BRPI0809836B1 - método e vetor capaz de manipular o envelhecimento ou intensificar a biomassa numa planta; e célula de planta transgênica, planta, semente de planta ou outra parte de planta - Google Patents

Description

MÉTODO E VETOR CAPAZ DE MANIPULAR O ENVELHECIMENTO OU INTENSIFICAR A BIOMASSA NUMA PLANTA; E CÉLULA DE PLANTA TRANSGÊNICA, PLANTA, SEMENTE DE PLANTA OU OUTRA PARTE DE PLANTA

[001] O presente pedido de patente é uma continuação em parte do pedido de patente US 10/363 723, intitulado "Manipulação de envelhecimento de plantas usando um promotor gene MYB e o gene da biossíntese da citoquinina", depositado em 5 de Março de 2003, que reivindica a prioridade do pedido de patente internacional PCT/AU01/01092, intitulado "Manipulação de envelhecimento de plantas usando um promotor gene MYB e genes da biossíntese da citoquinina", depositado em 30 de Agosto de 2001, que reivindica a prioridade do pedido de patente australiana PQ 9946, intitulado "Manipulação de envelhecimento de plantas usando um promotor gene MYB e genes da biossíntese da citoquinina", depositado em 6 de Setembro de 2000, cujos conteúdos são aqui incorporados por referência na sua totalidade.

[002] Refere-se o presente invento a métodos para manipular o envelhecimento em plantas. O presente invento também se refere a vetores úteis em tais métodos, plantas transformadas com características modificadas de envelhecimento e células, sementes e outras partes de tais plantas.

[003] O envelhecimento de folhas envolve alterações metabólicas e estruturais nas células antes da morte celular. Ele também envolve a reciclagem de nutrientes para regiões ativamente em crescimento.

[004] A regulação do envelhecimento da planta e de órgãos da planta por citoquininas tem conseqüências importantes para a agricultura. Níveis elevados de citoquinina em folhas tendem a retardar o envelhecimento. Vários promotores tem sido usados para regular a expressão do gene ipt, cujo produto (isopenteniltransferase) catalisa uma etapa chave na síntese da citoquinina. Entretanto, em geral, têm-se relatado que plantas transgênicas sobre-expressando o gene ipt têm um crescimento retardado de raiz e brotos, nenhuma formação de raiz, domínio apical reduzido, e área de folhas reduzida.

[005] É um objetivo do presente invento superar, ou pelo menos aliviar, uma ou mais das dificuldades ou deficiências associadas com o estado da técnica.

[006] Em um aspecto, o presente invento provê um método para manipular o envelhecimento numa planta, dito método incluindo introduzir em dita planta uma construção genética incluindo um promotor gene myb modificado, ou um fragmento funcionalmente ativo ou variante deste, ligado operacionalmente a um gene que codifica uma enzima envolvida na biossíntese de uma citoquinina, ou a um fragmento funcionalmente ativo ou variante deste.

[007] A manipulação do envelhecimento se refere à planta e/ou a órgãos específicos da planta. O envelhecimento de órgãos diferentes da planta, tais como folhas, raizes, brotos, caules, tubérculos, flores, estolões e frutos podem ser manipulados. A manipulação do envelhecimento da planta e do órgão da planta pode ter conseqüências agrícolas importantes, tais como tempo de prateleira aumentado de, p.ex., frutos, flores, folhas e tubérculos em produtos de horticultura e flores cortadas, perecibilidade reduzida de colheitas de horticultura, fixação aumentada de carbono em folhas com envelhecimento retardado levando a rendimentos intensificados, produção intensificada de biomassa em plantas de folhagem, produção intensificada de sementes, etc.

[008] "Manipular o envelhecimento" geralmente se refere a atrasar o envelhecimento na planta transformada com relação a uma planta de controle não transformada. Entretanto, para algumas aplicações, pode ser desejável promover ou de outra forma modificar o envelhecimento na planta. O envelhecimento pode ser promovido ou de outra forma modificado por exemplo, pela utilização de um gene anti-senso.

[009] Uma quantidade efetiva de dita construção genética pode ser introduzida em dita planta, por qualquer técnica adequada, por exemplo por transdução, transfecção ou transformação. Por "uma quantidade efetiva" entende-se uma quantidade suficiente para resultar numa característica fenotípica identificável em dita planta, ou numa planta, semente ou outra parte de planta derivadas dela. Tais quantidades podem ser prontamente determinadas por um técnico da área, levando-se em conta o tipo de planta, a rota de administração e outros fatores relevantes. Tal pessoa será prontamente capaz de determinar uma quantidade e um método adequados de administração. Vide, por exemplo, Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, cuja descrição integral é aqui incorporada por referência.

[010] Por "promotor gene myb modificado" entende-se um promotor normalmente associado com um gene myb, o qual promotor é modificado para excluir ou desativar um ou mais motifs específicos da raiz e/ou motifs específicos de pólen em dito promotor.

[011] Embora o depositante não queira estar restrito pela teoria, postula-se que a exclusão ou desativação de um ou mais motifs específicos da raiz em dito promotor gene myb pode aliviar ou superar o problema de expressão sem retenção do gene que codifica uma enzima biossintética citoquinina em meristemas da planta, que pode afetar o desenvolvimento da raiz em algumas espécies de plantas. Também é postulado que a exclusão ou desativação de um ou mais motifs específicos do pólen em dito promotor gene myb pode aliviar ou superar o problema da expressão sem retenção do gene que codifica a enzima biossintética citoquinina no pólen, o que pode afetar o desenvolvimento do pólen em algumas espécies de plantas.

[012] Preferencial mente, o promotor gene myb é um promotor gene myb32 modificado. Preferencialmente, o promotor gene myb modificado é de Arabidopsis, mais preferencial mente de Arabidopsis thaiiana.

[013] Um promotor adequado que pode ser modificado de acordo com o presente invento é descrito em Li et al., Cioning the three MYB-iike genes from Arabidopsis (PGR 99-138) Piant Physioiogy 121:313 (1999), cuja descrição integral é aqui incorporada por referência.

[014] Por um "motif específico de raiz" entende-se uma seqüência de 3 a 7 nucleotídeos, preferencialmente de 4 a 6 nucleotídeos, mais preferencial mente de 5 nucleotídeos, que dirige a expressão de um gene associado nas raizes de uma planta.

[015] Preferencial mente, o /raf/fespecífico de raiz inclui uma seqüência de consenso ATATT ou AATAT.

[016] Preferencial mente, entre um e dez, mais preferencialmente entre três e oito, ainda mais preferencialmente entre cinco e sete motifs específicos de raiz são excluídos ou desativados, preferencial mente excluídos, em dito promotor gene myb.

[017] Os motifs específicos de raizes podem ser excluídos pela remoção de motifs individuais ou pela remoção de um fragmento do promotor contendo um ou mais motifs. Por exemplo, toda ou parte da região entre os nucleotídeos 1 e 530, preferencial mente entre os nucleotídeos 110 e 530 do promotor gene myb da Arabidopsis thaiiana podem ser excluídos, [018] A exclusão pode ser efetuada pelo corte do ácido nucléíco, por exemplo com endonucleases de restrição, e ligando as extremidades coitadas para gerar um promotor com um fragmento removido.

[019] Por exemplo, o promotor gene myb da Arabidopsis thaíiana modificado pode ser preparado pela remoção de um fragmento entre o sítio Xcml nas posições 162 a 176 e 0 sítio Sspl nas posições de 520 a 525. Isto gera um promotor gene myb modificado com 6 dos 7 motifs específicos de raiz excluídos. Alternativamente, todos os 7 motifs específicos de raiz podem ser excluídos, por exemplo pela exclusão da região a montante do sítio Sspl nas posições de 520 a 525, ou pela exclusão da região entre os nucleotídeos 1 e 120 junto com a região entre o sítio Xcml nas posições de 162 a 176 e o sítio Sspl nas posições de 520 a 525, [020] Um motíf específico de raiz pode ser desativado por adição, exclusão, substituição ou derivação de um ou mais nucleotídeos dentro do motíf, de modo que ele não tenha mais a seqüêncía de consenso preferida.

[021] Preferenciai mente, o promotor gene myb modificado inclui uma seqüêncía de nucleotídeos escolhida dentre o grupo que consiste das seqüências mostradas nas figuras 2, 3 e 4 (ID de seqüência Nos.; 2, 3 e 4, respectiva mente) e seus fragmentos funcional mente ativos e suas variantes.

[022] Por um "motíf específico de pólen" entende-se uma seqüência de 3 a 7 nucleotídeos, preferencial mente de 4 a 6 nucleotídeos, mais preferencial mente de 4 ou 5 nucleotídeos, que dirige a expressão de um gene associado no pólen de uma planta, [023] Preferencial mente, o motíf específico de pólen inclui uma seqüência de consenso escolhida dentre o grupo que consiste de TTCT e AGAA.

