CN114760836A - 使用腋生分生组织的植物原位转化方法 - Google Patents

使用腋生分生组织的植物原位转化方法 Download PDF

Info

Publication number
CN114760836A
CN114760836A CN202080081868.2A CN202080081868A CN114760836A CN 114760836 A CN114760836 A CN 114760836A CN 202080081868 A CN202080081868 A CN 202080081868A CN 114760836 A CN114760836 A CN 114760836A
Authority
CN
China
Prior art keywords
plant
axillary
meristem
optionally
days
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202080081868.2A
Other languages
English (en)
Inventor
李常宝
余文金
钟衡
周华平
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Syngenta Crop Protection AG Switzerland
Original Assignee
Syngenta Crop Protection AG Switzerland
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Syngenta Crop Protection AG Switzerland filed Critical Syngenta Crop Protection AG Switzerland
Publication of CN114760836A publication Critical patent/CN114760836A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y202/00—Transferases transferring aldehyde or ketonic groups (2.2)
    • C12Y202/01—Transketolases and transaldolases (2.2.1)
    • C12Y202/01006—Acetolactate synthase (2.2.1.6)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8201—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation
    • C12N15/8209—Selection, visualisation of transformants, reporter constructs, e.g. antibiotic resistance markers
    • C12N15/821—Non-antibiotic resistance markers, e.g. morphogenetic, metabolic markers
    • C12N15/8212—Colour markers, e.g. beta-glucoronidase [GUS], green fluorescent protein [GFP], carotenoid
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8201—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation
    • C12N15/8202—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation by biological means, e.g. cell mediated or natural vector
    • C12N15/8205—Agrobacterium mediated transformation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8201—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation
    • C12N15/8213—Targeted insertion of genes into the plant genome by homologous recombination
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y205/00—Transferases transferring alkyl or aryl groups, other than methyl groups (2.5)
    • C12Y205/01—Transferases transferring alkyl or aryl groups, other than methyl groups (2.5) transferring alkyl or aryl groups, other than methyl groups (2.5.1)
    • C12Y205/01019—3-Phosphoshikimate 1-carboxyvinyltransferase (2.5.1.19), i.e. 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/20—Type of nucleic acid involving clustered regularly interspaced short palindromic repeats [CRISPRs]

Abstract

常规的基因转化需要组织培养，并且一些优良品系在组织培养中的转化效率非常低。本披露涉及植物原位转化方法。在一些方面，将植物的腋生分生组织创伤并与转化剂接触。然后将创伤腋生分生组织再生并用选择步骤处理，以产生可以产生转基因种子的转化的组织。

