado. As placas foram colocadas em um agitador de microplacas a 750 rpm por 2 min e então incubadas em temperatura ambiente por 10 min no escuro. A intensidade luminescente foi detectada por um leitor multimodo conectado com um cassete luminescente de alta sensibilidade (tempo integrado: 1 segundo) para calcular os valores de EC50 dos anticorpos anti-CD20 e a atividade de CDC relacionada dos anticorpos.
[00189]A Figura 5 mostra que a atividade de CDC do anticorpo anti-CD20 afucosilado (clone R1) foi comparável com a de RITUXAN®. O valor de EC50 do anticorpo anti-CD20 afucosilado (clone R1) foi de 0,682 μg/mL, superior ao do RITUXAN® (EC50 = 0,582 μg/mL).
[00190]GAZYVA®, um anticorpo anti-CD20 comercial afucosilado, mostrou induzir a atividade de ADCC, mas suprimir a atividade de CDC (E. Mössener et al. (2010); C. Ferrara et al. (2011)). Os resultados obtidos por outros sugerem que a quantidade de GAZYVA® deve ser aumentada para se obter um tratamento eficaz do câncer. Em contraste, os resultados desse Exemplo e Exemplo 5 demonstram que o anticorpo anti-CD20 afucosilado produzido pelos métodos divulgados induz atividade de ADCC enquanto mantém a atividade de CDC similar à sua contraparte fucosilada. Portanto, o anticorpo anti-CD20 fucosilado da presente divulgação teve um desempenho melhor do que GAZYVA®. EXEMPLO 6
PROVA DE EFICÁCIA PARA O ANTICORPO AFUCOSILADO EM MODELOS ANIMAIS
[00191]O modelo de xenoenxerto subcutâneo de linfoma de células B foi usado nesse exemplo para provar a eficácia antitumoral do anticorpo fucosilado da presente divulgação. SU-DHL-4 é uma linha de célula de linfoma de células B que expressa alto nível de CD20 na membrana celular e pode crescer e formar um tumor sólido por via subcutânea. Assim, o modelo de xenoenxerto em camundongos SCID/Beige foi desenvolvido para comparar a eficácia antitumoral do anticorpo fucosilado (Clone R1) e RITUXAN® (MABTHERA®) disponível comercialmente.
[00192]As células SU-DHL-4 foram cultivadas com o meio de cultura RPMI (CM) em frascos. Quando a concentração de células atingiu 0,8-1,0 x 106 células/mL, a suspensão de células foi coletada e centrifugada a 300g por 5 min para remover o sobrenadante. As células foram recolocadas em suspensão com novo meio de cultura contendo parte do meio de condição (a razão de CM fresco:CM de condição = 9:1). As células foram subcultivadas em uma razão de 1 2 a 1:10 (número de células de semeadura: número de células de colheita total), e a concentração de células foi de pelo menos 1 x 105 células/mL. As placas de cultura foram incubadas a 37°C. As células SU-DHL-4 foram cultivadas em cinco frascos 150T. Quando a concentração de células atingiu 0,8 a 1,0 x 106 células/mL, a suspensão de células foi coletada em tubos de 50 mL e, em seguida, centrifugada a
1.200 rpm por 5 min para remover o sobrenadante. A concentração de células foi ajustada para 1 x 108 células/mL usando meio RPMI sem soro. A suspensão de células foi misturada com igual volume de MATRIGEL® em um centritubo de 50 mL usando uma seringa pré-resfriada com agulha 18 G em gelo. A concentração final de células foi de 5 x 107 células/mL. A mistura de células Matrigel-SU-DHL-4 (100 uL) a uma concentração de 5 x 107 células/mL foi injetada por via subcutânea no lado direito da área dorsal de cada camundongo (SCID/camundongo bege) usando uma seringa pré- resfriada de 1 mL com uma agulha 23G*1”. O número total de células de inoculação foi de 5 x 106 células. O volume do tumor de cada camundongo foi medido usando um calibrador a cada 3 ou 4 dias, e calculado pela equação: V = 0,5 x ab2, em que a e b são o comprimento e a largura do tumor, respectivamente.