[024] Preferencial mente, entre um e trinta, mais preferencialmente entre três e quinze, ainda mais preferencial mente entre quatro e dez motifs específicos de pólen são excluídos ou desativados, preferencial mente excluídos, em dito promotor gene myb.

[025] Os motifs específicos de pólen podem ser excluídos pela remoção de motifs individuais ou pela remoção de um fragmento do promotor contendo um ou mais motifs. Por exemplo toda ou parte da região entre os nucleotídeos 1 e 540, preferencialmente entre os nucleotídeos 390 e 540 do promotor gene myb de Arabidopsis thaliana pode ser excluída.

[026] A exclusão pode ser efetuada pelo corte do ácido nucléico, por exemplo com endonucleases de restrição, e ligando as extremidades cortadas para gerar um promotor com um fragmento removido.

[027] Por exemplo, o promotor gene myb da Arabidopsis thaliana modificado pode ser preparado pela remoção de um fragmento entre o sítio Xcml nas posições 162 a 176 e o sítio Sspl nas posições de 520 a 525. Isto gera um promotor gene myb modificado com 4 dos 23 motifs específicos de pólen excluídos. Alternativa mente, 10 dos motifs específicos de pólen podem ser excluídos, por exemplo pela exclusão da região a montante do sítio Sspl nas posições de 520 a 525.

[028] Um motif específico de pólen pode ser desativado por adição, exclusão, substituição ou derivação de um ou mais nucleotídeos dentro do motif, de modo que ele não tenha mais a seqüência de consenso preferida.

[029] Preferencial mente, o promotor gene myb modificado inclui uma seqüência de nucleotídeos escolhida dentre o grupo que consiste das seqüências mostradas nas figuras 2, 3 e 4 (ID de seqüência Nos.: 2, 3 e 4, respectivamente) e seus fragmentos funcionalmente ativos e suas variantes.

[030] Num aspecto adicional do presente invento é provido um método para intensificar a biomassa numa planta, dito método inclui introduzir em dita planta uma construção genética incluindo um promotor gene myb, ou um fragmento funcional mente ativo dele ou uma variante dele, operacional mente ligado a um gene que codifica uma enzima envolvida na biossíntese de uma citoquinina, ou um fragmento funcional mente ativo dele ou uma variante dele.

[031] O promotor gene myb ou um fragmento funcional mente ativo dele ou uma variante dele pode ser um promotor gene myb de comprimento inteiro ou um promotor gene myb modificado.

[032] O promotor gene myb de comprimento inteiro pode ser um promotor gene myb32. Preferencial mente, o promotor gene myb é de Arabidopsis, mais preferencial mente Arabidopsis thaliana. Mais preferencialmente, o promotor gene myb inclui uma seqüência de nudeotídeos escolhida dentre o grupo que consiste da seqüência mostrada na figura 1 anexa (ID de seqüência No. 1) e seus fragmentos funcionalmente ativos e suas variantes.

[033] O promotor gene myb modificado pode ser um promotor gene myb modificado como descrito anteriormente.

[034] Por "intensificar a biomassa" entende-se intensificar ou aumentar numa planta transformada com relação a uma planta de controle não transformada uma característica de crescimento escolhida dentre o grupo que consiste de área total de folha, área cumulativa de folha, dinâmica de crescimento de folhas (i.e., o número de folhas sobre o tempo), comprimento do estolão, percentagem de plantas florescendo e produção de sementes por flor ou por área semeada. "Intensificar a biomassa" também inclui reduzir ou diminuir a percentagem de morte de estolão numa planta transformada com relação a uma planta de controle normal.

[035] Em particular, os depositantes descobriram que enquanto o peso de sementes (i.e. o peso de mil sementes) de plantas transgênicas de acordo com o presente invento não se podia distinguir das plantas de controle não transgênicas, o rendimento de sementes total, expresso com base por flor ou por área semeada foi significativamente maior nas plantas transgênicas quando comparado com plantas de controle não transgênicas de intensidade de florescimento equivalente.

[036] Por "funcionalmente ativo" em relação a um promotor de gene myb ou promotor de gene myb modificado entende-se que o fragmento ou variante (tal como um análogo, derivado ou mutante) é capaz de manipular o envelhecimento numa planta pelo método do presente invento. Tais variantes incluem variantes alélicos que ocorrem naturalmente e variantes que não ocorrem naturalmente. Adições, exclusões, substituições e derivações de um ou mais dos nudeotídeos são contemplados enquanto as modificações não resultarem em perda de atividade funcional do fragmento ou variante.

[037] Preferencial mente, o fragmento funcionalmente ativo ou variante tem pelo menos 80% de identidade com a parte relevante da seqüência mencionada acima à qual o fragmento ou variante corresponde, mais preferencialmente pelo menos 90% de identidade, mais preferencialmente de pelo menos aproximadamente 95% de identidade.

Preferencial mente, o fragmento tem um tamanho de 20 nudeotídeos, mais preferencial mente de 50 nudeotídeos e mais preferencial mente pelo menos 100 nudeotídeos, mais preferencialmente pelo menos 200 nudeotídeos, mais preferencial mente pelo menos 300 nudeotídeos.

[038] Por um "gene que codifica uma enzima envolvida na biossíntese de uma citoquinina" entende-se um gene que codifica uma enzima envolvida na síntese de citoquinas tais como quinetina, zeatina e benzil-adenina, por exemplo um gene que codifica isopenti It ra n sfe ra se {ipf), ou um gene similar a /pitai como o gene sho (p.ex. de petúnia), Preferencial mente, o gene é um gene isopentiltransferase {ipf) ou o gene sho, Numa forma preferida de realização, o gene é de espécies escolhidas dentre o grupo que consiste de Agrobacterium, mais preferencial mente Agrobacteríum tumefaciens, Lotus, mais preferencial mente Lotus japonicus, e Petunia, mais preferencialmente Petunia hybrida.

[039] Mais preferencial mente, o gene inclui uma seqüência de nudeotídeos escolhidos dentre o grupo que consiste das sequências mostradas nas figuras 6, 8 e 10 (ID de seqüência nos. 5, 7 e 9) sequências que codificam os polipeptídeos mostrados nas figuras 7, 9 e 11 (ID de seqüência nos. 6, 8 e 10) e seus fragmentos funcionalmente ativos e suas variantes.

[040] Por "funciona(mente ativo", em relação a um gene que codifica uma enzima biossintética citoquinina, entende-se que o fragmento ou variante (tal como um análogo, derivado ou mutante) é capaz de manipular o envelhecimento numa planta pelo método de acordo com o presente invento, Tais variantes incluem variantes alélicas de ocorrência natural e variantes de ocorrência não natural. Adições, exclusões, substituições e derivações de um ou mais dos nudeotídeos são contemplados enquanto as modificações não resultarem em perda de atividade funcional do fragmento ou variante. Preferencial mente, o fragmento funcionalmente ativo ou variante tem pelo menos 80% de identidade com a parte relevante da seqüência mencionada acima à qual o fragmento ou variante corresponde, mais preferencialmente pelo menos 90% de identidade, mais preferencial mente de pelo menos aproximadamente 95% de identidade. Tais variantes funcionalmente ativos e fragmentos incluem, por exemplo, aqueles tendo mudanças conservativas de ácido nucléico ou mudanças de ácido nudéico que resultam em substituições conservativas de aminoácido de um ou mais resíduos na seqüência de aminoácido correspondente. Por exemplo, a variante funcional mente ativa pode incluir uma ou mais substituições conservativas de ácido nucléico de uma seqüência mostrada nas figuras 6, 8 ou 10, a variante funcionalmente ativa resultante codificando uma seqüência de aminoácidos mostrada nas figuras 7, 9 ou 11, respectivamente. Preferencial mente, o fragmento tem um tamanho de pelo menos 20 nucleotídeos, mais preferencial mente de pelo menos 50 nucleotídeos, mais preferencial mente pelo menos 100 nucleotídeos, mais preferencialmente pelo menos 500 nucleotídeos.

[041] A construção genética pode ser introduzida na planta por qualquer técnica adequada. As técnicas para incorporar as construções genéticas do presente invento nas células da planta (por exemplo por transdução, transfecção ou transformação) são bem conhecidas dos técnicos da área. Tais técnicas incluem introdução mediada por Agrobacterium, eletroporação em tecidos, células e protoplastos, fusão de protoplastos, injeção nos órgãos reprodutores, injeção em embriões imaturos e introdução por projétil de alta velocidade em células, tecidos, calos, embriões imaturos e maduros, transformação biolística e suas combinações. A escolha da técnica dependerá em grande parte do tipo de planta a ser transformada e pode ser prontamente determinada por um técnico da área.