Description

使用腋生分生组织的植物原位转化方法
相关申请的交叉引用
本申请要求于2019年11月26日提交的临时申请62/940,268的优先权，并且将其通过援引以其全文并入本文。
技术领域
本发明涉及用于转化植物(如双子叶植物)的组合物和方法。特别地，本发明涉及植物原位(in planta)转化方法。
背景技术
基因组编辑被认为是植物育种的一场革命。尽管在多个植物系统方面已经取得了重大进展，但仍存在一些技术障碍需要克服。大多数基因组编辑方法依赖于组织培养。组织培养既费时又费力。常规的基因转化也需要组织培养，并且当使用这种方法时一些优良品系的转化效率非常低。无组织培养和非基因型依赖性方法将显著减少作物基因组编辑和转化所耗费的劳动力和时间。
发明内容
本披露涉及转化方法。如本文所述，通过如下方式研发了植物原位转化方法：创伤植物的腋生分生组织并向这些创伤腋生分生组织施用转化诱导剂，例如土壤杆菌属(Agrobacterium)。将顶端优势打破，以允许腋生分生组织再生为转化的腋生分生组织。创伤腋生分生组织内的细胞显示成功转化。然后使转化了的腋生分生组织在选择下(植物原位选择)生长成芽，并且这些芽显示是转化了的。由转化了的芽生长而来的整株植物也显示是转化了的。本文所述的方法在多种不同的双子叶植物和不同种质中显示是有效的。不希望受理论的约束，与依赖胚形成的其他常规转化方法不同，本文所述方法被认为是利用器官发生来产生转化的植物和植物部分。本文所述的方法可用于例如，将异源核酸或蛋白质引入植物细胞用于基因组编辑及转基因植物产生。
在一些方面，本披露提供了方法，该方法包括：a)提供包含腋生分生组织和芽顶端分生组织的植物，b)去除或创伤该腋生分生组织的至少一部分以产生创伤腋生分生组织区域，c)使该创伤腋生分生组织区域与异源多核苷酸和/或异源蛋白在其中该异源多核苷酸和/或异源蛋白进入创伤腋生分生组织区域的条件下接触，d)在步骤b)或步骤c)的同时或在步骤c)之后，去除该芽顶端分生组织或抑制该芽顶端分生组织的生长，以及e)使植物生长以再生该创伤腋生分生组织区域的至少一部分，以产生再生的腋生分生组织或芽。
在一些实施例中，腋生分生组织是两个腋生分生组织，创伤腋生分生组织区域是两个创伤腋生分生组织区域，并且再生的腋生分生组织是两个再生的腋生分生组织。在一些实施例中，该方法包括在步骤b)的同时去除或抑制芽顶端分生组织。在一些实施例中，该方法包括在步骤c)之后去除或抑制芽顶端分生组织。在一些实施例中，在接触后，将芽顶端分生组织去除或抑制2-7天，任选地3-4天。在一些实施例中，植物是双子叶植物，任选地大豆植物、烟草植物、豆植物、葵花植物、棉花植物、番茄植物、西瓜植物、南瓜植物、黄瓜植物、莴苣植物或胡椒植物。在一些实施例中，步骤c)包括使创伤腋生分生组织区域与异源多核苷酸接触，其中该异源多核苷酸包含选择性标记，并且其中该方法进一步包括使植物与选择剂接触以消除或减少未转化的组织，其中与该选择剂接触的至少一部分发生在步骤e)期间或之后。在一些实施例中，与选择剂接触包括(i)将选择剂添加到植物生长的培养基中，(ii)用该选择剂喷洒植物，或(iii)将该选择剂施用于创伤腋生分生组织区域和/或再生的腋生分生组织，或其组合，任选地其中该其组合是(i)与(iii)的组合。在一些实施例中，与选择剂接触持续一段时间，任选地至少一周，进一步任选地3-5周之间。在一些实施例中，选择剂是除草剂、抗生素、或不可代谢的糖。在一些实施例中，选择剂是草甘膦、草铵膦、壮观霉素、苄嘧磺隆-甲基、灭草烟、D-木糖、甘露糖或卡那霉素。在一些实施例中，该方法进一步包括对再生的腋生分生组织或该再生的腋生分生组织的样品进行测定，以评估转化细胞的存在或不存在和/或评估转化细胞的数目。在一些实施例中，该方法进一步包括使植物生长以产生种子，并且收获该种子，其中该种子任选地包含异源多核苷酸的至少一部分。在一些实施例中，该方法进一步包括使种子生长以产生子代植物，任选地其中该子代植物包含异源多核苷酸的至少一部分。在一些实施例中，异源多核苷酸编码或包含基因组编辑剂，或其中异源蛋白包含基因组编辑剂，任选地其中该基因组编辑剂是核酸酶或重组酶。在一些实施例中，异源多核苷酸包含编码Cas蛋白和/或指导RNA的一种或多种多核苷酸，或其中异源蛋白包含Cas蛋白，任选地其中该Cas蛋白是Cas9或Cas12a、或其功能变体。在一些实施例中，异源多核苷酸包含含有编码序列的表达盒。在一些实施例中，表达盒进一步包含可操作地连接至编码序列的启动子。在一些实施例中，编码序列编码目的蛋白或非编码RNA。在一些实施例中，其中步骤c)中的接触用土壤杆菌属、病毒颗粒、微粒、纳米颗粒、细胞膜穿透肽、气溶胶束、化学物、电穿孔、或压力进行。在一些实施例中，接触用土壤杆菌属或病毒颗粒进行，并且该接触包括感染步骤，以及孵育步骤。在一些实施例中，感染步骤进行30分钟至24小时，任选地1-9或5-12小时，并且孵育步骤在黑暗中进行至少2天，任选地3-7天。在一些实施例中，植物在1天龄-30天龄之间，任选地4天龄-7天龄。在一些实施例中，腋生分生组织是子叶腋芽、或真叶腋中的分生组织。在一些实施例中，该方法进一步包括在去除或抑制芽顶端分生组织之前去除植物的子叶。在一些实施例中，该方法进一步包括使再生的腋生分生组织生长成芽。
在其他方面，本披露提供植物或植物部分，该植物或植物部分通过如上述实施例中任一项所述的方法产生。在其他方面，本披露提供植物或植物部分，该植物或植物部分通过实例中提供的方法产生。在其他方面，本披露提供子代种子，该子代种子通过使植物与第二植物杂交或通过该植物自交产生。在其他方面，本披露提供衍生物或商品产品，该衍生物或商品产品产生或获得自植物或植物部分。
附图说明
图1是示出了示例大豆植物原位转化过程的图。
图2示出了用土壤杆菌属转化后腋生分生组织细胞中的CFP表达。
图3示出了用草甘膦选择7天后再生的腋生分生组织中的CFP表达。
图4示出了用草甘膦选择14天后再生的腋生分生组织中的CFP表达。
图5示出了转基因芽中的CFP表达。
图6示出了来自子叶区的葵花不定芽的器官发生。
图7示出了再生的葵花不定芽产生了正常的头部。
定义
尽管认为以下术语可以很好地为本领域的普通技术人员所理解，但是提出以下定义是为了使本披露主题容易理解。
除非下文中另有定义，本文所用的所有技术和科学术语旨在具有与本领域普通技术人员通常所理解的相同的含义。在此采用的技术的参考文献旨在参考本领域中通常理解的技术，包括对本领域的普通技术人员而言很清楚的那些技术的变化或等效技术的替换。
本文引用的所有的专利、专利公布、非专利公布对于引用中提及的有关句子或段落的传授内容通过引用以其全文并入。在术语冲突的情况下，以本说明书为准。
如本文使用的，术语“一个或一种(a或an)”或“该(the)”可以是指一个或多于一个，除非上下文清楚地并明确地另外指明。例如，“一个”内源核酸可以意指一个内源核酸或多个内源核酸。
术语“约”在本文用于表示大约、大致、约或在……左右。当术语“约”结合数值范围来使用时，它通过将边界延伸至高于以及低于所阐明的数值来限定这个范围。通常，术语“约”在本文中用于将数值限定至以20％的变化，优选地10％上下(更高或更低)地高于以及低于规定值。关于温度，术语“约”意指±1℃，优选±0.5℃。当术语“约”被用于本发明的上下文中(例如与温度或分子量值组合)时，确切值(即，无“约”)是优选的。
如本文使用的，术语“顶端优势”是指主芽支配并抑制腋生分生组织的生长的现象。顶端优势被认为是由生长素引起的，生长素向下移向腋生分生组织并抑制其生长。
如本文使用的，术语“腋芽”意指位于子叶或叶腋中的胚芽或器官发生芽。腋芽含有腋生分生组织，该腋生分生组织能够发育成枝芽或花簇。
如本文使用的，术语“腋生分生组织”是指位于植物茎的外侧，但不位于茎尖的含有干细胞的植物区域。
如本文所用，“外植体”是指源自植物或植物部分(例如种子)的组织、一个组织片或多个组织片。外植体可以是植物的一部分，例如未成熟胚、叶分生组织，或者可以源自植物或种子的芽、叶、未成熟胚或任何其他组织的一部分。
如本文使用的，术语“表达盒”是指在宿主细胞中能够指导特定核酸序列表达的核苷酸。在一些实施例中，表达盒包含以下、基本上由以下组成、或由以下组成：可操作地连接至目的核酸的一种或多种启动子序列(例如，一种或多种组成型/诱导型启动子序列、一种或多种组织特异性和/或器官特异性启动子序列和/或一种或多种发育阶段特异性启动子序列)，该目的核酸可操作地连接至终止序列。表达盒通常包含在宿主细胞中适当翻译目的核酸序列所需的序列。表达盒可以是嵌合的，意味着它的组分中的至少一种相对于它的其他组分中的至少一种是异源的。该表达盒可以是天然存在的但已经是以对于异源表达有用的重组形式而获得的表达盒。然而，典型地，表达盒相对于宿主是异源的(即该表达盒的特定核酸序列不是天然存在于该宿主细胞中的，并且必须已经通过转化事件引入到该宿主细胞或该宿主细胞的祖先中)。
如本文使用的，术语“基因组编辑剂”是指能够诱导细胞基因组中的缺失、插入、插入缺失(indel)、或其他修饰的药剂，例如，通过在该基因组中产生单链断裂或双链断裂。基因组编辑剂的实例包括CRISPR/Cas剂(例如，Cas蛋白和指导RNA)、转录激活子样效应子核酸酶(TALEN)、受DNA指导的核酸酶、大范围核酸酶、重组酶、和锌指核酸酶。Cas蛋白包括Cas9、Cas12a(也称为Cpf1)、C2c1、C2c2、和C2c3、以及其功能变体。示例Cas9和Cas12a蛋白包括化脓性链球菌(Streptococcus pyogenes)Cas9(SpCas9)、嗜热链球菌(Streptococcusthermophilus)Cas9(StCas9)、巴氏链球菌(Streptococcus pasteurianus)(SpaCas9)、空肠弯曲菌(Campylobacter jejuni)Cas9(CjCas9)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)(SaCas9)、新凶手弗朗西丝氏菌(Francisella novicida)Cas9(FnCas9)、灰色奈瑟球菌(Neisseria cinerea)Cas9(NcCas9)、脑膜炎奈瑟球菌(Neisseria meningitis)Cas9(NmCas9)、新凶手弗朗西丝氏菌Cpf1(FnCpfl)、氨基酸球菌属物种(Acidaminococcus sp.)Cpf1(AsCpfl)、或毛螺菌科(Lachnospiraceae)细菌ND2006 Cpf1(LbCpfl)。Cas蛋白的“变体”是指野生型Cas蛋白的蛋白或多肽衍生物，例如具有一个或多个点突变、插入、缺失、截短、融合蛋白、或其组合的蛋白。在某些实施例中，Cas变体是基本上保留了野生型Cas蛋白的核酸酶活性或具有比野生型Cas蛋白更好的核酸酶活性的功能变体。示例指导RNA包括单指导RNA和双指导RNA。
如本文使用的，术语“异源”是指以下多核苷酸/多肽，该多核苷酸/多肽的至少一部分源自外来物种，或者如果源自相同物种，则通过有意的人工介入对其天然形式在组成和/或基因组基因座方面进行了实质性的修饰。因此，源自与将其引入的细胞所属的生物体或物种不同的生物体或物种的核苷酸序列相对于那个细胞或细胞的后裔而言是异源的。另外，异源核苷酸序列包括一种核苷酸序列，该核苷酸序列源自并插入相同的天然原始细胞类型，但是却以非天然状态存在，例如，以不同拷贝数目存在，和/或处于与在该核酸分子的天然状态中发现的那些不同的调节序列的控制下。核酸序列还可以异源于与其相关的其他核酸序列，例如在核酸构建体中，例如像表达载体。作为一个非限制性实例，启动子可以与一种或多种调节元件和/或编码序列组合存在于核酸构建体中，该调节元件和/或编码序列不与那个特定启动子相关地天然存在，即它们与该启动子是异源的。
如本文使用的，当提及过程或方法步骤时，术语“植物原位”是指在植物上而不是在离体的或体外培养的植物组织或器官上进行的过程或方法步骤。为清楚起见，植物包括那些受创伤的或已去除一个或多个组织的植物，例如，具有创伤腋生分生组织和/或去除的SAM的植物。
