JP2008301827A - マンノースまたはキシロースに基づく陽性選択 - Google Patents
マンノースまたはキシロースに基づく陽性選択 Download PDFInfo
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Abstract
【解決手段】少なくとも1種の化合物を含む培地上または中で培養された植物細胞集団から、形質転換の結果として代謝優勢を有する細胞を同定または選択するにあたり、i)前記細胞を、ホスホ糖−イソメラーゼ、ホスホ糖−ムターゼ、ホスファターゼ、および糖−エピメラーゼからなる群より選択される、前記化合物の代謝に関与する酵素タンパク質をコードする領域をいずれかが含むヌクレオチド配列または共挿入ヌクレオチド配列で形質転換する、かつii)前記化合物がマンノースまたはキシロースもしくはそれらの誘導体または前駆体、またはマンノースまたはキシロースの代謝に直接または間接に関与する前記酵素タンパク質の基質であることを特徴とする方法。
【選択図】なし
Description
(1)マンノース−ホスフェートイソメラーゼをコードする領域を含むヌクレオチド配列または共挿入ヌクレオチド配列にて形質転換された、全植物およびそのような植物または植物細胞から由来する後代または種子であってもよいトランスジェニック植物細胞であって、該植物細胞中で該領域が発現された場合に、化合物マンノースを含有する培地上または中において培養された植物細胞の集団から形質転換植物細胞を選択する方法において使用可能になるという代謝上の利点が該形質転換植物細胞に与えられるものであり、該共挿入ヌクレオチド配列が抗生物質耐性または除草剤耐性遺伝子ではない、トランスジェニック植物細胞、
(2)マンノース−ホスフェートイソメラーゼをコードする領域を含むヌクレオチド配列または共挿入ヌクレオチド配列にて形質転換された、全植物およびそのような植物または植物細胞から由来する後代または種子であってもよい、果実、圃場作物、小穀粒禾穀類および野菜からなる群より選択されるトランスジェニック植物細胞であって、該植物細胞中で該領域が発現された場合に、化合物マンノースを含有する培地上または中において培養された植物細胞の集団から形質転換植物細胞を選択する方法において使用可能になるという代謝上の利点が該形質転換植物細胞に与えられるものであり、該共挿入ヌクレオチド配列が抗生物質耐性または除草剤耐性遺伝子ではない、トランスジェニック植物細胞、
(3)化合物がマンノースであり、ヌクレオチド配列または共挿入ヌクレオチド配列がマンノース−6−ホスフェートイソメラーゼをコードするものである、(1)または(2)記載の全植物およびそのような植物または植物細胞から由来する後代または種子であってもよいトランスジェニック植物細胞、
(4)ヌクレオチド配列の少なくとも1つが、当該配列が挿入された植物によって好まれるコドンが使用されて、当該配列の酵素タンパク質コード成分が内因性である植物中において非修飾DNAの発現で得られたのと実質的に類似している酵素タンパク質を産生するように修飾されたDNAを含む、(1)〜(3)のいずれか1つに記載の全植物およびそのような植物または植物細胞から由来する後代または種子であってもよいトランスジェニック植物細胞、
(5)毒素、抗生物質および除草剤からなる群より選択される少なくとも1つに対する耐性をコードしており、その発現が毒素、抗生物質および除草剤からなる群より選択される少なくとも1つに対する耐性を形質転換細胞に与えるヌクレオチド配列を含む、請求項(1)〜(4)のいずれか1つに記載の全植物およびそのような植物または植物細胞から由来する後代または種子であってもよいトランスジェニック植物細胞であって、該植物中における該配列の発現により、該形質転換植物細胞が、それぞれマンノース、マンノース−6−ホスフェートイソメラーゼ、キシロースまたはD−マンノサミンのほかに毒素、抗生物質または除草剤を含有する培地上または中において培養された植物細胞の集団から形質転換植物細胞を選択する方法において使用可能になるものである、トランスジェニック植物細胞、
