ES2408305T3 - Manipulación de senescencia vegetal mediante promotores modificados - Google Patents

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Abstract

Un método para manipular la senescencia en una planta, en donde dicho método incluye introducir en dichaplanta una construcción genética que incluye un promotor modificado del gen myb, que incluye una secuencia denucleótido seleccionada del grupo que consiste en las Secuencias ID Nº: 2, 3 y 4, o uno de sus fragmentos ovariantes funcionalmente activo que tiene al menos 95% de identidad con la parte de SEC ID N5 º 2, 3 o 4 a la quecorresponde el fragmento o variante y que tiene un tamaño de al menos 300 nucleótidos, ligado operativamente a ungen que codifica una enzima que interviene en la biosíntesis de una citoquinina, o uno de sus fragmentos o variantesfuncionalmente activo, en donde uno o más motivos específicos de raíz y/o motivos específicos de polen han sidoeliminados o inactivados en dicho promotor modificado del gen myb.

Description

Manipulación de senescencia vegetal mediante promotores modificados
La presente invención se refiere a métodos para manipular la senescencia en plantas. La invención también se refiere a vectores de utilidad en dichos métodos, plantas transformadas con características de senescencia modificadas y células vegetales, semillas y otras partes de dichas plantas.
La senescencia de la hoja incluye cambios metabólicos y estructurales de las células antes de la muerte celular. También incluye el reciclado de nutrientes hacia las regiones de crecimiento activo.
La regulación de la senescencia de plantas y órganos de plantas por citoquininas tiene importantes consecuencias agrícolas. Los niveles elevados de citoquininas en hojas tienden a retardar la senescencia. Se han usado numerosos promotores para regular la expresión del gen ipt, cuyo producto (isopenteniltransferasa) cataliza una etapa clave en la síntesis de citoquininas. Sin embargo, en general, se ha informado que las plantas transgénicas que sobreexpresan el gen ipt tienen retraso de crecimiento de raíces y brotes, sin formación de raíces, reducida dominancia apical y reducida superficie de la hoja.
Un objeto de la presente invención consiste en superar o al menos aliviar una o más de las dificultades o deficiencias asociadas en la técnica previa.
En un aspecto, la presente invención provee un método para manipular la senescencia en una planta, en donde dicho método incluye introducir en dicha planta una construcción genética que incluye un promotor modificado de gen myb que incluye una secuencia de nucleótido seleccionada del grupo que consiste en las SEC ID Nº: 2, 3 y 4, o uno de sus fragmentos o variantes funcionalmente activo que tiene al menos 95% de identidad con la parte de SEC ID Nº 2, 3 o 4 a la que corresponde el fragmento o variante y que tiene un tamaño de al menos 300 nucleótidos, ligado operativamente a un gen que codifica una enzima que interviene en la biosíntesis de una citoquinina o uno de sus fragmentos o variantes funcionalmente activo.
La manipulación de la senescencia se refiere a la planta y/o órganos vegetales específicos. Se puede manipular la senescencia de diferentes órganos vegetales, tales como hojas, raíces, brotes, tallos, tubérculos, flores, estolones y frutas. La manipulación de la senescencia de plantas y de órganos de plantas puede tener importantes consecuencias agrícolas, tales como aumento de la vida de depósito por ejemplo de frutas, flores, hojas y tubérculos en productos hortícolas y flores cortadas, reducción del perecimiento de cultivos hortícolas, aumento de la fijación de carbono en hojas con senescencia retardada que conducen a aumento de los rendimientos, aumento de la producción de biomasa en plantas forrajeras, aumento de la producción de semillas, etc.
“Manipulación de la senescencia” se refiere en general a retrasar la senescencia en la planta transformada respecto de una planta control no transformada. Sin embargo, para algunas aplicaciones puede ser deseable promover o de otro modo modificar la senescencia en la planta. La senescencia se puede promover o de otro modo modificar por ejemplo, mediante la utilización de un gen antisentido.
Una cantidad efectiva de dicha construcción génica se puede introducir en dicha planta por cualquier técnica adecuada, por ejemplo por transducción, transfección o transformación. Por “una cantidad efectiva” se entiende una cantidad suficiente para dar un rasgo fenotípico identificable en dicha planta o una planta, semilla de planta u otra parte de la planta derivada de ella. Dichas cantidades pueden ser determinadas con facilidad por las personas con la pericia correspondiente, si se tiene en cuenta el tipo de planta, la vía de administración y otros factores relevantes. Dicha persona podrá fácilmente determinar una cantidad y un método de administración adecuados. Ver, por ejemplo, Maniatis et al, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, cuya descripción total se incorpora en la presente por referencia.
Por “promotor de gen modificado myb” se entiende un promotor asociado normalmente con un gen myb, en donde el promotor está modificado para eliminar o inactivar uno o más motivos específicos de raíz y/o motivos específicos de polen en dicho promotor.
Si bien el solicitante no desea estar restringido por la teoría, se postula que la eliminación o la inactivación de uno o más motivos específicos de raíz de dicho promotor de gen myb puede aliviar o superar el problema de filtración de la expresión del gen que codifica una enzima de biosíntesis de citoquinina en los meristemas vegetales, lo cual puede afectar el desarrollo de la raíz en algunas especies de plantas. También se postula que la eliminación o inactivación de uno o más motivos específicos de polen de dicho promotor de gen myb pueden aliviar o superar el problema de filtración de la expresión del gen que codifica una enzima de biosíntesis de citoquinina en polen, lo cual puede afectar el desarrollo del polen en algunas especies de plantas.
El promotor modificado de gen myb es un promotor modificado de gen myb32. El promotor modificado de gen myb proviene de Arabidopsis thaliana.
Un promotor adecuado que se puede modificar de acuerdo con la presente invención se describe en Li et al., Cloning of three MYB-like genes from Arabidopsis (PGR 99-138) Plant Physiology 121:313 (1999).
Por “motivo específico de raíz” se entiende una secuencia de 3-7 nucleótidos, de preferencia 4-6 nucleótidos, con mayor preferencia 5 nucleótidos, que dirige la expresión de un gen asociado en las raíces de una planta.
De preferencia, el motivo específico de raíz incluye una secuencia de consenso ATATT o AATAT.
De preferencia, entre uno y diez, con mayor preferencia entre tres y ocho, con aún mayor preferencia entre cinco y siete motivos específicos de raíz se eliminan o inactivan, de preferencia se eliminan, en dicho promotor de gen myb.
Los motivos específicos de raíz se pueden eliminar mediante la remoción de motivos individuales o por remoción de un fragmento del promotor que contiene uno o más motivos. Por ejemplo, se puede eliminar la totalidad o parte de la región entre los nucleótidos 1 y 530, de preferencia entre los nucleótidos 110 y 530 del promotor de gen myb de Arabidopsis thaliana.
La eliminación se puede efectuar por corte del ácido nucleico, por ejemplo mediante endonucleasas de restricción, y ligadura de los extremos cortados a fin de generar un promotor con un fragmento extraído.
Por ejemplo, un promotor modificado del gen myb de Arabidopsis thaliana se puede preparar al extraer un fragmento entre el sitio XcmI en las posiciones 162-176 y el sitio SspI en las posiciones 520-525. Esto genera un promotor modificado de gen myb con 6 de los 7 motivos específicos de raíz eliminados. Alternativamente, se pueden eliminar todos los 7 motivos específicos de raíz, por ejemplo al eliminar la región corriente arriba respecto del sitio SspI en las posiciones 520-525, o por eliminación de la región entre los nucleótidos 1 y 120 junto con la región entre el sitio XcmI en las posiciones 162-176 y el sitio SspI en las posiciones 520-525.
Un motivo específico de raíz se puede inactivar por agregado, eliminación, sustitución o derivación de uno o más nucleótidos dentro del motivo, por lo que ya no tiene la secuencia de consenso preferido.
De preferencia, el promotor modificado del gen myb incluye una secuencia de nucleótido seleccionada del grupo que consiste en las secuencias mostradas en las Figuras 2, 3 y 4 de la presente (Secuencias ID No: 2, 3 y 4, respectivamente) y sus fragmentos y variantes funcionalmente activos que tiene al menos 95% de identidad con la parte de SEC ID Nº 2, 3 o 4 a la que corresponde el fragmento o variante y que tiene un tamaño de al menos 300 nucleótidos.
Por “motivo específico de polen” se entiende una secuencia de 3-7 nucleótidos, de preferencia 4-6 nucleótidos, con mayor preferencia 4 o 5 nucleótidos, la cual dirige la expresión de un gen asociado en el polen de una planta.
De preferencia, el motivo específico de polen incluye una secuencia de consenso seleccionada del grupo que consiste en TTCT y AGAA.
De preferencia, entre uno y treinta, con mayor preferencia entre tres y quince, con aún mayor preferencia entre cuatro y diez motivos específicos de polen son eliminados o inactivados, de preferencia eliminados, en dicho promotor de gen myb.
Los motivos específicos de polen se pueden eliminar por remoción de motivos individuales o por remoción de un fragmento del promotor que contiene uno o más motivos. Por ejemplo, se puede eliminar la totalidad o parte de la región entre los nucleótidos 1 y 540, de preferencia entre los nucleótidos 390 y 540 del promotor de gen myb de Arabidopsis thaliana.
La eliminación se puede efectuar por corte del ácido nucleico, por ejemplo mediante endonucleasas de restricción, y ligadura de los extremos cortados a fin de generar un promotor con un fragmento extraído.
Por ejemplo, un promotor modificado del gen myb de Arabidopsis thaliana se puede preparar por remoción de un fragmento entre el sitio XcmI en las posiciones 162-176 y el sitio SspI en las posiciones 520-525. Esto genera un promotor modificado del gen myb con 4 de los 23 motivos específicos de polen eliminados. Alternativamente, se pueden eliminar 10 de los motivos específicos de polen, por ejemplo por eliminación de la región corriente arriba del sitio SspI en las posiciones 520-525.
Un motivo específico de polen se puede inactivar al agregar, eliminar, sustituir o derivar uno o más nucleótidos dentro del motivo, de manera tal que ya no tenga la secuencia de consenso preferida.
El promotor modificado del gen myb incluye una secuencia de nucleótido seleccionada del grupo que consiste en las secuencias mostradas en las Figuras 2, 3 y 4 de la presente (Secuencias ID No: 2, 3 y 4, respectivamente) y sus fragmentos y variantes funcionalmente activos que tiene al menos 95% de identidad con la parte de SEC ID Nº 2, 3 o 4 a la que corresponde el fragmento o variante y que tiene un tamaño de al menos 300 nucleótidos]2.
En otro aspecto de la presente invención se provee un método para incrementar la biomasa en una planta, en donde dicho método incluye introducir en dicha planta una construcción genética que incluye un promotor de gen myb que incluye una secuencia de nucleótido seleccionada del grupo que consiste en las SEC ID Nº: 2, 3 y 4, o uno de sus fragmentos o variantes funcionalmente activo que tiene al menos 95% de identidad con la parte de SEC ID Nº 2, 3 o 4 a la que corresponde el fragmento o variante y que tiene un tamaño de al menos 300 nucleótidos; ligado
operativamente a un gen que codifica una enzima que interviene en biosíntesis de una citoquinina, o uno de sus fragmentos o variantes funcionalmente activo.
El promotor de gen myb o uno de sus fragmentos o variantes funcionalmente activo es un promotor modificado del gen myb.
El promotor modificado del gen myb es un promotor modificado del gen myb tal como se describió con anterioridad.
Por “incrementar la biomasa” se entiende aumentar o incrementar una planta transformada respecto de una planta control no transformada con una característica de crecimiento seleccionada del grupo que consiste en superficie total de la hoja, superficie acumulada de las hojas, dinámica de crecimiento de las hojas (es decir cantidad de hojas en el transcurso del tiempo), longitud del estolón, porcentaje de plantas con flor y rendimiento de semillas por flor o por superficie sembrada. El “incremento de la biomasa” también incluye reducir o disminuir el porcentaje de muerte del estolón en una planta transformada respecto de una planta control no transformada.
En particular, los solicitantes hallaron que mientras que el peso de semillas (es decir peso de mil semillas) de las plantas transgénicas de acuerdo con la presente invención era indistinguible de las plantas control no transgénicas, el rendimiento total de semillas expresado sobre la base de la flor o por superficie sembrada era significativamente superior en las plantas transgénicas si se comparaba con plantas control no transgénicas de intensidad de floración equivalente.
Por “funcionalmente activo” en relación con un promotor de gen myb o promotor modificado del gen myb se entiende que el fragmento o variante (tales como un análogo, derivado o mutante) es capaz de manipular la senescencia en una planta por el método de la presente invención. Dichas variantes incluyen variantes alélicas naturales y variantes no naturales. Las adiciones, eliminaciones, sustituciones y derivaciones de uno o más de los nucleótidos se contemplan siempre que las modificaciones no den por resultado la pérdida de actividad funcional del fragmento o variante.
El fragmento o variante funcionalmente activo tiene al menos 95% de identidad con la parte relevante de la secuencia antes mencionada a la cual corresponde el fragmento o variante. El fragmento tiene un tamaño de al menos 300 nucleótidos.
Por un “gen que codifica una enzima que interviene en la biosíntesis de una citoquinina” se entiende un gen que codifica una enzima que interviene en la síntesis de citoquinas tales como quinetina, zeatina y benciladenina, por ejemplo un gen que codifica isopentilotransferasa (ipt), o un gen símil ipt tal como el gen sho (por ejemplo de petunia). De preferencia, el gen es un gen de isopentenilotransferasa (ipt) o gen sho. En una forma de realización preferida, el gen proviene de una especie seleccionada del grupo que consiste en Agrobacterium, con mayor preferencia Agrobacterium tumefaciens; Lotus, con mayor preferencia Lotus japonicus; y Petunia, con mayor preferencia Petunia hybrida.
Con máxima preferencia, el gen incluye una secuencia de nucleótido seleccionada del grupo que consiste en las secuencias mostradas en las Figuras 6, 8 y 10 de la presente (Secuencias ID No: 5, 7 y 9) las secuencias que codifican los polipéptidos mostrados en las Figuras 7, 9 y 11 de la presente (Secuencias ID No: 6, 8 y 10), y sus fragmentos y variantes funcionalmente activos.
Por “funcionalmente activo” en relación con un gen que codifica una enzima de biosíntesis de citoquinina se entiende que el fragmento o variante (tales como un análogo, derivado o mutante) es capaz de manipular la senescencia en una planta por el método de la presente invención. Dichas variantes incluyen variantes alélicas naturales y variantes no naturales. Se contemplan las adiciones, eliminaciones, sustituciones y derivaciones de uno o más de los nucleótidos siempre que las modificaciones no den por resultado la pérdida de actividad funcional del fragmento o variante. De preferencia, el fragmento o variante funcionalmente activo tiene al menos aproximadamente 80% de identidad con la parte relevante de la secuencia antes mencionada, con la cual el fragmento o variante corresponde con mayor preferencia en al menos aproximadamente 90% de identidad, con máxima preferencia al menos aproximadamente 95% de identidad. Dichos variantes y fragmentos funcionalmente activos incluyen, por ejemplo, los que tienen cambios conservadores de ácidos nucleicos o cambios de ácidos nucleicos que dan por resultado sustituciones conservadoras de aminoácidos de uno o más restos en la correspondiente secuencia de aminoácidos. Por ejemplo, la variante funcionalmente activa puede incluir una o más sustituciones de aminoácidos conservadoras de una secuencia mostrada en la Figura 6, 8 o 10, y la variante funcionalmente activa obtenida que codifica una secuencia de aminoácidos se muestra en la Figura 7, 9 o 11, respectivamente. De preferencia, el fragmento tiene un tamaño de al menos 20 nucleótidos, con mayor preferencia al menos 50 nucleótidos, con mayor preferencia al menos 100 nucleótidos, con mayor preferencia al menos 500 nucleótidos.
La construcción genética se puede introducir en la planta por cualquier técnica adecuada. Las técnicas para incorporar las construcciones genéticas de la presente invención en células vegetales (por ejemplo por transducción, transfección o transformación) son bien conocidas por los expertos en la técnica. Dichas técnicas incluyen introducción mediada por Agrobacterium, electroporación de tejidos, células y protoplastos, fusión de protoplastos, inyección en órganos reproductivos, inyección en embriones maduros e introducción de proyectiles de alta velocidad en células, tejidos, callos, embriones inmaduros y maduros, transformación biolística y sus combinaciones. La
elección de la técnica dependerá en gran medida del tipo de planta que se transforma y puede ser determinada fácilmente por una persona con la pericia adecuada.
Las células que incorporan la construcción genética de la presente invención se pueden seleccionar, tal como se describe más adelante, y luego se cultivan en un medio adecuado para regenerar las plantas transformadas, mediante técnicas bien conocidas en la técnica. Las condiciones de cultivo, tales como temperatura, pH y similares, serán aparentes para las personas expertas en la técnica. Las plantas obtenidas se pueden reproducir en forma sexual o asexual, mediante métodos bien conocidos en la técnica, a fin de producir sucesivas generaciones de plantas transformadas.
Los métodos de la presente invención se pueden aplicar a diversas plantas, incluso monocotiledóneas [tales como pastos (por ejemplo forraje, césped y pastos bioenergéticos que incluyen ryegrass perenne, festuca alta, ryegrass italiano, festuca roja, pasto canario rojo, tallo azul grande, cordgrass, napiergrass, centeno silvestre, caña de azúcar silvestre, Miscanthus), maíz, avena, trigo y cebada)], dicotiledóneas [tales como Arabidopsis, tabaco, poroto de soja, trébol (por ejemplo trébol blanco, trébol rojo, trébol subterráneo), alfalfa, canola, brassicas vegetales, lechuga, espinaca] y gimnospermas.
En otro aspecto de la presente invención se provee un vector capaz de manipular la senescencia en una planta, en donde dicho vector incluye un promotor modificado del gen myb que incluye una secuencia de nucleótido seleccionada del grupo que consiste en las Secuencias ID Nº: 2, 3 y 4, o uno de sus fragmentos o variantes funcionalmente activo que tiene al menos 95% de identidad con la parte de SEC ID Nº 2, 3 o 4 a la que corresponde el fragmento o variante y que tiene un tamaño de al menos 300 nucleótidos; ligado operativamente a un gen que codifica una enzima que interviene en la biosíntesis de una citoquinina, o uno de sus fragmentos o variantes funcionalmente activo.
En aún otro aspecto de la presente invención se provee un vector capaz de incrementar la biomasa de una planta, en donde dicho vector incluye un promotor de gen myb, o uno de sus fragmentos o variantes funcionalmente activo, ligado operativamente a un gen que codifica una enzima que interviene en la biosíntesis de una citoquinina, o uno de sus fragmentos o variantes funcionalmente activo.
El promotor de gen myb o uno de sus fragmentos o variantes funcionalmente activo es un promotor modificado del gen myb, tal como se describe en la presente.
En una forma de realización preferida del presente aspecto de la invención, el vector también puede incluir un terminador; dicho promotor, gen y terminador están ligados operativamente.
Por “ligado operativamente” se entiende que dicho promotor es capaz de generar la expresión de dicho gen en una célula vegetal y dicho terminador es capaz de terminar la expresión de dicho gen en una célula vegetal. De preferencia, dicho promotor está corriente arriba respecto de dicho gen y dicho terminador está corriente abajo respecto de dicho gen.
El vector puede ser de cualquier tipo adecuado y puede ser viral o no viral. El vector puede ser un vector de expresión. Dichos vectores incluyen secuencias de ácidos nucleicos cromosómicas, no cromosómicas y sintéticas, por ejemplo derivados de virus vegetales; plasmados bacterianos; derivados del plásmido Ti de Agrobacterium tumefaciens; derivados del plásmido Ri de Agrobacterium rhizogenes; ADN fago; cromosomas artificiales de levaduras; cromosomas artificiales de bacterias; cromosomas artificiales bacterianos binarios; vectores derivados de combinaciones de plásmidos y ADN de fagos. Sin embargo, se puede usar cualquier otro vector siempre que sea replicable o integrador o viable en la célula vegetal.