如本文使用的，术语“植物原位转化”是指在植物上进行的转化方法，不对任何离体组织或器官进行任何组织培养步骤。为清楚起见，组织培养步骤不包括在生长培养基、水培、培养基板等上或中生长植物。
术语“核酸”或“多核苷酸”在本文可互换使用，并且是指可以对应于一系列核苷酸的单体单元的任何物理串，包括核苷酸的聚合物(例如，典型的DNA聚合物或聚脱氧核糖核苷酸或RNA聚合物或多核糖核苷酸)、经修饰的寡核苷酸(例如，包含生物RNA或DNA不典型的碱基的寡核苷酸，例如2'-O-甲基化寡核苷酸)等。在一些实施例中，核酸或多核苷酸可以是单链的、双链的、多链的或其组合。除非另有说明，否则除任何明确指示的多核苷酸之外，本发明的具体核酸或多核苷酸任选地还包含或编码互补多核苷酸。核酸可以存在于载体中，例如细胞、病毒或质粒中。
如在此所使用的，短语“可操作地连接”、“操作性地连接”、“操作性相关的”或“操作性相关”等意指核酸构建体的元件(如表达盒或核酸分子)被配置以便执行其通常的功能。因此，可操作地与核苷酸序列相关的调节或控制序列(例如，启动子)能够影响核苷酸序列的表达。例如，当启动子能够影响编码序列或者功能RNA的表达时(即该编码序列或功能RNA处于该启动子的转录控制之下)，则该启动子与编码序列或者功能RNA是可操作地连接的。正义方向或者反义方向的编码序列能够与调节序列可操作地连接。控制序列不需要与目的核苷酸序列相邻，只要它们起到指导其表达的作用。因此，例如，介入未翻译的、已转录的序列可以在启动子与编码序列之间存在，并且该启动子序列仍可以被认为“可操作地连接至”该编码序列上。
术语“植物”是指任何植物，特别是农艺上有用的植物(例如种子植物)，并且“植物细胞”是该植物的结构单元和生理单元(包含细胞壁)，还可以指原生质体。该植物细胞可以是处于分离的单细胞或经培养的细胞的形式、或作为高等组织化的单位(例如像，植物组织、或分化成植物发育的任一阶段存在的结构的植物器官)的一部分。植物可以是单子叶植物或双子叶植物物种。
术语“植物部分”是指植物的一部分，包括单细胞和细胞组织(例如植物中完整的植物细胞)、细胞团块和可以再生植物的组织培养物。植物部分的实例包括但不限于来自以下各项的单细胞和组织：花粉、胚珠、叶、胚、根、根尖、花药、花、果实、茎、芽和种子；以及花粉、胚珠、叶、胚、根、根尖、花药、花、果实、茎、芽、接穗、根茎、种子、原生质体、愈伤组织等。术语“植物部分”还包括外植体。
术语“子代”是指特定杂交的一个或多个后裔。典型地，子代由两个个体的育种产生，但一些物种(特别是一些植物和雌雄同体的动物)可以自体受精(即，同一个植株充当雄性和雌性配子两者的供体)。该一个或多个后裔可以是例如F1、F2或任何后续世代。
“启动子”是指核苷酸序列，通常在它的编码序列的上游(5’)，它通过提供对适当的转录所需的RNA聚合酶以及其他因子的识别来控制该编码序列的表达。“启动子调节序列”由近端和更远端上游元件组成。启动子调节序列影响相关编码序列的转录、RNA加工或稳定性、或翻译。调节序列包括增强子、启动子、非翻译的前导序列、内含子、以及聚腺苷酸化信号序列。它们包括天然序列以及合成序列、连同可能是合成序列与天然序列的组合的序列。“增强子”是DNA序列，它可以刺激启动子的活性并且可以是该启动子或插入的异源元件的固有元件以增强启动子的水平或组织特异性。它能够在两个方向(正常或翻转)上进行操作，并且甚至当移动到该启动子的上游或下游时还能够发挥作用。术语“启动子”的含义包括“启动子调节序列”。
如本文使用的，术语“芽顶端分生组织”、“芽尖分生组织”或“SAM”是指位于植物茎尖的含有干细胞的植物区域。
在被引入细胞中的多核苷酸的背景下，“稳定引入(stably introducing)”或“稳定引入的(stably introduced)”意指所引入的多核苷酸被稳定地合并到该细胞的基因组中，并且因此该细胞用该多核苷酸进行了稳定转化。
如本文所使用的，“稳定转化”或“被稳定地转化的”意指将核酸引入到细胞中并且整合到该细胞的基因组中。按照这样，整合的核酸能够被其子代遗传，更特别地，被多个连续世代的子代遗传。如本文所使用的，“基因组”还包括核基因组、线粒体基因组与质粒基因组，并且因此包括该核酸到例如叶绿体基因组的整合。如本文所使用的，稳定转化也可以是指以染色体外方式(例如，作为微型染色体)维持的转基因。
“选择剂”是指与选择性标记相互作用以给予植物细胞选择性优势的药剂(例如，化学物)。示例选择剂为本领域已知的并在本文中描述，如草甘膦、草铵膦、壮观霉素、苄嘧磺隆-甲基、和卡那霉素。
“选择性标记”或“选择性标记基因”是指一种基因，该基因在植物细胞中的表达给予该细胞选择优势。“正向选择”是指转化的细胞，该转化的细胞获得其以前不能使用或不能有效使用的底物代谢能力，典型地通过转化并表达正向选择性标记基因。因此，这种转化的细胞从非转化组织的群中生长出来。正向选择可以是来自植物生长调节剂的无活性形式的许多类型，然后通过转移的酶转化为活性形式来转化碳水化合物来源，这些碳水化合物来源不被非转化细胞(例如甘露糖)有效利用，其然后在转化后可得到酶，例如磷酸甘露糖异构酶，使其能够被代谢。与转化的细胞相比，不转化的细胞生长缓慢或根本不生长。与非转化细胞生长能力相比，其他类型的选择可能是由于用选择性标记基因的细胞转化，该选择性标记基因获得在阴性选择试剂(例如抗生素或除草剂)存在下生长的能力。转化细胞所具有的选择优势还可以是由于在所谓“阴性选择”中失去以前具有的基因。在这种情况下，所添加的化合物只对未失去亲本细胞(通常是转基因)中存在的特异性基因(阴性选择性标记基因)的细胞具有毒性。
如本文使用的，术语“转化”是指将核酸转移到宿主细胞中，包括整合到染色体、可遗传的染色体外事件和瞬时转移。在一些特定的实施例中，引入植物、植物部分和/或植物细胞中是经由细菌介导的转化、粒子轰击转化(也称为基因枪粒子转化)、磷酸钙介导的转化、环糊精介导的转化、电穿孔、脂质体介导的转化、纳米颗粒介导的转化、聚合物介导的转化、病毒介导的核酸递送、晶须介导的核酸递送、微量注射、超声波处理法、浸润法、聚乙二醇介导的转化、原生质体转化或导致向植物、植物部分和/或其细胞引入核酸的任何其他电学、化学、物理和/或生物学机制，或其组合进行的。本领域中已知的各种植物转化方法的一般指南包括Miki等人(“Procedures for Introducing Foreign DNA into Plants[将外源DNA引入植物中的程序]”在Plant Molecular Biology and Biotechnology[植物分子生物学和生物技术]的方法中，Glick,B.R.和Thompson,J.E.,编辑(CRC Press,Inc.[CRC出版有限公司],波卡拉顿,1993),第67-88页)和Rakowoczy-Trojanowska(2002,Cell Mol BiolLett[细胞分子生物学快报]7:849-858(2002))。
如本文使用的，术语“转基因”是指含有至少一种异源多核苷酸的全部或部分的任何植物、植物细胞、愈伤组织、植物组织、或植物部分。在一些实施例中，将异源多核苷酸的全部或部分稳定地整合到染色体或稳定的染色体外元件中，以便使得其传递到连续世代。
具体实施方式
本文提供了用于在植物原位中转化植物并且任选地在植物原位中进行一个或多个选择步骤的方法和组合物。
在一些方面，本披露提供了方法，该方法包括(a)提供包含腋生分生组织(例如，子叶腋芽或真叶腋生分生组织)和芽顶端分生组织的植物，(b)去除或创伤(例如，通过切割、刺穿、或压碎)该腋生分生组织的至少一部分以产生创伤腋生分生组织区域，(c)使该创伤腋生分生组织区域与异源多核苷酸和/或异源蛋白在其中该异源多核苷酸和/或异源蛋白进入创伤腋生分生组织区域的条件下接触，(d)在步骤(b)或步骤(c)的同时或在步骤(c)之后，去除或抑制该芽顶端分生组织的生长，以及(e)使植物生长以再生该创伤腋生分生组织区域的至少一部分，以产生再生的腋生分生组织。
在该方法的一些实施例中，植物是双子叶植物。在一些实施例中，植物是单子叶植物。在一些实施例中，植物是大豆植物、豆植物、葵花植物、胡椒植物、或烟草植物。在一些实施例中，植物是大豆植物。
在该方法的一些实施例中，腋生分生组织是一个、两个、三个、四个或更多个腋生分生组织，并且这些腋生分生组织中的至少一个处于创伤。在一些实施例中，所有的腋生分生组织都受到创伤。在一些实施例中，例如，在双子叶植物中，腋生分生组织是两个腋生分生组织，并且这些腋生分生组织中的一个或两个都受到创伤。
在该方法的一些实施例中，将整个芽顶端分生组织去除。在一些实施例中，将包括芽顶端分生组织的上胚轴上方的整个区域去除。在一些实施例中，将顶端分生组织的一部分去除(包括通过破坏顶端分生组织)，其中去除的部分足以破坏顶端优势。在一些实施例中，该方法包括在步骤(c)之后去除或抑制芽顶端分生组织的生长。在一些实施例中，步骤(c)后1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或更多天，例如，2-7天、2-6天、2-5天、2-4天、2-3天、3-7天、3-6天、3-5天或3-4天，将芽顶端分生组织(整个或部分)去除。在一些实施例中，该方法包括在步骤(b)或步骤(c)的同时(例如，在至少一些部分期间)去除或抑制顶端分生组织的生长。在一些实施例中，抑制顶端分生组织的生长包括杀伤该顶端分生组织的细胞或施用抑制剂以破坏顶端优势。
在一些实施例中，可以例如，使用存在于异源多核苷酸中的选择性标记来选择用异源多核苷酸转化的植物、植物部分和植物细胞。在一些实施例中，使用实例中描述的一个或多个选择步骤或选择剂来选择用异源多核苷酸转化的植物、植物部分和植物细胞。
选择性标记的实例包括但不限于，提供对以下抗生素抗性或耐受性的基因，如卡那霉素(Dekeyser等人1989,Plant Phys[植物生理学]90:217-23)、壮观霉素(Svab和Maliga 1993,Plant Mol Biol[植物分子生物学]14:197-205)、链霉素(Maliga等人1988,Mol Gen Genet[分子基因遗传]214:456-459)、潮霉素B(Waldron等人1985,Plant MolBiol[植物分子生物学]5:103-108)、博来霉素(Hille等人1986,Plant Mol Biol[植物分子生物学]7:171-176)、磺胺剂(sulphonamides)(Guerineau等人1990,Plant Mol Biol[植物分子生物学]15:127-136)、链丝菌素(Jelenska等人2000,Plant Cell Rep[植物细胞报告]19:298-303)、或氯霉素(De Block等人1984,EMBO J 3:1681-1689)。其他选择性标记包括提供对除草剂抗性或耐受性的基因，如赋予除草剂(包括磺胺尿素类、咪唑啉酮类、三唑嘧啶类、和嘧啶基硫代苯酸盐类(thiobenzoates))耐受性的乙酰乳酸合酶(ALS)的S4和/或Hra突变；5-烯醇-丙酮-莽草酸-3-磷酸-合酶(EPSPS)基因，包括但不限于描述在美国专利号4,940,935、5,188,642、5,633,435、6,566,587、7,674,598中的那些(连同全部相关的应用)和草甘膦N-乙酰转移酶(GAT)，其赋予对草甘膦的抗性(Castle等人2004,Science[科学]304:1151-1154，和美国专利申请公开号20070004912、20050246798、和20050060767)；BAR，其赋予对草铵膦的抗性(参见例如，美国专利号5,561,236)；芳氧基链烷酸酯双加氧酶或AAD-1、AAD-12、或AAD-13，其赋予对2,4-D的抗性；如假单胞菌(Pseudomonas)HPPD的基因，其赋予对HPPD抗性；卟啉酮氧化酶(PPO)突变体和变体，其赋予对过氧化除草剂的抗性，这些除草剂包括氟磺胺草醚、氟羧草醚钠、乙氧氟草醚、乳氟禾草灵、氟噻甲草酯、嘧啶肟草醚、丙炔氟草胺、氟烯草酸、唑酮草酯、甲磺草胺)；以及赋予对麦草畏抗性的基因，如麦草畏单加氧酶(Herman等人2005,J Biol Chem[生物化学杂志]280:24759-24767和美国专利号7,812,224，以及相关的申请和专利)。选择性标记的其他实例可以在Sundar和Sakthivel(2008,J Plant Physiology[植物生理学杂志]165:1698-1716)中发现，通过引用结合在此。用于在本披露中使用的另外的选择性标记为本领域已知的，如草丁膦N-乙酰转移酶(PAT)和氨基糖苷3’-腺苷酸转移酶(aadA)(参见例如，Rosellini(2012)SelectableMarkers and Reporter Genes:A Well Furnished Toolbox for Plant Science andGenetic Engineering[选择性标记和报告基因：植物科学和基因工程的完善的工具箱],Critical Reviews in Plant Sciences[植物科学评论性综述],31:5,401-453)。