[042] As células que incorporam a construção genética do presente invento podem ser escolhidas, como descrito abaixo, e então cultivadas num meio apropriado para regenerarem plantas transformadas, usando técnicas bem conhecidas do estado da técnica. As condições de cultura, tais como temperatura, pH e similares, estarão aparentes para os técnicos da área. As plantas resultantes podem ser reproduzidas, seja sexualmente ou assexualmente, usando métodos bem conhecidos do estado da técnica para produzir gerações sucessivas de plantas transformadas.

[043] Os métodos do presente invento podem ser aplicados a uma variedade de plantas, incluindo monocotiledôneas [tais como gramas (p.ex. forragem, turfa e gramas de bioenergia incluindo azevém perene, festuca alta, azevém italiano, festuca vermelha, caniço-malhado, bluestem grande, espartina, capim-elefante, centeio selvagem, cana de açúcar selvagem, Miscanthus), milho, aveia, trigo e cevada], dicotiledôneas [tais como Arabidopsis, tabaco, soja, trevos (p.ex., trevo branco, trevo vermelho, trevo subterrâneo), alfafa, canola, couves vegetais, alface, espinafre] e gimnospermas.

[044] Num aspecto adicional do presente invento, é provido um vetor capaz de manipular o envelhecimento numa planta, dito vetor incluindo um promotor gene myb modificado, ou um fragmento funcionalmente ativo dele ou uma variante dele, operacionalmente ligado a um gene que codifica uma enzima envolvida na biossíntese de uma citoquinina, ou um seu fragmento funcionalmente ativo ou sua variante.

[045] Num aspecto adicional do presente invento é provido um vetor capaz de intensificar a biomassa numa planta, dito vetor incluindo um promotor gene myb ou um fragmento funcionalmente ativo dele ou uma variante dele, operacional mente ligado a um gene que codifica uma enzima envolvida na biossíntese de uma citoquinina, ou um seu fragmento funcionalmente ativo ou uma sua variante.

[046] O promotor gene myb ou um fragmento funcionalmente ativo dele ou variante dele pode ser um promotor gene myb de tamanho inteiro ou um promotor gene myb modificado, como aqui descrito.

[047] Numa forma preferida de realização deste aspecto do presente invento, o vetor pode adicional mente incluir um terminador; dito promotor, gene e terminador sendo operacionalmente ligados.

[048] Por "operacionalmente ligado" entende-se que dito promotor é capaz de causar a expressão de dito gene numa célula da planta e dito terminador é capaz de terminar a expressão de dito gene numa célula de planta. Preferencial mente, dito promotor está a montante de dito gene e dito terminador está a jusante de dito gene, [049] O vetor pode ser de qualquer tipo adequado e pode ser viral ou não. O vetor pode ser um vetor de expressão. Tais vetores incluem sequências de ácidos nucléicos cromossômicas, não cromossômicas e sintéticas, p.ex. derivadas de vírus de plantas; plasmídeos bactéria is, derivados do plasmídeo Ti de Agrobacterium tumetadens; derivados do plasmídeo Ri de Agrobacterium rhizogenes, DMA do fago; cromossomos artificiais de levedura; cromossomos artificiais bacteriais; cromossomos artificiais bacteriais binários; vetores derivados de combinações de plasmídeos e DNA do fago. Entretanto, qualquer outro vetor pode ser usado enquanto seja replícável ou íntegrativo ou viável na célula da planta, [050] O promotor, gene e terminador podem ser de qualquer tipo adequado e podem ser endógenos à célula da planta alvo ou podem ser exógenos, desde que sejam funcionais na célula da planta alvo.

[051] Uma variedade de termínadores que podem ser empregados nos vetores do presente invento também são conhecidos dos técnicos da área. O terminador pode ser do mesmo gene da seqüência do promotor ou um gene diferente. São termínadores particular mente adequados os sinais poliaden ilação, tais como CaMV 35S poli A e outros termínadores dos genes nopalína sinta se {nos) e octopina síntase (ocs).

[052] O vetor, em adição ao promotor, o gene e o terminador, podem incluir elementos adicionais necessários para a expressão do gene, em combinações diferentes, por exemplo espinha dorsal de vetor, origem de replicação (orl), múltiplos sftios de clonagem, sequências espaçadoras, intensificadores, íntrons (tais como o íntron Ubi da ubiquitína do milho), genes de resistência a antibióticos e outros genes marcadores selecionáveis [tais como o gene neomicína fosfotransferase {nptfl), o gene higromidna fosfotransferase {hph), o gene fosfoinotrícina acetiltransferase (bar ou paf)\, e genes repórteres (tais como o gene beta-glucuronidase (GUS) (gusA)]. O vetor também pode conter um sítio de ligação a ribossomo para iniciação da tradução. O vetor também pode incluir as sequências apropriadas para amplificar a expressão.

[053] Como uma alternativa ao uso de um gene marcador selecionável para prover uma característica fenotípica para seleção de células hospedeiras transformadas, a presença do vetor nas células transformadas pode ser determinada por outras técnicas bem conhecidas do estado da técnica, tais como PCR (reação de poli mera se em cadeia), análise de hibridização Southern blot, ensaios histoquímicos (p.ex. ensaios GUS), cromatografia de camada delgada (TLC), análises de hibridização Worthern e Western blot.

[054] Os técnicos da área apreciarão que os vários componentes do vetor são operacionalmente ligados, para resultar na expressão de dito gene. As técnicas para operacionalmente ligar os componentes do vetor do presente invento são bem conhecidas dos técnicos da área. Tais técnicas incluem o uso de ligantes, tais como ligantes sintéticos, por exemplo incluindo um ou mais sítios de enzimas de restrição.

[055] Num aspecto adicional do presente invento é provida uma célula de planta transgênica, planta, semente de planta ou outra parte de planta, com características de envelhecimento modificadas ou biomassa intensificada. Preferencialmente, dita célula de planta, planta, semente de planta ou outra parte de planta inclui um vetor de acordo com o presente invento. Preferencial mente, a célula de planta transgênica, planta, semente de planta ou outra parte de planta é produzida por um método de acordo com o presente invento.

[056] O presente invento também provê uma planta transgênica, semente de planta ou outra parte de planta derivada de uma célula de planta do presente invento.

[057] O presente invento também provê uma planta transgênica, semente de planta ou outra parte de planta derivada de uma planta do presente invento.

[058] O presente invento será agora melhor descrito com referência aos exemplos e desenhos anexos. Deve ser entendido entretanto que a seguinte descrição é somente ilustrativa e não deve ser tomada de qualquer maneira como uma restrição ã generalidade do presente invento descrito acima.