[00193]Quando o volume do tumor atingiu cerca de 200 mm3 (198,25 ± 55,53 mm3), o que ocorreu aproximadamente 20 dias após a inoculação do tumor, os camundongos foram distribuídos em três grupos de cinco, sendo então tratados com solução salina (veículo), RITUXAN® comercialmente disponível (MABTHERA®), ou anticorpo anti-CD20 afucosilado (clone R1). Os camundongos foram injetados com 0,2 mL de 0,1 mg/mL de anticorpo semanalmente por 3 semanas. O peso corporal e o tamanho do tumor de todos os camundongos foram medidos duas vezes por semana por uma balança eletrônica e um paquímetro digital. No final do período de tratamento, os camundongos foram sacrificados e os tecidos tumorais foram removidos e pesados. Os tecidos tumorais foram então fixados em tampão de formalina a 10% em temperatura ambiente para posterior exame.
[00194]Como mostrado na Figura 6, o anticorpo anti-CD20 afucosilado (clone R1) mostrou eficácia antitumoral significativamente mais forte do que RITUXAN®. Houve diferença estatisticamente significativa (P <0,001, pelo teste t de Student) no volume do tumor entre o grupo de veículo e o grupo tratado com anticorpo anti-CD20 afucosilado (clone R1). Ao contrário, RITUXAN® não mostrou uma diferença estatisticamente significativa no volume do tumor quando comparado com o grupo apenas com veículo. O anticorpo anti- CD20 afucosilado (clone R1) suprimiu o crescimento do tumor de forma mais eficaz em comparação com RITUXAN® a uma dose de 1 mg/kg (clone R1 = 468 ± 148 mm3; RITUXAN® = 1407 ± 241 mm3) como mostrado na Tabela 9. Houve diferença estatisticamente significativa no volume do tumor entre os grupos de anticorpo anti-CD20 afucosilado (clone R1) e RITUXAN® (P <0,001).
[00195]O peso do tumor do grupo tratado com anticorpo anti-CD20 afucosilado (clone R1) foi significativamente menor do que o do grupo apenas com veículo (P <0,001), como mostrado na Figura 7. No entanto, RITUXAN® não apresentou uma diferença estatisticamente significativa no peso do tumor na mesma dose em comparação com o grupo com veículo. Assim, houve uma diminuição estatisticamente significativa no peso do tumor no grupo de anticorpo anti-CD20 afucosilado (clone R1) em comparação com o grupo com RITUXAN® (clone R1 = 0,27 ± 0,15 g; RITUXAN® = 0,62 ± 0,09 g, P<0,01), como mostrado na Tabela 9. O anticorpo anti-CD20 afucosilado (clone R1) inibiu o crescimento do tumor de forma muito mais eficiente do que RITUXAN®, o que corresponde aos resultados obtidos com o volume do tumor.
[00196]O peso corporal dos camundongos em todos os grupos aumentou gradualmente durante o período de tratamento, como mostrado na Figura 8.
[00197]Os resultados dos estudos sugerem que o anticorpo anti-CD20 afucosilado (clone R1) era seguro.