其他选择系统包括使用药物、代谢物类似物、代谢中间体和酶用于转基因植物的正向选择或有条件的正向选择。实例包括但不限于编码其中甘露糖是选择剂的磷酸甘露糖异构酶(PMI)的基因，或编码其中D-木糖是选择试剂的木糖异构酶的基因(Haldrup等人1998,Plant Mol Biol[植物分子生物学]37:287-96)。最后，其他选择系统可以使用无激素培养基作为选择剂。一个非限制性实例玉米同源盒基因kn1，其异位表达导致转化效率3倍增加(Luo等人2006,Plant Cell Rep[植物细胞报告]25:403-409)。各种选择性标记和编码他们的基因的实例披露在Miki和McHugh(J Biotechnol[生物技术杂志],2004,107:193-232；通过引用结合)中。
在本披露的一些实施例，选择性标记可以是植物来源的。可以是植物衍生的选择性标记的实例包括但不限于5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合酶(EPSPS)。酶5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合酶(EPSPS)催化植物中芳香族氨基酸生物合成常见的莽草酸通路中的重要步骤。除草剂草甘膦抑制EPSPS，因此杀死植物。可以通过引入修饰的EPSPS转基因产生转基因草甘膦耐受植物，该植物不由草甘膦影响(例如美国专利6,040,497；通过引用结合)。在草甘膦的存在下可以被用作选择性标记的修饰的植物EPSPS的其他实例包括稻EPSPS的P106L突变(Zhou等人2006,Plant Physiol[植物生理学]140:184-195)和在蟋蟀草EPSPS中的P106S突变(Baerson等人2002,Plant Physiol[植物生理学]129:1265-1275)。不是植物来源的并可以被赋予草甘膦耐受性的EPSPS的其他来源包括但不限于来自鼠伤寒沙门氏菌的EPSPS P101S突变(Comai等人1985,Nature[自然]317:741-744)以及来自土壤杆菌属菌株的CP4的CP4 EPSPS的突变的版本(Funke等人2006,PNAS 103:13010-13015)。尽管植物EPSPS基因是细胞核，但是成熟酶位于叶绿体(Mousdale和Coggins 1985,Planta[植物]163:241-249)。EPSPS合成为包含转运肽的前蛋白，随后该前体随后转运至叶绿体基质中并进行蛋白质水解以产生成熟酶(della-Cioppa等人1986,PNAS 83:6873-6877)。因此，为了产生对草甘膦具有耐受性的转基因植物，可以引入正确地易位至叶绿体的EPSPS的适当的突变形式。然后此类转基因植物具有天然的、基因组的EPSPS基因，连同突变的EPSPS转基因。然后草甘膦可以被用作在转化和再生过程中的选择剂，由此仅用突变的EPSPS转基因成功地转化的那些植物或植物组织存活。
在该方法的一些实施例中，异源多核苷酸包含选择性标记，并且该方法进一步包括使植物与选择剂接触以消除或减少未转化的组织，其中与该选择剂接触的至少一部分发生在步骤(e)期间。在一些实施例中，选择剂是除草剂、抗生素、或不可代谢的糖。在一些实施例中，选择剂是草甘膦、草铵膦、壮观霉素、苄嘧磺隆-甲基、灭草烟、D-木糖、甘露糖或卡那霉素。在一些实施例中，选择性标记是EPSPS，并且选择剂是草甘膦。
在该方法的一些实施例中，与选择剂接触包括将该选择剂添加到植物生长的培养基(例如，土壤或水培)中(例如，通过浇水或向土壤或其他培养基中施用组合物，该组合物包含选择剂，如1uM至1M之间的选择剂，例如，10uM至500uM的草甘膦)，用选择剂喷洒植物(例如，用可喷雾组合物，该可喷雾组合物包含选择剂，如1uM至1M的选择剂，例如，10uM至50mM之间的草甘膦)，或将选择剂(如1uM至1M之间的选择剂，例如，10uM至200uM的草甘膦或1uM至10uM的苄嘧磺隆-甲基)施用于再生的腋生分生组织(例如，使用可释放选择剂(如到创伤腋生分生组织和/或再生的腋生分生组织上)的溶液、凝胶、可吸收的材料(例如，棉球)或其他材料。在一些实施例中，与选择剂接触持续至少一天、至少一周、至少两周、至少三周、至少四周、至少五周、或更长。在一些实施例中，与选择剂接触持续1-10、1-9、1-8、1-7、1-6、1-5、1-4、1-3、1-2、2-10、2-9、2-8、2-7、2-6、2-5、2-4、2-3、3-10、3-9、3-8、3-7、3-6、3-5、3-4、4-10、4-9、4-8、4-7、4-6、4-5、5-10、5-9、5-8、5-7、或5-6周。在一些实施例中，与选择剂接触持续1天至6周之间。在一些实施例中，与选择剂接触持续3-6周之间。
在该方法的一些实施例中，该方法进一步包括对再生的腋生分生组织的样品进行测定，以评估该样品中转化细胞的存在或不存在和/或评估该样品中转化细胞的数目。示例测定包括荧光蛋白检测、qPCR、实时PCR、免疫测定等。
在该方法的一些实施例中，该方法进一步包括使植物生长以产生任选地包含异源多核苷酸的至少一部分的种子(例如，一个种子、两个种子、十个种子、二十个种子、五十个种子或更多)，以及收获该种子。在一些实施例中，由植物产生的所有种子包含异源多核苷酸的至少一部分。在一些实施例中，由植物产生的种子中的至少一个种子或多个种子(例如，至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、或至少90％)包含异源多核苷酸的至少一部分。在该方法的一些实施例中，该方法进一步包括使一个或多个种子生长以产生一个或多个子代植物，任选地该子代植物包含异源多核苷酸的至少一部分。
在该方法的一些实施例中，异源多核苷酸编码基因组编辑剂，例如，CRISPR/Cas剂、TALEN、受DNA指导的核酸酶、大范围核酸酶、重组酶、或锌指核酸酶。在该方法的一些实施例中，异源蛋白包含基因组编辑剂，例如，Cas蛋白、TALEN、受DNA指导的核酸酶、大范围核酸酶、重组酶、或锌指核酸酶。在一些实施例中，异源多核苷酸包含编码Cas蛋白和/或指导RNA的一种或多种多核苷酸。在一些实施例中，异源多核苷酸包含一种或多种指导RNA，任选地其中该异源多核苷酸包含在具有Cas蛋白的核糖核蛋白(RNP)内。在一些实施例中，Cas蛋白是Cas9或Cas12a、或其功能变体。
在该方法的一些实施例中，异源多核苷酸包含含有编码序列的表达盒。在该方法的一些实施例中，编码序列编码目的蛋白或非编码RNA。在一些实施例中，目的蛋白或非编码RNA赋予植物一个或多个所希望的性状，如增强的生长、提高的产量、耐旱性、耐盐性、除草剂耐受性、昆虫抗性、有害生物抗性、疾病抗性、温度耐受性、提高的氮利用等。在一些实施例中，编码序列编码基因组编辑剂，如Cas蛋白和/或指导RNA。在一些实施例中，异源多核苷酸包含编码目的蛋白或非编码RNA的编码序列和编码序列选择性标记。在该方法的一些实施例中，表达盒进一步包含可操作地连接至一个或多个编码序列的启动子。启动子可以是例如，组成型启动子、组织特异性启动子、或诱导型启动子。
在该方法的一些实施例中，步骤(c)中的接触用土壤杆菌属、病毒颗粒、颗粒，如微粒或纳米颗粒(例如，金或钨微粒或纳米颗粒)、细胞膜穿透肽、气溶胶束、化学物、电穿孔、或压力(例如，真空)进行。在一些实施例中，步骤(c)中的接触用土壤杆菌属进行。在一些实施例中，步骤(c)中的接触用病毒颗粒进行。在一些实施例中，步骤(c)中的接触用金或钨颗粒，如微粒或纳米颗粒进行。在一些实施例中，步骤(c)中的接触用细胞膜穿透肽进行。在一些实施例中，步骤(c)中的接触用气溶胶束进行。在一些实施例中，步骤(c)中的接触用化学物进行。在一些实施例中，步骤(c)中的接触用电穿孔进行。在一些实施例中，步骤(c)中的接触用压力(例如，真空)进行。
在该方法的一些实施例中，接触用土壤杆菌属或病毒颗粒进行，并且该接触包括感染步骤，以及孵育步骤。在该方法的一些实施例中，感染步骤进行至少30分钟，例如，30分钟至24小时，如1-12、2-12、3-12、4-12、5-12、6-12、7-12、8-12、9-12、10-12、11-12、1-11、2-11、3-11、4-11、5-11、6-11、7-11、8-11、9-11、10-11、1-10、2-10、3-10、4-10、5-10、6-10、7-10、8-10、9-10、1-9、2-9、3-9、4-9、5-9、6-9、7-9、8-9、1-8、2-8、3-8、4-8、5-8、6-8、7-8、1-7、2-7、3-7、4-7、5-7、6-7、1-6、2-6、3-6、4-6、5-6、1-5、2-5、3-5、4-5、1-4、2-4、3-4、1-3、2-3、或1-2小时，并且孵育步骤在黑暗中或在光照下或在光照/黑暗周期中进行至少1天、至少2天、至少3天、至少4天、至少5天、至少6天、至少7天或更长时间，例如，1-7、2-7、3-7、4-7、5-7、6-7、1-6、2-6、3-6、4-6、5-6、1-5、2-5、3-5、4-5、1-4、2-4、3-4、1-3、2-3、或1-2天。在一些实施例中，感染步骤包括使一个或多个创伤腋生分生组织与含有土壤杆菌属或病毒颗粒的溶液、凝胶、可吸收的材料或其他材料接触。在一些实施例中，感染步骤持续5-12小时。在一些实施例中，孵育步骤在黑暗中进行3-7天。在一些实施例中，孵育后，施用抗生素(例如，特美汀、头孢噻肟和/或万古霉素)以消除土壤杆菌属或病毒颗粒。
土壤杆菌属介导的转化是用于转化植物的常用方法，这是由于它具有相对较高的转化效率和增加的转化通量以及因为它对于许多不同物种的广泛实用性。土壤杆菌属介导的转化通常涉及将携带外来目的DNA的二元载体转移至适当的土壤杆菌属菌株，这可能取决于由宿主土壤杆菌属菌株在共同存在的Ti质粒上或在染色体上携带的vir基因的互补物(参见例如，Uknes等人1993,Plant Cell[植物细胞]5:159-169)。将重组二元载体转移至土壤杆菌属可以例如，使用携带该重组二元载体的大肠杆菌——辅助大肠杆菌菌株(该辅助菌株携带能够将该重组二元载体移动到靶土壤杆菌属菌株中的质粒)通过三亲本交配程序实现。可替代地，可以通过核酸转化将重组二元载体转移至土壤杆菌属中(参见例如，
Figure BDA0003660563810000181
和Willmitzer 1988,Nucleic Acids Res[核酸研究]16:9877)。通过重组土壤杆菌属进行的植物转化通常涉及该土壤杆菌属与来自该植物的外植体的孵育，尽管在本披露中孵育发生在一个或多个创伤腋生分生组织上。将转化的组织通常在位于二元质粒T-DNA边界之间的选择性标记的选择剂存在下再生。
在该方法的一些实施例中，植物在1天龄-100天龄之间，如1天龄-30天龄，例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、或30天龄，如4天龄-7天龄。