[059] Nas figuras: - a figura 1 mostra a seqüência de nucleotídeos do promotor a partir do gene myb32 {atmyb32) de Arabidopsis thaíiana (ID de sequência no. 1), seqüência do promotor Atmyb32 com o tipo MYB, motifs específicos de pólen e específicos de raiz destacados. WAACCA ( subfinhadofitáiicó) MYB 1 AT; GTTAGTT (negrito/caixa) MYB1LEPR; CCWACC ([cãixãl) MYBPZM; GGATA {itálico) MYBST1; AGAAA fsublinhado) POLLEN1LELAT52; ATATT (negrito) ROOTMOTIFTAPOX1. - a figura 2 mostra uma variante de seqüência de promotor Atmyb32 {Atmyb32xs) com a seqüência Xcmi - Sspl da planta excluída. G tipo MYB, motifs específico de pólen e específico de raiz são destacados. WAACCA (suMinhado/jtálicch MYB 1 AT; GTTAGTT (negrito/caixa) MYB1LEPR; CCWACC (caixa) MYBPZM; AGAAA (sublinhado) POLLEN1LELAT52; ATATT (negrito) ROOTMOTIFTAPOX1 (ID de seqüência no. 2). - a figura 3 mostra uma variante de seqüência de promotor Atmyb32 com todos os motifs de raiz excluídos. O tipo MYB, motifs específico de pólen e específico de raiz são destacados, WAACCA (subiinhado/itálicol MYBiAT; CCWACC (Icalxal) MYBPZM; AGAAA fsublinhado) POLLEN1LELAT52 (ID de sequência no, 3), - a figura 4 mostra uma variante de sequência de promotor Atmyb32 com o sítio Sspl a montante da sequência excluído. O tipo MYB, motifs específico de pólen e específico de raiz são destacados. WAACCA fsublinhado/itáiico) MYBIAT; CCWACC (icaíxa1) MYBPZM; AGAAA f sublinhado^ POLLEN1LELAT52 (ID de seqüência no. 4). - a figura 5 mostra motifs nas sequências de promotores Atmyb32 e Atmyb32xs. - a figura 6 mostra a seqüência de nucleotídeos do gene isopenteníl transferase {ipt\ de Agrobacterium tumefaciens(ID de seqüência no. 5). - a figura 7 mostra a seqüência de aminoácidos deduzida do gene isopentil transferase de Agrobacterium tumefaciens (ID de seqüência no. 6), - a figura 8 mostra a seqüência de nucleotídeos do gene isopentil transferase de Lotus japonicus (ID de seqüência no. 7). - a figura 9 mostra a seqüência de aminoácidos deduzida do gene isopentil transferase de Lotus japonicus (ID de seqüência no. 8). - a figura 10 mostra a seqüência de nucleotídeos do gene Sho de biossíntese de citoquinina de Petunia hybrida (ID de seqüência no. 9). - a figura 11 mostra a seqüência de aminoácidos deduzida do gene Sho de biossíntese de citoquinina de Petunia hybrida (ID de seqüência no. 10). - a figura 12 mostra PCR e análise Southern de DNA de plantas trevo branco (Trifoiium repetis) transgênicas atmyb32::ipt, a) a região T-DNA de patmyb32:ipt mostrando sítios de enzimas de restrição e localização das sondas usadas para a análise de hibridização Southern, b) gel agarose 1% manchado com brometo de etídío dos produtos 599 bp nptíie 583 bp ipt amplificados por PCR. c) hibridização Southern blot com DNA genômico total digerido por Hindíll isolado de PCR positiva de plantas trevo branco híbridizadas com a sonda ipt d) hibridização Southern blot com DNA genômico total digerido por Hindíll isolado de PCR positiva de plantas trevo branco híbridizadas com a sonda nptíi. Trilhas 1 e 2: dois regenerantes cv. Haifa independentes resistentes a kanamicina, código; HmiOl e Hmi08, respectivamente; Trilhas de 3 a 12; doze regenerantes cv. Irrigação independentes, resistentes a kanamicína, códigos: ImiOõ, Imi07, Imi08, Imi09, ImilO, Imill, Imil2, Imil4, Imil6, Imil8, respectiva mente; Trilha C: trevo branco não transformado; Trilha P: controle positivo plasmídeo patmyb32ipt. - a figura 13 mostra a análise RT-PCR da expressão /pímRNA em plantas trevo branco (T. repens) transgênicas atmyb32::ipt As trilhas de 1 a 11 são amostras de 11 linhas transgênicas independentes com os correspondentes códigos de plantas como na figura 4.8; a Trilha C, controle planta não transformada; Trilha P, plasmídeo como controle positivo. O RN A total foi isolado de tecidos de folha. O RN A total (13 pg) foi usado para cada reação de transcrição reversa e 1/5 do produto RT foi amplificado por PCR. Os produtos DNA no gel à direita foram amplificados por 2x 30 ciclos de PCR intensiva. Nenhuma transcríptase reversa foi adicionada à reação RT-PCR correspondente carregada em trilhas alternadas. - a figura 14 mostra um bioensaio de envelhecimento de folhas extirpadas de plantas trevo branco (T. repens) transgênicas atmyb32::ipt Pelo menos 30 folhas foram coletadas de cada linha a partir de posições similares em estolões de linhas de planta. A. O número de folhas amarelando como uma fração do número total de folhas extirpadas. B. Aparência típica de folhas mantidas em água sob luz por duas semanas. Chave para as linhas de plantas: HC, IC e Hmg, Img, não transformada e plantas transgênicas atmyb32::gusA (cv. Haifa e Irrigação) respectiva mente; 01 e 08, linhas Haifa transgênicas atmyb32;;ipt HmiOl e Hmí08, respectiva mente; 11, 12, 16 e 18 linhas Irrigação transgênicas atmyb32::ipt Imill, Imíl2, Imil6 e ImilS, respectivamente, - a figura 15 mostra A) morfologia geral da planta, B) desenvolvimento normal de broto, e C) desenvolvimento normal de raiz em plantas (direita) trevo branco (T. repens) transgênicas atmyb32::Íptem comparação com plantas de controle (esquerda). - a figura 16 mostra detalhes do vetor para pBMVkAtMYB32-900::ipt [Gene: isopentil transfera se {ipt)\ vetor: pBMVkAtM YB32-900::ipt-nos (espinha dorsal pPZPRCS2); marcador selecionável: spec; cartucho marcador selecíonável de planta: 35S::kan::35ST; promotor gene: AtMYB32-90B, termina dor gene: nos\. - a figura 17 mostra a sequência de nucleotídeos do vetor pBMVkAtMYB32- 900::ipt~nos(ID de sequência no, li). - a figura 18 mostra detalhes do vetor pBMVkAtMYB32xs::ipt-nos [Gene: isopentil transferase {iptf, vetor: pBMVkA tMYB32XS::ipt-nos (espinha dorsal pPZPRCS2); marcador selecionável: spec; cartucho marcador selecionável de planta: 35S::kan::35ST; promotor gene: AtMYB32-xs, terminador gene: nos}. - a figura 19 mostra a seqüêncía de nucleotídeos do vetor pBMVkAtMYB32XS::ipt-nos (ID de sequência no. 12). - a figura 20 mostra detalhes do vetor para pBMVhAtMYB32-900::ipt-nos [Gene: isopentil transferase (ipfy, vetor: pBMVhAtMYB32-9ÕÕ;;ipt-no$ (espinha dorsal pPZPRCS2); marcador selecionável: spec; cartucho marcador selecionável de planta: 35S;;hph:;35ST; promotor gene: AtMYB32-90Q·, terminador gene: nos}. - a figura 21 mostra a seqüência de nucleotídeos do vetor pBMVhAtMYB32-900::ipt-nos (ID de seqüência no. 13). - a figura 22 mostra detalhes do vetor para pBMVhAtMYB32xs::ipt-nos [Gene: isopentil transferase {ipfy, vetor: pBMVhAtM YB32XS::ípt-nos (espinha dorsal pPZPRCS2); marcador selecionável: spec; cartucho marcador selecionável de planta: 35S::hph::35ST; promotor gene: AtMYB32-xsf terminador gene: nos\. - a figura 23 mostra a seqüência de nucleotídeos do vetor pBMVhAtMYB32xs;;ipt-nos (ID de seqüência no. 14), - a figura 24 mostra detalhes do vetor para pBSubn-AtMYB32-9Õ0;;ipt-no$ [Gene: isopentil transferase {ipfy vetor: pBSubn-AtMYB32-90Õ::ipt~nos (espinha dorsal pPZPRCS2); marcador selecionável: spec; cartucho marcador selecionável de planta: Ubi::bar::nos; promotor gene: AtMYB32-900, terminador gene: nos}, - a figura 25 mostra a seqüência de nucleotídeos do vetor pBSubn-AtMYB32-900::ipt-nos (ID de seqüência no. 15). - a figura 26 mostra geração de canola transgênica contendo o pBMVhAtMYB32-900::ipt-nos e o pBMVhAtMYB32xs::ipt-nos. A. Sementes de canola são germinadas in vitro; B. Seções hipocótilo são extirpadas das plantas novas de 7 dias de idade e inoculadas com uma suspensão de Agrobactehunr, C & D, Regeneração a partir das seções hipocótilo inoculadas sob seleção higromicina; E-X Plantas de canola transgênica T0 portando os vetores pBMVhAtMYB32-900::ipt-nos e o pBMVhAtMYB32xs::ipt-nos. - a figura 27 mostra um processo para transformação biolística de trigo. - a figura 28 mostra a transformação biolística do trigo (Triticum aestivum L. MPB Bobwhite 26). Produção de planta doadora (A & B); isolamento de embrião zigótico (C & D); Regeneração sob seleção glufosinato (E - G); Formação de raiz sob seleção (H); plantas T0 crescendo sob condições de estufa de contenção para recuperação de descendência transgênica (I). - a figura 29 mostra teste de campo contido de plantas trevo branco transgênico expressando genes quiméricos Atmyb32::ipt. - a figura 30 mostra a avaliação comparativa de taxas de crescimento e dinâmica de crescimento de plantas trevo branco transgênicas expressando genes quiméricos Atmyb32::ipt com plantas de controle trevo branco não transgênicas. A) Taxas de crescimento B) Dinâmica de crescimento C) características de crescimento (após 45 dias) □ Trevo branco transgênico ■ Trevo branco não transgênico (claro) (escuro) - a figura 31 mostra a intensidade de florescimento (i.e. o número de folhas maduras por m2) de plantas trevo branco transgênicas expressando genes quiméricos Atmyb32::ipt (i.e. LXR 12, LXR 18 e LXR 11) e plantas de controle trevo branco não transgênicas (i.e. WT) sob condições de campo contido. - a figura 32 mostra o peso das sementes (i.e. o peso de mil sementes, em gramas) de plantas trevo branco transgênicas expressando os genes quiméricos Atmyb32::ipt (i.e. LXR 12, LXR 18 e LXR 11) e plantas de controle trevo branco não transgênicas (i.e. WT) sob condições de campo contido. - a figura 33 mostra o rendimento de sementes por flor (em miligramas) de plantas trevo branco transgênicas expressando os genes quiméricos Atmyb32::ipt (i.e. LXR 12, LXR 18 e LXR 11) e plantas de controle trevo branco não transgênicas (i.e. WT) sob condições de campo contido. - a figura 35 mostra a geração de plantas transgênicas de alfafa contendo os genes quiméricos pBMVkA TMYB3-900::ipt-nos e pBMVkA TMYB32xs::ipt-nos A, Explantes de pecíolo de clones de alfafa C2-3, C2-4 e 19-17 são usados para inoculação com uma suspensão de Agrobacterium e levam à produção de calos embriogênicos transformados após seleção em presença de kanamicina; B-D. Regeneração de plântulas transgênicas de alfafa portanto genes quiméricos de vetores pBMVkA TMYB3-90Q::ipt-nos e pBMVkATMYB32xs::ipt-nos, a partir de embriões somáticos crescidos in vitro. - a figura 36 mostra a análise PCR de plantas transgê nicas de canoia (plantas de canoia TI LXR Linha 4). O DNA genômico foi isolado a partir de plantas transgênícas diferentes de canoia de linhas Ti LXR04 e submetido a PCR usando preparadores específicos para A. o marcador selecionável {hph) ou B. o gene candidato de interesse - a figura 37 mostra a análise de expressão do gene IPT em plantas transgênícas Tj de canoia (TI LXR canoia com relação à expressão de IPT na folha). - a figura 38 mostra canoia transgênica exibindo atraso no envelhecimento de cotílédone destacado em comparação com cotilédones de controle do tipo selvagem 7 dias após o destacamento. - a figura 39 mostra a classificação de envelhecimento de cotilédones de canoia transgênica Ti em 7 dias após o destacamento. - a figura 40 mostra canoia transgênica exibindo atraso no envelhecimento de folhas juvenis destacadas em comparação com cotilédones de controle do tipo selvagem 14 dias após o destacamento. - a figura 41 mostra a classificação de envelhecimento das primeiras folhas juvenis de canoia transgênica Ti em 14 dias após o destacamento. - a figura 42 mostra o ensaio de hibridização de linhas de trigo transgênicas. As trilhas incluem: MW - peso molecular; WT - tipo selvagem; linhas transgênicas de trigo LXR3, LXR4, LXR13, LXR16 e controles positivos plasmídeo contendo 10 e 20 pg. - a figura 43 mostra a análise de expressão de linhas de trigo transgênicas Ti independentes (expressão quantitativa de IPT em trigo). Os valores de transcrição quantitativa foram determinados em femtomoles (fmol) por micrograma de RNA usando uma curva padrão derivada do DNA do plasmídeo contendo a seqüência alvo. As amostras representam classes de expressão alta, média e baixa para o gene candidato IPT. - a figura 44 mostra a variação fenotípica de plantas de trigo transgênico Ti crescidas em estufa. A. plantas de trigo Ti LXR 13 exibindo fenótipo normal se comparadas às plantas de trigo de controle. B. plantas de trigo Ti LXR 04 exibindo fenótipo atrofiado e número de folhas de bandeira aumentado em comparação com plantas de trigo de controle. - a figura 45 mostra trigo transgênico exibindo atraso de envelhecimento de folhas se comparado com folhas de controle nulas 7 dias após o destacamento.