(6)少なくとも2種の異なる選択遺伝子が共挿入された所望ヌクレオチド配列を含む、(1)〜(5)のいずれか1つに記載の全植物およびそのような植物または植物細胞から由来する後代または種子であってもよいトランスジェニック植物細胞、
(7)植物細胞がトマト、マンゴ、モモ、リンゴ、ナシ、イチゴ、バナナおよびメロンからなる群より選択される植物由来である、(1)〜(6)のいずれか1つに記載の全植物およびそのような植物または植物細胞から由来する後代または種子であってもよいトランスジェニック植物細胞、
(8)植物細胞がキャノーラ、ヒマワリ、タバコ、シュガービート、トウモロコシおよびワタからなる群より選択される植物由来である、(1)〜(6)のいずれか1つに記載の全植物およびそのような植物または植物細胞から由来する後代または種子であってもよいトランスジェニック植物細胞、
(9)植物細胞がコムギ、オオムギおよびイネからなる群より選択される植物由来である、(1)〜(6)のいずれか1つに記載の全植物およびそのような植物または植物細胞から由来する後代または種子であってもよいトランスジェニック植物細胞、
(10)植物細胞がジャガイモ、ニンジン、レタス、キャベツおよびタマネギからなる群より選択される植物由来である、(1)〜(6)のいずれか1つに記載の全植物およびそのような植物または植物細胞から由来する後代または種子であってもよいトランスジェニック植物細胞。
i)前記細胞が(a)化合物の代謝に含まれるタンパク質をコードするか、および/または(b)当該タンパク質をコードする遺伝子の活性を制御する領域を含むヌクレオチド配列または共挿入ヌクレオチド配列で形質転換されていること、および
ii)前記化合物がマンノースもしくはキシロースまたはそれらの誘導体または前駆体、または前記タンパク質の基質であるか、または形質転換細胞によりそのような基質に代謝される(ただし前記化合物は前記タンパク質がマンノース−6−リン酸イソメラーゼである場合、マンノースではない。)。
i)前記細胞が(a)化合物の代謝に関与するタンパク質をコードするか、および/または(b)タンパク質をコードする遺伝子の活性を制御する領域を含むヌクレオチド配列または共挿入ヌクレオチド配列で形質転換されていること、およびii)前記化合物の細胞に対する毒性を低下させる薬剤を培地に添加する。
大腸菌ホスホマンノースイソメラーゼ(EC5.3.2.8)遺伝子は、プラスミドpGS63(マイルス,Hら、Gene32、41〜48頁(1984))(図1)由来であり、構築物はpBR322由来であり、その中の独自のPstIおよびHindIII部位の間の領域が、ホスホマンノースイソメラーゼの構造遺伝子(マンA)およびフマラーゼ(フムA(fum A))の隣接遺伝子のフラグメントを保持する大腸菌染色体の一部で置き換えられている。pGS63は、したがって、β−ラクタマーゼ遺伝子の部分を欠失しており、テトラサイクリン上で選択される。
p(EPL−マンノース)を、完全促進35Sプロモーター、大腸菌ホスホマンノースイソメラーゼおよびCaMVターミネーターコード領域を含むフラグメントを単離するためにHindIIIで消化した。単離フラグメントをバイナリーベクターpBKL4のHindIII部位にクローン化する(図4)。得られるプラスミドをp(BKL−マンノース)と名付ける。pBKL4中のHindIII部位をカナマイシン耐性遺伝子およびβ−グルクロニダーゼ(GUS)遺伝子の間に位置させる(図3)。マンノースキメラ遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子(NPTII)およびGUS遺伝子は、各々プロモーターおよびターミネーターを有する。図4は、プラスミドpBLK4のGUSおよびNPTII遺伝子の間に挿入されたキメラホスホマンノースイソメラーゼ遺伝子を含むp(BKL−マンノース)構築物を示す。