在该方法的一些实施例中，该方法进一步包括在去除或抑制芽顶端分生组织的生长之前去除植物的子叶(例如，一个或两个子叶)。在一些实施例中，子叶的去除与一个或多个腋生分生组织的创伤同时发生。在一些实施例中，子叶去除后至少1天，例如，至少1天、至少2天、至少3天、至少4天、至少5天、至少6天、或至少7天，如子叶去除后1-7、2-7、3-7、4-7、5-7、6-7、1-6、2-6、3-6、4-6、5-6、1-5、2-5、3-5、4-5、1-4、2-4、3-4、1-3、2-3、或1-2天，将芽顶端分生组织去除。在一些实施例中，子叶去除后，将芽顶端分生组织去除3-7天。
在该方法的一些实施例中，该方法包括与步骤(b)同时(例如，在此期间)去除或抑制芽顶端分生组织的生长，以及任选地将选择性试剂(如1uM至1M的选择剂，例如，10-200uM草甘膦和/或1uM-10uM苄嘧磺隆-甲基)和植物激素(如1-10mg/L 6-苄基氨基嘌呤)施用于植物以抑制非转化细胞分裂并刺激转化细胞再生。
本披露的其他方面涉及通过以上或本文别处(包括实例)所述的方法中的任一种产生的植物或植物部分。本披露的其他方面涉及子代种子，该子代种子通过使以上或本文别处所述的方法中的任一种产生的植物与第二植物杂交或通过该植物自交产生。本披露的其他方面涉及产生或获得自植物或植物部分的衍生物或商品产品，该植物或植物部分通过以上或本文别处所述的方法中的任一种产生。在一些实施例中，商品产品选自由以下组成的组：完整或加工过的种子、粉、蛋白质分离物、浓缩物、液体、糖浆、糊状物、酱汁或由植物或植物部分产生的其他食物或产品。
在下文中，将通过以下实例详细描述本发明。然而，以下实例是对本发明的说明，本发明的范围不受以下实例限制。
实例
实例1：植物原位转化的示例过程：
双子叶植物胚包括上胚轴(芽顶端分生组织)、胚根、下胚轴和两个子叶。然而，这是另一个非常微小的结构，位于每个子叶和芽之间的腋上。这些结构是腋生分生组织，并且被称为子叶腋生分生组织(或苗期的子叶腋芽)。这种子叶芽具有很强的分生能力，特别是在主芽被去除后，从而为植物原位转化提供了优异的材料，可用于基因组编辑和转基因植物产生。
植物原位的第一个示例过程如下所述。
1)种子萌发或苗期种植后，去除或损伤位于子叶腋或真叶腋中的腋生分生组织，以造成严重创伤。为了打破腋生分生组织的休眠，在同一时间或几天后去除初生芽分生组织。
2)转化剂用于促进构建体转移到一个或多个创伤分生组织中。一个实例是将土壤杆菌属或含有构建体的病毒施用到创伤区的表面上。另一个实例是使用基因枪或细胞膜穿透肽来引入构建体。
3)在黑暗或弱光照下孵育1-7天后，创伤分生组织内的一些细胞将发生转化。施用阴性或阳性选择剂以抑制非转化细胞分裂，并促进转化细胞增殖。将选择剂施用于创伤区(“顶部选择”)，和/或浇灌到植物生长培养基或土壤中(“底部选择”)。
4)将植物在选择条件下保持数周。将转化细胞增殖并发育成转基因芽，而非转基因芽则受到选择的抑制并严重地发育迟缓。可以用分子或生物测定验证转化体。
5)使阳性菌生长用于(T1)种子生产，并从生产的种子中鉴定种系转化。
实例2：用含有AmCyan和EPSPS的构建体对烟草(本氏烟(Nicotianabenthamiana))幼苗进行植物原位转化
方法
1)将烟草种子播种在2.5英寸的土壤盆中。萌发后，去除任何额外的植物，使得每盆只有幼苗。将由种子长出的约3周龄幼苗用于腋生分生组织转化。
2)创伤腋生分生组织：使用刀片或镊子创伤或部分去除腋生分生组织。然后立即将初生芽顶端分生组织完全去除，以消除顶端优势。
3)土壤杆菌属感染：在pH 5-6下制备土壤杆菌属溶液(OD＝1)用于感染。土壤杆菌属具有含有AmCyan和EPSPS基因的构建体。在植物上孵育细菌之前，将100uM乙酰丁香酮添加到土壤杆菌属溶液中，以提高感染效率。对于感染，将小棉球用土壤杆菌属溶液浸泡，并在创伤区放置7小时。感染后，使用滤纸或纸巾去除多余的土壤杆菌属溶液。
4)孵育：将含有感染的幼苗的扁平托盘用圆顶覆盖以保持水分。将幼苗在黑暗中放置3-7天，用于与土壤杆菌属孵育。孵育后，施用抗生素(特美汀、头孢噻肟和万古霉素)以抑制土壤杆菌属的生长。
5)选择：孵育后，在16小时光照和8小时黑暗条件下，将幼苗移入生长箱中。然后将用含有50-100uM草甘膦的选择溶液浸泡的小棉球放置在感染的腋区。将托盘用圆顶覆盖以保持高湿度。对于一些植物，在同一时间或1周后，将300-500uM草甘膦选择液浇灌到土壤盆中。
6)基于“顶部选择”的棉球持续2-4周。将棉球每周更换1-2次。“底部选择”土壤浇水每周完成一次，持续4-7周。3-7周的选择后，非转基因细胞受到抑制，而转基因细胞增殖并发育成芽。
7)分子分析以鉴定转基因事件：从假定的转基因芽中收集叶组织，然后提取DNA并分析转基因的存在。将阳性事件移植到新的土壤盆中，在16小时的昼长条件下生长，并收获T1种子。
8)播种T1种子并基于Amcyan信号和分子方法检测T1代中的转基因存在。分子方法是实时PCR，其用于同时检测假定的转基因植物组织中的Amcyan和EPSPS基因。
结果
上述方法的结果示于下表1和表2中。使用50或100uM草甘膦持续3周的仅顶部选择方法在烟草中未产生阳性事件，但预期通过增加选择步骤的浓度和/或时间量，顶部选择在烟草中是可行的。使用500uM草甘膦选择6周的仅底部选择法在烟草中未产生阳性事件。
对于表2，实时PCR用于估计转基因拷贝数。在测试的7个事件中，所有事件都是转基因的。结果显示，T1植株的转基因分离不符合典型的孟德尔遗传率。不希望受理论的约束，结果表明，一些T0转基因芽可能是多细胞来源的。独立的转基因细胞有助于形成相同的T0芽，因此来自同一转基因芽的T1植物可能属于不同的转基因事件。
表1：
用土壤杆菌属(OD A660为1)对3周龄的烟草幼苗进行棉球介导的感染的选择和转化频率
Figure BDA0003660563810000221
表2：T1代中烟草转基因事件的遗传分析。
Figure BDA0003660563810000222
实例3：植物原位转化的示例过程
图1中概述了植物原位转化的另一个示例性一般过程，下面描述另一个示例过程。
1)种子萌发1-7天后，去除一个或两个子叶分生组织，或将子叶分生组织区域创伤以造成严重创伤。在同一时间或几天后去除植物顶端。
2)转化剂用于促进构建体转移到一个或多个创伤分生组织中。一个实例是将土壤杆菌属或含有构建体的病毒施用到创伤区的表面上。另一个实例是使用基因枪或细胞膜穿透肽来引入构建体。
3)孵育1-7天后，将选择剂施用于创伤区(“顶部选择”)，和/或将选择剂浇灌到土壤/培养基中(“底部选择”)。在选择下将植物保持2-4周，转化的细胞将发育成芽。
5)将潜在的转基因植物移植到新的土壤盆中，并且使植物保持良好的生长条件。用分子测定验证阳性转化体。
6)使阳性菌生长用于(T1)种子生产，并从生产的种子中鉴定种系转化的事件。
实例4：用含有AmCyan和EPSPS的构建体对大豆幼苗进行植物原位转化
使用土壤杆菌属进行植物原位转化，将含有AmCyan荧光和EPSPS选择基因的构建体转化到大豆中。转化方法如下。
1)萌发：将大豆种子播种在2.5英寸盆中，每个盆中两颗种子。将由种子长出的4天龄-7天龄幼苗用于子叶腋生分生组织转化。
2)创伤腋生分生组织：将位于子叶腋中的腋生分生组织完全去除。如下所述，将位于腋生分生组织基部的干细胞使用土壤杆菌属转化。为了打破腋生分生组织的休眠，在同一时间或3-7天后去除初生芽分生组织。
3)土壤杆菌属感染：将土壤杆菌属溶液(OD＝0.6-1.2)施用于创伤区。土壤杆菌属含有包含AmCyan和EPSPS基因的构建体。对于感染，将小棉球用土壤杆菌属溶液浸泡，并在创伤区放置0.5-24小时(表3)。对于7天龄幼苗，发现5-12小时的感染会导致更好的感染结果。
表3.感染时间
Figure BDA0003660563810000231
Figure BDA0003660563810000241
感染后，使用滤纸或可替代的吸收材料去除多余的土壤杆菌属溶液。
4)孵育：将含有感染的幼苗的扁平托盘用圆顶覆盖以保持水分。将幼苗在22℃-25℃的温度下置于黑暗中。感染后第3天可以清楚地观察到AmCyan信号，但信号较弱。在第5天和第7天，信号强度变得更强。将幼苗与土壤杆菌属在黑暗中孵育5天。孵育后，施用抗生素(特美汀、头孢噻肟和万古霉素)以抑制土壤杆菌属的生长。图2显示了孵育后腋生分生组织细胞中的AmCyan信号，证实了这种细胞类型可以在植物原位中转化。
5)选择：为了确定在顶部选择中有效抑制腋生分生组织再生的草甘膦浓度，使用非转基因植物并将10uM至200uM草甘膦(特别是10、25、50、75、100或200uM草甘膦)施用于创伤腋生区。结果表明，75-200uM草甘膦是非致死的，但足以在2周内抑制腋生分生组织再生。
孵育后，在16小时光照和8小时黑暗条件下，将幼苗移入生长箱中。将浸泡在选择溶液中的小棉球放置在感染区(“顶部选择”)上。顶部选择溶液含有75-150uM草甘膦、0.5-2mg/L 6-苄基氨基嘌呤和0.5-2g/L 2-(N-吗啉代)乙磺酸。将托盘用圆顶覆盖以保持高湿度。将棉球每周更换1-2次。顶部选择持续2周。图3显示，在顶部选择后7天，在转化细胞中可以检测到来自构建体的AmCyan信号。图4显示，在顶部选择后14天，在新再生的分生组织中可以检测到来自构建体的AmCyan信号。
发现顶部选择对大豆非常有效。但是，棉球可能会变干，这可能会造成一些选择差异。为了保持持续的选择压力，将草甘膦选择液浇灌到一些植物的土壤盆中(“底部选择”)。每周施用一次含有150-500uM的草甘膦的选择浇灌液，持续4-5周。
假定的转基因芽在施用选择后的3-5周内再生。首先基于它们的生长和叶子形态鉴定假定的事件。假定的转基因芽生长迅速并且具有正常的叶子。非转基因芽发育不良、生长缓慢或叶片小而窄。转化频率的结果显示在表4中。以50、100、10、200和300uM草甘膦的仅底部选择未产生任何阳性事件。以75uM草甘膦的仅顶部选择未产生任何阳性事件。
表4.用测试的不同选择条件的转化频率的总结。
Figure BDA0003660563810000251
6)：假定的转基因芽的转化确认：两种方法用于鉴定假定的转基因芽。一种方法是在荧光显微镜下观察AmCyan信号。如图5所示，AmCyan信号均匀分布在被认为是假定转基因的不同叶上。另一种方法是使用实时PCR来鉴定植物组织中的转基因。AmCyan和EPSPS转基因都可以通过实时PCR，在衍生自该转基因芽的组织中检测到。这些数据表明，在T0阶段，植物原位转化是成功的。
7)：在不同种质中的测试植物原位转化方法。
由于这种方法避免了传统的再生过程，因此预期这种方法将实现用于植物转化的非基因型依赖性方案。由于该过程是快速的，因此其可用于一些早熟大豆种质的转化。为了检验这个假设，用代表不同成熟度组的三种大豆种质进行并排实验。由于在培养板中较早的开花和衰老，MG2优良品系很难使用组织培养转基因方法产生健康的T0幼苗。为了检验这个假设，使用这种方法对三个品系进行了转化。顶部和底部选择均持续了4周。表5所示的结果表明，转化事件可以在三种不同的种质中产生。
表5.不同种质中的植物原位转化
Figure BDA0003660563810000261
8)：种系转化确认：
转化后，使转基因芽生长至成熟，并产生T1种子。通过EPSPS和AmCyan基因的PCR扩增进行T0转化体的子代分析。测试T1代中的四个最早事件，并在两个事件中的T1种子中检测到转基因。
实例5：大豆中转基因的遗传
转基因AmCyan存在于构建体23093中。由这种构建体产生的所有转基因植物期望携带可见标记基因AmCyan和选择性标记基因EPSPS。转基因的遗传可以通过AmCyan和EPSPS基因的PCR分析来证明。我们从每个种质中选择14到15个事件以确定转基因的遗传。通过PCR分析了每个事件的十个T1植株。表6总结了分析结果。结果表明了从T0代到T1代转基因的遗传传递效率。在一些事件中未检测到转基因，表明存在嵌合体。通过选择优化可以减少嵌合转化。
表6.T1子代中的转基因遗传
Figure BDA0003660563810000271
为了评估T2代中转基因的遗传，我们在每个事件中选择一个T1纯合植物并产生T2种子。PCR分析证实了T2中稳定的转基因。
表7.T2大豆子代中的转基因遗传