Exemplos Exemplo 1 Seqüência de promotor Atmyb32 e variantes de seqüência de promotor [060] A seqüência do promotor Atmyb32 e suas variantes são mostrados nas figuras de 1 a 4.

Exemplo 2 Genes da biossíntese de citoquinina [061] Exemplos de genes da biossíntese de citoquinina adequados para uso no presente invento, são mostrados nas figuras 6, 8 e 10. Os genes adequados também incluem aqueles que codificam o polipeptídeo mostrado nas figuras 7, 9 e 11.

Exemplo 3 Produção de plantas trevo branco transgênicas [062] As plantas trevo branco (Trifolium repens cv. Haifa e Irrigação) transgênicas foram produzidas por transformação mediada por Agrobacterium usando um vetor binário carregando o gene químérico atmyb32::ipt (Figura 12a). As plantas transgênicas foram rastreadas por PCR usando preparadores ipt e nptíl (Figura 12b). Amostras de DMA genômico digerido por Hindlll submetidas a análise de hibridização de DMA Southern mostraram que os fragmentos de DNA maiores que 4.4 kb foram detectados em todas as trilhas por ambas sondas ipte nptHf demonstrando a presença e integração do T-DNA de comprimento total no genoma do trevo branco (Figura 12). As linhas transgênicas HmiOl, ImiQ6, Imill e Imil8 (Trilhas 1, 3, 5, 8 e 12, respectiva mente) pareciam ter uma cópia única do T-DNA de comprimento total no genoma. Outras linhas transgênicas tinham múltiplas cópias do transgene atmyb32;;ipt Exemplo 4 Expressão do gene IPTem plantas trevo branco transgênicas [063] A expressão do transgene atmyb32::ipt em plantas trevo branco transgênicas (T, repens) foi avaliada por RT-PCR. O mRNA ipt foi detectado em tecidos de folhas de todas as plantas trevo branco transgênicas atmyb32::ipt examinadas, com níveis variados de produtos PCR detectados (Figura 13).

Exemplo 5 Envelhecimento retardado de folhas destacadas em plantas trevo branco transgênicas [064] Foram realizados experimentos para avaliar o envelhecimento de folhas destacadas de plantas transgênicas atmyb32;;ipt O amarelamento rápido foi observado em folhas destacadas de plantas trevo branco não transformadas e transgênicas atmyb32::gusA de ambos os cultivares dentro de uma semana. As linhas transgênicas HmiOl, Hmi08, Imii6 e ImilS mostraram envelhecimento retardado enquanto Imill e Imil2 mostraram nenhum sinal de amarelamento ao fim de 7 dias. Após duas semanas, as folhas de todas as plantas transgênicas atmyb32::ipt estavam muito mais verdes que aquelas das plantas de controle não transformadas e transgênicas atmyb32::gusA (figura 14). O grau de envelhecimento nas folhas extirpadas foi na ordem HC, Hmg > HmiOl > HmiOB para o cv. Haifa, e IC e Img > Imil6 > Imil8 > Imill e Imil2 para o cv Irrigação. HC é o controle Haifa não transformado, Hmg é o controle Haifa atmyb32::gusA, IC é o controle Irrigação não transformado, Img é o controle Irrigação atmyb32;:gusA. HmiOl, HmiOS, Imíl6, Imil8, Imill e Imil2 são plantas trevo branco transgênicas atmyb32::ipt independentes, dos cultivares Haifa (H) e Irrigação (I), respectiva mente.

Exemplo 6 Morfoiogia de plantas e desenvolvimento de raiz em plantas trevo branco transgênicas [065] Uma morfoiogia normal de planta, bem como desenvolvimento normal de broto e de raiz foram observados nas plantas trevo branco transgênicas atmyb32::ipt (figura 6), indicando assim que a expressão regulada do gene ipt sob controle do promotor atmyb32 não afetaram negatívamente nem a raiz nem o domínio a picai das plantas trevo branco tra nsgên icas (Tabela 1).

Tabela 1 [066] Uma morfoiogia normal de planta e raizes normais foram observados em 10 linhas analisadas de trevo branco transgênico atmyb32::ipt independentes. É mostrado o número de cópias do gene ipt nas 10 linhas de trevo branco transgênico atmyb32::ipt independentes.

Exemplo 7 Geração de vetores para a transformação da planta [067] Quatro vetores binários foram gerados para transformação de plantas mediada por Agrobacterium (figuras de 16 a 19). Cada vetor tem uma dorsal de vetor pPZP200 (Hajdukiewicz et ai, 1994) e contém ou Atmyb32-900::ipt-nos ou Atmyb32-xs::ipt-nos quiméricos, com ou sem cartuchos marcadores selecionáveis 35S::ntpll-35st ou 35S::hph::35st q u i méricos.