TABELA 1 Modificações da Enzima de FUT8 Empregada em Ensaios Localização DNA Localização de Aminoácido Código Tipo Selvagem Mutação de DNA1 SEQ ID NO aminoácido2 SEQ ID NO 1093-1095 AGG R365A F83M 1225-1227 GAC GCC 3 D409A 4 1357-1359 GAC D453A F8M1 1105-1107 AAG GAG 5 K369E 6 F8M2 1225-1227 GAC AAG 7 D409K 8 F8M3 1405-1407 TCC GTG 9 S469V 10
CACGTGAGGAGGACCGACAA Eliminação de
GGTGGGCACCGAGGCCGCCT resíduos de F8D1 1087-1149 TCCACCCCATCGAGGAGTAC N/A3 11 12 aminoácidos de
ATG 365 a 386 (SEQ ID NO: 17) 1 Localização da sequência de DNA com base na sequência de DNA de FUT8 de tipo selvagem da SEQ ID NO: 1 2 Localização de aminoácidos com base na sequência da proteína FUT8 de tipo selvagem da SEQ ID NO: 2 3 N/A = não aplicável TABELA 2 Modificações da Enzima de GMD Empregada em ensaios Localização de DNA Localização de Aminoácido Código Tipo Selvagem Mutação DNA1 SEQ ID NO aminoácido2 SEQ ID NO 463-465 ACC T155A 469-471 GAG E157A GMD4M GCC 15 16 535-537 TAC Y179A 547-549 AGG K183A 1 Localização da sequência de DNA com base na sequência de tipo selvagem da SEQ ID NO: 13 2 Localização de aminoácidos com base na sequência de tipo selvagem da SEQ ID NO: 14
TABELA 3 Perfil de N-glicano de anticorpos produzidos em células CHO com e sem superexpressão da enzima modificada de F83M w/o G0-GN G0F-GN G0 G0F Man5 G1 G1F Man6 G2 G2F Fuc. (%) MABTHERA® 0,11 0,72 0,71 42,36 1,26 1,16 44,35 0,11 0,32 8,89 3,67 RC79F83M 1,36 0,00 58,17 0,66 1,60 33,35 0,33 0,24 4,13 0,15 98,86 RITUXAN® Clone R1 (anti-CD20) RC79F83M 1,37 0,00 57,22 0,68 1,49 34,18 0,16 0,29 4,31 0,31 98,85 Clone R2 RC79F83M 1,28 0,00 59,20 0,62 2,48 31,62 0,30 0,26 4,06 0,17 98,91 Clone R3 HERCEPTIN® 0,13 0,73 0,82 42,07 1,32 1,15 44,04 0,22 n/a 9,50 3,64 HC59F83M 5,29 0 65,23 3,65 17,68 3,72 1,85 2,18 n/a 0,39 94,11 HERCEPTIN® Clone H1 (anti-ErbB2) HC59F83M 4,13 0 68,92 2,00 17,41 4,16 1,13 1,91 n/a 0,35 96,52 Clone H2 HC59F83M 3,07 0 68,74 5,26 15,08 3,51 2,28 1,72 n/a 0,34 92,12 Clone H3 w/o Fuc.: (quantidade de glicano total - quantidade de fucose)/quantidade de glicano total x 100%
TABELA 4 Perfil de N-glicano de anticorpo anti-CD20 produzido por células com e sem superexpressão da enzima modificada de F8M1, F8M2, F8M3, F8D1 ou GMD4M w/o G0-GN G0F-GN G0 G0F Man5 G1 G1F Man6 G2 G2F Fuc. (%) MABTHERA® 0,11 0,72 0,71 42,36 1,26 1,16 44,35 0,11 0,32 8,89 3,67 RC79F8M1 1,12 0,19 51,16 1,07 0,58 36,64 1,43 1,83 5,83 0,15 97,16 RC79F8M2 1,80 0,34 56,53 1,78 0,60 31,57 1,92 1,29 3,91 0,26 95,70 RC79F8M3 2,50 0,21 54,03 1,53 0,15 35,89 0,85 0,62 4,41 0,26 97,16 RC79F8D1 1,27 n/a 57,47 2,30 2,03 29,99 1,54 0,24 4,04 0,43 95,70 RC79GMD4M 1,80 0,67 41,58 2,33 0,6 35,35 3,23 2,53 5,66 0,58 92,78 w/o Fuc.: (quantidade de glicano total - quantidade de fucose)/quantidade de glicano total x 100%
TABELA 5 Perfil de N-glicano de anticorpo anti-CD20 produzido por células com e sem superexpressão da enzima modificada de F83M w/o Fuc.