El promotor, el gen y el terminador pueden ser de cualquier tipo adecuado y pueden ser endógenos de la célula de la planta blanco o pueden ser exógenos, siempre que sean funcionales en la célula de la planta blanco.
Diversos terminadores que se emplean en los vectores de la presente invención son también bien conocidos por los expertos en la técnica. El terminador puede provenir del mismo gen que la secuencia promotor o un gen diferente. Los terminadores particularmente adecuados son las señales de poliadenilación tales como poliA CaMV 35S y otros terminadores provenientes de los genes de nopalinasintetasa (nos) y octopinasintetasa (ocs).
El vector, además del promotor, el gen y el terminador, puede incluir otros elementos necesarios para la expresión del gen en diferentes combinaciones, por ejemplo el esqueleto del vector, el origen de replicación (ori), múltiples sitios de clonación, secuencias espaciadoras, mejoradores, intrones (tales como el intrón Ubicuitina de maíz Ubi), genes de resistencia a antibióticos y otros genes de marcadores seleccionables [tales como el gen de neomicina fosfotransferasa (nptII), el gen de higromicina fosfotransferasa (hph), el gen de fosfinotricina acetiltransferasa (bar o pat)], y genes informadores (tales como el gen de beta-glucuronidasa (GUS) (gusA)]. El vector también puede contener un sitio de fijación del ribosoma para la iniciación de la traducción. El vector también puede incluir secuencias adecuadas para amplificar la expresión.
Como alternativa para usar un gen de marcador seleccionable par proveer un rasgo fenotípico para la selección de células huésped transformadas, la presencia del vector en las células transformadas se puede determinar por otras
técnicas bien conocidas en la técnica, tales como PCR (reacción en cadena de polimerasa), análisis de hibridación por Southern blot, ensayos histoquímicos (por ejemplo ensayos GUS), cromatografía de capa fina (TLC), análisis de hibridación por northern y western blot.
Los expertos en la técnica apreciarán que los diversos componentes del vector están ligados operativamente, lo cual da por resultado la expresión de dicho gen. Las técnicas para la ligadura operativa de los componentes del vector de la presente invención son bien conocidas por los expertos en la técnica. Dichas técnicas incluyen el uso de ligadores, tales como los ligadores de síntesis, por ejemplo incluso uno o más restricción sitios de enzima.
En otro aspecto de la presente invención, se provee una célula vegetal transgénica, planta, semilla de planta u otra parte de la planta, con características de senescencia modificadas o aumento de la biomasa. De preferencia dicha célula vegetal, planta, semilla de planta u otra parte de la planta incluye un vector de acuerdo con la presente invención. De preferencia, la célula vegetal transgénica, planta, semilla de planta u otra parte de la planta es producida por un método de acuerdo con la presente invención.
La presente invención también provee una planta transgénica, semilla de planta u otra parte de la planta derivada de una célula vegetal de la presente invención.
La presente invención también provee una planta transgénica, semilla de planta u otra parte de la planta derivada de una planta de la presente invención.
La presente invenciones describirá ahora más exhaustivamente con referencia a los ejemplos y dibujos acompañantes. Se debe entender, sin embargo, que la siguiente descripción sólo es ilustrativa y de ninguna manera se debe tomar como una restricción de la generalidad de la invención descrita con anterioridad.
En las figuras:
La Figura 1 muestra la secuencia de nucleótido del promotor del gen myb32 (atmyb32) de Arabidopsis thaliana (Secuencia ID No: 1), la secuencia del promotor Atmyb32 con tipo MYB, el motivo específico de polen y los
motivos específicos de raíz destacados. WAACCA (subrayado/cursiva) MYB1AT; GTTAGTT (negrita/recuadro)
MYB1LEPR; CCWACC (recuadro) MYBPZM; GGATA (cursiva) MYBST1; AGAAA (subrayado) POLLEN1LELAT52; ATATT (negrita) ROOTMOTIVOTAPOX1.
La Figura 2 muestra una variante de secuencia de promotor Atmyb32 (Atmyb32xs) con la secuencia vegetal XcmI – SspI eliminada. Están destacados el tipo MYB, específico de polen y los motivos específicos de raíz. WAACCA (subrayado/cursiva) MYB1AT; GTTAGTT (negrita/recuadro) MYB1LEPR; CCWACC (recuadro)
MYBPZM; AGAAA (subrayado) POLLEN1LELAT52; ATATT (negrita) ROOTMOTIVOTAPOX1 (Secuencia ID No: 2).
La Figura 3 muestra una variante de secuencia de promotor Atmyb32 con todos los motivos de raíz eliminados.
Están
destacados el tipo MYB, específico de polen y los motivos específicos de raíz. WAACCA
(subrayado/cursiva) MYB1AT; CCWACC (recuadro)
MYBP ZM; AGAAA (subrayado) POLLEN1LELAT52
(Secuencia ID No: 3)
La Figura 4 muestra una variante de secuencia de promotor Atmyb32 con la secuencia del sitio SspI corriente arriba eliminada. Están destacados el tipo MYB, específico de polen y los motivos específicos de raíz. WAACCA (subrayado/cursiva) MYB1AT; CCWACC (recuadro) MYBPZM; AGAAA (subrayado) POLLEN1LELAT52 (Secuencia ID No: 4).
La Figura 5 muestra los motivos de las secuencias de promotor Atmyb32 y Atmyb32xs
La Figura 6 muestra la secuencia de nucleótido del gen de isopentenilotransferasa (ipt) de Agrobacterium tumefaciens (Secuencia ID No: 5).
La Figura 7 muestra la secuencia de aminoácidos deducida del gen de isopentilotransferasa de Agrobacterium tumefaciens (Secuencia ID No. 6)
La Figura 8 muestra la secuencia de nucleótido del gen de isopentilotransferasa de Lotus japonicus (Secuencia ID No. 7).
La Figura 9 muestra la secuencia de aminoácidos deducida del gen de isopentilotransferasa de Lotus japonicus (Secuencia ID No. 8).
La Figura 10 muestra la secuencia de nucleótido del gen de biosíntesis de citoquinina Sho de Petunia hybrida (Secuencia ID No. 9)
La Figura 11 muestra la secuencia de aminoácidos deducida del gen de biosíntesis de citoquinina Sho de Petunia hybrida (Secuencia ID No. 10).
La Figura 12 muestra el análisis por PCR y Southern DNA de atmyb32::ipt de plantas transgénicas de trébol blanco (Trifolium repens). a) La región T-ADN de patmyb32:ipt que muestra los sitios de enzimas de restricción y la ubicación de las sondas usadas para el análisis de hibridación Southern. b) 1% de gel de agarosa teñido con bromuro de etidio de PCR amplificado de los productos 599 bp nptII y 583 bp ipt. c) hibridación por Southern blot con ADN HindIII genómico total digerido aislado de plantas de trébol blanco positivas para PCR hibridadas con la sonda ipt. d) hibridación por Southern blot con ADN HindIII genómico total digerido aislado de plantas de trébol blanco positivas para PCR hibridadas con la sonda nptII. Carriles 1-2: dos cv independientes resistentes a canamicina. regenerantes Haifa, código: Hmi01, Hmi08 respectivamente; carriles 3-12: doce cv independientes resistentes a canamicina. Regenerantes de irrigation, códigos: Imi06, Imi07, Imi08, Imi09, Imi10, Imi11, Imi12, Imi14, Imi16, Imi18 respectivamente; carril C: trébol blanco no transformado; carril P: control positivo de plásmido patmyb32ipt.
La Figura 13 muestra el análisis por RT-PCR de expresión de mARN de ipt en plantas transgénicas atmyb32::ipt de trébol blanco (T. repens). Carril 1-11 son muestras de 11 líneas transgénicas independientes con los correspondientes códigos de plantas como en la Figura 4.8; carril C, control de planta no transformada; carril P, plásmido como control positivo. Se aisló ARN total de tejidos de hojas. Se usó ARN total (13 μg) para cada reacción de transcripción inversa y 1/5 de producto RT se amplificó por PCR. Los productos de ADN en el gel de la derecha se amplificaron por 2X 30 ciclos de PCR intensivo. No se añadió transcriptasa inversa a la correspondiente reacción de RT-PCR cargada en carriles alternados.
La Figura 14 muestra un bioensayo de senescencia de hojas extraídas de plantas transgénicas de trébol blanco atmyb32::ipt (T. repens). Se juntaron al menos 30 hojas de cada línea desde posiciones similares en los estolones de las líneas de plantas. A. Cantidad de hojas amarillas como fracción de la cantidad total de hojas extraídas. B. Típico aspecto de las hojas mantenidas en agua con luz durante dos semanas. Clave para las líneas de plantas: HC, IC y Hmg, Img, no transformada y plantas transgénicas atmyb32::gusA (cv. Haifa e irrigación) respectivamente; 01 y 08, líneas transgénicas Haifa atmyb32::ipt Hmi01 y Hmi08 respectivamente; 11, 12, 16 y 18 líneas transgénicas de irrigación atmyb32::ipt Imi11, Imi12, Imi16 y Imi18 respectivamente.
La Figura 15 muestra A) morfología general de la planta, B) desarrollo normal de los brotes, y C) desarrollo normal de la raíz en plantas transgénicas de trébol blanco atmyb32::ipt (T. repens) (derecha) comparadas con plantas control (izquierda).
La Figura 16 muestra detalles del vector de pBMVkAtMYB32-900::ipt [Gen: Isopentilotransferasa (IPT); Vector: pBMVkAtMYB32-900::ipt-nos (esqueleto pPZPRCS2); Marcador seleccionable: spec; casete de marcador seleccionable vegetal: 35S::kan::35ST; promotor de gen: AtMYB32-900; terminador de gen: nos.]
La Figura 17 muestra la secuencia de nucleótidos del vector pBMVkAtMYB32-900::ipt-nos (Secuencia ID No. 11)
La Figura 18 muestra detalles del vector de pBMVkAtMYB32xs::ipt-nos [Gen: Isopentilotransferasa (IPT); Vector: pBMVkAtMYB32XS::ipt-nos (esqueleto pPZPRCS2); Marcador seleccionable: spec; casete de marcador seleccionable vegetal: 35S::kan::35ST; promotor de gen: AtMYB32-xs; terminador de gen: nos.]
La Figura 19 muestra la secuencia de nucleótidos del vector pBMVkAtMYB32xs::ipt-nos (Secuencia ID No. 12).
La Figura 20 muestra detalles del vector de pBMVhAtMYB32-900::ipt-nos [Gen: Isopentilotransferasa (IPT); Vector: pBMVhAtMYB32-900::ipt-nos (esqueleto pPZPRCS2); Marcador seleccionable: spec; casete de marcador seleccionable vegetal: 35S::hph::35ST; promotor de gen: AtMYB32-900; terminador de gen: nos.]
La Figura 21 muestra la secuencia de nucleótidos del vector pBMVhAtMYB32-900::ipt-nos (Secuencia ID No. 13)
La Figura 22 muestra detalles del vector de pBMVhAtMYB32xs::ipt-nos [Gen: Isopentilotransferasa (IPT); Vector: pBMVhAtMYB32XS::ipt-nos (esqueleto pPZPRCS2); Marcador seleccionable: spec; casete de marcador seleccionable vegetal: 35S::hph::35ST; promotor de gen: AtMYB32-xs; terminador de gen: nos.]
La Figura 23 muestra la secuencia de nucleótidos del vector pBMVhAtMYB32xs::ipt-nos (Secuencia ID No. 14)
La Figura 24 muestra detalles del vector de pBSubn-AtMYB32-900::ipt-nos [Gen: Isopentilotransferasa (IPT); Vector: pBSubn-AtMYB32-900::ipt-nos (esqueleto pPZPRCS2); Marcador seleccionable: spec; casete de marcador seleccionable vegetal: Ubi::bar::nos; promotor de gen: AtMYB32-900; terminador de gen: nos.]
La Figura 25 muestra la secuencia de nucleótidos del vector pBSAtMYB32900::ipt-nos (Secuencia ID No. 15)
La Figura 26 muestra la generación de canola transgénico que contiene pBMVhATMYB3-900::ipt-nos y pBMVhATMYB32xs::ipt-nos. A. Las semillas de canola se germinaron in vitro; B. las secciones de hipocotilo se extrajeron de semillas germinadas de 7 días y se inocularon con una suspensión de Agrobacterium; C&D.
Regeneración de secciones de hipocotilo regeneradas con selección de higromicina; E-J. Plantas transgénicas de canola T0 portadoras de los vectores pBMVhATMYB3-900::ipt-nos y pBMVhATMYB32xs::ipt-nos.
La Figura 27 muestra un proceso para la transformación biolística de trigo.
La Figura 28 muestra la transformación biolística de trigo (Triticum aestivum L. MPB Bobwhite 26). Producción de planta donante (A & B); aislamiento de embrión cigótico (C&D); Regeneración con selección de glufosinato (E-G); formación de raíz durante la selección (H); plantas T0 que crecen en condiciones de invernadero de contención para recuperación de progenie transgénica (I).
La Figura 29 muestra el estudio de campo contenido de plantas transgénicas de trébol blanco que expresan genes quiméricos Atmyb32::ipt.
La Figura 30 muestra la evaluación comparativa de las tasas de crecimiento y la dinámica de crecimiento de plantas transgénicas de trébol blanco que expresan genes quiméricos Atmyb32::ipt con control de plantas de trébol blanco no transgénicas. A) Tasa de crecimiento B) Dinámica de crecimiento C) Características de
La Figura 31 muestra la intensidad de floración (es decir cantidad de flores maduras por m2) de plantas transgénicas de trébol blanco que expresan genes quiméricos Atmyb32::ipt (es decir LXR 12, LXR 18 y LXR 11) y plantas control de trébol blanco no transgénicas (es decir WT) en condiciones de campo contenidas.
La Figura 32 muestra el peso de semillas (es decir el peso de mil semillas, en gramos) de plantas transgénicas de trébol blanco que expresan genes quiméricos Atmyb32::ipt (es decir LXR 12, LXR 18 y LXR 11) y plantas control de trébol blanco no transgénicas (es decir WT) en condiciones de campo contenidas.
La Figura 33 muestra el rendimiento de semillas por flor (en miligramos) de plantas transgénicas de trébol blanco que expresan genes quiméricos Atmyb32::ipt (es decir LXR 12, LXR 18 y LXR 11) y plantas control de trébol blanco no transgénicas (es decir WT) en condiciones de campo contenidas.
La Figura 34 muestra el rendimiento de semillas por superficie (en kg/ha) de plantas transgénicas de trébol blanco que expresan genes quiméricos Atmyb32::ipt (es decir LXR 12, LXR 18 y LXR 11) y plantas control de trébol blanco no transgénicas (es decir WT) en condiciones de campo contenidas.
La Figura 35 muestra la generación de plantas transgénicas de alfalfa que contienen los genes quiméricos pBMVkATMYB3-900::ipt-nos y pBMVkATMYB32xs::ipt-nos A. Se usan explantados de pecíolos de clones de alfalfa C2-3, C2-4 y 19-17 para la inoculación con una suspensión de Agrobacterium y llevó a la producción de callos embriogénicos transformados tras la selección en presencia de canamicina; B-D. Regeneración de plantines transgénicos de alfalfa portadores de genes quiméricos de los vectores pBMVkATMYB3-900::ipt-nos y pBMVkATMYB32xs::ipt-nos, a partir de embriones somáticos cultivados in vitro.
La Figura 36 muestra el análisis por PCR de plantas de canola transgénicas (T1 LXR línea de plantas de canola de línea 4). Se asiló el ADN genómico de diferentes plantas de canola transgénicas de las líneas T1 LXR04 y se sometió a PCR mediante cebadores específicos para A. el marcador seleccionable (hph) o B. el gen candidato de interés (IPT).
La Figura 37 muestra el análisis de la expresión del gen IPT en plantas de canola transgénicas T1 (T1 LXR canola respecto de la expresión de IPT en hojas).
La Figura 38 muestra canola transgénico que muestra el retraso de la senescencia del cotiledón separado, comparado con cotiledones control de tipo salvaje 7 días después de separados.
La Figura 39 muestra la calificación de senescencia de cotiledones de canola transgénico T1 7 días después de la separación.
La Figura 40 muestra canola transgénico que muestra retraso de senescencia de hojas juveniles separadas, comparado con cotiledones control de tipo salvaje 14 días después de la separación.
La Figura 41 muestra la calificación de senescencia de las primeras hojas juveniles de canola transgénico T1 14 días después de la separación.
La Figura 42 muestra análisis de hibridación Southern de líneas de trigo transgénico. Los carriles incluyen: PM
– peso molecular; WT – tipo salvaje; líneas de trigo transgénico LXR3, LXR4, LXR13, LXR16 y controles positivos de plásmido que contiene 10 y 20 pg.
La Figura 43 muestra análisis de expresión de líneas de trigo transgénico independiente T1 (expresión cuantitativa de IPT en trigo). Los valores de transcripción cuantitativa se determinaron en fentomoles (fmol) por microgramo de ARN mediante una curva estándar derivada de ADN plásmido que contiene la secuencia blanco. Las muestras representan clases de expresión alta, media y baja para el gen candidato IPT.
La Figura 44 muestra la variación fenotípica de plantas de trigo transgénicas T1 cultivadas en invernadero. A. 13 plantas de trigo T1 LXR que muestran fenotipo normal, comparadas con plantas de trigo control nulas. B. Plantas de trigo T1 LXR 04 que muestran fenotipo romo y aumento de las hojas primarias, comparado con plantas de trigo control nulas.
La Figura 45 muestra trigo transgénico que muestra el retraso de la senescencia de las hojas, comparado con hojas control nulas 7 días después de la separación.
Ejemplos
Los ejemplos que no conciernen a la invención reivindicada son solament para fines ilustrativos.
Ejemplo 1
Secuencia de promotor Atmyb32 y variantes de secuencia de promotor
La secuencia de promotor Atmybb32 y sus variantes se muestran en las Figuras 1-4.
Ejemplo 2
Genes de biosíntesis de citoquinina
Los ejemplos de genes de biosíntesis de citoquinina adecuados para el uso en la presente invención se muestran en las Figuras 6, 8 y 10. Los genes adecuados también incluyen los que codifican los polipéptidos mostrados en las Figuras 7, 9 y 11.
Ejemplo 3
Producción de plantas transgénicas de trébol blanco
Se produjeron plantas transgénicas de trébol blanco (Trifolium repens cv. Haifa e irrigación) por transformación mediada por Agrobacterium mediante un vector binario portador del gen quimérico atmyb32::ipt (Figura 12a). Las plantas transgénicas se analizaron por PCR mediante los cebadores ipt y nptII (Figura 12b). Las muestras de ADN genómico digeridas de HindIII sometidas a análisis por hibridación Southern demostraron que se detectaron fragmentos de ADN mayores de 4,4 kb en todos los carriles mediante sondas ipt y nptII, lo cual demuestra la presencia y la integración de T-ADN de longitud total en el genoma de trébol blanco (Figura 12). Las líneas transgénicas Hmi01, Imi06, Imi11 e Imi18 (carril 1, 3, 5, 8 y 12 respectivamente) mostraron tener una única copia de T-ADN de longitud total integrado en el genoma. Otras líneas transgénicas tenían múltiples copias del transgén atmyb32::ipt.
Ejemplo 4
Expresión de gen IPT en plantas transgénicas de trébol blanco
La expresión del transgén atmyb32::ipt en plantas de trébol blanco transgénico (T. repens) se evaluó por RT-PCR. Se detectó mARN de ipt en los tejidos de las hojas de todas las plantas transgénicas atmyb32::ipt de trébol blanco examinadas, con niveles variables de productos de PCR detectados (Figura 13).