[068] Um vetor de transformação foi construído para transformação biolística (figuras 20 e 21). O vetor de transformação contém Atmyb32-900::ipt-35st com um cartucho marcador selecionável Ubi::bar-nos quimérico.

[069] O promotor Atmyb32, a variante de promotor Atmyb32xs, o gene isopentil transferase e os terminadores 35st e nos foram amplificados por PCR usando preparadores adaptados Gateway™ (Invitrogen) e clonado em um vetor de entrada pDONR221. Estes foram subseqüentemente clonados usando recombinação nos vetores de destino contendo os cartuchos marcadores selecionáveis convencionalmente clonados. Todos os vetores foram completamente seqüenciados seguindo protocolos estritos de garantia de qualidade.

Exemplo 8 Transformação de canola {Brassica napus) mediada por Agrobacterium [070] Vetores binários pBMVhATMYB3-900::ipt-nos (figura 20) e pBMVhATMYB32xs::ipt-nos (figura 22) contendo genes ipt quiméricos sob controle do promotor Atmyb32 (figura 1) e seqüência de variante de promotor Atmyb32xs com motifs específicos de raiz excluídos (figura 2) foram usados para a transformação mediada por Agrobacterium de segmentos hipocótilo de Brassica napus (figura 26).

[071] As sementes de Brassica napus foram esterilizadas na superfície em etanol 70% por 2 minutos, lavando 3 vezes com água esterilizada e então esterilizadas adicionalmente na superfície numa solução contendo 1% (p/v) de hipoclorito de cálcio e 0,1% (v/v) de Tween 20 por 30 minutos. As sementes foram lavadas 3 vezes numa água esterilizada e plantadas em vasos de cultura de 120 ml_ contendo um meio de germinação solidificada contendo lx macronutrientes Murashige e Skoog (Murashige e Skoog, Physiol. Plant. 15, 473, 497, 1962), lx micronutrientes e vitaminas orgânicas B5 suplementadas com 500 mg/L de MÊS, 2% (p/v) de sacarose a pH 5,8 com a adição de 4 g/L de Gelrite. Os vasos são incubados a 25°C sob 16h/18h de condições escuras por 7 dias para encorajar a germinação.

[072] Após 7 dias, as sementes de Brassica napus (todas as sementes) são transferidas para um meio líquido contendo de 1 x Murashige e Skoog macronutrientes, lx micronutrientes e vitaminas orgânicas B5, suplementado com 500 mg/L de MÊS, 3% de sacarose (p/v) a pH 5.8. As sementes são agrupadas entre si e as raizes e os cotilédones são removidos antes de cortar os hipocótilos em seções de 7 a 10 mm e plantar em discos de petri de 9 x 1,5. contendo um meio precondicionante consistindo de lx Murashige e Skoog macronutrientes, lx micronutrientes e vitaminas orgânicas B5, suplementada com 500 ml_ de MES 3% (w/v) de sacarose em pH 5.8 solidificado com 6,4 g/l de Bacto-Agar.

[073] Os hipocótilos são cultivados por 24 horas antes da inoculação com a suspensão OD50o = 0,2 por 30 minutos consistindo de lx Murashige e Skoog macronutrientes, lx micronutrientes e vitaminas orgânicas B5, suplementada com 500 mL de MES, 100 μΜ de Acetosiringona, 3% (w/v) de sacarose em pH 5.8 [074] Após a inoculação, as seções de hipocótilos são engarrafadas em toalhas de papel esterilizadas e transferidas para discos de petri de 9 x 1,5 cm contendo lx Murashige e Skoog, lx micronutrientes e vitaminas orgânicas B5, suplementada com 500 ml_ 3% (w/v) de MÊS, 100 μg de Acetosiringona, 1 mg/L de 2,4-D, de sacarose em pH 5.8 solidificado como 8 g/l. Os explantes são incubados a 25°C sob 16 h de luz, 8h de escuridão por 72 horas de co-cultivo.

[075] Seguinte ao co-cultivo, de 20 a 30 explantes de hipocótilo .são transferidos para discos de petri contendo um meio de reação solidificado consistindo de lx Murashige e Skoog macronutrientes, lx micronutrientes e vitaminas orgânicas B5, suplementada com 500 mL de MES, 1 mg/L de 2,4-D, 3% (p/v) de sacarose em pH 5.8 solidificado com 8 g/l de Bacto-Agar, suplementado com 250 mg/L de timentina e 10 mg/L de higromicina para selecionar os brotos resistentes a higromicina. Os pratos são incubados a 25°C sob 16 h de luz, 8h de escuridão.

[076] Após 7 dias, os explantes hipocótilos são transferidos para placas de petri de 9 x 20 cm contendo um meio de regeneração solidificado consistindo de lx Murashige e Skoog macronutrientes, lx micronutrientes e vitaminas orgânicas B5, suplementada com 500 mL de MES, 1 mg/L de 2,4-D, 3% (p/v) de sacarose em pH 5.8 solidificado com 8 g/l de Bacto-Agar, suplementado com 4 mg/L de BAP, 2 mg/L de Zeatina, 5 mg/L de nitrato de prata, 250 mg/L de timentina e 10 mg/L de higromicina. As placas são incubadas sob luz direta a 25°C sob condições de luz fluorescente (16 h de luz/ 8 h de fotoperfodo escuro; 55 μηηοΙ m"2 sec"1) por 4 semanas para encorajar o desenvolvimento de brotos.

[077] A regeneração é monitorada semanalmente e os explantes de hipocótilo são transferidos para novas placas de petri limpas 9 x 2,0 cm contendo meio de regeneração solidificado, RM suplementado com 4 mg/L de benziladenina, 2 mg/L de zeatina, 5 mg/L de nitrato de prata, 250 mg/L de trimetina e 10% de higromicina durante 6 a 8 semanas para estimular o desenvolvimento de brotos.

[078] Brotos resistentes a higromicina (Hyg1) são transferidos para vasos de 120 mL contendo meio de indução de raiz solidificada, RIM1, consistindo de lx Murashige e Skoog macronutrientes, lx micronutrientes e vitaminas orgânicas B5, suplementada com 500 mL de MES, 1 mg/L de 2,4-D, 1% (p/v) de sacarose em pH 5.8 solidificado com 8 g/l de Bacto-Agar suplementado com 250 mg/L de timentina. Os brotos são incubados sob luz fluorescente direta a 25°C (fotoperfodo de 16 h de luz/ 8 h de escuridão; 55 μιτιοΙ m'2 sec 1) para encorajar o alongamento do broto e o desenvolvimento de raiz por de 4 a 5 semanas. Todos os brotos de Hygr com sistemas de broto e raiz desenvolvidos são transferidos para o solo e crescidos sob condições de estufa.

Exemplo 9 Transformação biolística de trigo ( Triticum aestivum L.) [079] Os vetores de transformação contendo os genes quiméricos ipt sob controle do promotor Atmyb32 (figura 1) e da seqüência promotora variante Atmyb32 com motifs específicos de raiz excluídos (figura 2), foram usados para a transformação biolística de trigo (Triticum aestivo L. MPB Bobwhite 26). Um vetor representativo é mostrado na figura 24. Um esquema do procedimento para a transformação biolística de trigo é delineado na figura 27. O procedimento de transformação inclui as seguintes etapas: Etapa 1 (produção da planta doadora) [080] A semente do Triticum aestivum (Bobwhite 26) é usada para a produção do material da planta doadora. As plantas de trigo crescem num misto de viveiro consistindo de um fundo de pinho composto, perlita e vermiculita, com 5 plantas por pote até um tamanho máximo de 20 cm. As plantas são mantidas sob condições de estufa em aproximadamente de 22 a 24°C por de 12 a 16 semanas (figura 28A). Uma vez que o primeiro espigão emirja da folha em bandeira, as plantas são rotuladas e são coletados embriões das cabeças mais altas 12 a 15 dias após antese.

Etapa 2 (dia 1) [081] Os espigões no estágio desejado de desenvolvimento são colhidos (figura 28B). As cariopses são removidas dos espigões e a superfície é esterilizada por 20 minutos em uma solução de NaOCI 0,8% (v/v) de solução MaOCI e lavados pelo menos quatro vezes em água destilada estéril. Embriões com até 10 mm de comprimento são asséptica mente extirpados de cada cariopse (removendo o eixo) usando um microscópio de dissecação e o lado axial cultivado é mergulhado num meio osmótico (E3 maltose) consistindo de 2x Murashige e Skoog (1962) macronutrientes, 2x micronutrientes, 1 x micronutrientes e vitaminas orgânicas, 40 mg/L de tiamina, 150 mg/L de L-asparagina, suplementado com 15% (p/v) de maltose, 0,8% (p/v) de agar Sigma e 2,5 mg/L de 2,4-D (figura 28 C 8i D). Os embriões são cultivados em placas de petri de polipropileno transparente de 60 mm x 15 mm com 15 mL de média. As placas de cultura são incubadas a 24°C no escuro por 4 horas antes do bombardeio. Os embriões são bombardeados usando uma pistola de gene BioRad PDS 1000 a 900 psi e a 6 cm com 1 pg de vetor DNA de plasmídeo precipitado sobre 0,6 pm de partículas de ouro. Após o bombardeio, os embriões são incubados de um dia para o outro no escuro em meio osmótico.