ソラナム・ツベロサム(Solanum tuberosum)「サツルナ(Saturna)」「ビンチェ(Bintje)」または「ディアネラ(Dianella)」の新芽培養を、2μMチオ硫酸銀を添加したLS基質(下記参照)上に温度は25℃で、培養を16時間明/8時間暗のサイクルに付してリンスマイアーおよびスコーグ(Physiol.Plant.、18:100〜127(1965))に記載のように維持する。保存培養を20〜40日後副次培養する。葉は新芽から除去し、それぞれ1個の節を有するように節セグメント(約0.8cm)に切断した。
共培養皿はLS基質(シュークロース30g/l)、寒天(8g/l)、2,4−ジクロロフェノキシ酢酸(2.0mg/l)およびトランス−ゼアチン(0.5mg/l)を含む。
新芽セグメントを細菌と72時間、白薄葉紙で覆ったペトリ皿中のLS−基質(上記で定義の通り)中の濾紙上で共培養する。本基質を以後「共培養基質」と呼ぶ。基質およびセグメントを滅菌濾紙で覆い、ペトリ皿を25℃に置き、16時間明/8時間暗のサイクルに付す。
共培養48時間後、新芽セグメントを800mg/lカルベニシリン添加LS−培地に移す。このように移したセグメントを、次いで穏やかに振り、付着アグロバクターを除去または破壊する。
このように洗浄したセグメントを、次いでトランス−ゼアチンの濃度が1mg/lである以外上記と同様であるLS−基質に移し、基質にジベレリン酸(0.1mg/l)およびカルベニシリン(800mg/l)および所望により硫酸カナマイシン(50mg/l)および/またはマンノース(0〜20g/l)および/またはシュークロース(0〜20g/l)を添加する。本基質を以後「選択/再生基質」と呼ぶ。
本セグメントを新鮮基質上で2週間間隔でまたは下記のように副次培養する。2〜4週間内に新芽がセグメントから発生し、新しい新芽の形成を約3〜4カ月続ける。
再生新芽をカルベニシリン(500mg/l)を加えたLS−基質から成る発根基質に移す。
新規発根再生新芽(植物)(高さ約2〜3cm)を発根基質から土壌に植え変え、16時間明/8時間暗サイクルおよび200〜400μE/sqm/秒の成育室に置く。植物が十分確立された場合、それらを温室に移し、そこでそれらを塊茎が発育し、植物の上部が老境を示すまで成育させる。
再生新芽のトランスジェニック遺伝子型を:
(a)ラッドケら(Theor.Appl.Genet.75,685〜694(1988))記載のNPTII測定を行う;または
(b)ホダルら(Plant.Sci.87,115〜122(1992))に従った共挿入β−グルクロニダーゼ遺伝子による酵素発現におけるGUS測定を行う;または
(c)マンノース代謝に関与する酵素、例えばホスホマンノースイソメラーゼをコードする挿入遺伝子のmRNAの発現を測定するまたは酵素の活性を測定する:ことにより確認する。
表1マンノースによる非形質転換ジャガイモ茎セグメント由来の新芽再生阻害
表2タバコ葉ディスクからの新芽再生の間、炭水化物源として作用するD−キシロースおよびD−キシルロースの能力の試験
表3ジャガイモ茎セグメントからの新芽再生の間、炭水化物源として作用するD−キシロースの能力の試験
表8
表9
形質転換組織: 1.4新芽/外植体
野生型組織: 1.7新芽/外植体
i)例えばホスホマンノースイソメラーゼコード遺伝子の挿入により、全般にまたはある組織/細胞型においてフルクトース−6−リン酸またはそれらの誘導体の濃度が減少した真核生物;
ii)例えばホスホマンノースイソメラーゼコード遺伝子の挿入により、全般にまたはある組織/細胞型においてマンノース−6−リン酸またはそれらの誘導体の濃度が増加した真核生物;
iii)細胞内にホスホマンノースイソメラーゼコード遺伝子を挿入したことにより、全体またはある細胞型のホスホマンノースイソメラーゼ活性が増加した、真核生物:
を産生することもまた認められよう。
Claims (10)
- マンノース−ホスフェートイソメラーゼをコードする領域を含むヌクレオチド配列または共挿入ヌクレオチド配列にて形質転換された、全植物およびそのような植物または植物細胞から由来する後代または種子であってもよいトランスジェニック植物細胞であって、該植物細胞中で該領域が発現された場合に、化合物マンノースを含有する培地上または中において培養された植物細胞の集団から形質転換植物細胞を選択する方法において使用可能になるという代謝上の利点が該形質転換植物細胞に与えられるものであり、該共挿入ヌクレオチド配列が抗生物質耐性または除草剤耐性遺伝子ではない、トランスジェニック植物細胞。