G0-GN G0F-GN G0 G0F Man5 G1 G1F Man6 G2 G2F (%) MABTHERA® n/a 0,78 0,74 41,93 1,41 1,09 43,90 0,29 0,39 9,48 3,92 AF97antiCD20 4,50 n/a 62,00 0,51 10,62 16,32 1,25 2,88 1,51 0,41 97,83 w/o Fuc.: (quantidade de glicano total - quantidade de fucose)/quantidade de glicano total x 100%
TABELA 6 Estabilidade de anticorpos anti-CD20 afucosilados produzidos por células que superexpressam a enzima modificada de F83M Dia 0 Dia 28 Dia 56 Dia 72
MABTHERA® 3,67% 5,34% 3,42% 3,67%
RC79F83M Clone 98,86% 98,58% 99,68% 99,15% R4 RC79F83M Clone 98,86% 98,76% 98,57% 99,30% R5 RC79F83M Clone 98,90% 98,89% 99,57% 98,88% R6 RC79F83M Clone 99,46% 98,68% 99,47% 99,13% R7 RC79F83M Clone 98,88% 98,40% 99,08% 98,38% R8
TABELA 7 Valor EC50 e atividade de ADCC de anticorpos anti-CD20 fucosilados e afucosilados EC50 Atividade de ADCC R quadrado (ng/mL) Relacionada (Vezes) Doador 1 MABTHERA® 0,9742 18,2 1,00 RC79F83M 0,9667 1,7 10,70 Clone R1 Doador 2 MABTHERA® 0,9779 35,0 1,00 RC79F83M 0,9777 4,6 7,68 Clone R1
TABELA 8 Afinidade de ligação de FcγRIIIa de RITUXAN®, GAZYVA® e anticorpos afucosilados Ka (M-1S-1) Kd (S-1) KD (nM) Rmax (RU) Qui2
MABTHERA® 4,9 x 104 7,5 x 10-3 151,5 52,2 1,52
GAZYVA® 17,3 x 104 6,9 x 10-3 39,9 77,9 0,40
Clone R1 48,5 x 104 6,3 x 10-3 13,0 114,4 3,39
TABELA 9 Volume do tumor, peso do tumor e peso corporal de camundongos tratados em cada grupo Volume do Tumor Peso do Tumor Peso Corporal Grupo Nome Dose (mm3) (g) (g)
1 Veículo - 1652 ± 474 0,72 ± 0,12 19,5 ± 1,2 2 MABTHERA® 1 mg/kg 1407 ± 241 0,62 ± 0,09 20,7 ± 1,3 3 Clone R1 1 mg/kg 468 ± 184 0,27 ± 0,15 19,0 ± 1,2
Os valores representam médias ± D.P.

Claims (15)

REIVINDICAÇÕES
1. Célula recombinante tendo baixa fucosilação, caracterizada pelo fato de que que compreende uma sequência de ácidos nucleicos que codifica uma enzima modificada da via de fucosilação.
2. Célula recombinante, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a enzima modificada é derivada de GDP-manose 4,6-desidratase (GMD), GDP-4-ceto-6-desoxi-D- manose epinierase-redutase (FX), ou fucosiltransferase (FUT).
3. Célula recombinante, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a enzima modificada é derivada de fucosiltransferase (FUT).
4. Célula recombinante, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a enzima modificada é derivada de α-1,6-fucosiltransferase (FUT8).
5. Célula recombinante, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a sequência de ácidos nucleicos é selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 3, 5, 7, 9, 11, 15 e qualquer combinação das mesmas.
6. Célula recombinante, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a enzima modificada tem uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 4, 6, 8, 10, 12, 16 e qualquer combinação das mesmas.
7. Célula recombinante, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a enzima modificada reduz ou inibe a atividade da enzima de tipo selvagem, da qual a enzima modificada é derivada, na célula hospedeira.
8. Célula recombinante, de acordo com a reivindicação 1,
caracterizada pelo fato de que a enzima modificada inibe ou reduz a fucosilação na célula hospedeira.
9. Célula recombinante, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que menos de 10% das proteínas produzidas na célula é fucosilado.
10. Célula recombinante, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que compreende adicionalmente um ácido nucleico que codifica um anticorpo.
11. Célula recombinante, de acordo com a reivindicação 10, caracterizada pelo fato de que o anticorpo é expressado na célula como um anticorpo afucosilado.
12. Anticorpo afucosilado, caracterizado pelo fato de ser produzido na célula recombinante conforme definida na reivindicação 11.
13. Anticorpo afucosilado, de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que é pelo menos 90% afucosilado.
14. Anticorpo afucosilado, de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que o anticorpo afucosilado tem atividade aumentada de citotoxicidade celular dependente de anticorpo (ADCC) em comparação com sua contraparte fucosilada.
15. Anticorpo afucosilado, de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que a atividade de citotoxicidade dependente do complemento (CDC) do anticorpo afucosilado não é reduzida ou suprimida em comparação com sua contraparte fucosilada.
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