Etapa 3 (dia 2): [082] Os embriões são transferidos para um meio de indução de calo (E3calli) consistindo de 2x Murashige e Skoog (1962) macronutrientes e lx micronutrientes e vitaminas orgânicas, 40 mg/L de tiamina, 150 mg/L de L-asparagina, suplementada com 6% (p/v) de sacarose, 0,8% (p/v) de agar Sigma e 2,5 mg/L de 2,4-D. Os embriões foram cultivados por duas semanas a 24°C no escuro.

Etapa 4 (dia 15): [083] Após 2 semanas de cultura em E3calli, os embriões produziram calos embriogênicos e são subcultivados em um meio de seleção (E3Select) consistindo de 2x Murashige e Skoog (1962) macronutrientes e lx micronutrientes e vitaminas orgânicas, 40 mg/L de tiamina, 150 mg/L de L-asparagina, suplementado com 2% (p/v) de sacarose, 0,8% (p/v) de agar Sigma, 5 mg/L de D,L-fosfinotricina (PPT) e nenhum regulador de crescimento de planta (figura 28E-G). As culturas foram incubadas por mais 14 dias em E3Select a 24°C na luz e num fotoperíodo de 12 horas.

Etapa 5 (dia 30) [084] Após 14 dias de cultura em E3Select, o calo embriogênico é subcultivado em meio E3Select fresco por mais 14 dias (Figuras de 28E a 28).

Etapa 6 (dia 44) [085] Após cerca de 4 semanas em E3Select, as plântulas são extirpadas da massa dos calos embriônicos e crescem por mais três semanas em vasos de cultura de tecido de policarbonato de 65 x 80 mm ou de 65 x 150 mm contendo meio de indução de raiz (RM). O meio de indução de raiz consiste de lx Murashige e Skoog (1962) macronutrientes, micronutrientes e vitaminas orgânicas, 40 mg/L de tiamina, 150 mg/L de L-asparagina, suplementados com 2% (p/v) de sacarose, 0,8% (p/v) de agar Sigma e 5 mg/L de PPT (figura 28H). O calo embriogênico remanescente é subcultivado em E3Select por mais 14 dias.

Etapa 7 (dia 65+) [086] As plântulas regeneradas que sobreviveram mais de 3 semanas em RM com formação saudável de raiz são colocadas num misto de viveiro consistindo de turfa e areia (1:1) e mantidos a de 22 a 24°C com elevada umidade sob um sistema de câmara de umidade de viveiro (figura 28). Após duas semanas, as plantas são removidas da câmara de umidade e lavadas a mão e alimentadas com Aquasol™ líquido semanalmente até a maturidade. As plantas T0 são amostradas para DNA genômico e análise molecular. A semente Ti é coletada e plantada para uma análise Q-PCR de alta saída (Figura 28J).

Exemplo 10 Desempenho agronômico de plantas trevo branco transgênicas [087] O desempenho agronômico de plantas trevo branco (Trifo/ium repens) transgênicas atmyb32::ipt, com relação às plantas de controle trevo branco não transgênicas, foi avaliado sob condições de câmara de crescimento ambiental mente controlado e em testes de campo contido (figura 29).

[088] As plantas trevo branco transgênicas expressando os genes Atmyb32::ipt quiméricos avaliadas sob condições de câmara de crescimento controlado revelaram uma acumulação de biomassa significativa mente intensificada e reduções nas manifestações de envelhecimento, quando comparados com as plantas de controle trevo branco não transgênicas (figura 30). As plantas trevo branco transgênicas expressando os genes Atmyb32::ipt quiméricos exibiram uma área de folhagem total intensificada, área de folhagem cumulativa aumentada, maior dinâmica de crescimento de folhas (i.e., número de folhas pelo tempo), maior comprimento de estolão e % de plantas florescendo aumentado bem como envelhecimento e morte reduzidos do estolão em comparação com as plantas de controle trevo branco não transgênicas (figura 30A a C).

[089] O desempenho de produção de sementes de 3 plantas trevo branco transgênicas independentes expressando o gene atmyb32::ipt(}.e. LXR 12, LXR 18 e LXR 11) também foi com parati va mente avaliado com plantas de controle não transgênicas (i.e., do tipo selvagem, WT) sob condições de campo contido. Duas plantas trevo branco transgênicas independentes expressando o gene atmyb32::ipt{\.&. LXR 12 e LXR 18) com intensidade de florescimento indistinta (i.e., numero de flores maduras por m2) com relação à planta de controle não transgênica (i.e. WT) foram escolhidos para avaliação de campo (figura 31).

[090] Enquanto o peso das sementes (i.e., o peso de mil sementes) de plantas trevo branco transgênicas, expressando os genes quiméricos Atmyb32::ipt (i.e., LXR 12, LXR 18 e LXR 11) foi indistinto das plantas de controle trevo branco não transgênicas (i.e., WT) (figura 32), a produtividade total de sementes expressa com base em cada flor (figura 33), e por área (figura 34) foi o dobro nas plantas trevo branco transgênicas, expressando os genes quiméricos Atmyb32::ipt (i.e., LXR 12 e LXR 18) quando comparada com plantas de controle trevo branco não transgênicas de intensidade de florescimento equivalente (i.e., WT).

Exemplo 11 Transformação de alfafa {Medicago sativa) mediada por Agrobacteríum [091] O vetor binário pBMVkATMYB32xs::ipt-nos (figura 18) contendo os genes quiméricos ipt sob controle da seqüência promotora variante Atmyb32xs com motifs específicos de raiz excluídos (Figura 2) foi usado para transformação mediada por Agrobacterium de ex plantes de pecíolo de Medicago Sativa a partir de clones de alfafa altamente regenerável {M, sativa) C2-3, C2-4 e 19-15 (figura 35), [092] Após o co-cultivo com a cepa LBA 4404 de Agrobacterium tumefaciens guardando o vetor binário pBMVkA TMBY32xs::ipt-nos, os explantes de alfafa foram lavados com meio contendo cefotaxime e usados para indução de caio embríogênico sob meio seletivo contendo 25 mg/L de kanamicina. Os calos de alfafa transgênica embriogênica foram recuperados e permitiu regenerar os brotos de alfafa transgênica, que foram transferidos para o meio de raiz levando à recuperação de plantas alfafa transgênicas expressando os genes quiméricos ipt sob controle do promotor variante Atmyb32sx (figura 35), [093] Deve ser entendido que o invento descrito e definido no presente relatório descritivo se estende a todas as combinações alternativas de duas ou mais das características individuais mencionadas ou evidentes a partir do texto ou dos desenhos, Todas estas combinações diferentes constituem vários aspectos alternativos do presente invento.

Exemplo 12 Produção de plantas transgênicas de canola [094] As plantas transgênicas de canola {Brassica napus) foram produzidas por transformação mediada por Agrobacterium usando vetores binários (figuras 20 e 22) portando o gene quimérico atmyb32:;ipt A modificação genética foi caracterizada pela presença do gene candidato {IPT) ou do marcador selecionável {hph) usando PCR na geração Ti (figura 36), [095] A figura 36 ilustra a análise PCR de plantas transgênicas de canola, O DNA genômico foi isolado de diferentes plantas transgênicas de canola de linhas Tj LXR04 e submetido a PCR usando preparadores específicos para o marcador selecionável (gene hph) ou o gene candidato de interesse {IPT}, Na figura 36A foram usados preparadores específicos para hph para amplificar um produto a partir do DNA genômico e eram visualizados num gel de agarose. A figura 36B demonstra o uso de preparadores específicos para IPT para amplificar o DNA genômico usando um método PCR fluorescente. Os preparadores são específicos para a sequência alvo que resulta em fluorescência detectável que é inversamente proporcional à quantidade de PCR acumulado.

Exemplo 13 Expressão do gene IPTem plantas transgênicas de canola [096] A expressão do transgene atmyb32::ipt em canola transgênica foi avaliada usando um método RT-PCR fluorescente específico para a seqüência alvo (figura 37). O mRNA IPTfoi detectado em tecidos e os níveis de expressão relativa foram comparados entre linhas e com controles nulos. Os controles nulos são linhas de descendência que sofreram o processo de transformação mas não contêm as seqüências alvo após cruzamento.