Figure BDA0003660563810000272
Figure BDA0003660563810000281
实例6：使用仅顶端选择法对具有含有AmCyan和ALS基因的构建体的大豆进行植物原位转化
方法
1.大豆幼苗制备：
将大豆(Glycine max)种子在室温下在用2mg/L BAP溶液浸泡24小时的纸巾上预发芽。将预发芽的种子播种在2.5英寸盆中，每个盆中两颗种子。将盆放置在平面上，并且每个平面上有32个盆。将3天龄-6天龄的幼苗用于子叶腋生分生组织转化。
2.土壤杆菌属悬浮液制备：
使用根癌农杆菌菌株[Chry5d3 recA-]。将土壤杆菌属用含有选择性标记基因乙酰乳酸合酶(ALS)和AmCyan荧光蛋白(CFP)基因的二元载体转化。将土壤杆菌属细胞悬浮于液体感染培养基中，该液体感染培养基含有1.1g/L MS基础盐混合物、20g/L蔗糖、10g/L葡萄糖、4g/L MES、1ml/L Gamborg的B5维生素(1000X)和2mg/L玉米素核苷。添加最终浓度为40-80mg/L(200-400uM)的乙酰丁香酮以诱导毒力基因的表达。添加二硫苏糖醇(DTT)至最终浓度为150μg/ml。
3.土壤杆菌属介导的感染与共培养：将位于子叶腋中的腋芽通过刀片完全去除。为了打破顶端优势，在同一时间去除初生芽分生组织。对于感染，将用土壤杆菌属溶液(OD＝0.5-1)浸泡的小棉球在创伤区放置5-24小时。感染后，使用滤纸或可替代的吸收材料去除多余的土壤杆菌属溶液。将含有感染的幼苗的扁平托盘用圆顶覆盖。将幼苗在22℃的温度下在黑暗中放置3-5天。共培养后，施用抗生素(特美汀、头孢噻肟和万古霉素)以抑制土壤杆菌属的生长。
4.选择：
1)第1周的选择：共培养后，在16小时光照，8小时黑暗条件下，将幼苗移入生长箱中。将小棉球浸泡在选择溶液中，并放置在感染区(“顶部选择”)上。顶部选择溶液含有2mg/L BAP、1g/L 2-(N-吗啉代)乙磺酸(MES)、2-7uM苄嘧磺隆-甲基、1uM 3.1g/LGamborg的B5基础培养基、5ml MS铁(200X)、1ml/L Gamborg的B5维生素(1000X)、100mg/L谷氨酰胺、100mg/L天冬酰胺、300mg/L特美汀。将平面用圆顶覆盖以保持水分。每天施用新鲜的选择溶液以保持棉花湿润。7天后，将棉球去除。
2)第2-4周的选择：通过喷洒选择溶液进行选择，该选择溶液含有3-7uM苄嘧磺隆-甲基、1mg/L BAP(6-苄基氨基嘌呤)、和1g/LMES(2-(N-吗啉代)乙磺酸)。将每个托盘中的幼苗用50ml的选择溶液每天喷洒一次，持续2-3周。然后将再生的芽取样用于Taqman测定。
结果
结果示于表9和表10中。这些结果表明，植物原位大豆转化方法也可以使用EPSPS以外的不同选择性标记进行。通过顶部选择过程在多个大豆种质系中实现了可遗传的转化。
表8.用CFP+ALS构建体和顶部选择对大豆进行植物原位转化
Figure BDA0003660563810000291
Figure BDA0003660563810000301
表9.使用ALS选择和顶部选择方法对从植物原位转化中恢复的大豆事件中的转基因进行遗传分析
Figure BDA0003660563810000302
实例8：用EPSPS以外的不同选择性标记对烟草(本氏烟)幼苗植物原位进行植物原位转化
方法
1.制备用于转化的烟草幼苗：将烟草种子播种在2.5英寸的土壤盆中。萌发后，去除任何额外的植物，使得每盆只有一个幼苗。将三周龄的幼苗用于腋生分生组织转化。
2.将土壤杆菌属菌株[Chry5d3 recA-]用含有选择性标记基因乙酰乳酸合酶(ALS)和AmCyan荧光蛋白(CFP)基因的二元载体转化。将土壤杆菌属细胞在液体感染培养基中培养，该液体感染培养基含有1.1g/L MS基础盐混合物、20g/L蔗糖、10g/L葡萄糖、4g/LMES、1ml/L Gamborg的B5维生素(1000X)和2mg/L玉米素核苷。添加最终浓度为40-80mg/L(200-400uM)的乙酰丁香酮以诱导毒力基因的表达。添加二硫苏糖醇(DTT)至最终浓度为150μg/ml。
3.腋生分生组织和茎端的去除：使用刀片去除每个叶腋上的腋芽。然后将芽顶端分生组织完全去除，以消除顶端优势。
4.感染与共培养：对于感染，将小棉球用土壤杆菌属溶液浸泡，并在创伤区放置7小时。感染后，使用滤纸或纸巾去除多余的土壤杆菌属溶液。感染后，将含有感染的幼苗的扁平托盘用圆顶覆盖以保持水分。将幼苗在22℃-25℃下在黑暗中放置在生长箱中3-7天。
5.选择：共培养后，施用抗生素(特美汀、头孢噻肟和万古霉素)以抑制土壤杆菌属的生长。16小时光照和8小时黑暗条件下，将幼苗移入生长箱中。然后将小棉球浸泡选择溶液中，并放置在感染的腋区，该选择溶液含有0.5uM苄嘧磺隆-甲基、1g/L MES、和0.5-1mg/LBAP(6-苄基氨基嘌呤)。将托盘用圆顶覆盖以保持高湿度。将棉球每周更换1-2次。两周后，将苄嘧磺隆-甲基浓度增加至1um。将选择持续4-7周，然后在产生不定芽后终止。
6.分子分析以鉴定转基因芽：从假定的转基因芽中对叶组织取样，然后提取DNA并分析转基因的存在。将阳性事件移植到新的土壤盆中，并且在16小时的昼长条件下生长直至收获T1种子。
7.播种T1种子并基于CFP信号和分子方法检测T1代中的转基因存在。
结果
上述方法的结果示于表10中。烟草幼苗用于转化。由该过程产生了一个芽。PCR证实了AmCyan和ALS基因的存在，并且转基因是单拷贝。为了验证可遗传的转化，我们在荧光显微镜下观察了51株T1幼苗，并且发现37株植物显示出CFP信号。
表10.烟草T1和T2子代中的转基因遗传
Figure BDA0003660563810000321
实例9：葵花(向日葵(Helianthus annuus))的植物原位转化
方法
1.葵花幼苗制备：
将葵花种子(种质F75400)播种在2.5英寸的盆中，每个盆中一颗种子，并且每个平面上有32个盆。将5天龄-7天龄的幼苗用于植物原位转化。
2.土壤杆菌属介导的感染与共培养：将土壤杆菌属用含有选择性标记基因乙酰乳酸合酶(ALS)和AmCyan荧光蛋白(CFP)基因的二元载体转化。将子叶腋芽和茎端通过刀片完全去除。对于感染，将小棉球用土壤杆菌属溶液(OD＝0.5-1)浸泡，并在创伤区放置5-24小时。感染后，将棉球去除，并且使幼苗在25℃下在黑暗中生长3-5天。
3：选择：共培养后，在16小时光照和8小时黑暗条件下，将幼苗移入生长箱中。将小棉球浸泡在选择溶液中，并放置在感染区(“顶部选择”)上。顶部选择溶液含有0.5-3uM苄嘧磺隆-甲基、1-2mg/LBAP(6-苄基氨基嘌呤)、和1g/L MES(2-(N-吗啉代)乙磺酸)。
结果
土壤杆菌属感染和培养后，我们观察到CFP信号，这表明感染过程有效。我们在来自子叶区的葵花不定芽的器官发生中取得了成功，并且再生的芽产生了正常的头部和种子。我们的结果表明使用这种方法，再生系统进行良好。我们还没有获得转基因植物，但我们期望在开发出用于葵花的有效的选择方案后取得成功。
实例10：顽固植物的植物原位转化的示例过程：
双子叶植物胚包括上胚轴(芽顶端分生组织)、胚根、下胚轴和两个子叶。然而，这是另一个非常微小的结构，位于每个子叶和芽之间的腋上。这些结构是腋生分生组织，并且被称为子叶腋生分生组织(或苗期的子叶腋芽)。这种子叶芽具有很强的分生能力，特别是在主芽被去除后，从而为植物原位转化提供了优异的材料，可用于基因组编辑和转基因植物产生。
植物原位的第一个示例过程如下所述。
1)种子萌发或苗期种植后，去除或损伤位于子叶腋或真叶腋中的腋生分生组织，以造成严重创伤。为了打破腋生分生组织的休眠，在同一时间或几天后去除初生芽分生组织。
2)转化剂用于促进构建体转移到一个或多个创伤分生组织中。一个实例是施用土壤杆菌属。将第一土壤杆菌属菌株用含有驱动目的基因或基因组编辑机械表达的表达盒的二元载体转化。还包括第二土壤杆菌属菌株。该第二土壤杆菌属用含有表达盒的二元载体转化，该表达盒驱动形态发生因子(MF)或发育调节因子(DR)如Baby Boom(BBM)、Wuschel(WUS/Wox)、生长调节因子(GRF)、生长调节因子4(GRF4)及其辅因子GRF-相互作用因子1(GIF1)、芽分生组织(STM)或异戊烯基转移酶(IPT)。MF/DR的表达通过从头分生组织诱导改进了顽固植物的转化。第二表达盒驱动1)针对配子及其共转化的MF/DR转基因选择的芽孢杆菌RNA酶的花粉特异性表达，或2)在种子、胚或幼苗中表达的荧光标记物基因允许使用目的基因(GOI)/基因组编辑(GE)子代中的MF/DR转基因鉴定和去除事件。
3)在黑暗或弱光照下孵育1-7天后，创伤分生组织内的一些细胞将发生转化。施用阴性或阳性选择剂以抑制非转化细胞分裂，并促进转化细胞增殖。将选择剂施用于创伤区(“顶部选择”)，和/或浇灌到植物生长培养基或土壤中(“底部选择”)。
4)将植物在选择条件下保持数周。将转化细胞增殖并发育成转基因芽，而非转基因芽则受到选择的抑制并严重地发育迟缓。可以用分子或生物测定验证转化体。
5)使阳性菌生长用于(T1)种子生产，并从生产的种子中鉴定种系转化。
总之，这些实例中的结果表明，可以在多种植物类型中使用植物原位转化方法以产生转基因芽，然后可产生T1转基因种子。这些转化方法也被证明对转化不同的种质和优良种质是有效的，由此这些方法被认为是非基因型依赖性的，并且可用于种质(如优良种质)，否则很难通过更传统的转化方法进行转化。
参考文献
US 5376543
US 5015580
US 7002058
US 20020073445
US 2003046733
US 2004034889
US 2005268357
US 20040237133
WO 0042207
WO 05121345
CN 103667342A
CN 106399359A
Li et al.Optimization of Agrobacterium-Mediated GeneticTransformation System of Soybean Cotyledonary Node with Non Tissue-Culture.2013.Journal of Plant Genetic Resources,Vol.13,No.5,pp.789-797.
Janani et al.Construction and transformation of peroxisomeproliferator activated receptor gamma(RnPPARγ)gene using Agrobacteriumtumefaciens into Glycine max L.Merr.2019.Gene Reports,Vol.16,p.100427.
Mangena et al.Challenges of In Vitro and In Vivo Agrobacterium-Mediated Genetic Transformation in Soybean,Soybean-The Basis of Yield,Biomassand Productivity,Minobu Kasai,IntechOpen,DOI:10.5772/66708.2017.Availablefrom:www.intechopen.com/books/soybean-the-basis-of-yield-biomass-and-productivity/challenges-of-in-vitro-and-in-vivo-agrobacterium-mediated-genetic-transformation-in-soybean
Soto et al.Efficient particle bombardment-mediated transformation ofCuban soybean(INCASoy-36)using glyphosate as a selective agent.2017.PlantCell,Tissue and Organ Culture,Vol.128,No.1,pp.187-196.