- マンノース−ホスフェートイソメラーゼをコードする領域を含むヌクレオチド配列または共挿入ヌクレオチド配列にて形質転換された、全植物およびそのような植物または植物細胞から由来する後代または種子であってもよい、果実、圃場作物、小穀粒禾穀類および野菜からなる群より選択されるトランスジェニック植物細胞であって、該植物細胞中で該領域が発現された場合に、化合物マンノースを含有する培地上または中において培養された植物細胞の集団から形質転換植物細胞を選択する方法において使用可能になるという代謝上の利点が該形質転換植物細胞に与えられるものであり、該共挿入ヌクレオチド配列が抗生物質耐性または除草剤耐性遺伝子ではない、トランスジェニック植物細胞。
- 化合物がマンノースであり、ヌクレオチド配列または共挿入ヌクレオチド配列がマンノース−6−ホスフェートイソメラーゼをコードするものである、請求項1または2記載の全植物およびそのような植物または植物細胞から由来する後代または種子であってもよいトランスジェニック植物細胞。
- ヌクレオチド配列の少なくとも1つが、当該配列が挿入された植物によって好まれるコドンが使用されて、当該配列の酵素タンパク質コード成分が内因性である植物中において非修飾DNAの発現で得られたのと実質的に類似している酵素タンパク質を産生するように修飾されたDNAを含む、請求項1〜3のいずれか1項に記載の全植物およびそのような植物または植物細胞から由来する後代または種子であってもよいトランスジェニック植物細胞。
- 毒素、抗生物質および除草剤からなる群より選択される少なくとも1つに対する耐性をコードしており、その発現が毒素、抗生物質および除草剤からなる群より選択される少なくとも1つに対する耐性を形質転換細胞に与えるヌクレオチド配列を含む、請求項1〜4のいずれか1項に記載の全植物およびそのような植物または植物細胞から由来する後代または種子であってもよいトランスジェニック植物細胞であって、該植物中における該配列の発現により、該形質転換植物細胞が、それぞれマンノース、マンノース−6−ホスフェートイソメラーゼ、キシロースまたはD−マンノサミンのほかに毒素、抗生物質または除草剤を含有する培地上または中において培養された植物細胞の集団から形質転換植物細胞を選択する方法において使用可能になるものである、トランスジェニック植物細胞。
- 少なくとも2種の異なる選択遺伝子が共挿入された所望ヌクレオチド配列を含む、請求項1〜5のいずれか1項に記載の全植物およびそのような植物または植物細胞から由来する後代または種子であってもよいトランスジェニック植物細胞。
- 植物細胞がトマト、マンゴ、モモ、リンゴ、ナシ、イチゴ、バナナおよびメロンからなる群より選択される植物由来である、請求項1〜6のいずれか1項に記載の全植物およびそのような植物または植物細胞から由来する後代または種子であってもよいトランスジェニック植物細胞。
- 植物細胞がキャノーラ、ヒマワリ、タバコ、シュガービート、トウモロコシおよびワタからなる群より選択される植物由来である、請求項1〜6のいずれか1項に記載の全植物およびそのような植物または植物細胞から由来する後代または種子であってもよいトランスジェニック植物細胞。
- 植物細胞がコムギ、オオムギおよびイネからなる群より選択される植物由来である、請求項1〜6のいずれか1項に記載の全植物およびそのような植物または植物細胞から由来する後代または種子であってもよいトランスジェニック植物細胞。
- 植物細胞がジャガイモ、ニンジン、レタス、キャベツおよびタマネギからなる群より選択される植物由来である、請求項1〜6のいずれか1項に記載の全植物およびそのような植物または植物細胞から由来する後代または種子であってもよいトランスジェニック植物細胞。
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