Exemplo 14 Envelhecimento retardado de folhas destacadas em plantas transgênicas de canola [097] Foram realizados experimentos para avaliar o envelhecimento de folhas destacadas de plantas transgênicas atmyb32::ipt As figuras de 38 a 41 indicam os dados de ensaio de envelhecimento destacado associados com a expressão do gene candidato em canola. Os ensaios para cotilédones destacados e folhas foram conduzidos para induzir envelhecimento e avaliar o fenótipo envelhecimento de canola transformada em comparação com controles do tipo selvagem. Nos dias 7 e 14 dos ensaios de envelhecimento destacado, o progresso do envelhecimento foi qualitativamente classificado para cada amostra de tecido como sendo 0 - nenhum sinal possível de envelhecimento; 1 - primeiros sinais visíveis de envelhecimento com um empalidecimento da cor verde; 2 - progressão adicional do envelhecimento com amarelamento da cor tornando-se notável; 3 - o tecido estava principalmente amarelo, entretanto permanecia evidente uma cor verde pálida; 4 - progressão para cor completamente amarela; 5 -amarelo na cor com algum descoramento e trechos de necrose (figuras 39 e 41).

Exemplo 15 Produção de plantas de trigo transgênico [098] A transformação genética do trigo foi baseada na transformação biolística de embriões zigóticos da linhagem de trigo Triticum aestivum L Bobwhite 26 como delineado nas figuras 27 e 28.

[099] O gene quimérico atmyb32::ipt foi inserido no genoma do trigo por bombardeamento de partícula usando plasmídeos inteiros, então seqüências de espinha dorsal de vetor também podem ser incorporadas no genoma (figura 24).

[0100] O vetor de transformação foi completamente seqüenciado (figura 25). A modificação genética foi caracterizada pela presença do gene candidato por análise Southern na geração Ti (figura 42).

[0101] A figura 42 ilustra a análise de hibridização Southern de plantas transgênicas de trigo. O DNA genômico foi isolado de diferentes linhas Ti de plantas transgênicas de trigo e digerido com uma enzima de restrição para determinar o número de cópias do gene candidato. O controle é o trigo não transformado do tipo selvagem Triticum aestivum "Bobwhite 26". O material digerido sofreu eletroforese, foi transferido para uma membrana de nylon e sondado com um gene IPTrotulado com DIG de tamanho integral, como uma sonda. Uma faixa de número de cópias foi observada.

Exemplo 16 Expressão do gene IPTem plantas transgênicas de trigo [0102] O RNA foi extraído de tecido de folha jovem de plantas de trigo Ti transgênicas crescidas em estufa contendo o gene IPT acionado pelo promotor AtMYB32 e a primeira fita cDNA foi preparada.

[0103] A expressão quantitativa do transgene foi determinada usando uma sonda baseada no método qRT-PCR para a seqüência alvo. Exemplos representativos de linhas de expressão alta, média e baixa para cada uma das construções estão presentes na figura 43. Um conjunto preparador/sonda projetado para o gene endógeno da sintase de sacarose também foi usado como controle. Todos os gráficos de amplificação do gene de controle começaram em um ciclo de cada outro indicando que as diferenças no nível de detecção dos GMOs é devida a variação em expressão.

[0104] Ambos iniciador e sonda PCR são específicos para a seqüência alvo o que resulta em fluorescência detectável que é proporcional à quantidade de produto PCR acumulado. O DNA do plasmídeo diluído serialmente contendo a seqüência alvo em detecção foi empregado para criar uma curva padrão de quantificação.

Exemplo 17 Morfologia de planta em plantas transgênicas de trigo [0105] As diferenças nas características de crescimento foram observadas na estufa dentro e entre as linhas de trigo transgênicas. Os fenótipos predominantemente observados entre plantas de trigo Ti incluem altura de planta atrofiada, intensidade de perfilamento, número de folhas, bem como biomassa vegetativa (figura 44).

Exemplo 18 Retardo no envelhecimento de folha destacada em plantas de trigo transgênicas [0106] Um ensaio de folha destacada foi usado para avaliar o envelhecimento induzido e o fenótipo de envelhecimento de folhas de trigo transformado em comparação com controles nulos (figura 45). Os controles nulos são linhas de descendência que sofreram o processo de transformação mas não contêm seqüências alvo após cruzamento.

[0107] Deve também ser entendido que o termo "compreende" (ou suas variantes gramaticais) como aqui usado é equivalente ao termo "inclui" e não deve ser tomado como excluindo a presença de outros elementos ou características.

[0108] Os documentos citados na presente descrição são somente para fins de referência e sua inclusão não é um reconhecimento de que eles forma parte de um conhecimento geral comum no estado da técnica.

[0109] Finalmente, deve ser entendido que as várias alterações, modificações e/ou adições podem ser feitas sem fugir ao espírito do presente invento, como aqui delineado.

Reivindicações

Claims (13)

1. Método de manipular o envelhecimento ou intensificar a biomassa numa planta, caracterizado pelo fato de incluir introduzir em dita planta uma construção genética incluindo um promotor gene myb32 de Arabidopsis modificado incluindo uma sequência de nucleotídeo selecionado a partir do grupo da SEQ ID NO 2, 3 e 4, operacionalmente ligado a um gene que codifica uma enzima envolvida na biossíntese de uma citoquinina em que dito gene é um gene isopentenil transferase {ipf) ou um gene sho, em que um ou mais motifs específicos de raiz e/ou motifs específicos de pólen são excluídos ou desativados em dito promotor gene myb modificado.

2. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato que um ou mais motifs específicos de raiz são excluídos ou desativados e que cada um de ditos motifs específicos de raiz inclui uma seqüência de consenso ATATT ou AATAT.

3. Método, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato que um ou mais motifs específicos de pólen são excluídos ou desativados e que cada um de ditos motifs específicos de pólen inclui uma seqüência de consenso TTCT ou AGAA.

4. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 3, caracterizado pelo fato que dito gene que codifica uma enzima envolvida na biossíntese de uma citoquinina é de um gênero escolhido dentre o grupo que consiste de Agrobacterium, Lotus e Petunia.

5. Método, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que dito gene que codifica uma enzima envolvida na biossíntese de uma citoquinina inclui uma seqüência de nucleotídeos escolhida dentre o grupo que consiste das SEQ ID Nos: 5, 7 e 9, e as seqüências que codificam os polipeptídeos tendo uma seqüência de SEQ ID NOs: 6, 8 e 10.

6. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 5, caracterizado pelo fato de que dita construção genética é introduzida em dita planta por transformação mediada por Agrobacterium ou biolística das células da planta.

7. Método, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que as células da planta que incorporam a construção genética são selecionadas e então cultivadas para regenerar plantas transformadas.

8. Vetor capaz de manipular o envelhecimento ou intensificar a biomassa numa planta, caracterizado pelo fato de que dito vetor inclui um promotor do gene myb32 de Arabidopsis modificado incluindo uma sequência de nucleotídeo selecionado a partir do grupo consistindo de SEQ ID NO 2, 3 e 4, operacional mente ligado a um gene que codifica uma enzima envolvida na biossíntese de uma citoquinina, em que dito gene é um gene ísopentenil transferase {ipf) ou um gene sho, em que um ou mais motifs específicos de raiz e/ou motifs específicos de pólen são excluídos ou desativados em dito promotor gene myb modificado.

9. Vetor, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de adicionalmente incluir um terminador; dito promotor, gene e terminador estando operacionalmente ligados.

10. Vetor, de acordo com a reivindicação 8 ou 9, caracterizado pelo fato de que um ou mais motifs específicos de raiz são excluídos ou desativados em dito promotor gene myb e que cada um de ditos motifs específicos de raiz inclui uma sequência de consenso ATATT ou AATAT.

11. Vetor, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 8 a 10, caracterizado pelo fato de que um ou mais motifs específicos de pólen são excluídos ou desativados em dito promotor gene myb e que cada um de ditos motifs específicos de pólen inclui uma sequência de consenso TTCT ou AGAA,

12. Vetor, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 8 a 11, caracterizado pelo fato de dito gene que codifica uma enzima envolvida na biossíntese de uma citoquinina é de um gênero escolhido dentre o grupo que consiste de Agrobacterium, Lotus e Petunia.

13. Vetor, de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que dito gene que codifica uma enzima envolvida na biossíntese de uma citoquinina inclui uma sequência de nucleotídeos escolhida dentre o grupo que consiste de SEQ ID Nos: 5, 7 e 9, e as seqüências que codificam os polipeptídeos tendo uma seqüência de SEQ ID Nos: 6, 8 e 10.