Claims (29)

1.一种方法，所述方法包括：
a)提供包含腋生分生组织和芽顶端分生组织的植物，
b)创伤所述腋生分生组织的至少一部分以产生创伤腋生分生组织区域，
c)使所述创伤腋生分生组织区域与异源多核苷酸和/或异源蛋白在其中所述异源多核苷酸和/或异源蛋白进入创伤腋生分生组织区域的条件下接触，
d)在步骤b)或步骤c)的同时或在步骤c)之后，去除所述芽顶端分生组织或抑制所述芽顶端分生组织的生长，以及
e)使所述植物生长以再生所述创伤腋生分生组织区域的至少一部分，以产生再生的腋生分生组织或芽。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述腋生分生组织是两个腋生分生组织，所述创伤腋生分生组织区域是两个创伤腋生分生组织区域，并且所述再生的腋生分生组织是两个再生的腋生分生组织。
3.如权利要求1或2所述的方法，其中所述方法包括在步骤b)的同时去除或抑制所述芽顶端分生组织。
4.如权利要求1或2所述的方法，其中所述方法包括在步骤c)之后去除或抑制所述芽顶端分生组织。
5.如权利要求4所述的方法，其中在所述接触后，将所述芽顶端分生组织去除或抑制2-7天，任选地3-4天。
6.如权利要求1至5中任一项所述的方法，其中所述植物是双子叶植物，任选地大豆植物、烟草植物、豆植物、葵花植物、棉花植物、番茄植物、西瓜植物、南瓜植物、黄瓜植物、莴苣植物或胡椒植物。
7.如权利要求1至6中任一项所述的方法，其中步骤c)包括使所述创伤腋生分生组织区域与异源多核苷酸接触，其中所述异源多核苷酸包含选择性标记，并且其中所述方法进一步包括使所述植物与选择剂接触以消除或减少未转化的组织，其中与所述选择剂接触的至少一部分发生在步骤e)期间或之后。
8.如权利要求7所述的方法，其中与所述选择剂接触包括(i)将所述选择剂添加到植物生长的培养基中，(ii)用所述选择剂喷洒所述植物，或(iii)将所述选择剂施用于所述创伤腋生分生组织区域和/或再生的腋生分生组织，或其组合，任选地其中所述其组合是(i)与(iii)的组合。
9.如权利要求7或8所述的方法，其中与所述选择剂接触持续一段时间，任选地至少一周，进一步任选地3-5周之间。
10.如权利要求7至9中任一项所述的方法，其中所述选择剂是除草剂、抗生素、或不可代谢的糖。
11.如权利要求7至9中任一项所述的方法，其中所述选择剂是草甘膦、草铵膦、壮观霉素、苄嘧磺隆-甲基、灭草烟、D-木糖、甘露糖或卡那霉素。
12.如权利要求1至11中任一项所述的方法，其中所述方法进一步包括对所述再生的腋生分生组织或所述再生的腋生分生组织的样品进行测定，以评估转化细胞的存在或不存在和/或评估转化细胞的数目。
13.如权利要求1至12中任一项所述的方法，其中所述方法进一步包括使所述植物生长以产生种子，并且收获所述种子，其中所述种子任选地包含所述异源多核苷酸的至少一部分。
14.如权利要求13所述的方法，其中所述方法进一步包括使所述种子生长以产生子代植物，任选地其中所述子代植物包含所述异源多核苷酸的至少一部分。
15.如权利要求1至14中任一项所述的方法，其中所述异源多核苷酸编码或包含基因组编辑剂，或其中所述异源蛋白包含基因组编辑剂，任选地其中所述基因组编辑剂是核酸酶或重组酶。
16.如权利要求15所述的方法，其中所述异源多核苷酸包含编码Cas蛋白和/或指导RNA的一种或多种多核苷酸，或其中所述异源蛋白包含Cas蛋白，任选地其中所述Cas蛋白是Cas9或Cas12a、或其功能变体。
17.如权利要求1至14中任一项所述的方法，其中所述异源多核苷酸包含含有编码序列的表达盒。
18.如权利要求17所述的方法，其中所述表达盒进一步包含可操作地连接至所述编码序列的启动子。
19.如权利要求17或18所述的方法，其中所述编码序列编码目的蛋白或非编码RNA。
20.如权利要求1至19中任一项所述的方法，其中步骤c)中的所述接触用土壤杆菌属、病毒颗粒、微粒、纳米颗粒、细胞膜穿透肽、气溶胶束、化学物、电穿孔、或压力进行。
21.如权利要求20所述的方法，其中所述接触用土壤杆菌属或病毒颗粒进行，并且所述接触包括感染步骤和孵育步骤。
22.如权利要求21所述的方法，其中所述感染步骤进行30分钟至24小时，任选地1-9或5-12小时，并且所述孵育步骤在黑暗中进行至少2天，任选地3-7天。
23.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述植物在1天龄-30天龄之间，任选地4天龄-7天龄。
24.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述腋生分生组织是子叶腋芽、或真叶腋中的分生组织。
25.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述方法进一步包括在去除或抑制所述芽顶端分生组织之前去除所述植物的子叶。
26.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述方法进一步包括使所述再生的腋生分生组织生长成芽。
27.一种植物或植物部分，所述植物或植物部分通过如权利要求1至26中任一项所述的方法产生。
28.一种子代种子，所述子代种子通过使如权利要求27所述的植物与第二植物杂交或通过如权利要求27所述的植物自交产生。
29.一种衍生物或商品产品，所述衍生物或商品产品从如权利要求27所述的植物或植物部分产生或获得。
CN202080081868.2A 2019-11-26 2020-11-24 使用腋生分生组织的植物原位转化方法 Pending CN114760836A (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201962940268P 2019-11-26 2019-11-26
US62/940,268 2019-11-26
PCT/US2020/061899 WO2021108336A1 (en) 2019-11-26 2020-11-24 Methods of in planta transformation using axillary meristem