Ejemplo 5
Retraso de senescencia en hojas separadas de plantas transgénicas de trébol blanco
Se realizaron experimentos para evaluar la senescencia de hojas separadas de plantas transgénicas atmyb32::ipt. Se observó rápida aparición de color amarillo en las hojas separadas de plantas transgénicas de trébol blanco no transformadas y atmyb32::gusA de ambos cultivars dentro de la semana. Las líneas transgénicas Hmi01, Hmi08, Imi16 y Imi18 mostraron retraso de la senescencia, mientras que Imi11 e Imi12 no mostraron signos de aparición de color amarillo al fin de los 7 días. Después de dos semanas, las hojas de todas las plantas transgénicas atmyb32::ipt eran mucho más verdes que las de plantas transgénicas control no transformadas y atmyb32::gusA (Figura 14). El grado de senescencia de las hojas extraídas estaba en el orden de HC, Hmg > Hmi01 > Hmi08 para cv. Haifa, y IC y Img > Imi16 > Imi18 > Imi11 y Imi12 para cv. irrigación. HC es control Haifa no transformado, Hmg es control Haifa atmyb32::gusA, IC es control irrigación no transformado, Img es control irrigación atmyb32::gusA. Hmi01, Hmi08,
5 Imi16, Imi18, Imi11 e Imi12 son plantas transgénicas de trébol blanco atmyb32::ipt independientes provenientes de los cultivar Haifa (H) e irrigación (I), respectivamente.
Ejemplo 6
Morfología vegetal y desarrollo de raíces en plantas transgénicas de trébol blanco
Se observó morfología normal de las plantas, así como desarrollo normal de brotes y raíces en plantas transgénicas
10 de trébol blanco atmyb32:ipt (Figura 6), lo cual indica que la expresión regulada del gen ipt bajo el control del promotor atmyb32 no afectaba negativamente la dominancia de raíces o apical de las plantas transgénicas de trébol blanco (Tabla 1).
Tabla 1
Transformante
Cultivar Construcción Copia ipt Nº Fenotipo
Hmi01
Haifa Atmyb32::ipt 1 Normal
Hmi08
Haifa Atmyb32::ipt >3 Normal
Imi06
irrigación Atmyb32::ipt 1 Normal
Imi07
irrigación Atmyb32::ipt 3 Normal
Imi09
irrigación Atmyb32::ipt >3 Normal
Imi10
irrigación Atmyb32::ipt >3 Normal
Imi11
irrigación Atmyb32::ipt 1 Normal
Imi12
irrigación Atmyb32::ipt 2 Normal
Imi16
irrigación Atmyb32::ipt 2 Normal
Imi18
irrigación Atmyb32::ipt 1 Normal
15 Se observó morfología normal de las plantas y raíces normales en diez líneas independientes de trébol blanco transgénico atmyb32::ipt analizadas. Se muestran las estimaciones de cantidades de copias de gen ipt en las diez líneas independientes de trébol blanco transgénico atmyb32::ipt.
Ejemplo 7
Generación de vectores para la transformación de plantas
20 Se generaron cuatro vectores binarios para la transformación mediada por Agrobacterium de las plantas (Figuras 1619). Cada vector tenía un esqueleto de vector pPZP200 (Hajdukiewicz et al., 1994) y contenía Atmyb32-900::ipt-nos
o Atmyb32-xs::ipt-nos quimérico con o sin casetes quiméricos de marcador seleccionable 35S::nptII-35st o 35S::hph35st.
Se construyó un vector de transformación para la transformación biolística (Figuras 20 y 21). El vector de 25 transformación contenía Atmyb32-900::ipt-35st quimérico con un casete quimérico de marcador seleccionable Ubi::bar-nos.
Se amplificaron el promotor Atmyb32, la variante de promotor Atmyb32xs, el gen de isopentiloatransferasa y los terminadores 35st y nos por PCR con cebadores adaptados Gateway™ (Invitrogen) y se clonaron en vectores de entrada pDONR221. Estos luego se clonaron mediante recombinación en vectores de destinación que contenían los
30 casetes clonados convencionalmente de marcador seleccionable. Se determinaron las secuencias completas de todos los vectores según protocolos de seguridad de estricta calidad.
Ejemplo 8
Transformación mediada por Agrobacterium de canola (Brassica napus)
Se usaron vectores binarios pBMVhATMYB3-900::ipt-nos (Figura 20) y pBMVhATMYB32xs::ipt-nos (Figura 22) que contienen los genes quiméricos ipt bajo el control del promotor Atmyb32 (Figura 1) y la secuencia de promotor variante Atmyb32xs con motivos específicos de raíz eliminados (Figura 2) para la transformación mediada por Agrobacterium de segmentos de hipocotilo de Brassica napus (Figura 26).
Semillas de Brassica napus se esterilizaron en superficie en 70% de etanol durante 2 minutos, se lavaron 3 veces en agua estéril y luego se volvieron a esterilizar en superficie en una solución que contiene 1% (p/v) de hipoclorito de calcio y 0,1 % (v/v) de Tween 20 de 30 minutos. Las semillas se lavaron al menos 3 times en agua estéril y se plantaron en frascos de cultivo de 120 ml que contienen un medio de germinación solidificado que contiene 1x de macronutrientes de Murashige y Skoog (Murashige y Skoog Physiol. Plant, 15: 473-497, 1962), 1x de micronutrientes y vitaminas orgánicas B5 complementado con 500 mg/L de MES, 2% (p/v) de sacarosa a pH 5,8 con adición de 4 g/L de Gelrite. Los frascos se incubaron a 25 °C en condiciones de 16 h de luz/8 h de oscuridad durante 7 días para favorecer la germinación.
Después de 7 días, las semillas germinadas de Brassica napus (semillas germinadas enteras) se transfirieron a un medio líquido que consiste en 1x macronutrientes de Murashige y Skoog, 1x de micronutrientes y vitaminas orgánicas B5 suplementadas con 500 mg/L de MES, 3% (p/v) de sacarosa a pH 5,8. Las semillas germinadas se agruparon y se extrajeron las raíces y los cotiledones antes de cortar los hipocotilos en secciones de 7-10 mm y plantarlos en placas de Petri de 9 X 1,5 cm que contienen un medio de preacondicionamiento que consiste en 1x de macronutrientes de Murashige y Skoog, 1x de micronutrientes y vitaminas orgánicas B5 suplementadas con 500 mg/L de MES, 3% (p/v) de sacarosa a pH 5,8 solidificado con 6,4 g/l de Bacto-Agar.
Las secciones de hipocotilo se cultivaron durante 24 horas antes de la inoculación con una suspensión de Agrobacterium DO600 = 0,2 durante 30 minutos que consiste en 1x de macronutrientes de Murashige y Skoog, 1x de micronutrientes y vitaminas orgánicas B5 suplementadas con 500 mg/L de MES, 100 μM de acetosiringona, 3% (p/v) de sacarosa a pH 5,8.
Tras la inoculación, se cortaron las secciones de hipocotilo en toallas de papel estériles y se transfirieron a placas de Petri de 9 X 1,5 cm que contienen 1x de macronutrientes de Murashige y Skoog, 1x de micronutrientes y vitaminas orgánicas B5 suplementadas con 500 mg/L de MES, 100 μM de acetosiringona, 1 mg/L de 2,4-D, 3% (p/v) de sacarosa a pH 5,8 solidificado con 8 g/l de Bacto-Agar. Los explantados se incubaron a 25 °C en condiciones de 16 h de luz/8 h de oscuridad durante 72 horas para el cocultivo.
Tras el cocultivo, se transfirieron 20-30 explantados de hipocotilo a placas de Petri de 9 X 1,5 cm que contienen un medio de selección solidificado que consiste en 1x de macronutrientes de Murashige y Skoog, 1x de micronutrientes y vitaminas orgánicas B5 suplementadas con 500 mg/L de MES, 1 mg/L de 2,4-D, 3% (p/v) de sacarosa a pH 5,8 solidificado con 8 g/l de Bacto-Agar, suplementado con 250 mg/l de timentina y 10 mg/l de higromicina a fin de seleccionar los brotes resistentes a higromicina. Las placas se incubaron a 25 °C en condiciones de 16 h de luz/8 h de oscuridad.
Después de 7 días se transfirieron los explantados de hipocotilo a placas de Petri de 9 X 1,5 cm que contienen un medio de regeneración solidificado que consiste en 1x de macronutrientes de Murashige y Skoog, 1x de micronutrientes y vitaminas orgánicas B5 suplementadas con 500 mg/L de MES, 1 mg/L de 2,4-D, 3% (p/v) de sacarosa a pH 5,8 solidificado con 8 g/l de Bacto-Agar, suplementado con 4 mg/l de BAP, 2 mg/l de Zeatina, 5 mg/l de nitrato de plata, 250 mg/l de timentina y 10 mg/l de higromicina. Las placas se incubaron a luz directa a 25 °C en condiciones de luz fluorescente (fotoperíodo de 16 h de luz/8 h de oscuridad; 55 μmol m-2 sec -1) durante 4 semanas para favorecer el desarrollo de brotes.
La regeneración se monitoreó semanalmente y los explantados de hipocotilo se transfirieron a placas de Petri nuevas de 9 X 2,0 cm que contienen medio de regeneración solidificado, RM suplementado con 4 mg/l de benciladenina, 2 mg/l de zeatina, 5 mg/l de nitrato de plata, 250 mg/l de timentina y 10 mg/l de higromicina durante 6-8 semanas para favorecer el desarrollo de brotes.
Posbrotes resistentes a higromicina (Hygr) se transfirieron a frascos de 120 ml que contiene, medio de inducción de raíces solidificado, RIM1, que consiste en 1x de macronutrientes de Murashige y Skoog, 1x de micronutrientes y vitaminas orgánicas B5 suplementadas con 500 mg/L de MES, 1 mg/L de 2,4-D, 1% (p/v) s e sacarosa a pH 5,8 solidificado con 8 g/l de Bacto-Agar, suplementado con 250 mg/l de timentina. Los brotes se incubaron a luz directa fluorescente a 25 °C (fotoperíodo de 16 h de luz/8 h de oscuridad; 55 μmol m-2 sec -1) para favorecer la elongación de los brotes y el desarrollo de las raíces durante 4-5 semanas. Todos los brotes Hygr con brotes y sistemas de raíces desarrollados se transfirieron a suelo y se cultivaron en condiciones de invernadero.
Ejemplo 9
Transformación biolística de trigo (Triticum aestivum L.)
Se usaron vectores de transformación que contienen genes quiméricos ipt bajo el control del promotor Atmyb32 (Figura 1) y la secuencia variante de promotor Atmyb32xs con motivos específicos de raíz eliminados (Figura 2) para la transformación biolística de trigo (Triticum aestivum L. MPB Bobwhite 26). Se muestra un vector representativo en la Figura 24. Un esquema del procedimiento para la transformación biolística de trigo se representa en la Figura 27. El procedimiento de transformación incluye las siguientes etapas:
Etapa 1 (Producción de planta donante):
Se usaron semillas de Triticum aestivum (Bobwhite 26) para la producción del material de planta donante. Las plantas de trigo se cultivaron en una mezcla de vivero que consiste en compost de corteza de pino, perlita y vermiculita, con cinco plantas por maceta con un tamaño máximo de maceta de 20 cm. Las plantas se mantuvieron en condiciones de invernadero a aproximadamente 22-24 oC durante 12-16 semanas (Figura 28A). Una vez que emergió la primera espícula de la hoja primaria, se rotularon las plantas y se juntaron los embriones de las cabezas más grandes 12-15 días después de la antesis.
Etapa 2 (Día 1)
Se cosecharon las espículas del estado de desarrollo deseado (Figura 28B). Se extrajo el cariopsis de las espículas y se esterilizaron en superficie durante 20 minutos en una solución 0,8% (v/v) de NaOCl y se enjuagaron al menos cuatro veces en agua destilada estéril.
Los embriones de hasta 10 mm de longitud se extrajeron asépticamente de cada cariopsis (remoción del eje) mediante un microscopio de disección y se cultivaron con el lado axial hacia abajo en medio osmótico (E3maltosa) que consiste en 2x de macronutrientes de Murashige y Skoog (1962), 1x de micronutrientes y vitaminas orgánicas, 40 mg/L de tiamina, 150 mg/L de L-asparagina, suplementado con 15% (p/v) de maltosa, 0,8% (p/v) de Sigma-agar y 2,5 mg/L de 2,4-D (Figura 28C&D). Los embriones se cultivaron en placas de Petri de 60 mm x 15 mm transparentes de polipropileno con 15 mL de medio. Las placas de cultivo se incubaron a 24 oC en oscuridad durante 4 horas antes del bombardeo. Los embriones se bombardearon con una pistola génica BioRad PDS1000 a 900 psi y a 6 cm con 1 μg de ADN de vector plásmido precipitado en partículas de oro de 0,6 μm. Tras el bombardeo se incubaron los embriones durante la noche en oscuridad en el medio osmótico.
Etapa 3 (Día 2):
Los embriones se transfirieron a un medio de inducción de callo (E3calli) que consiste en 2x de macronutrientes de Murashige y Skoog (1962), 1x de micronutrientes y vitaminas orgánicas, 40 mg/L de tiamina, 150 mg/L de Lasparagina, suplementado con 6% (p/v) de sacarosa, 0,8% (p/v) de Sigma-agar y 2,5 mg/L de 2,4-D. Los embriones se cultivaron durante dos semanas a 24 oC en la oscuridad.
Etapa 4 (Día 16):
Después de 2 semanas de cultivo en E3calli, los embriones habían producido callos embriogénicos y se subcultivaron en medio de selección (E3Select) que consiste en 2x de macronutrientes de Murashige y Skoog (1962), 1x de micronutrientes y vitaminas orgánicas, 40 mg/L de tiamina, 150 mg/L de L-asparagina, suplementado con 2% (p/v) de sacarosa, 0,8% (p/v) de Sigma-agar, 5 mg/L de D,L fosfinotricina (PPT) y sin reguladores de crecimiento vegetal (Figura 28E-G). Los cultivos se incubaron durante otros 14 días en E3Select a 24 oC en la luz y con un fotoperíodo de 12 horas.
Etapa 5 (Día 30):
Después de 14 días de cultivo en E3Select, los callos embriogénicos se subcultivaron en E3Select nuevo durante otros 14 días (Figura 28 E-G).
Etapa 6 (Día 44):
Después de aproximadamente 4 semanas en E3Select, las plantas en desarrollo se extrajeron de la masa del callo embrionario y se cultivaron durante otras tres semanas en frascos de cultivo de tejido de policarbonato de 65 mm X 80 mm o 65 mm x 150 mm que contienen medio de inducción de raíz (RM). El medio de inducción de raíz consiste en 1x de macronutrientes de Murashige y Skoog (1962), vitaminas orgánicas, 40 mg/L de tiamina, 150 mg/L de Lasparagina, suplementado con 2% (p/v) de sacarosa, 0,8% (p/v) de Sigma-agar, y 5 mg/L de PPT (Figura 28H). El resto de callo embriogénico se subcultivó en E3Select durante otros 14 días.
Etapa 7 (Día 65+):
Los plantines regenerados que sobrevivieron más de 3 semanas en RM con formación de raíces saludables se plantaron en una mezcla de invernadero que consiste en turba y arena (1:1) y se mantuvieron a 22-24 oC con
humedad elevada en un sistema de cámara de humedad (Figura 28). Después de dos semanas, se extrajeron las plantas de la cámara de humedad y se regaron manualmente con agua y se alimentaron con Aquasol™ líquido semanalmente hasta maduración. Las plantas T0 se tomaron como muestra para el análisis de ADN genómico y molecular. Las semillas T1 se juntaron y plantaron para el análisis de Q-PCR de alto rendimiento (Figura 28J).
Ejemplo 10
Rendimiento agronómico de plantas transgénicas de trébol blanco
Se evaluó el rendimiento agronómico de plantas transgénicas atmyb32::ipt de trébol blanco (Trifolium repens), respecto de plantas de trébol blanco control no transgénicas, en condiciones de cámara de crecimiento controlada y en estudios de campo contenidos (Figura 29).
Las plantas transgénicas de trébol blanco que expresan genes quiméricos Atmyb32::ipt evaluadas en condiciones de cámara de crecimiento controlada revelaron significativos aumentos de la acumulación de biomasa y reducciones de las manifestaciones de senescencia, comparadas con plantas control no transgénicas de trébol blanco (Figura 30). Las plantas transgénicas de trébol blanco que expresan genes quiméricos Atmyb32::ipt mostraron mayor superficie total de hoja, aumento de la superficie acumulada de las hojas, mayor dinámica de crecimiento de las hojas (es decir cantidad de hojas en el tiempo), mayor altura de estolón y aumento del % de plantas florecidas, así como reducción de la senescencia del estolón y muerte comparado con plantas control no transgénicas de trébol blanco (Figura 30A-C).
El rendimiento de las semillas de 3 plantas transgénicas de trébol blanco independientes que expresan atmyb32::ipt (es decir LXR 12, LXR 18 y LXR 11) también se evaluó comparativamente con plantas control no transgénicas (es decir de tipo salvaje, WT) en condiciones de campo contenidas. Se seleccionaron dos plantas transgénicas de trébol blanco independientes que expresan atmyb32::ipt (es decir LXR 12 y LXR 18) con intensidad de floración indistinguible (es decir cantidad de flores maduras por m2) respecto de la planta control no transgénica (es decir WT) para la evaluación de campo (Figura 31).
Si bien el peso de semillas (es decir el peso de mil semillas) de las plantas transgénicas de trébol blanco que expresan genes quiméricos Atmyb32::ipt (es decir LXR 12, LXR 18 y LXR 11) era indistinguible de las plantas de trébol blanco control no transgénicas (es decir WT) (Figura 32), el rendimiento total de las semillas expresado sobre la base por flor (Figura 33), y por superficie sembrada (Figura 34) se duplicó en las plantas transgénicas de trébol blanco que expresan genes quiméricos Atmyb32::ipt (es decir LXR 12 y LXR 18), comparado con plantas de trébol blanco control no transgénicas de intensidad de floración equivalente (es decir WT).
Ejemplo 11
Transformación de alfalfa (Medicago sativa) mediada por Agrobacterium
El vector binario pBMVkATMYB32xs::ipt-nos (Figura 18) que contiene genes quiméricos ipt bajo el control de la secuencia variante de promotor Atmyb32xs con motivos específicos de raíz eliminados (Figura 2) se usó para la transformación mediada por Agrobacterium de explantados de pecíolos de Medicago sativa de clones altamente regenerables de alfalfa (M. sativa) C2-3, C2-4 y 19-17 (Figura 35).
Tras el cocultivo con la cepa de Agrobacterium tumefaciens LBA 4404 que contiene el vector binario pBMVkATMYB32xs::ipt-nos, los explantados de alfalfa se lavaron con medio que contiene cefotaxima y se usaron para la inducción de callos embriogénico en medio selectivo que contiene 25 mg/l de canamicina. Se recuperaron los callos embriogénicos transgénicos de alfalfa y se dejaron regenerar brotes transgénicos de alfalfa, que se transfirieron a medio de raíz para recuperar las plantas transgénicas de alfalfa que expresan genes quiméricos ipt bajo el control del promotor variante Atmyb32xs (Figura 35).
Se comprenderá que la invención descrita y definida en la presente memoria descriptiva se extiende a todas las combinaciones alternativas de dos o más de las características individuales mencionadas o evidentes del texto o los dibujos. Todas estas diferentes combinaciones constituyen diversos aspectos alternativos de la invención.
Ejemplo 12
Producción de plantas de canola transgénicas
Se produjeron plantas transgénicas de canola (Brassica napus) por transformación mediada por Agrobacterium mediante vectores binarios (Figuras 20 y 22) portadores del gen quimérico atmyb32::ipt. La modificación genética se caracterizó por la presencia del gen candidato (IPT) o el marcador seleccionable (hph) mediante PCR en la generación T1 (Figuras 36).
La Figura 36 ilustra el análisis por PCR de plantas de canola transgénicas. El ADN genómico se aisló de diferentes plantas de canola transgénicas de líneas T1 LXR04 y sometidas a PCR mediante cebadores específicos para el marcador seleccionable (gen hph) o el gen candidato de interés (IPT). En la Figura 36A se usaron cebadores hph específicos para amplificar un producto a partir de ADN genómico y se visualizaron en gel de agarosa. La Figura
36B demuestra el uso de cebadores específicos IPT para amplificar el ADN genómico mediante un método de PCR fluorescente. Los cebadores son específicos para la secuencia blanco que da por resultado fluorescencia detectable que es inversamente proporcional a la cantidad de producto de PCR acumulado.
Ejemplo 13
Expresión del gen IPT en plantas de canola transgénicas
La expresión del transgén atmyb32::ipt en canola transgénico se evaluó mediante un método de RT-PCR fluorescente específico para la secuencia blanco (Figura 37). El mARN de IPT se detectó en tejidos y los niveles de expresión relativos se compararon entre líneas y con controles nulos. Los controles nulos son líneas de progenie que han sido sometidas al proceso de transformación pero no contienen secuencias blanco después del cruzamiento.
Ejemplo 14
Retraso de la senescencia de hojas separadas en plantas de canola transgénicas
Se realizaron experimentos para evaluar la senescencia de hojas separadas de plantas transgénicas atmyb32::ipt. Las Figuras 38 a 41 indican los datos de ensayos de senescencia de hojas caídas asociados con la expresión del gen candidato en canola. Los ensayos para cotiledones y hojas separadas se condujeron para inducir el envejecimiento y evaluar el fenotipo de senescencia de la canola transformada, comparado con los controles de tipo salvaje. El día 7 y 14 de los ensayos de senescencia de hojas separadas se calificó el progreso de la senescencia cualitativamente para cada muestra de tejido como 0 – sin posibles signos de senescencia; 1 – primeros signos visibles de senescencia con color verde pálido: 2 – ulterior progresión de senescencia con color amarillo notable; 3 – tejido principalmente de color amarillo, aunque permanecía evidente un color verde pálido; 4- progresión a color totalmente amarillo; 5 – color amarillo con algo de palidez y parches de necrosis (Figuras 39 y 41).
Ejemplo 15
Producción de plantas de trigo transgénicas
La transformación genética de trigo se basó en la transformación biolística de embriones cigóticos de la línea Triticum aestivum L Bobwhite 26 de trigo tal como se indica en las Figuras 27 y 28.
El gen quimérico atmyb32::ipt se insertó en el genoma de trigo mediante bombardeo de partículas con plásmido entero para incorporar también las secuencias de vector esqueleto al genoma (Figura 24).
Se ha obtenido la secuencia completa del vector de transformación (Figura 25). La modificación genética se caracterizó para la presencia del gen candidato mediante análisis Southern de la generación T1 (Figura 42).
La Figura 42 ilustra el análisis de hibridación Southern de plantas de trigo transgénicas. Se aisló el ADN genómico de diferentes líneas T1 de plantas de trigo transgénicas y se digirió con una enzima de restricción para determinar la cantidad de copias de gen candidato. El control es Triticum aestivum ‘Bobwhite 26’ de tipo salvaje no transformado. Las digestiones se sometieron a electroforesis, se transfirieron a membrana de nailon y se sondaron con un gen IPT con rótulo DIG de longitud total, como sonda. Se observó un rango de cantidades de copias.
Ejemplo 16
Expresión de gen IPT en plantas de trigo transgénicas
Se extrajo ARN de tejido de hojas jóvenes de plantas de trigo transgénicas T1 cultivadas en invernadero que contiene el gen IPT dirigido por el promotor AtMYB32 y se preparó la primera cadena de cADN.
Se determinó la expresión cuantitativa del transgén mediante una sonda basada en el método qRT-PCR para la secuencia blanco. Se presentan ejemplos representativos de líneas de expresión alta, mediana y baja para cada una de las construcciones en la Figura 43. También se usó un cebador /sonda diseñada para el gen endógeno de sacarosa sintetasa como control. Todos los gráficos de amplificación del gen de control comenzaron con un ciclo entre sí para indicar las diferencias en el nivel de detección de GMO debido a la variación de expresión.
Los cebadores y la sonda PCR son específicos para la secuencia blanco, lo cual da por resultado fluorescencia detectable que es proporcional a la cantidad de producto PCR acumulado. El plásmido de ADN diluido en forma seriada que contiene la secuencia blanco detectada se empleó para crear una curva estándar para la cuantificación.
Ejemplo 17
Morfología vegetal en plantas de trigo transgénicas
Se observaron las diferencias de características de crecimiento en el invernadero entre las líneas de trigo transgénicas. Los fenotipos predominantes observados entre las plantas T1 de trigo incluyeron detención de la altura
de las plantas, intensidad de semillas, cantidad de hojas, y biomasa vegetativa (Figura 44).
Ejemplo 18 Retraso de la senescencia de hojas separadas en plantas de trigo transgénicas
Se usó un ensayo de hojas caídas para evaluar el envejecimiento inducido y el fenotipo de senescencia de las hojas de trigo transformadas, comparados con controles nulos (Figura 45). Los controles nulos son líneas de progenie que han sido sometidas al proceso de transformación pero no contienen secuencias blanco después del cruzamiento.
También se entenderá que el término “comprende” (o sus variantes gramaticales) tal como se usa en la presente memoria descriptiva es equivalente al término “incluye” y no se debe tomar como excluyente de la presencia de otros elementos o propiedades.
Los documentos citados en la presente memoria descriptiva tienen solo fines de referencia y su inclusión no es un reconocimiento de que formen parte del conocimiento general común en la técnica relevante.
LISTADO DE SECUENCIAS
<110> Agriculture Victoria Services Pty Ltd La Trobe University
<120> Manipulación de senescencia vegetal mediante promotores modificados
<130> 118-006
<140> 08 733 383.7
<141> 2008-04-21
<150> US 10/363723
<151> 2001-08-30
<150> PCT/AU2008/000556
<151> 2008-04-21
<150> US 11/798526
<151> 2007-04-24
<150> PCT/AU01/01092
<151> 2001-08-30
<160> 15
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 941
<212> DNA
<213> Arabidopsis thaliana
<400> 1 gtttgtgtct tctagattaa tcctccaaac ttttgattaa ccaaaaaaat tatcaaacta
60 acatgttctc cttttttctt tagaaattct aacgaattta tctttatact gatttgaata 120
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<211> 588
<212> DNA
<213> Arabidopsis thaliana
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588
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<212> DNA
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<212> DNA
<213> Arabidopsis thaliana
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<210> 5
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<212> DNA
<213> Agrobacterium tumefaciens
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<212> PRT
<213> Agrobacterium tumefaciens
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<213> Lotus japonicus
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<213> Lotus japonicus
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<213> Petunia x hybrida
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<210> 11
<211> 10786
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 11 gtcccgtatc acgcagcgcg tgagctaccc aggcactgcc gccgccggca caaccgttct 60 tgaatcagaa cccgagggcg acgctgcccg cgaggtccag gcgctggccg ctgaaattaa 120 atcaaaactc atttgagtta atgaggtaaa gagaaaatga gcaaaagcac aaacacgcta 180 agtgccggcc gtccgagcgc acgcagcagc aaggctgcaa cgttggccag cctggcagac 240 acgccagcca tgaagcgggt caactttcag ttgccggcgg aggatcacac caagctgaag 300 atgtacgcgg tacgccaagg caagaccatt accgagctgc tatctgaata catcgcgcag 360 ctaccagagt aaatgagcaa atgaataaat gagtagatga attttagcgg ctaaaggagg 420 cggcatggaa aatcaagaac aaccaggcac cgacgccgtg gaatgcccca tgtgtggagg 480 aacgggcggt tggccaggcg taagcggctg ggttgtctgc cggccctgca atggcactgg 540 aacccccaag cccgaggaat cggcgtgacg gtcgcaaacc atccggcccg gtacaaatcg 600 gcgcggcgct gggtgatgac ctggtggaga agttgaaggc cgcgcaggcc gcccagcggc 660 aacgcatcga ggcagaagca cgccccggtg aatcgtggca agcggccgct gatcgaatcc 720 gcaaagaatc ccggcaaccg ccggcagccg gtgcgccgtc gattaggaag ccgcccaagg 780 gcgacgagca accagatttt ttcgttccga tgctctatga cgtgggcacc cgcgatagtc 840 gcagcatcat ggacgtggcc gttttccgtc tgtcgaagcg tgaccgacga gctggcgagg 900
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<220>
<223> Synthetic construct
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<400> 15 ttatacatag ttgataattc actggccgtc gtgggggatc cactagttct agagcggccg 60 ccaccgcggt ggagctccag cttttgttcc ctttagtgag ggttaatttc gagcttggcg 120 taatcatggt catagctgtt tcctgtgtga aattgttatc cgctcacaat tccacacaac 180 atacgagccg gaagcataaa gtgtaaagcc tggggtgcct aatgagtgag ctaactcaca 240 ttaattgcgt tgcgctcact gcccgctttc cagtcgggaa acctgtcgtg ccagctgcat 300 taatgaatcg gccaacgcgc ggggagaggc ggtttgcgta ttgggcgctc ttccgcttcc 360 tcgctcactg actcgctgcg ctcggtcgtt cggctgcggc gagcggtatc agctcactca 420 aaggcggtaa tacggttatc cacagaatca ggggataacg caggaaagaa catgtgagca 480 aaaggccagc aaaaggccag gaaccgtaaa aaggccgcgt tgctggcgtt tttccatagg 540 ctccgccccc ctgacgagca tcacaaaaat cgacgctcaa gtcagaggtg gcgaaacccg 600 acaggactat aaagatacca ggcgtttccc cctggaagct ccctcgtgcg ctctcctgtt 660 ccgaccctgc cgcttaccgg atacctgtcc gcctttctcc cttcgggaag cgtggcgctt 720 tctcatagct cacgctgtag gtatctcagt tcggtgtagg tcgttcgctc caagctgggc 780 tgtgtgcacg aaccccccgt tcagcccgac cgctgcgcct tatccggtaa ctatcgtctt 840 gagtccaacc cggtaagaca cgacttatcg ccactggcag cagccactgg taacaggatt 900 agcagagcga ggtatgtagg cggtgctaca gagttcttga agtggtggcc taactacggc 960 tacactagaa ggacagtatt tggtatctgc gctctgctga agccagttac cttcggaaaa 1020 agagttggta gctcttgatc cggcaaacaa accaccgctg gtagcggtgg tttttttgtt 1080 tgcaagcagc agattacgcg cagaaaaaaa ggatctcaag aagatccttt gatcttttct 1140
acggggtctg acgctcagtg gaacgaaaac tcacgttaag ggattttggt catgagatta 1200 tcaaaaagga tcttcaccta gatcctttta aattaaaaat gaagttttaa atcaatctaa 1260 agtatatatg agtaaacttg gtctgacagt taccaatgct taatcagtga ggcacctatc 1320 tcagcgatct gtctatttcg ttcatccata gttgcctgac tccccgtcgt gtagataact 1380 acgatacggg agggcttacc atctggcccc agtgctgcaa tgataccgcg agacccacgc 1440 tcaccggctc cagatttatc agcaataaac cagccagccg gaagggccga gcgcagaagt 1500 ggtcctgcaa ctttatccgc ctccatccag tctattaatt gttgccggga agctagagta 1560 agtagttcgc cagttaatag tttgcgcaac gttgttgcca ttgctacagg catcgtggtg 1620 tcacgctcgt cgtttggtat ggcttcattc agctccggtt cccaacgatc aaggcgagtt 1680 acatgatccc ccatgttgtg caaaaaagcg gttagctcct tcggtcctcc gatcgttgtc 1740 agaagtaagt tggccgcagt gttatcactc atggttatgg cagcactgca taattctctt 1800 actgtcatgc catccgtaag atgcttttct gtgactggtg agtactcaac caagtcattc 1860 tgagaatagt gtatgcggcg accgagttgc tcttgcccgg cgtcaatacg ggataatacc 1920 gcgccacata gcagaacttt aaaagtgctc atcattggaa aacgttcttc ggggcgaaaa 1980 ctctcaagga tcttaccgct gttgagatcc agttcgatgt aacccactcg tgcacccaac 2040 tgatcttcag catcttttac tttcaccagc gtttctgggt gagcaaaaac aggaaggcaa 2100 aatgccgcaa aaaagggaat aagggcgaca cggaaatgtt gaatactcat actcttcctt 2160 tttcaatatt attgaagcat ttatcagggt tattgtctca tgagcggata catatttgaa 2220 tgtatttaga aaaataaaca aataggggtt ccgcgcacat ttccccgaaa agtgccacct 2280 gacgcgccct gtagcggcgc attaagcgcg gcgggtgtgg tggttacgcg cagcgtgacc 2340 gctacacttg ccagcgccct agcgcccgct cctttcgctt tcttcccttc ctttctcgcc 2400 acgttcgccg gctttccccg tcaagctcta aatcgggggc tccctttagg gttccgattt 2460 agtgctttac ggcacctcga ccccaaaaaa cttgattagg gtgatggttc acgtagtggg 2520 ccatcgccct gatagacggt ttttcgccct ttgacgttgg agtccacgtt ctttaatagt 2580 ggactcttgt tccaaactgg aacaacactc aaccctatct cggtctattc ttttgattta 2640 taagggattt tgccgatttc ggcctattgg ttaaaaaatg agctgattta acaaaaattt 2700 aacgcgaatt ttaacaaaat attaacgctt acaatttcca ttcgccattc aggctgcgca 2760 actgttggga agggcgatcg gtgcgggcct cttcgctatt acgccagctg gcgaaagggg 2820 gatgtgctgc aaggcgatta agttgggtaa cgccagggtt ttcccagtca cgacgttgta 2880 aaacgacggc cagtgaattg taatacgact cactataggg cgaattgggt accgggcccc 2940
ccctcgaggt cgacggtatc gataagcttg atatcgaatt ctcatgtttg acagcttatc 3000 atcggatcta gtaacataga tgacaccgcg cgcgataatt tatcctagtt tgcgcgctat 3060 attttgtttt ctatcgcgta ttaaatgtat aattgcggga ctctaatcat aaaaacccat 3120 ctcataaata acgtcatgca ttacatgtta attattacat gcttaacgta attcaacaga 3180 aattatatga taatcatcgc aagaccggca acaggattca atcttaagaa actttattgc 3240 caaatgtttg aacgatctgc aggtcgacgg atcagatctc ggtgacgggc aggaccggac 3300 ggggcggtac cggcaggctg aagtccagct gccagaaacc cacgtcatgc cagttcccgt 3360 gcttgaagcc ggccgcccgc agcatgccgc ggggggcata tccgagcgcc tcgtgcatgc 3420 gcacgctcgg gtcgttgggc agcccgatga cagcgaccac gctcttgaag ccctgtgcct 3480 ccagggactt cagcaggtgg gtgtagagcg tggagcccag tcccgtccgc tggtggcggg 3540 gggagacgta cacggtcgac tcggccgtcc agtcgtaggc gttgcgtgcc ttccaggggc 3600 ccgcgtaggc gatgccggcg acctcgccgt ccacctcggc gacgagccag ggatagcgct 3660 cccgcagacg gacgaggtcg tccgtccact cctgcggttc ctgcggctcg gtacggaagt 3720 tgaccgtgct tgtctcgatg tagtggttga cgatggtgca gaccgccggc atgtccgcct 3780 cggtggcacg gcggatgtcg gccgggcgtc gttctgggct catggttact tcctaatcga 3840 tggatcctct agagtcgacc tgcagaagta acaccaaaca acagggtgag catcgacaaa 3900 agaaacagta ccaagcaaat aaatagcgta tgaaggcagg gctaaaaaaa tccacatata 3960 gctgctgcat atgccatcat ccaagtatat caagatcaaa ataattataa aacatacttg 4020 tttattataa tagataggta ctcaaggtta gagcatatga atagatgctg catatgccat 4080 catgtatatg catcagtaaa acccacatca acatgtatac ctatcctaga tcgatatttc 4140 catccatctt aaactcgtaa ctatgaagat gtatgacaca cacatacagt tccaaaatta 4200 ataaatacac caggtagttt gaaacagtat tctactccga tctagaacga atgaacgacc 4260 gcccaaccac accacatcat cacaaccaag cgaacaaaaa gcatctctgt atatgcatca 4320 gtaaaacccg catcaacatg tatacctatc ctagatcgat atttccatcc atcattttca 4380 attcgtaact atgaatatgt atggcacaca catacagatc caaaattaat aaatccacca 4440 ggtagtttga aacagaattc tactccgatc tagaacgacc gcccaaccag accacatcat 4500 cacaaccaag acaaaaaaaa gcatgaaaag atgacccgac aaacaagtgc acggcatata 4560 ttgaaataaa ggaaaagggc aaaccaaacc ctatgcaacg aaacaaaaaa aatcatgaaa 4620 tcgatcccgt ctgcggaacg gctagagcca tcccaggatt ccccaaagag aaacactggc 4680 aagttagcaa tcagaacgtg tctgacgtac aggtcgcatc cgtgtacgaa cgctagcagc 4740
acggatctaa cacaaacacg gatctaacac aaacatgaac agaagtagaa ctaccgggcc 4800 ctaaccatgg accggaacgc cgatctagag aaggtagaga gggggggggg gggaggacga 4860 gcggcgtacc ttgaagcgga ggtgccgacg ggtggatttg ggggagatct ggttgtgtgt 4920 gtgtgcgctc cgaacaacac gaggttgggg aaagagggtg tggagggggt gtctatttat 4980 tacggcgggc gaggaaggga aagcgaagga gcggtgggaa aggaatcccc cgtagctgcc 5040 ggtgccgtga gaggaggagg aggccgcctg ccgtgccggc tcacgtctgc cgctccgcca 5100 cgcaatttct ggatgccgac agcggagcaa gtccaacggt ggagcggaac tctcgagagg 5160 ggtccagagg cagcgacaga gatgccgtgc cgtctgcttc gcttggcccg acgcgacgct 5220 gctggttcgc tggttggtgt ccgttagact cgtcgacggc gtttaacagg ctggcattat 5280 ctactcgaaa caagaaaaat gtttccttag tttttttaat ttcttaaagg gtatttgttt 5340 aatttttagt cactttattt tattctattt tatatctaaa ttattaaata aaaaaactaa 5400 aatagagttt tagttttctt aatttagagg ctaaaataga ataaaataga tgtactaaaa 5460 aaattagtct ataaaaacca ttaaccctaa accctaaatg gatgtactaa taaaatggat 5520 gaagtattat ataggtgaag ctatttgcaa aaaaaaagga gaacacatgc acactaaaaa 5580 gataaaactg tagagtcctg ttgtcaaaat actcaattgt cctttagacc atgtctaact 5640 gttcatttat atgattctct aaaacactga tattattgta gtactataga ttatattatt 5700 cgtagagtaa agtttaaata tatgtataaa gatagataaa ctgcacttca aacaagtgtg 5760 acaaaaaaaa tatgtggtaa ttttttataa cttagacatg caatgctcat tatctctaga 5820 gaggggcacg accgggtcac gctgcactgc aggcatgcaa gcttgaattc ctgcagcccc 5880 gccaagctat caactttgta tagaaaagtt ggtttgtgtc ttctagatta atcctccaaa 5940 cttttgatta accaaaaaaa ttatcaaact aacatgttct ccttttttct ttagaaattc 6000 taacgaattt atctttatac tgatttgaat atacttaatt tggtcatttg gatgcccttt 6060 acaacctcct taccaaactc actatggcaa atatatacta ttttccattg taacataaat 6120 gtccataatt tgaattaaat tcgttgcagt acgaaaccat ccaactttgt ccaaaaacaa 6180 aatccttata actatttact ttaatgtaaa tatatcctct acttttgttt ttacaaccct 6240 agctcaaaca aatttattat ttgcgataaa aaatcatatc gaacaaactc gatgattttt 6300 tttttcttac gttattaatg aaactaaaat atagaaaaaa acaagatgaa ccaaattttc 6360 acctatctaa ctacttaaat ataatatgat taaatttggt aaagtttgaa aagtttcttt 6420 agaaatgtga aatattgatc acagtttcta ttgctaaaat caccaacaaa acgcatgtcg 6480 ccattcataa ttatggtttc acacctacaa ctaggctaat aagtaaataa gtagacaact 6540
agactcaggt ttgaaaaaac cataaaagcc atatagcgtt ttctcattga aactgcgaac 6600 acgatcgtgt gaatgttgca gtttctagtt ttgatacaaa caaacaaaaa cacaatttaa 6660 tcttagatta aaaagaaaaa agagaacgga gcccactagc cactccttca aacgtgtctt 6720 accaactctc ttctagaaac aaattaggct tcaccttcct cttccaacct ctctctctct 6780 5 ctctctctct ttttctcaaa ccatctctcc ataaagccct aatttcttca tcacaagaat 6840 cagaagaaga aacaagtttg tacaaaaaag caggcttact gcaaaaaact tatggacctg 6900 catctaattt tcggtccaac ttgcacagga aagacgacga ccgcgatagc tcttgcccag 6960 cagacagggc ttccagtcct ttcgcttgat cgggtccaat gctgtcctca actatcaacc 7020 ggaagcggac gaccaacagt ggaagaactg aaaggaacga cgcgtctcta ccttgatgat 7080 10 cggcctctgg tggagggtat catcgcagcc aagcaagctc atcataggct gatcgaggag 7140 gtgtataatc atgaggccaa cggcgggctt attcttgagg gaggatccac ctcgttgctc 7200 aactgcatgg cgcgaaacag ctattggagt gcagattttc gttggcatat tattcgccac 7260 aagttacccg accaagagac cttcatgaaa gcggccaagg ccagagttaa gcagatgttg 7320 caccccgctg caggccattc tattattcaa gagttggttt atctttggaa tgaacctcgg 7380 15 ctgaggccca ttctgaaaga gatcgatgga tatcgatatg ccatgttgtt tgctagccag 7440 aaccagatca cggcagatat gctattgcag cttgacgcaa atatggaagg taagttgatt 7500 aatgggatcg ctcaggagta tttcatccat gcgcgccaac aggaacagaa attcccccaa 7560 gttaacgcag ccgctttcga cggattcgaa ggtcatccgt tcggaatgta ttaggtaccc 7620 agctttcttg tacaaagtgg agtccgcaaa aatcaccagt ctctctctac aaatctatct 7680 20 ctctctattt ttctccagaa taatgtgtga gtagttccca gataagggaa ttagggttct 7740 tatagggttt cgctcatgtg ttgagcatat aagaaaccct tagtatgtat ttgtatttgt 7800 aaaatacttc tatcaataaa atttctaatt cctaaaacca aaatccagtg acctcaactt 7860 ta 7862

Claims (16)

  1. REIVINDICACIONES
    1.
    Un método para manipular la senescencia en una planta, en donde dicho método incluye introducir en dicha planta una construcción genética que incluye un promotor modificado del gen myb, que incluye una secuencia de nucleótido seleccionada del grupo que consiste en las Secuencias ID Nº: 2, 3 y 4, o uno de sus fragmentos o variantes funcionalmente activo que tiene al menos 95% de identidad con la parte de SEC ID Nº 2, 3 o 4 a la que corresponde el fragmento o variante y que tiene un tamaño de al menos 300 nucleótidos, ligado operativamente a un gen que codifica una enzima que interviene en la biosíntesis de una citoquinina, o uno de sus fragmentos o variantes funcionalmente activo, en donde uno o más motivos específicos de raíz y/o motivos específicos de polen han sido eliminados o inactivados en dicho promotor modificado del gen myb.
  2. 2.
    Un método de acuerdo con la reivindicación 1 en donde uno o más motivos específicos de raíz han sido eliminados o inactivados y en donde cada uno de dichos motivos específicos de raíz incluye una secuencia de consenso ATATT o AATAT; o en donde uno o más motivos específicos de polen han sido eliminados o inactivados y en donde cada uno de dichos motivos específicos de polen incluye una secuencia de consenso TTCT o AGAA.
  3. 3.
    Un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicacones 1 o 2 en donde dicho gen que codifica una enzima que interviene en la biosíntesis de una citoquinina es un gen de isopentenilotransferasa (ipt) o uno de sus fragmentos o variantes funcionalmente activo.
  4. 4.
    Un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicacones 1 o 2, en donde dicho gen que codifica una enzima que interviene en la biosíntesis de una citoquinina incluye una secuencia de nucleótido seleccionada del grupo que consiste en las Secuencias ID No: 5, 7 y 9, secuencias que codifican los polipéptidos que tienen una secuencia de las Secuencias ID No: 6, 8 y 10, y sus fragmentos y variantes funcionalmente activos.
  5. 5.
    Un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicacones 1-4, en donde dicha construcción genética se introduce en dicha planta por transformación biolística mediada por Agrobacterium o transformación biolística de células vegetales y en donde las células vegetales que incorporan la construcción genética se seleccionan y luego se cultivan para regenerar las plantas transformadas.
  6. 6.
    Un método de acuerdo con la reivindicación 1 que tiene entre uno y diez motivos específicos de raíz eliminados o inactivados, teniendo cada uno de dichos motivos específicos de raíz una secuencia de consenso ATATT o AATAT;
    o que tiene entre uno y treinta motivos específicos de polen eliminados o inactivados, teniendo dichos motivos específicos de polen una secuencia de consenso TTCT o AGAA; estando dicho promotor modificado del gen myb ligado operativamente a un gen ipt o sho.
  7. 7.
    Un vector capaz de manipular la senescencia en una planta, incluyendo dicho vector un promotor modificado del gen myb, que incluye una secuencia de nucleótido seleccionada del grupo que consiste en las Secuencias ID Nº: 2, 3 y 4, o uno de sus fragmentos o variantes funcionalmente activo que tiene al menos 95% de identidad con la parte de SEC ID Nº 2, 3 o 4 a la que corresponde el fragmento o variante y que tiene un tamaño de al menos 300 nucleótidos, ligado operativamente a un gen que codifica una enzima que interviene en la biosíntesis de una citoquinina, o uno de sus fragmentos o variantes funcionalmente activo, en donde uno o más motivos específicos de raíz y/o motivos específicos de polen han sido eliminados o inactivados en dicho promotor modificado del gen myb.
  8. 8.
    Un vector de acuerdo con la reivindicación 7, que además incluye un terminador; dicho promotor, gen y terminador están ligados operativamente.
  9. 9.
    Un vector de acuerdo con la reivindicación 7 u 8, en donde dicho uno o más motivos específicos de raíz están eliminados o inactivados en dicho promotor modificado del gen myb y en donde cada uno de dichos motivos específicos de raíz incluye una secuencia de consenso ATATT o AATAT; o en donde uno o más motivos específicos de polen están eliminados o inactivados dicho promotor modificado del gen myb y en donde cada uno de dichos motivos específicos de polen incluye una secuencia de consenso TTCT o AGAA.
  10. 10.
    Un vector de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 7-9, en donde dicho gen que codifica una enzima que interviene en la biosíntesis de una citoquinina es un gen de isopentenil transferasa (ipt) o sho o uno de sus fragmentos o variantes funcionalmente activo.
  11. 11.
    Un vector de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 7-9, en donde dicho gen que codifica una enzima que interviene en la biosíntesis de una citoquinina incluye una secuencia de nucleótido seleccionada del grupo que consiste en las Secuencias ID No: 5, 7 y 9, y las secuencias que codifican polipéptidos que tienen una secuencia de las Secuencias ID No: 6, 8 y 10.
  12. 12.
    Una célula vegetal, planta, semilla de planta u otra parte de planta transgénica, con características de senescencia modificadas, en donde dicha célula vegetal, planta, semilla de planta u otra parte de planta incluye una construcción genética que incluye un promotor modificado del gen myb que incluye una secuencia de nucleótido seleccionada del grupo que consiste en las Secuencias ID Nº: 2, 3 y 4, o uno de sus fragmentos o variantes funcionalmente activo que tiene al menos 95% de identidad con la parte de SEC ID Nº 2, 3 o 4 a la que corresponde el fragmento o variante y que tiene un tamaño de al menos 300 nucleótidos, ligado operativamente a un gen que
    codifica una enzima que interviene en la biosíntesis de una citoquinina, o uno de sus fragmentos o variantes funcionalmente activo, en donde uno o más motivos específicos de raíz y/o motivos específicos de polen han sido eliminados o inactivados en dicho promotor modificado del gen myb.
  13. 13.
    Una célula vegetal, planta, semilla de planta u otra parte de planta, de acuerdo con la reivindicación 12 producida
    5 por un método que incluye introducir en dicha planta una construcción genética que incluye un promotor modificado del gen myb que incluye una secuencia de nucleótido seleccionada del grupo que consiste en las Secuencias ID Nº: 2, 3 y 4, o uno de sus fragmentos o variantes funcionalmente activo que tiene al menos 95% de identidad con la parte de SEC ID Nº 2, 3 o 4 a la que corresponde el fragmento o variante y que tiene un tamaño de al menos 300 nucleótidos, ligado operativamente a un gen que codifica una enzima que interviene en la biosíntesis de una
    10 citoquinina, o uno de sus fragmentos o variantes funcionalmente activo, en donde uno o más motivos específicos de raíz y/o motivos específicos de polen han sido eliminados o inactivados en dicho promotor modificado del gen myb.
  14. 14.
    Una planta, semilla de planta u otra parte de planta derivada de una célula vegetal o planta de acuerdo con la reivindicación 12.
  15. 15.
    Un método para incrementar la biomasa en una planta, en donde dicho método incluye introducir en dicha planta
    15 una construcción genética que incluye un promotor modificado de gen myb que incluye una secuencia de nucleótido seleccionada del grupo que consiste en las Secuencias ID Nº: 2, 3 y 4, o uno de sus fragmentos o variantes funcionalmente activo que tiene al menos 95% de identidad con la parte de SEC ID Nº 2, 3 o 4 a la que corresponde el fragmento o variante y que tiene un tamaño de al menos 300 nucleótidos, ligado operativamente a un gen que codifica una enzima que interviene en la biosíntesis de una citoquinina, o uno de sus fragmentos o variantes
    20 funcionalmente activo, en donde uno o más motivos específicos de raíz y/o motivos específicos de polen han sido eliminados o inactivados en dicho promotor modificado del gen myb.
  16. 16. Un vector capaz de incrementar la biomasa en una planta, en donde dicho vector incluye un promotor de gen myb que incluye una secuencia de nucleótido seleccionada del grupo que consiste en las Secuencias ID Nº: 2, 3 y 4,
    o uno de sus fragmentos o variantes funcionalmente activo que tiene al menos 95% de identidad con la parte de
    25 SEC ID Nº 2, 3 o 4 a la que corresponde el fragmento o variante y que tiene un tamaño de al menos 300 nucleótidos, ligado operativamente a un gen que codifica una enzima que interviene en la biosíntesis de una citoquinina, o uno de sus fragmentos o variantes funcionalmente activo, en donde uno o más motivos específicos de raíz y/o motivos específicos de polen han sido eliminados o inactivados en dicho promotor modificado del gen myb.
    1 gtttgtgtct tctagattaa tcctccaaac ttttgattaa ccaaaaaaat tatcaaacta
    61 acatgttctc cttttttctt tagaaattct aacgaattta tctttatact gatttgaata
    <<< XcmI >>> 121 tacttaattt ggtcatttgg atgcccttta caacctcctt accaaactca ctatggcaaa 181 tatatactat tttccattgt aacataaatg tccataattt gaattaaatt cgttgcagta 241 cgaaaccatc caactttgtc caaaaacaaa atccttataa ctatttactt taatgtaaat 301 atatcctcta cttttgtttt tacaacccta gctcaaacaa atttattatt tgcgataaaa 361 aatcatatcg aacaaactcg atgatttttt ttttcttacg ttattaatga aactaaaata 421 tagaaaaaaa caagatgaac caaattttca cctatctaac tacttaaata taatatgatt
    < SspI> 481 aaatttggta aagtttgaaa agtttcttta gaaatgtgaa atattgatca cagtttctat 541 tgctaaaatc accaacaaaa cgcatgtcgc cattcataat tatggtttca cacctacaac 601 taggctaata agtaaataag tagacaacta gactcaggtt tgaaaaaacc ataaaagcca 661 tatagcgttt tctcattgaa actgcgaaca cgatcgtgtg aatgttgcag tttctagttt 721 tgatacaaac aaacaaaaac acaatttaat cttagattaa aaagaaaaaa gagaacggag 781 cccactagcc actccttcaa acgtgtctta ccaactctct tctagaaaca aattaggctt 841 caccttcctc ttccaacctc tctctctctc tctctctctt tttctcaaac catctctcca 901 taaagcccta atttcttcat cacaagaatc agaagaagaa a
    Figura 1.
    1 gtttgtgtct tctagattaa tcctccaaac ttttgattaa
    ccaaaaaaat tatcaaacta
    61 acatgttctc cttttttctt tagaaattct aacgaattta tctttatact gatttgaata
    121 tacttaattt ggtcatttgg atgcccttta caacctcctt accaaactca ttgatcacag 181 tttctattgc taaaatcacc aacaaaacgc atgtcgccat tcataattat ggtttcacac 241 ctacaactag gctaataagt aaataagtag acaactagac tcaggtttga aaaaaccata 301 aaagccatat agcgttttct cattgaaact gcgaacacga tcgtgtgaat gttgcagttt 361 ctagttttga tacaaacaaa caaaaacaca atttaatctt agattaaaaa gaaaaaagag 421 aacggagccc actagccact ccttcaaacg tgtcttacca actctcttct agaaacaaat
    481 taggcttcac cttcctcttc caacctctct ctctctctct ctctcttttt ctcaaaccat
    541 ctctccataa agccctaatt tcttcatcac aagaatcaga agaagaaa
    Figura 2.
    1 tacttaattt ggtcatttgg atgcccttta caacctcctt accaaactca ttgatcacag
    61 tttctattgc taaaatcacc aacaaaacgc atgtcgccat tcataattat ggtttcacac 121 ctacaactag gctaataagt aaataagtag acaactagac tcaggtttga aaaaaccata 181 aaagccatat agcgttttct cattgaaact gcgaacacga tcgtgtgaat gttgcagttt 241 ctagttttga tacaaacaaa caaaaacaca atttaatctt agattaaaaa gaaaaaagag 301 aacggagccc actagccact ccttcaaacg tgtcttacca actctcttct agaaacaaat
    361 taggcttcac cttcctcttc caacctctct ctctctctct ctctcttttt ctcaaaccat
    421 ctctccataa agccctaatt tcttcatcac aagaatcaga agaagaaa
    Figura 3.
    1 attgatcaca gtttctattg ctaaaatcac caacaaaacg catgtcgcca ttcataatta
    61 tggtttcaca cctacaacta ggctaataag taaataagta gacaactaga ctcaggtttg 121 aaaaaaccat aaaagccata tagcgttttc tcattgaaac tgcgaacacg atcgtgtgaa 181 tgttgcagtt tctagttttg atacaaacaa acaaaaacac aatttaatct tagattaaaa 241 agaaaaaaga gaacggagcc cactagccac tccttcaaac gtgtcttacc aactctcttc
    301 tagaaacaaa ttaggcttca ccttcctctt ccaacctctc tctctctctc tctctctttt
    361 tctcaaacca tctctccata aagccctaat ttcttcatca caagaatcag aagaagaaa
    Figura 4.
    1 atggacctgc atctaatttt cggtccaact tgcacaggaa agacgacgac cgcgatagct
    61 cttgcccagc agacagggct tccagtcctt tcgcttgatc gggtccaatg ctgtcctcaa 121 ctatcaaccg gaagcggacg accaacagtg gaagaactga aaggaacgac gcgtctctac 181 cttgatgatc ggcctctggt ggagggtatc atcgcagcca agcaagctca tcataggctg 241 atcgaggagg tgtataatca tgaggccaac ggcgggctta ttcttgaggg aggatccacc 301 tcgttgctca actgcatggc gcgaaacagc tattggagtg cagattttcg ttggcatatt 361 attcgccaca agttacccga ccaagagacc ttcatgaaag cggccaaggc cagagttaag 421 cagatgttgc accccgctgc aggccattct attattcaag agttggttta tctttggaat 481 gaacctcggc tgaggcccat tctgaaagag atcgatggat atcgatatgc catgttgttt 541 gctagccaga accagatcac ggcagatatg ctattgcagc ttgacgcaaa tatggaaggt 601 aagttgatta atgggatcgc tcaggagtat ttcatccatg cgcgccaaca ggaacagaaa 661 ttcccccaag ttaacgcagc cgctttcgac ggattcgaag gtcatccgtt cggaatgtat 721 tag
    Figura 6.
    1 MDLHLIFGPT CTGKTTTAIA LAQQTGLPVL SLDRVQCCPQ LSTGSGRPTV EELKGTTRLY
    61 LDDRPLVEGI IAAKQAHHRL IEEVYNHEAN GGLILEGGST SLLNCMARNS YWSADFRWHI
    121 IRHKLPDQET FMKAAKARVK QMLHPAAGHS IIQELVYLWN EPRLRPILKE IDGYRYAMLF
    181 ASQNQITADM LLQLDANMEG KLINGIAQEY FIHARQQEQK FPQVNAAAFD GFEGHPFGMY
    241 *
    Figura 7.
    1 atgtccatct caatgctaat gtgcagacta agacaaccct taataaacgt tccctgcagt
    61 ggcaaaaaac tgagcatgag gcagattcaa aaggagaagg tagtgttggt gatgggagct 121 acagggacag gaaagtcaaa gctctccatt gacctcgcca cctgtttccc ctcagaaatc 181 atcaactccg acaagattca aatctacgac ggcctcgaca tcgtcaccaa caaaatctcc 241 aaggaagaac aacgtggaat cccccaccac ctcctcggaa ctcaaaaccc taacacagac 301 ttcaccgccg gcgatttcag tgactgttcc accgccgcca ttgacgcaat cacaagccgc 361 gaccaccttc cgatcatcgc cggaggttcg aactcctacc tggaggcgtt aatcgacgac 421 gacgactaca aattccgatc gaggtacgac ttctgctgcc tctgggtcga cgtggcaatg 481 ccggtgctgg actcatacgt ggcggcgcgt gtggatcaga tgctccggag cggaatggtg 541 gaggagctga gaccgttttt caacgcgaac ggcgactact cgagaggaat cagaagagcg 601 attggggttc ctgaattcga cgagtatttc cggcgggaag ggttcgccga tgaggaaacg 661 aggaaattgt tactggagcg agcggtgagg gagatgaagg tgaacacgtg caagctcgcg 721 aggaggcaat tggggaagat tcagaggctg aggaatgtga agaggtggga gattcaccgt 781 gttgatgcga cgccggtgtt ttggaagcgt ggggaggagg ctgatgaggc gtggcggaag 841 gtggtggcag agcctagtgc tatgatcgta gcgcagtttc tgtataaggc aaagagtgat 901 gtgaatgttg tttctggcgg tttcagagtg ccggcgggtt caacggagag tgttatggcg 961 gcggcgacgt gttag
    Figura 8.
    1 MSISMLMCRL RQPLINVPCS GKKLSMRQIQ KEKVVLVMGA TGTGKSKLSI DLATCFPSEI
    61 INSDKIQIYD GLDIVTNKIS KEEQRGIPHH LLGTQNPNTD FTAGDFSDCS TAAIDAITSR 121 DHLPIIAGGS NSYLEALIDD DDYKFRSRYD FCCLWVDVAM PVLDSYVAAR VDQMLRSGMV 181 EELRPFFNAN GDYSRGIRRA IGVPEFDEYF RREGFADEET RKLLLERAVR EMKVNTCKLA 241 RRQLGKIQRL RNVKRWEIHR VDATPVFWKR GEEADEAWRK VVAEPSAMIV AQFLYKAKSD 301 VNVVSGGFRV PAGSTESVMA AATC*
    Figura 9.
    1 atgttaattg tagtacatat tattagcatc acacgcatca tattcatcac cttaacccat
    61 aatcatctcc atttccttat gtttagatca ttatcataca atcacaagca cctcaaattc
    121 cttacaaacc cgaccacacg ggtactccga agaaacatgt cgtcatccac tgtagtaaca
    181 atacccggcc ccacacaaaa aaacaaaaac aaaatcatag taataatggg tgcaacaggt
    241 tcaggaaaat caaaactctc aatagacctc gtcacacgtc actatccttt ttccgaaatc
    301 attaactccg acaaaatcca aattaccaaa ggtttaaaca taaccacaaa caaaatcact
    361 gtacccgacc gacgtggcgt agttcatcat ttactcggcg agattgaccc cgactttaac
    421 ttttctcctt ctcatttccg gtcaattgct ggtcaacgca ttaactccat tattaatcgc
    481 cataaactcc cattcctcgt tggtgggtcc aactcatata tctacgcttt attaacaaac
    541 cggttcgacc cggattttaa ccctgattca aacccggttc attttatatc caacgagtta
    601 cgctacaact gttgttttat ttgggtcgat gtattaaacc cggttttgaa tgagtatttg
    661 gataaacggg tcgatgagat gatgaactcg ggtatgtatg aagaactgga acagtttttt
    721 aaagaaaaca ggttttcgga tccgggtttg gaaccgggtc gggccaccgg gttgaggaaa
    781 gcgatagggg taccggaaat ggagaggtat tttaagaaga gctgtacgta tgaggaagca
    841 gtgagggaaa taaaagaaaa cacgtggcgg ttagcgaaga agcagatgtg gaagatccaa
    901 cggttgagag aagcagggtg ggacctacaa agagtagatg ccacggaggc atttgtggag
    961 gcgatgagta ataagaagga aaagggaatt atttgggaaa aacaagtagt ggaaccaagt 1021 gtcaagattg tgaaccgttt tttgttggac tga
    Figura 10.
    1 MLIVVHIISI TRIIFITLTH NHLHFLMFRS LSYNHKHLKF LTNPTTRVLR RNMSSSTVVT
    61 IPGPTQKNKN KIIVIMGATG SGKSKLSIDL VTRHYPFSEI INSDKIQITK GLNITTNKIT 121 VPDRRGVVHH LLGEIDPDFN FSPSHFRSIA GQRINSIINR HKLPFLVGGS NSYIYALLTN 181 RFDPDFNPDS NPVHFISNEL RYNCCFIWVD VLNPVLNEYL DKRVDEMMNS GMYEELEQFF 241 KENRFSDPGL EPGRATGLRK AIGVPEMERY FKKSCTYEEA VREIKENTWR LAKKQMWKIQ 301 RLREAGWDLQ RVDATEAFVE AMSNKKEKGI IWEKQVVEPS VKIVNRFLLD *
    Figura 11.
    Figura 12.
    Figura 13.
    Figura 14.
    Figura 15.
    Figura 16.
    1 gtcccgtatc acgcagcgcg tgagctaccc aggcactgcc gccgccggca caaccgttct 61 tgaatcagaa cccgagggcg acgctgcccg cgaggtccag gcgctggccg ctgaaattaa 121 atcaaaactc atttgagtta atgaggtaaa gagaaaatga gcaaaagcac aaacacgcta 181 agtgccggcc gtccgagcgc acgcagcagc aaggctgcaa cgttggccag cctggcagac 241 acgccagcca tgaagcgggt caactttcag ttgccggcgg aggatcacac caagctgaag 301 atgtacgcgg tacgccaagg caagaccatt accgagctgc tatctgaata catcgcgcag 361 ctaccagagt aaatgagcaa atgaataaat gagtagatga attttagcgg ctaaaggagg 421 cggcatggaa aatcaagaac aaccaggcac cgacgccgtg gaatgcccca tgtgtggagg 481 aacgggcggt tggccaggcg taagcggctg ggttgtctgc cggccctgca atggcactgg 541 aacccccaag cccgaggaat cggcgtgacg gtcgcaaacc atccggcccg gtacaaatcg 601 gcgcggcgct gggtgatgac ctggtggaga agttgaaggc cgcgcaggcc gcccagcggc 661 aacgcatcga ggcagaagca cgccccggtg aatcgtggca agcggccgct gatcgaatcc 721 gcaaagaatc ccggcaaccg ccggcagccg gtgcgccgtc gattaggaag ccgcccaagg 781 gcgacgagca accagatttt ttcgttccga tgctctatga cgtgggcacc cgcgatagtc 841 gcagcatcat ggacgtggcc gttttccgtc tgtcgaagcg tgaccgacga gctggcgagg 901 tgatccgcta cgagcttcca gacgggcacg tagaggtttc cgcagggccg gccggcatgg 961 ccagtgtgtg ggattacgac ctggtactga tggcggtttc ccatctaacc gaatccatga 1021 accgataccg ggaagggaag ggagacaagc ccggccgcgt gttccgtcca cacgttgcgg 1081 acgtactcaa gttctgccgg cgagccgatg gcggaaagca gaaagacgac ctggtagaaa 1141 cctgcattcg gttaaacacc acgcacgttg ccatgcagcg tacgaagaag gccaagaacg 1201 gccgcctggt gacggtatcc gagggtgaag ccttgattag ccgctacaag atcgtaaaga 1261 gcgaaaccgg gcggccggag tacatcgaga tcgagctagc tgattggatg taccgcgaga 1321 tcacagaagg caagaacccg gacgtgctga cggttcaccc cgattacttt ttgatcgatc 1381 ccggcatcgg ccgttttctc taccgcctgg cacgccgcgc cgcaggcaag gcagaagcca 1441 gatggttgtt caagacgatc tacgaacgca gtggcagcgc cggagagttc aagaagttct 1501 gtttcaccgt gcgcaagctg atcgggtcaa atgacctgcc ggagtacgat ttgaaggagg 1561 aggcggggca ggctggcccg atcctagtca tgcgctaccg caacctgatc gagggcgaag 1621 catccgccgg ttcctaatgt acggagcaga tgctagggca aattgcccta gcaggggaaa 1681 aaggtcgaaa aggtctcttt cctgtggata gcacgtacat tgggaaccca aagccgtaca 1741 ttgggaaccg gaacccgtac attgggaacc caaagccgta cattgggaac cggtcacaca 1801 tgtaagtgac tgatataaaa gagaaaaaag gcgatttttc cgcctaaaac tctttaaaac 1861 ttattaaaac tcttaaaacc cgcctggcct gtgcataact gtctggccag cgcacagccg 1921 aagagctgca aaaagcgcct acccttcggt cgctgcgctc cctacgcccc gccgcttcgc 1981 gtcggcctat cgcggccgct ggccgctcaa aaatggctgg cctacggcca ggcaatctac 2041 cagggcgcgg acaagccgcg ccgtcgccac tcgaccgccg gcgcccacat caaggcaccc 2101 tgcctcgcgc gtttcggtga tgacggtgaa aacctctgac acatgcagct cccggagacg 2161 gtcacagctt gtctgtaagc ggatgccggg agcagacaag cccgtcaggg cgcgtcagcg 2221 ggtgttggcg ggtgtcgggg cgcagccatg acccagtcac gtagcgatag cggagtgtat 2281 actggcttaa ctatgcggca tcagagcaga ttgtactgag agtgcaccat atgcggtgtg 2341 aaataccgca cagatgcgta aggagaaaat accgcatcag gcgctcttcc gcttcctcgc 2401 tcactgactc gctgcgctcg gtcgttcggc tgcggcgagc ggtatcagct cactcaaagg 2461 cggtaatacg gttatccaca gaatcagggg ataacgcagg aaagaacatg tgagcaaaag 2521 gccagcaaaa ggccaggaac cgtaaaaagg ccgcgttgct ggcgtttttc cataggctcc 2581 gcccccctga cgagcatcac aaaaatcgac gctcaagtca gaggtggcga aacccgacag 2641 gactataaag ataccaggcg tttccccctg gaagctccct cgtgcgctct cctgttccga 2701 ccctgccgct taccggatac ctgtccgcct ttctcccttc gggaagcgtg gcgctttctc 2761 atagctcacg ctgtaggtat ctcagttcgg tgtaggtcgt tcgctccaag ctgggctgtg 2821 tgcacgaacc ccccgttcag cccgaccgct gcgccttatc cggtaactat cgtcttgagt 2881 ccaacccggt aagacacgac ttatcgccac tggcagcagc cactggtaac aggattagca
    2941 gagcgaggta tgtaggcggt gctacagagt tcttgaagtg gtggcctaac tacggctaca 3001 ctagaaggac agtatttggt atctgcgctc tgctgaagcc agttaccttc ggaaaaagag 3061 ttggtagctc ttgatccggc aaacaaacca ccgctggtag cggtggtttt tttgtttgca 3121 agcagcagat tacgcgcaga aaaaaaggat ctcaagaaga tcctttgatc ttttctacgg 3181 ggtctgacgc tcagtggaac gaaaactcac gttaagggat tttggtcatg catgatatat 3241 ctcccaattt gtgtagggct tattatgcac gcttaaaaat aataaaagca gacttgacct
    3301 gatagtttgg ctgtgagcaa ttatgtgctt agtgcatcta atcgcttgag ttaacgccgg 3361 cgaagcggcg tcggcttgaa cgaatttcta gctagacatt atttgccgac taccttggtg 3421 atctcgcctt tcacgtagtg gacaaattct tccaactgat ctgcgcgcga ggccaagcga 3481 tcttcttctt gtccaagata agcctgtcta gcttcaagta tgacgggctg atactgggcc 3541 ggcaggcgct ccattgccca gtcggcagcg acatccttcg gcgcgatttt gccggttact 3601 gcgctgtacc aaatgcggga caacgtaagc actacatttc gctcatcgcc agcccagtcg 3661 ggcggcgagt tccatagcgt taaggtttca tttagcgcct caaatagatc ctgttcagga 3721 accggatcaa agagttcctc cgccgctgga cctaccaagg caacgctatg ttctcttgct 3781 tttgtcagca agatagccag atcaatgtcg atcgtggctg gctcgaagat acctgcaaga 3841 atgtcattgc gctgccattc tccaaattgc agttcgcgct tagctggata acgccacgga 3901 atgatgtcgt cgtgcacaac aatggtgact tctacagcgc ggagaatctc gctctctcca 3961 ggggaagccg aagtttccaa aaggtcgttg atcaaagctc gccgcgttgt ttcatcaagc 4021 cttacggtca ccgtaaccag caaatcaata tcactgtgtg gcttcaggcc gccatccact 4081 gcggagccgt acaaatgtac ggccagcaac gtcggttcga gatggcgctc gatgacgcca 4141 actacctctg atagttgagt cgatacttcg gcgatcaccg cttcccccat gatgtttaac 4201 tttgttttag ggcgactgcc ctgctgcgta acatcgttgc tgctccataa catcaaacat 4261 cgacccacgg cgtaacgcgc ttgctgcttg gatgcccgag gcatagactg taccccaaaa 4321 aaacatgtca taacaagaag ccatgaaaac cgccactgcg ccgttaccac cgctgcgttc 4381 ggtcaaggtt ctggaccagt tgcgtgacgg cagttacgct acttgcatta cagcttacga 4441 accgaacgag gcttatgtcc actgggttcg tgcccgaatt gatcacaggc agcaacgctc 4501 tgtcatcgtt acaatcaaca tgctaccctc cgcgagatca tccgtgtttc aaacccggca 4561 gcttagttgc cgttcttccg aatagcatcg gtaacatgag caaagtctgc cgccttacaa 4621 cggctctccc gctgacgccg tcccggactg atgggctgcc tgtatcgagt ggtgattttg 4681 tgccgagctg ccggtcgggg agctgttggc tggctggtgg caggatatat tgtggtgtaa 4741 acaaattgac gcttagacaa cttaataaca cattgcggac gtttttaatg tactgaatta 4801 acgccgaatt gaattcctcg agtacgtagg atccatttaa attctagagg cgcgccgata 4861 tcctctctta aggtagcgag ctcttaatta atagggataa cagggtaatg cggccgcaag 4921 ctaaaacgac ggccagtgaa ttatcaactt tgtatagaaa agttgctctg ccgacagtgg 4981 tcccaaagat ggacccccac ccacgaggag catcgtggaa aaagaagacg ttccaaccac 5041 gtcttcaaag caagtggatt gatgtgataa catggtggag cacgacactc tcgtctactc 5101 caagaatatc aaagatacag tctcagaaga ccaaagggct attgagactt ttcaacaaag 5161 ggtaatatcg ggaaacctcc tcggattcca ttgcccagct atctgtcact tcatcaaaag 5221 gacagtagaa aaggaaggtg gcacctacaa atgccatcat tgcgataaag gaaaggctat 5281 cgttcaagat gcctctgccg acagtggtcc caaagatgga cccccaccca cgaggagcat 5341 cgtggaaaaa gaagacgttc caaccacgtc ttcaaagcaa gtggattgat gtgatatctc 5401 cactgacgta agggatgacg cacaatccca ctatccttcg caagaccctt cctctatata 5461 aggaagttca tttcatttgg agaggacacg ctgcaagttt gtacaaaaaa gcaggctatg 5521 gcaattacct tatccgcaac ttctttacct atttccgccc ggatccgggc aggttctccg 5581 gccgcttggg tggagaggct attcggctat gactgggcac aacagacaat cggctgctct 5641 gatgccgccg tgttccggct gtcagcgcag gggcgcccgg ttctttttgt caagaccgac 5701 ctgtccggtg ccctgaatga actgcaggac gaggcagcgc ggctatcgtg gctggccacg 5761 acgggcgttc cttgcgcagc tgtgctcgac gttgtcactg aagcgggaag ggactggctg 5821 ctattgggcg aagtgccggg gcaggatctc ctgtcatctc accttgctcc tgccgagaaa
    5881 gtatccatca tggctgatgc aatgcggcgg ctgcatacgc ttgatccggc tacctgccca 5941 ttcgaccacc aagcgaaaca tcgcatcgag cgagcacgta ctcggatgga agccggtctt 6001 gtcgatcagg atgatctgga cgaagagcat caggggctcg cgccagccga actgttcgcc 6061 aggctcaagg cgcgcatgcc cgacggcgag gatctcgtcg tgacccatgg cgatgcctgc 6121 ttgccgaata tcatggtgga aaatggccgc ttttctggat tcatcgactg tggccggctg 6181 ggtgtggcgg accgctatca ggacatagcg ttggctaccc gtgatattgc tgaagagctt 6241 ggcggcgaat gggctgaccg cttcctcgtg ctttacggta tcgccgctcc cgattcgcag 6301 cgcatcgcct tctatcgcct tcttgacgag ttcttctgaa cccagctttc ttgtacaaag 6361 tggagtccgc aaaaatcacc agtctctctc tacaaatcta tctctctcta tttttctcca 6421 gaataatgtg tgagtagttc ccagataagg gaattagggt tcttataggg tttcgctcat 6481 gtgttgagca tataagaaac ccttagtatg tatttgtatt tgtaaaatac ttctatcaat 6541 aaaatttcta attcctaaaa ccaaaatcca gtgacctcaa ctttattata catagttgat 6601 aattcactgg ccgtgcttat tccatggctg caggtcgacg aattcaccgg ttagggataa 6661 cagggtaatc gctaccttag gaccgttata gttacggcca gtgccattac cctgttatcc 6721 ctaaccggtg acaactttgt atagaaaagt tggtttgtgt cttctagatt aatcctccaa 6781 acttttgatt aaccaaaaaa attatcaaac taacatgttc tccttttttc tttagaaatt 6841 ctaacgaatt tatctttata ctgatttgaa tatacttaat ttggtcattt ggatgccctt 6901 tacaacctcc ttaccaaact cactatggca aatatatact attttccatt gtaacataaa 6961 tgtccataat ttgaattaaa ttcgttgcag tacgaaacca tccaactttg tccaaaaaca 7021 aaatccttat aactatttac tttaatgtaa atatatcctc tacttttgtt tttacaaccc 7081 tagctcaaac aaatttatta tttgcgataa aaaatcatat cgaacaaact cgatgatttt 7141 ttttttctta cgttattaat gaaactaaaa tatagaaaaa aacaagatga accaaatttt 7201 cacctatcta actacttaaa tataatatga ttaaatttgg taaagtttga aaagtttctt 7261 tagaaatgtg aaatattgat cacagtttct attgctaaaa tcaccaacaa aacgcatgtc 7321 gccattcata attatggttt cacacctaca actaggctaa taagtaaata agtagacaac 7381 tagactcagg tttgaaaaaa ccataaaagc catatagcgt tttctcattg aaactgcgaa 7441 cacgatcgtg tgaatgttgc agtttctagt tttgatacaa acaaacaaaa acacaattta 7501 atcttagatt aaaaagaaaa aagagaacgg agcccactag ccactccttc aaacgtgtct 7561 taccaactct cttctagaaa caaattaggc ttcaccttcc tcttccaacc tctctctctc 7621 tctctctctc tttttctcaa accatctctc cataaagccc taatttcttc atcacaagaa 7681 tcagaagaag aaacaagttt gtacaaaaaa gcaggcttac tgcaaaaaac ttatggacct 7741 gcatctaatt ttcggtccaa cttgcacagg aaagacgacg accgcgatag ctcttgccca 7801 gcagacaggg cttccagtcc tttcgcttga tcgggtccaa tgctgtcctc aactatcaac 7861 cggaagcgga cgaccaacag tggaagaact gaaaggaacg acgcgtctct accttgatga 7921 tcggcctctg gtggagggta tcatcgcagc caagcaagct catcataggc tgatcgagga 7981 ggtgtataat catgaggcca acggcgggct tattcttgag ggaggatcca cctcgttgct 8041 caactgcatg gcgcgaaaca gctattggag tgcagatttt cgttggcata ttattcgcca 8101 caagttaccc gaccaagaga ccttcatgaa agcggccaag gccagagtta agcagatgtt 8161 gcaccccgct gcaggccatt ctattattca agagttggtt tatctttgga atgaacctcg 8221 gctgaggccc attctgaaag agatcgatgg atatcgatat gccatgttgt ttgctagcca 8281 gaaccagatc acggcagata tgctattgca gcttgacgca aatatggaag gtaagttgat 8341 taatgggatc gctcaggagt atttcatcca tgcgcgccaa caggaacaga aattccccca 8401 agttaacgca gccgctttcg acggattcga aggtcatccg ttcggaatgt attaggtacc 8461 cagctttctt gtacaaagtg ggatcgttca aacatttggc aataaagttt cttaagattg 8521 aatcctgttg ccggtcttgc gatgattatc atataatttc tgttgaatta cgttaagcat 8581 gtaataatta acatgtaatg catgacgtta tttatgagat gggtttttat gattagagtc 8641 ccgcaattat acatttaata cgcgatagaa aacaaaatat agcgcgcaaa ctaggataaa 8701 ttatcgcgcg cggtgtcatc tatgttacta gatccaactt tattatacat agttgattcg 8761 tcgacctgca gtcgctacct taggaccgtt atagttatgg caaacagcta ttatgggtat
    8821 tatgggtggt tctttatgcg gacactgacg gctttatgcc tgcaggtcgc gagcgatcgc
    8881 ggtaccgccc gggcgtcgac aggcctaagc ttagcttgag cttggatcag attgtcgttt
    8941 cccgccttca gtttaaacta tcagtgtttg acaggatata ttggcgggta aacctaagag
    9001 aaaagagcgt ttattagaat aacggatatt taaaagggcg tgaaaaggtt tatccgttcg
    9061 tccatttgta tgtgcatgcc aaccacaggg ttcccctcgg gatcaaagta ctttgatcca
    9121 acccctccgc tgctatagtg cagtcggctt ctgacgttca gtgcagccgt cttctgaaaa
    9181 cgacatgtcg cacaagtcct aagttacgcg acaggctgcc gccctgccct tttcctggcg
    9241 ttttcttgtc gcgtgtttta gtcgcataaa gtagaatact tgcgactaga accggagaca
    9301 ttacgccatg aacaagagcg ccgccgctgg cctgctgggc tatgcccgcg tcagcaccga
    9361 cgaccaggac ttgaccaacc aacgggccga actgcacgcg gccggctgca ccaagctgtt
    9421 ttccgagaag atcaccggca ccaggcgcga ccgcccggag ctggccagga tgcttgacca
    9481 cctacgccct ggcgacgttg tgacagtgac caggctagac cgcctggccc gcagcacccg
    9541 cgacctactg gacattgccg agcgcatcca ggaggccggc gcgggcctgc gtagcctggc
    9601 agagccgtgg gccgacacca ccacgccggc cggccgcatg gtgttgaccg tgttcgccgg
    9661 cattgccgag ttcgagcgtt ccctaatcat cgaccgcacc cggagcgggc gcgaggccgc
    9721 caaggcccga ggcgtgaagt ttggcccccg ccctaccctc accccggcac agatcgcgca
    9781 cgcccgcgag ctgatcgacc aggaaggccg caccgtgaaa gaggcggctg cactgcttgg
    9841 cgtgcatcgc tcgaccctgt accgcgcact tgagcgcagc gaggaagtga cgcccaccga
    9901 ggccaggcgg cgcggtgcct tccgtgagga cgcattgacc gaggccgacg ccctggcggc
    9961 cgccgagaat gaacgccaag aggaacaagc atgaaaccgc accaggacgg ccaggacgaa 10021 ccgtttttca ttaccgaaga gatcgaggcg gagatgatcg cggccgggta cgtgttcgag 10081 ccgcccgcgc acgtctcaac cgtgcggctg catgaaatcc tggccggttt gtctgatgcc 10141 aagctggcgg cctggccggc cagcttggcc gctgaagaaa ccgagcgccg ccgtctaaaa 10201 aggtgatgtg tatttgagta aaacagcttg cgtcatgcgg tcgctgcgta tatgatgcga 10261 tgagtaaata aacaaatacg caaggggaac gcatgaaggt tatcgctgta cttaaccaga 10321 aaggcgggtc aggcaagacg accatcgcaa cccatctagc ccgcgccctg caactcgccg 10381 gggccgatgt tctgttagtc gattccgatc cccagggcag tgcccgcgat tgggcggccg 10441 tgcgggaaga tcaaccgcta accgttgtcg gcatcgaccg cccgacgatt gaccgcgacg 10501 tgaaggccat cggccggcgc gacttcgtag tgatcgacgg agcgccccag gcggcggact 10561 tggctgtgtc cgcgatcaag gcagccgact tcgtgctgat tccggtgcag ccaagccctt 10621 acgacatatg ggccaccgcc gacctggtgg agctggttaa gcagcgcatt gaggtcacgg 10681 atggaaggct acaagcggcc tttgtcgtgt cgcgggcgat caaaggcacg cgcatcggcg 10741 gtgaggttgc cgaggcgctg gccgggtacg agctgcccat tcttga
    Figura 17.
    Figura 18.
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    3061 ttggtagctc ttgatccggc aaacaaacca ccgctggtag cggtggtttt tttgtttgca 3121 agcagcagat tacgcgcaga aaaaaaggat ctcaagaaga tcctttgatc ttttctacgg 3181 ggtctgacgc tcagtggaac gaaaactcac gttaagggat tttggtcatg catgatatat 3241 ctcccaattt gtgtagggct tattatgcac gcttaaaaat aataaaagca gacttgacct 3301 gatagtttgg ctgtgagcaa ttatgtgctt agtgcatcta atcgcttgag ttaacgccgg 3361 cgaagcggcg tcggcttgaa cgaatttcta gctagacatt atttgccgac taccttggtg 3421 atctcgcctt tcacgtagtg gacaaattct tccaactgat ctgcgcgcga ggccaagcga 3481 tcttcttctt gtccaagata agcctgtcta gcttcaagta tgacgggctg atactgggcc 3541 ggcaggcgct ccattgccca gtcggcagcg acatccttcg gcgcgatttt gccggttact 3601 gcgctgtacc aaatgcggga caacgtaagc actacatttc gctcatcgcc agcccagtcg 3661 ggcggcgagt tccatagcgt taaggtttca tttagcgcct caaatagatc ctgttcagga 3721 accggatcaa agagttcctc cgccgctgga cctaccaagg caacgctatg ttctcttgct 3781 tttgtcagca agatagccag atcaatgtcg atcgtggctg gctcgaagat acctgcaaga 3841 atgtcattgc gctgccattc tccaaattgc agttcgcgct tagctggata acgccacgga 3901 atgatgtcgt cgtgcacaac aatggtgact tctacagcgc ggagaatctc gctctctcca 3961 ggggaagccg aagtttccaa aaggtcgttg atcaaagctc gccgcgttgt ttcatcaagc 4021 cttacggtca ccgtaaccag caaatcaata tcactgtgtg gcttcaggcc gccatccact 4081 gcggagccgt acaaatgtac ggccagcaac gtcggttcga gatggcgctc gatgacgcca 4141 actacctctg atagttgagt cgatacttcg gcgatcaccg cttcccccat gatgtttaac 4201 tttgttttag ggcgactgcc ctgctgcgta acatcgttgc tgctccataa catcaaacat 4261 cgacccacgg cgtaacgcgc ttgctgcttg gatgcccgag gcatagactg taccccaaaa 4321 aaacatgtca taacaagaag ccatgaaaac cgccactgcg ccgttaccac cgctgcgttc 4381 ggtcaaggtt ctggaccagt tgcgtgacgg cagttacgct acttgcatta cagcttacga 4441 accgaacgag gcttatgtcc actgggttcg tgcccgaatt gatcacaggc agcaacgctc 4501 tgtcatcgtt acaatcaaca tgctaccctc cgcgagatca tccgtgtttc aaacccggca 4561 gcttagttgc cgttcttccg aatagcatcg gtaacatgag caaagtctgc cgccttacaa 4621 cggctctccc gctgacgccg tcccggactg atgggctgcc tgtatcgagt ggtgattttg 4681 tgccgagctg ccggtcgggg agctgttggc tggctggtgg caggatatat tgtggtgtaa 4741 acaaattgac gcttagacaa cttaataaca cattgcggac gtttttaatg tactgaatta 4801 acgccgaatt gaattcctcg agtacgtagg atccatttaa attctagagg cgcgccgata 4861 tcctctctta aggtagcgag ctcttaatta atagggataa cagggtaatg cggccgcaag 4921 ctaaaacgac ggccagtgaa ttatcaactt tgtatagaaa agttgctctg ccgacagtgg 4981 tcccaaagat ggacccccac ccacgaggag catcgtggaa aaagaagacg ttccaaccac 5041 gtcttcaaag caagtggatt gatgtgataa catggtggag cacgacactc tcgtctactc 5101 caagaatatc aaagatacag tctcagaaga ccaaagggct attgagactt ttcaacaaag 5161 ggtaatatcg ggaaacctcc tcggattcca ttgcccagct atctgtcact tcatcaaaag 5221 gacagtagaa aaggaaggtg gcacctacaa atgccatcat tgcgataaag gaaaggctat 5281 cgttcaagat gcctctgccg acagtggtcc caaagatgga cccccaccca cgaggagcat 5341 cgtggaaaaa gaagacgttc caaccacgtc ttcaaagcaa gtggattgat gtgatatctc 5401 cactgacgta agggatgacg cacaatccca ctatccttcg caagaccctt cctctatata 5461 aggaagttca tttcatttgg agaggacacg ctgcaagttt gtacaaaaaa gcaggctatg 5521 gcaattacct tatccgcaac ttctttacct atttccgccc ggatccgggc aggttctccg 5581 gccgcttggg tggagaggct attcggctat gactgggcac aacagacaat cggctgctct 5641 gatgccgccg tgttccggct gtcagcgcag gggcgcccgg ttctttttgt caagaccgac 5701 ctgtccggtg ccctgaatga actgcaggac gaggcagcgc ggctatcgtg gctggccacg 5761 acgggcgttc cttgcgcagc tgtgctcgac gttgtcactg aagcgggaag ggactggctg 5821 ctattgggcg aagtgccggg gcaggatctc ctgtcatctc accttgctcc tgccgagaaa 5881 gtatccatca tggctgatgc aatgcggcgg ctgcatacgc ttgatccggc tacctgccca 5941 ttcgaccacc aagcgaaaca tcgcatcgag cgagcacgta ctcggatgga agccggtctt 6001 gtcgatcagg atgatctgga cgaagagcat caggggctcg cgccagccga actgttcgcc 6061 aggctcaagg cgcgcatgcc cgacggcgag gatctcgtcg tgacccatgg cgatgcctgc 6121 ttgccgaata tcatggtgga aaatggccgc ttttctggat tcatcgactg tggccggctg
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    Figura 19.
    Figura 20.
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    2881 ccaacccggt aagacacgac ttatcgccac tggcagcagc cactggtaac aggattagca 2941 gagcgaggta tgtaggcggt gctacagagt tcttgaagtg gtggcctaac tacggctaca 3001 ctagaaggac agtatttggt atctgcgctc tgctgaagcc agttaccttc ggaaaaagag 3061 ttggtagctc ttgatccggc aaacaaacca ccgctggtag cggtggtttt tttgtttgca 3121 agcagcagat tacgcgcaga aaaaaaggat ctcaagaaga tcctttgatc ttttctacgg 3181 ggtctgacgc tcagtggaac gaaaactcac gttaagggat tttggtcatg catgatatat 3241 ctcccaattt gtgtagggct tattatgcac gcttaaaaat aataaaagca gacttgacct 3301 gatagtttgg ctgtgagcaa ttatgtgctt agtgcatcta atcgcttgag ttaacgccgg 3361 cgaagcggcg tcggcttgaa cgaatttcta gctagacatt atttgccgac taccttggtg 3421 atctcgcctt tcacgtagtg gacaaattct tccaactgat ctgcgcgcga ggccaagcga 3481 tcttcttctt gtccaagata agcctgtcta gcttcaagta tgacgggctg atactgggcc 3541 ggcaggcgct ccattgccca gtcggcagcg acatccttcg gcgcgatttt gccggttact 3601 gcgctgtacc aaatgcggga caacgtaagc actacatttc gctcatcgcc agcccagtcg 3661 ggcggcgagt tccatagcgt taaggtttca tttagcgcct caaatagatc ctgttcagga 3721 accggatcaa agagttcctc cgccgctgga cctaccaagg caacgctatg ttctcttgct 3781 tttgtcagca agatagccag atcaatgtcg atcgtggctg gctcgaagat acctgcaaga 3841 atgtcattgc gctgccattc tccaaattgc agttcgcgct tagctggata acgccacgga 3901 atgatgtcgt cgtgcacaac aatggtgact tctacagcgc ggagaatctc gctctctcca 3961 ggggaagccg aagtttccaa aaggtcgttg atcaaagctc gccgcgttgt ttcatcaagc 4021 cttacggtca ccgtaaccag caaatcaata tcactgtgtg gcttcaggcc gccatccact 4081 gcggagccgt acaaatgtac ggccagcaac gtcggttcga gatggcgctc gatgacgcca 4141 actacctctg atagttgagt cgatacttcg gcgatcaccg cttcccccat gatgtttaac 4201 tttgttttag ggcgactgcc ctgctgcgta acatcgttgc tgctccataa catcaaacat 4261 cgacccacgg cgtaacgcgc ttgctgcttg gatgcccgag gcatagactg taccccaaaa 4321 aaacatgtca taacaagaag ccatgaaaac cgccactgcg ccgttaccac cgctgcgttc 4381 ggtcaaggtt ctggaccagt tgcgtgacgg cagttacgct acttgcatta cagcttacga 4441 accgaacgag gcttatgtcc actgggttcg tgcccgaatt gatcacaggc agcaacgctc 4501 tgtcatcgtt acaatcaaca tgctaccctc cgcgagatca tccgtgtttc aaacccggca 4561 gcttagttgc cgttcttccg aatagcatcg gtaacatgag caaagtctgc cgccttacaa 4621 cggctctccc gctgacgccg tcccggactg atgggctgcc tgtatcgagt ggtgattttg 4681 tgccgagctg ccggtcgggg agctgttggc tggctggtgg caggatatat tgtggtgtaa 4741 acaaattgac gcttagacaa cttaataaca cattgcggac gtttttaatg tactgaatta 4801 acgccgaatt gaattcctcg agtacgtagg atccatttaa attctagagg cgcgccgata 4861 tcctctctta aggtagcgag ctcttaatta atagggataa cagggtaatg cggccgcaag 4921 ctaaaacgac ggccagtgaa ttatcaactt tgtatagaaa agttgctctg ccgacagtgg 4981 tcccaaagat ggacccccac ccacgaggag catcgtggaa aaagaagacg ttccaaccac 5041 gtcttcaaag caagtggatt gatgtgataa catggtggag cacgacactc tcgtctactc 5101 caagaatatc aaagatacag tctcagaaga ccaaagggct attgagactt ttcaacaaag 5161 ggtaatatcg ggaaacctcc tcggattcca ttgcccagct atctgtcact tcatcaaaag 5221 gacagtagaa aaggaaggtg gcacctacaa atgccatcat tgcgataaag gaaaggctat 5281 cgttcaagat gcctctgccg acagtggtcc caaagatgga cccccaccca cgaggagcat 5341 cgtggaaaaa gaagacgttc caaccacgtc ttcaaagcaa gtggattgat gtgatatctc 5401 cactgacgta agggatgacg cacaatccca ctatccttcg caagaccctt cctctatata 5461 aggaagttca tttcatttgg agaggacacg ctgcaagttt gtacaaaaaa gcaggctaga 5521 ccggggggca atgagatatg aaaaagcctg aactcaccgc gacgtctgtc gagaagtttc 5581 tgatcgaaaa gttcgacagc gtctccgacc tgatgcagct ctcggagggc gaagaatctc 5641 gtgctttcag cttcgatgta ggagggcgtg gatatgtcct gcgggtaaat agctgcgccg 5701 atggtttcta caaagatcgt tatgtttatc ggcactttgc atcggccgcg ctcccgattc 5761 cggaagtgct tgacattggg gaattcagcg agagcctgac ctattgcatc tcccgccgtg
    5821 cacagggtgt cacgttgcaa gacctgcctg aaaccgaact gcccgctgtt ctgcagccgg 5881 tcgcggaggc catggatgcg atcgctgcgg ccgatcttag ccagacgagc gggttcggcc 5941 cattcggacc gcaaggaatc ggtcaataca ctacatggcg tgatttcata tgcgcgattg 6001 ctgatcccca tgtgtatcac tggcaaactg tgatggacga caccgtcagt gcgtccgtcg 6061 cgcaggctct cgatgagctg atgctttggg ccgaggactg ccccgaagtc cggcacctcg 6121 tgcacgcgga tttcggctcc aacaatgtcc tgacggacaa tggccgcata acagcggtca 6181 ttgactggag cgaggcgatg ttcggggatt cccaatacga ggtcgccaac atcttcttct 6241 ggaggccgtg gttggcttgt atggagcagc agacgcgcta cttcgagcgg aggcatccgg 6301 agcttgcagg atcgccgcgg ctccgggcgt atatgctccg cattggtctt gaccaactct 6361 atcagagctt ggttgacggc aatttcgatg atgcagcttg ggcgcagggt cgatgcgacg 6421 caatcgtccg atccggagcc gggactgtcg ggcgtacaca aatcgcccgc agaagcgcgg 6481 ccggccgtct ggaccgatgg ctgtgtagaa gtactcgccg atagtggaaa ccgacgcccc 6541 agcactcgtc cggacccagc tttcttgtac aaagtggagt ccgcaaaaat caccagtctc 6601 tctctacaaa tctatctctc tctatttttc tccagaataa tgtgtgagta gttcccagat 6661 aagggaatta gggttcttat agggtttcgc tcatgtgttg agcatataag aaacccttag 6721 tatgtatttg tatttgtaaa atacttctat caataaaatt tctaattcct aaaaccaaaa 6781 tccagtgacc tcaactttat tatacatagt tgataattca ctggccgtgc ttattccatg 6841 gctgcaggtc gacgaattca ccggttaggg ataacagggt aatcgctacc ttaggaccgt 6901 tatagttacg gccagtgcca ttaccctgtt atccctaacc ggtgacaact ttgtatagaa 6961 aagttggttt gtgtcttcta gattaatcct ccaaactttt gattaaccaa aaaaattatc 7021 aaactaacat gttctccttt tttctttaga aattctaacg aatttatctt tatactgatt 7081 tgaatatact taatttggtc atttggatgc cctttacaac ctccttacca aactcactat 7141 ggcaaatata tactattttc cattgtaaca taaatgtcca taatttgaat taaattcgtt 7201 gcagtacgaa accatccaac tttgtccaaa aacaaaatcc ttataactat ttactttaat 7261 gtaaatatat cctctacttt tgtttttaca accctagctc aaacaaattt attatttgcg 7321 ataaaaaatc atatcgaaca aactcgatga tttttttttt cttacgttat taatgaaact 7381 aaaatataga aaaaaacaag atgaaccaaa ttttcaccta tctaactact taaatataat 7441 atgattaaat ttggtaaagt ttgaaaagtt tctttagaaa tgtgaaatat tgatcacagt 7501 ttctattgct aaaatcacca acaaaacgca tgtcgccatt cataattatg gtttcacacc 7561 tacaactagg ctaataagta aataagtaga caactagact caggtttgaa aaaaccataa 7621 aagccatata gcgttttctc attgaaactg cgaacacgat cgtgtgaatg ttgcagtttc 7681 tagttttgat acaaacaaac aaaaacacaa tttaatctta gattaaaaag aaaaaagaga 7741 acggagccca ctagccactc cttcaaacgt gtcttaccaa ctctcttcta gaaacaaatt 7801 aggcttcacc ttcctcttcc aacctctctc tctctctctc tctctttttc tcaaaccatc 7861 tctccataaa gccctaattt cttcatcaca agaatcagaa gaagaaacaa gtttgtacaa 7921 aaaagcaggc ttactgcaaa aaacttatgg acctgcatct aattttcggt ccaacttgca 7981 caggaaagac gacgaccgcg atagctcttg cccagcagac agggcttcca gtcctttcgc 8041 ttgatcgggt ccaatgctgt cctcaactat caaccggaag cggacgacca acagtggaag 8101 aactgaaagg aacgacgcgt ctctaccttg atgatcggcc tctggtggag ggtatcatcg 8161 cagccaagca agctcatcat aggctgatcg aggaggtgta taatcatgag gccaacggcg 8221 ggcttattct tgagggagga tccacctcgt tgctcaactg catggcgcga aacagctatt 8281 ggagtgcaga ttttcgttgg catattattc gccacaagtt acccgaccaa gagaccttca 8341 tgaaagcggc caaggccaga gttaagcaga tgttgcaccc cgctgcaggc cattctatta 8401 ttcaagagtt ggtttatctt tggaatgaac ctcggctgag gcccattctg aaagagatcg 8461 atggatatcg atatgccatg ttgtttgcta gccagaacca gatcacggca gatatgctat 8521 tgcagcttga cgcaaatatg gaaggtaagt tgattaatgg gatcgctcag gagtatttca 8581 tccatgcgcg ccaacaggaa cagaaattcc cccaagttaa cgcagccgct ttcgacggat 8641 tcgaaggtca tccgttcgga atgtattagg tacccagctt tcttgtacaa agtgggatcg 8701 ttcaaacatt tggcaataaa gtttcttaag attgaatcct gttgccggtc ttgcgatgat
    8761 tatcatataa tttctgttga attacgttaa gcatgtaata attaacatgt aatgcatgac
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    8941 actagatcca actttattat acatagttga ttcgtcgacc tgcagtcgct accttaggac
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    9181 tttgacagga tatattggcg ggtaaaccta agagaaaaga gcgtttatta gaataacgga
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    Figura 21.
    Figura 22.
    1 gtcccgtatc acgcagcgcg tgagctaccc aggcactgcc gccgccggca caaccgttct 61 tgaatcagaa cccgagggcg acgctgcccg cgaggtccag gcgctggccg ctgaaattaa 121 atcaaaactc atttgagtta atgaggtaaa gagaaaatga gcaaaagcac aaacacgcta 181 agtgccggcc gtccgagcgc acgcagcagc aaggctgcaa cgttggccag cctggcagac 241 acgccagcca tgaagcgggt caactttcag ttgccggcgg aggatcacac caagctgaag 301 atgtacgcgg tacgccaagg caagaccatt accgagctgc tatctgaata catcgcgcag 361 ctaccagagt aaatgagcaa atgaataaat gagtagatga attttagcgg ctaaaggagg 421 cggcatggaa aatcaagaac aaccaggcac cgacgccgtg gaatgcccca tgtgtggagg 481 aacgggcggt tggccaggcg taagcggctg ggttgtctgc cggccctgca atggcactgg 541 aacccccaag cccgaggaat cggcgtgacg gtcgcaaacc atccggcccg gtacaaatcg 601 gcgcggcgct gggtgatgac ctggtggaga agttgaaggc cgcgcaggcc gcccagcggc 661 aacgcatcga ggcagaagca cgccccggtg aatcgtggca agcggccgct gatcgaatcc 721 gcaaagaatc ccggcaaccg ccggcagccg gtgcgccgtc gattaggaag ccgcccaagg 781 gcgacgagca accagatttt ttcgttccga tgctctatga cgtgggcacc cgcgatagtc 841 gcagcatcat ggacgtggcc gttttccgtc tgtcgaagcg tgaccgacga gctggcgagg 901 tgatccgcta cgagcttcca gacgggcacg tagaggtttc cgcagggccg gccggcatgg 961 ccagtgtgtg ggattacgac ctggtactga tggcggtttc ccatctaacc gaatccatga 1021 accgataccg ggaagggaag ggagacaagc ccggccgcgt gttccgtcca cacgttgcgg 1081 acgtactcaa gttctgccgg cgagccgatg gcggaaagca gaaagacgac ctggtagaaa 1141 cctgcattcg gttaaacacc acgcacgttg ccatgcagcg tacgaagaag gccaagaacg 1201 gccgcctggt gacggtatcc gagggtgaag ccttgattag ccgctacaag atcgtaaaga 1261 gcgaaaccgg gcggccggag tacatcgaga tcgagctagc tgattggatg taccgcgaga 1321 tcacagaagg caagaacccg gacgtgctga cggttcaccc cgattacttt ttgatcgatc 1381 ccggcatcgg ccgttttctc taccgcctgg cacgccgcgc cgcaggcaag gcagaagcca 1441 gatggttgtt caagacgatc tacgaacgca gtggcagcgc cggagagttc aagaagttct 1501 gtttcaccgt gcgcaagctg atcgggtcaa atgacctgcc ggagtacgat ttgaaggagg 1561 aggcggggca ggctggcccg atcctagtca tgcgctaccg caacctgatc gagggcgaag 1621 catccgccgg ttcctaatgt acggagcaga tgctagggca aattgcccta gcaggggaaa 1681 aaggtcgaaa aggtctcttt cctgtggata gcacgtacat tgggaaccca aagccgtaca 1741 ttgggaaccg gaacccgtac attgggaacc caaagccgta cattgggaac cggtcacaca 1801 tgtaagtgac tgatataaaa gagaaaaaag gcgatttttc cgcctaaaac tctttaaaac 1861 ttattaaaac tcttaaaacc cgcctggcct gtgcataact gtctggccag cgcacagccg 1921 aagagctgca aaaagcgcct acccttcggt cgctgcgctc cctacgcccc gccgcttcgc 1981 gtcggcctat cgcggccgct ggccgctcaa aaatggctgg cctacggcca ggcaatctac 2041 cagggcgcgg acaagccgcg ccgtcgccac tcgaccgccg gcgcccacat caaggcaccc 2101 tgcctcgcgc gtttcggtga tgacggtgaa aacctctgac acatgcagct cccggagacg 2161 gtcacagctt gtctgtaagc ggatgccggg agcagacaag cccgtcaggg cgcgtcagcg 2221 ggtgttggcg ggtgtcgggg cgcagccatg acccagtcac gtagcgatag cggagtgtat 2281 actggcttaa ctatgcggca tcagagcaga ttgtactgag agtgcaccat atgcggtgtg 2341 aaataccgca cagatgcgta aggagaaaat accgcatcag gcgctcttcc gcttcctcgc 2401 tcactgactc gctgcgctcg gtcgttcggc tgcggcgagc ggtatcagct cactcaaagg 2461 cggtaatacg gttatccaca gaatcagggg ataacgcagg aaagaacatg tgagcaaaag 2521 gccagcaaaa ggccaggaac cgtaaaaagg ccgcgttgct ggcgtttttc cataggctcc 2581 gcccccctga cgagcatcac aaaaatcgac gctcaagtca gaggtggcga aacccgacag 2641 gactataaag ataccaggcg tttccccctg gaagctccct cgtgcgctct cctgttccga
    2701 ccctgccgct taccggatac ctgtccgcct ttctcccttc gggaagcgtg gcgctttctc 2761 atagctcacg ctgtaggtat ctcagttcgg tgtaggtcgt tcgctccaag ctgggctgtg 2821 tgcacgaacc ccccgttcag cccgaccgct gcgccttatc cggtaactat cgtcttgagt 2881 ccaacccggt aagacacgac ttatcgccac tggcagcagc cactggtaac aggattagca 2941 gagcgaggta tgtaggcggt gctacagagt tcttgaagtg gtggcctaac tacggctaca 3001 ctagaaggac agtatttggt atctgcgctc tgctgaagcc agttaccttc ggaaaaagag 3061 ttggtagctc ttgatccggc aaacaaacca ccgctggtag cggtggtttt tttgtttgca 3121 agcagcagat tacgcgcaga aaaaaaggat ctcaagaaga tcctttgatc ttttctacgg 3181 ggtctgacgc tcagtggaac gaaaactcac gttaagggat tttggtcatg catgatatat 3241 ctcccaattt gtgtagggct tattatgcac gcttaaaaat aataaaagca gacttgacct 3301 gatagtttgg ctgtgagcaa ttatgtgctt agtgcatcta atcgcttgag ttaacgccgg 3361 cgaagcggcg tcggcttgaa cgaatttcta gctagacatt atttgccgac taccttggtg 3421 atctcgcctt tcacgtagtg gacaaattct tccaactgat ctgcgcgcga ggccaagcga 3481 tcttcttctt gtccaagata agcctgtcta gcttcaagta tgacgggctg atactgggcc 3541 ggcaggcgct ccattgccca gtcggcagcg acatccttcg gcgcgatttt gccggttact 3601 gcgctgtacc aaatgcggga caacgtaagc actacatttc gctcatcgcc agcccagtcg 3661 ggcggcgagt tccatagcgt taaggtttca tttagcgcct caaatagatc ctgttcagga 3721 accggatcaa agagttcctc cgccgctgga cctaccaagg caacgctatg ttctcttgct 3781 tttgtcagca agatagccag atcaatgtcg atcgtggctg gctcgaagat acctgcaaga 3841 atgtcattgc gctgccattc tccaaattgc agttcgcgct tagctggata acgccacgga 3901 atgatgtcgt cgtgcacaac aatggtgact tctacagcgc ggagaatctc gctctctcca 3961 ggggaagccg aagtttccaa aaggtcgttg atcaaagctc gccgcgttgt ttcatcaagc 4021 cttacggtca ccgtaaccag caaatcaata tcactgtgtg gcttcaggcc gccatccact 4081 gcggagccgt acaaatgtac ggccagcaac gtcggttcga gatggcgctc gatgacgcca 4141 actacctctg atagttgagt cgatacttcg gcgatcaccg cttcccccat gatgtttaac 4201 tttgttttag ggcgactgcc ctgctgcgta acatcgttgc tgctccataa catcaaacat 4261 cgacccacgg cgtaacgcgc ttgctgcttg gatgcccgag gcatagactg taccccaaaa 4321 aaacatgtca taacaagaag ccatgaaaac cgccactgcg ccgttaccac cgctgcgttc 4381 ggtcaaggtt ctggaccagt tgcgtgacgg cagttacgct acttgcatta cagcttacga 4441 accgaacgag gcttatgtcc actgggttcg tgcccgaatt gatcacaggc agcaacgctc 4501 tgtcatcgtt acaatcaaca tgctaccctc cgcgagatca tccgtgtttc aaacccggca 4561 gcttagttgc cgttcttccg aatagcatcg gtaacatgag caaagtctgc cgccttacaa 4621 cggctctccc gctgacgccg tcccggactg atgggctgcc tgtatcgagt ggtgattttg 4681 tgccgagctg ccggtcgggg agctgttggc tggctggtgg caggatatat tgtggtgtaa 4741 acaaattgac gcttagacaa cttaataaca cattgcggac gtttttaatg tactgaatta 4801 acgccgaatt gaattcctcg agtacgtagg atccatttaa attctagagg cgcgccgata 4861 tcctctctta aggtagcgag ctcttaatta atagggataa cagggtaatg cggccgcaag 4921 ctaaaacgac ggccagtgaa ttatcaactt tgtatagaaa agttgctctg ccgacagtgg 4981 tcccaaagat ggacccccac ccacgaggag catcgtggaa aaagaagacg ttccaaccac 5041 gtcttcaaag caagtggatt gatgtgataa catggtggag cacgacactc tcgtctactc 5101 caagaatatc aaagatacag tctcagaaga ccaaagggct attgagactt ttcaacaaag 5161 ggtaatatcg ggaaacctcc tcggattcca ttgcccagct atctgtcact tcatcaaaag 5221 gacagtagaa aaggaaggtg gcacctacaa atgccatcat tgcgataaag gaaaggctat 5281 cgttcaagat gcctctgccg acagtggtcc caaagatgga cccccaccca cgaggagcat 5341 cgtggaaaaa gaagacgttc caaccacgtc ttcaaagcaa gtggattgat gtgatatctc
    5401 cactgacgta agggatgacg cacaatccca ctatccttcg caagaccctt cctctatata 5461 aggaagttca tttcatttgg agaggacacg ctgcaagttt gtacaaaaaa gcaggctaga 5521 ccggggggca atgagatatg aaaaagcctg aactcaccgc gacgtctgtc gagaagtttc 5581 tgatcgaaaa gttcgacagc gtctccgacc tgatgcagct ctcggagggc gaagaatctc 5641 gtgctttcag cttcgatgta ggagggcgtg gatatgtcct gcgggtaaat agctgcgccg 5701 atggtttcta caaagatcgt tatgtttatc ggcactttgc atcggccgcg ctcccgattc 5761 cggaagtgct tgacattggg gaattcagcg agagcctgac ctattgcatc tcccgccgtg 5821 cacagggtgt cacgttgcaa gacctgcctg aaaccgaact gcccgctgtt ctgcagccgg 5881 tcgcggaggc catggatgcg atcgctgcgg ccgatcttag ccagacgagc gggttcggcc 5941 cattcggacc gcaaggaatc ggtcaataca ctacatggcg tgatttcata tgcgcgattg 6001 ctgatcccca tgtgtatcac tggcaaactg tgatggacga caccgtcagt gcgtccgtcg 6061 cgcaggctct cgatgagctg atgctttggg ccgaggactg ccccgaagtc cggcacctcg 6121 tgcacgcgga tttcggctcc aacaatgtcc tgacggacaa tggccgcata acagcggtca 6181 ttgactggag cgaggcgatg ttcggggatt cccaatacga ggtcgccaac atcttcttct 6241 ggaggccgtg gttggcttgt atggagcagc agacgcgcta cttcgagcgg aggcatccgg 6301 agcttgcagg atcgccgcgg ctccgggcgt atatgctccg cattggtctt gaccaactct 6361 atcagagctt ggttgacggc aatttcgatg atgcagcttg ggcgcagggt cgatgcgacg 6421 caatcgtccg atccggagcc gggactgtcg ggcgtacaca aatcgcccgc agaagcgcgg 6481 ccggccgtct ggaccgatgg ctgtgtagaa gtactcgccg atagtggaaa ccgacgcccc 6541 agcactcgtc cggacccagc tttcttgtac aaagtggagt ccgcaaaaat caccagtctc 6601 tctctacaaa tctatctctc tctatttttc tccagaataa tgtgtgagta gttcccagat 6661 aagggaatta gggttcttat agggtttcgc tcatgtgttg agcatataag aaacccttag 6721 tatgtatttg tatttgtaaa atacttctat caataaaatt tctaattcct aaaaccaaaa 6781 tccagtgacc tcaactttat tatacatagt tgataattca ctggccgtgc ttattccatg 6841 gctgcaggtc gacgaattca ccggttaggg ataacagggt aataactata acggtcctaa 6901 ggtagcgagc ggccgcaagc taaaacgacg gccagtgaat tatcaacttt gtatagaaaa 6961 gttggtttgt gtcttctaga ttaatcctcc aaacttttga ttaaccaaaa aaattatcaa 7021 actaacatgt tctccttttt tctttagaaa ttctaacgaa tttatcttta tactgatttg 7081 aatatactta atttggtcat ttggatgccc tttacaacct ccttaccaaa atattgatca 7141 cagtttctat tgctaaaatc accaacaaaa cgcatgtcgc cattcataat tatggtttca 7201 cacctacaac taggctaata agtaaataag tagacaacta gactcaggtt tgaaaaaacc 7261 ataaaagcca tatagcgttt tctcattgaa actgcgaaca cgatcgtgtg aatgttgcag 7321 tttctagttt tgatacaaac aaacaaaaac acaatttaat cttagattaa aaagaaaaaa 7381 gagaacggag cccactagcc actccttcaa acgtgtctta ccaactctct tctagaaaca 7441 aattaggctt caccttcctc ttccaacctc tctctctctc tctctctctt tttctcaaac 7501 catctctcca taaagcccta atttcttcat cacaagaatc agaagaagaa acaagtttgt 7561 acaaaaaagc aggcttactg caaaaaactt atggacctgc atctaatttt cggtccaact 7621 tgcacaggaa agacgacgac cgcgatagct cttgcccagc agacagggct tccagtcctt 7681 tcgcttgatc gggtccaatg ctgtcctcaa ctatcaaccg gaagcggacg accaacagtg 7741 gaagaactga aaggaacgac gcgtctctac cttgatgatc ggcctctggt ggagggtatc 7801 atcgcagcca agcaagctca tcataggctg atcgaggagg tgtataatca tgaggccaac 7861 ggcgggctta ttcttgaggg aggatccacc tcgttgctca actgcatggc gcgaaacagc 7921 tattggagtg cagattttcg ttggcatatt attcgccaca agttacccga ccaagagacc 7981 ttcatgaaag cggccaaggc cagagttaag cagatgttgc accccgctgc aggccattct 8041 attattcaag agttggttta tctttggaat gaacctcggc tgaggcccat tctgaaagag
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    8221 ttcatccatg cgcgccaaca ggaacagaaa ttcccccaag ttaacgcagc cgctttcgac
    8281 ggattcgaag gtcatccgtt cggaatgtat taggtaccca gctttcttgt acaaagtggg
    8341 atcgttcaaa catttggcaa taaagtttct taagattgaa tcctgttgcc ggtcttgcga
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    8461 tgacgttatt tatgagatgg gtttttatga ttagagtccc gcaattatac atttaatacg
    8521 cgatagaaaa caaaatatag cgcgcaaact aggataaatt atcgcgcgcg gtgtcatcta
    8581 tgttactaga tccaacttta ttatacatag ttgataattc actggccgtc gcttattcca
    8641 tggctgcagg tcgacgaatt caccggttaa ctataacggt cctaaggtag cgatggcaaa
    8701 cagctattat gggtattatg ggtggttctt tatgcggaca ctgacggctt tatgcctgca
    8761 ggtcgcgagc gatcgcggta ccgcccgggc gtcgacaggc ctaagcttag cttgagcttg
    8821 gatcagattg tcgtttcccg ccttcagttt aaactatcag tgtttgacag gatatattgg
    8881 cgggtaaacc taagagaaaa gagcgtttat tagaataacg gatatttaaa agggcgtgaa
    8941 aaggtttatc cgttcgtcca tttgtatgtg catgccaacc acagggttcc cctcgggatc
    9001 aaagtacttt gatccaaccc ctccgctgct atagtgcagt cggcttctga cgttcagtgc
    9061 agccgtcttc tgaaaacgac atgtcgcaca agtcctaagt tacgcgacag gctgccgccc
    9121 tgcccttttc ctggcgtttt cttgtcgcgt gttttagtcg cataaagtag aatacttgcg
    9181 actagaaccg gagacattac gccatgaaca agagcgccgc cgctggcctg ctgggctatg
    9241 cccgcgtcag caccgacgac caggacttga ccaaccaacg ggccgaactg cacgcggccg
    9301 gctgcaccaa gctgttttcc gagaagatca ccggcaccag gcgcgaccgc ccggagctgg
    9361 ccaggatgct tgaccaccta cgccctggcg acgttgtgac agtgaccagg ctagaccgcc
    9421 tggcccgcag cacccgcgac ctactggaca ttgccgagcg catccaggag gccggcgcgg
    9481 gcctgcgtag cctggcagag ccgtgggccg acaccaccac gccggccggc cgcatggtgt
    9541 tgaccgtgtt cgccggcatt gccgagttcg agcgttccct aatcatcgac cgcacccgga
    9601 gcgggcgcga ggccgccaag gcccgaggcg tgaagtttgg cccccgccct accctcaccc
    9661 cggcacagat cgcgcacgcc cgcgagctga tcgaccagga aggccgcacc gtgaaagagg
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    9781 aagtgacgcc caccgaggcc aggcggcgcg gtgccttccg tgaggacgca ttgaccgagg
    9841 ccgacgccct ggcggccgcc gagaatgaac gccaagagga acaagcatga aaccgcacca
    9901 ggacggccag gacgaaccgt ttttcattac cgaagagatc gaggcggaga tgatcgcggc
    9961 cgggtacgtg ttcgagccgc ccgcgcacgt ctcaaccgtg cggctgcatg aaatcctggc 10021 cggtttgtct gatgccaagc tggcggcctg gccggccagc ttggccgctg aagaaaccga 10081 gcgccgccgt ctaaaaaggt gatgtgtatt tgagtaaaac agcttgcgtc atgcggtcgc 10141 tgcgtatatg atgcgatgag taaataaaca aatacgcaag gggaacgcat gaaggttatc 10201 gctgtactta accagaaagg cgggtcaggc aagacgacca tcgcaaccca tctagcccgc 10261 gccctgcaac tcgccggggc cgatgttctg ttagtcgatt ccgatcccca gggcagtgcc 10321 cgcgattggg cggccgtgcg ggaagatcaa ccgctaaccg ttgtcggcat cgaccgcccg 10381 acgattgacc gcgacgtgaa ggccatcggc cggcgcgact tcgtagtgat cgacggagcg 10441 ccccaggcgg cggacttggc tgtgtccgcg atcaaggcag ccgacttcgt gctgattccg 10501 gtgcagccaa gcccttacga catatgggcc accgccgacc tggtggagct ggttaagcag 10561 cgcattgagg tcacggatgg aaggctacaa gcggcctttg tcgtgtcgcg ggcgatcaaa 10621 ggcacgcgca tcggcggtga ggttgccgag gcgctggccg ggtacgagct gcccattctt 10681 ga
    Figura 23.
    Figura 24.
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