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN114760836A true CN114760836A (zh) 2022-07-15

Family

ID=76130745

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202080081868.2A Pending CN114760836A (zh) 2019-11-26 2020-11-24 使用腋生分生组织的植物原位转化方法

Country Status (5)

Country Link
US (1) US20220389437A1 (zh)
EP (1) EP4064828A4 (zh)
CN (1) CN114760836A (zh)
CA (1) CA3157607A1 (zh)
WO (1) WO2021108336A1 (zh)

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5736369A (en) * 1994-07-29 1998-04-07 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Method for producing transgenic cereal plants
US20070033671A1 (en) * 2002-09-18 2007-02-08 Cai-Zhong Jiang Polynucleotides and polypeptides in plants
US20150074842A1 (en) * 2012-04-05 2015-03-12 Basf Plant Science Company Gmbh Fungal Resistant Plants Expressing Hydrophobin
US20190211347A1 (en) * 2018-01-10 2019-07-11 Wisconsin Alumni Research Foundation Agrobacterium-mediated and particle bombardment transformation method for cowpea and dry bean meristem explants

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP4170078B2 (ja) * 2002-11-25 2008-10-22 クミアイ化学工業株式会社 アグロバクテリウム・ツメファシエンスによるケナフ植物のインプランタ形質転換法
ES2249982B1 (es) * 2004-05-07 2007-05-16 Consejo Sup. Investig. Cientificas Secuencia reguladora de la expresion de un gen en meristemos axilares de plantas y sus aplicaciones.
GB0421598D0 (en) * 2004-09-29 2004-10-27 Cambridge Advanced Tech Modification of plant development and morphology
WO2007064724A2 (en) * 2005-12-01 2007-06-07 Cropdesign N.V. Plants having improved growth characteristics and methods for making the same
US8293977B2 (en) * 2006-04-21 2012-10-23 Syngenta Participations Ag Transgenic plants and methods for controlling bolting in sugar beet
US10329579B2 (en) * 2011-12-23 2019-06-25 Basf Plant Science Company Gmbh Genes to enhance disease resistance in crops
NL2011980C2 (en) * 2013-12-17 2015-06-18 Univ Leiden New effects of plant ahl proteins.

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5736369A (en) * 1994-07-29 1998-04-07 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Method for producing transgenic cereal plants
US20070033671A1 (en) * 2002-09-18 2007-02-08 Cai-Zhong Jiang Polynucleotides and polypeptides in plants
US20150074842A1 (en) * 2012-04-05 2015-03-12 Basf Plant Science Company Gmbh Fungal Resistant Plants Expressing Hydrophobin
US20190211347A1 (en) * 2018-01-10 2019-07-11 Wisconsin Alumni Research Foundation Agrobacterium-mediated and particle bombardment transformation method for cowpea and dry bean meristem explants

Also Published As

Publication number Publication date
WO2021108336A1 (en) 2021-06-03
US20220389437A1 (en) 2022-12-08
EP4064828A4 (en) 2024-01-03
EP4064828A1 (en) 2022-10-05
CA3157607A1 (en) 2021-06-03

Similar Documents

Publication Publication Date Title
ES2256856T3 (es) Proceso de seccion de celulas transgenicas.
Casas et al. Transgenic sorghum plants obtained after microprojectile bombardment of immature inflorescences
Kalunke et al. Agrobacterium mediated transformation of sugarcane for borer resistance using cry 1Aa 3 gene and one-step regeneration of transgenic plants
US11512320B2 (en) Methods of gene editing and transforming cannabis
CN107250355A (zh) 烟草植物中腋芽生长的遗传控制
JP2012115266A (ja) 植物の形質転換および選択
Ren et al. Agrobacterium-mediated transformation and shoot regeneration in elite breeding lines of western shipper cantaloupe and honeydew melons (Cucumis melo L.)
Sainger et al. Development of an efficient in vitro plant regeneration system amenable to Agrobacterium-mediated transformation of a recalcitrant grain legume blackgram (Vigna mungo L. Hepper)
BRPI0809836B1 (pt) método e vetor capaz de manipular o envelhecimento ou intensificar a biomassa numa planta; e célula de planta transgênica, planta, semente de planta ou outra parte de planta
JP3174048B2 (ja) ＣｕｃｕｍｉｓＭｅｌｏ（マスクメロン）種に属する遺伝子導入植物
US20090023212A1 (en) Method for transforming soybean (Glycine max)
JP2002532114A (ja) トランスジェニック植物およびその作出法
Baranski et al. Genetic engineering of carrot
Bicknell et al. Agrobacterium-mediated transformation of Hieracium aurantiacum
Mei et al. A simple and efficient in planta transformation method based on the active regeneration capacity of plants
Wang et al. Improvement of Agrobacterium-mediated transformation and rooting of black cherry
JP4228044B2 (ja) シバ属植物の再分化植物体及び形質転換植物体
Chen et al. Transgenic Eustoma grandiflorum expressing the bar gene are resistant to the herbicide Basta®
CN114760836A (zh) 使用腋生分生组织的植物原位转化方法
JP2008526183A (ja) ユーカリプツス・ウロフィラ（Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓｕｒｏｐｈｙｌｌａ）の形質転換および選択
JPWO2006057306A1 (ja) ストレス耐性及び／又は生産性を改良したイネ科植物、及びその作出方法
Joung et al. Plant transformation methods and applications
Khatun et al. An improved Agrobacterium mediated transformation and regeneration protocol for successful genetic engineering and genome editing in eggplant
JP3755876B2 (ja) 選択マーカーを含まない組換え植物の作出方法、ならびに該方法により作出される組換え植物
JP3234534B2 (ja) 形質転換されたホモノ科植物

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination